CH646875A5

CH646875A5 - Verfahren zur gewinnung eines interferons und interferon hergestellt nach diesem verfahren.

Info

Publication number: CH646875A5
Application number: CH766981A
Authority: CH
Inventors: Fumiaki Taguchi
Original assignee: Fumiaki Taguchi
Priority date: 1980-03-26
Filing date: 1981-03-25
Publication date: 1984-12-28
Also published as: SE8106944L; GB2083359A; WO1981002674A1; DE3140623A1; NL8120080A; AU6924881A; JPS56135420A; EP0048283A4; EP0048283B1; EP0048283A1; AU538563B2; GB2083359B

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Interferons und auch ein Interferon hergestellt nach diesem Verfahren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Interferon aus menschlichen Epithelzellen (im folgenden manchmal als HE-IF bezeichnet), das eine besonders starke antivirale Aktivität in menschlichen Epithelzellen aufweist, das in menschlichen Epithelzellen, wie solchen aus Amnion, Niere oder amniotischer Flüssigkeit, erzeugt wird.

Das Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung wird in einem umfassenden Sinn als zum Typ I-Interferon gehörend betrachtet, es ist aber ein neues Interferon, das in seiner Reaktivität mit Antikörpern von Humanleukozyten-Interferon und Humanfibroblasten-Interferon verschieden ist.

Ganz allgemein können Interferone grob in Typ I und Typ II eingeteilt werden. Als Typ I-Interferone bekannt sind Fibroblasten-Interferon (im weiteren als HF-IF bezeichnet), das von Fibroblasten produziert wird, und Leukozyten-Interferon (im folgenden mit HL-IF bezeichnet), das durch Blutzellen, wie Leukozyten, Lymphozyten und Lymphobla-sten, produziert wird. Das Typ Ii-Interferon ist instabil und kann nur in sehr geringer Aktivität produziert werden, und deswegen sind die Eigenschaften des Typ Ii-Interferons bis jetzt noch nicht genügend aufgeklärt worden. Im Gegensatz dazu hat das oben erwähnte Typ I-Interferon als geeignet für therapeutische Zwecke Aufmerksamkeit erhalten. Das heisst, es wird berichtet, dass HL-IF wirksam auf Lympho-blasten des Burkitt-Lymphom wirken kann und auch dass HF-IF wirkungsvoll auf Osteosarcom-Zellen wirken kann.

Es gibt jedoch keine Berichte oder Vorschläge, die die Anwesenheit eines Interferons voraussagen würden, das eine ausgezeichnete Aktivität auf Epithelzellen über die gesamte Körperoberfläche aufweisen würde, darunter Zellpopulationen, einschliesslich Blutzellen, Skelettzellen (Muskelzellen), substantielle Zellen der entsprechenden Organe und Epithelzellen.

Die Erfinder haben Untersuchungen gemacht, um ein Interferon aus Epithelzellen zu entdecken, das eine spezifisch auf Epithelzellen gerichtete antivirale Aktivität hat. Folglich wurde jetzt gefunden, dass ein neues Interferon durch Am-nion-Epithelzelien, Nieren-Epithelzellen und Epithelzellen aus amniotischer Flüssigkeit produziert werden kann, das eine starke Aktivität zur Hemmung der Virusvermehrung speziell in Epithelzellen aufweist und doch antigene Eigenschaften hat, die verschieden von denen von HL-IF und HF-IF sind, und deshalb mit einem neuen Namen bezeichnet werden sollte. Die Reinigung sowie die Charakterisierung der Eigenschaften dieses Interferons wurden auch durchgeführt, um seine Neuheit zu bestätigen.

Somit wird das neue Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung in menschlichen Epithelzellen produziert, weist eine sehr starke Aktivität gegen Viren in menschlichen Epithelzellen auf und unterscheidet sich von Humanleukozyten-Interferon und HF-IF in seiner Reaktivität mit den Antikörpern.

Das spezifische Merkmal des Verfahrens zur Gewinnung des neuen Interferons gemäss der vorliegenden Erfindung ist die Massnahme, dass menschliche Epithelzellen mit einem Interferon-Inducer in Berührung gebracht werden und dann diese Epithelzellen in einem Kulturmedium in Gegenwart oder in Abwesenheit von Serum kultiviert werden, um ein Interferon, das eine sehr starke antivirale Aktivität in menschlichen Epithelzellen aufweist, zu produzieren.

Das Interferon HE-IF gemäss der vorliegenden Erfindung ist sehr stabil, hat eine hohe virale Wachstumshemmaktivität und auch eine spezifische Aktivität, die bezüglich der starken antiviralen Aktivität, die speziell bei menschlichen Epithelzellen auftritt, verschieden von herkömmlichen Typ I-Interferonen ist. In anderen Worten, das Interferon HE-IF zeigt eine antivirale Aktivität in Epithelzellen, die weitaus grösser ist als in Fibroblasten. Ausserdem kann die Aktivität schneller und stärker in Epithelzellen auftreten als in Fibroblasten in vitro, was daraufhindeutet, dass das vorliegende Interferon Eigenschaften hat, die in den bekannten nicht gefunden wurden. Wegen dieser Merkmale kann man erwarten, dass dieses Interferon ausgezeichnete pharmakologische Eigenschaften aufweist, insbesondere in bezug auf Krankheiten, wie virale Infektionen, bösartige Tumore, usw., die in Epithelzellen in vivo gefunden werden können.

Es ist auch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass das Humanepithel, das als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, relativ leicht zu erhalten ist.

Fig. 1 zeigt die Hemmung der Ausbeute eines Vesicular-stomatitis-Virus (abgekürzt als VSV) durch HE-IF, wobei die HE-IF-Titer auf der Abszisse gegen die Hemmung der VSV-Ausbeute auf der Ordinate aufgetragen sind, in welcher:

1-1 den Fall darstellt, wenn Zellart aus Fibroblasten aus menschlicher Embryolunge (abgekürzt als HEL-R-66-Zellen) mit HE-IF während 5 Minuten behandelt und dann mit dem Virus infiziert werden;

1-2 den Fall darstellt, wenn HEL-R66-Zellen mit HE-IF während 360 Minuten behandelt und dann mit dem Virus infiziert werden;

2-1 den Fall darstellt, wenn primäre Humanamnion-Zellen (abgekürzt als PHA) mit HE-IF während 5 Minuten behandelt und dann mit dem Virus infiziert werden; und

2-2 den Fall darstellt, wenn PHA-Zellen mit HE-IF während 360 Minuten behandelt und dann mit dem Virus infiziert werden; und

Fig. 2 zeigt die Hemmung der VSV-Ausbeute, wenn die Inokulation von VSV und HE-IF gleichzeitig durchgeführt wird, in welcher:

1 den Fall darstellt, wenn HEL-R66 verwendet wird;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

646 875

2 den Fall darstellt, wenn Fibroblasten aus Humanembryolunge (abgekürzt als HEL-Zellen) verwendet wird; und

3 den Fall darstellt, wenn PHA verwendet wird.

1. Gewinnung des Interferons Das Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung wird dadurch gewonnen, dass zuerst menschliche Epithelzellen mit einem Interferon-Inducer in Berührung gebracht und dann diese Epithelzellen in einem Medium in Gegenwart oder in Abwesenheit von Serum kultiviert werden.

1) Quelle für menschliche Epithelzellen Als menschliche Epithelzellen können verschiedene Arten von Epithelzellen verwendet werden. Typische Beispiele sind solche, die aus dem Amnion, amniotischen Flüssigkeiten und den Nieren stammen. Unter diesen ist das Amnion bevorzugt wegen seiner Verfügbarkeit und der Leichtigkeit der Erhaltung und auch deswegen, weil es aus einer Masse von Zellen besteht, die IF mit hohem Titer produzieren können.

2) Interferon-Inducer Als Substanzen, die auflebende Zellen wirken und darin Interferone induzieren, d.h. Interferon-Inducer, sind Viren, Bakterien, Bestandteile oder Produkte von Pilzen und Bakterien, Nucleinsäuren, Polysaccharide, usw., bekannt. In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, jede gewünschte Art zu verwenden, die die Wirkung der vorliegenden Erfindung entfalten kann (wobei die Induktions-Wirkung verschieden ist je nach Art).

Ein typischer Interferon-Inducer, der in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ist ein Virus. Als einen solchen Virus ist es möglich, jeden Paramyxovirus und Orthomyxovirus zu verwenden. Die für die vorliegende Erfindung geeigneten Viren schliessen auch den Newcastle-Krankheits-Virus (im folgenden mit NDV abgekürzt), Sendai-Virus, Influenza-Virus, usw., ein.

Ein Virus, der durch ultraviolette Strahlen oder Hitze inaktiviert worden ist, kann auch verwendet werden.

3) Induktion des Interferons Menschliche Epithelzellen können mit einem wie oben beschriebenen Interferon-Inducer nach jeder Methode, die die Induktion des Interferons gewährleistet, in Berührung gebracht werden.

Die spezifischen Berührungsverfahren können je nach verwendetem Inducer (und je nach verwendeten Epithelzellen) verschieden sein. Ist der Inducer ein Virus, so ist es allgemein üblich, eine Dispersion des Virus mit den Epithelzellen zu schütteln, z.B. ein zweckmässigerweise in Stücke geschnittenes Amnion, um das Virus darauf zu adsorbieren. Die Epithelzellen können entweder aus einzelnen Zellen bestehen oder in Form einer Membran sein, die in einem Medium, das in der folgenden Stufe verwendet wird, suspendiert ist. Die Berührungstemperatur und -zeit können jeden gewünschten, genügend hohen Wert haben, um die Induktion des Interferons zu gewährleisten, und spezifische Werte können durch den Fachmann anhand der weiter unten beschriebenen Beispiele leicht ausgewählt werden.

4) Kulturmedium und Inkubationsbedingungen Als Grundmedium für die Erhaltung der menschlichen Epithelzellen und die Produktion von HE-IF kann man ein im Handel erhältliches synthetisches Komplettmedium verwenden, das Saccharide, Aminosäuren, Vitamine und anorganische Salze enthält, z. B. Eagle's Minimumessentialme-dium (MEM), RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, M199-Medium, usw. (E.H. Lennette und N.J. Schmidt «Diagnostic Procédures for Viral and Rickett-

sial Infections (4. Ausgabe)», 1969, Am. Public Health As-soc., N.Y., V.St.A.).

Im allgemeinen wird die Zugabe eines Serums als uner-lässlich erachtet für die Produktion von Interferon, es ist jedoch in der vorliegenden Erfindung auch möglich, ein Medium zu verwenden, zu dem kein Serum zugesetzt worden ist.

Die Kulturbedingungen können passend für die Produktion von Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Die Kulturtemperatur beträgt im allgemeinen 37 °C, wobei die Kultur während 38 bis 58 Stunden durchgeführt wird, und dann wird die Kulturtemperatur auf 27 + 2 °C erniedrigt, wodurch die Ausbeute an Interferon in einem grossen Ausmass erhöht werden kann. Die Kulturdauer kann in jedem Fall zweckmässigerweise 2 bis 4 Tage betragen.

5) Beschleuniger für die Interferon-Produktion

Zusätzlich zu den Grundbedingungen für die wie oben angegebene Produktion von HE-IF haben die Erfinder die Wirkung verschiedener Zusätze untersucht. Mit fortschreitender Untersuchung wurde festgestellt, dass eine Produktion von HE-IF in Titern von 300% oder mehr, bezogen auf den Fall, in dem nichts zugesetzt worden ist, erreicht werden kann durch Zugabe von Zusätzen, die bisher noch nicht beschrieben worden sind, einschliesslich schleimabsondernder Hormone, wie ACTH, Xanthin-Derivaten, wie Kaffein, Theophyllin, Theobromin, usw., Alloxan, Indol, Indolessig-säure, Barbiturat, Amantadin, Imidazol, Carbazol, usw., und auch Insulin, von dem berichtet worden ist, dass es einen schwach verstärkenden Effekt im HF-IF-Produktions-system hat.

Es wurde festgestellt, dass die Wirkung dieser Zusätze sogar noch ausgeprägter ist, wenn sie in geeignet ausgewählten Stufen zugesetzt werden. Insulin zum Beispiel sollte vorzugsweise dann zugesetzt werden, wenn die Kultivierung 12 bis 36 Stunden gedauert hat und wenn die Temperatur über das gesamte Kulturverfahren auf 37 °C gehalten worden ist, oder es sollte vorzugsweise am Beginn der Kultivierung zugesetzt werden, wenn die Temperatur während 48 Stunden auf 37 °C gehalten und dann auf 27 °C abgesenkt wird.

Diese neuen, die Beschleuniger betreffenden Befunde und die oben angegebenen Kulturtemperaturen können für die grosstechnische Produktion von HE-IF wirkungsvoll verwendet werden. Gemäss dem bekannten Verfahren zur Herstellung von Interferon durch ein Massenproduktionssystem beträgt die maximale Menge an Interferon etwa 10 000 Einheiten/ml für HF-IF und etwa 30 000 Einheiten/ml für HL-IF, wobei das von einer Zelle produzierte Interferon etwa 0,15 Einheiten oder weniger beträgt. Im Gegensatz dazu ist es im erfindungsgemässen Verfahren möglich, HE-IF in einer Menge von etwa 2 000 000 Einheiten/ml zu gewinnen, wobei das von einer Zelle produzierte Interferon sogar 10 Einheiten beträgt.

6) Reinigung des erhaltenen Interferons

Die Reinigung des im erfindungsgemässen Verfahren produzierten HE-IF kann gemäss bekannten Methoden durchgeführt werden, die zur Reinigung von bekannten In-terferonen, einschliesslich menschlicher Interferone, wie HF-IF, HL-IF, oder Mäuseinterferone, verwendet werden. So ist es z.B. möglich, ein gereinigtes Produkt mit 10® Einheiten/ mg oder darüber durch eine Stufe von Säulenchromatographie, in der SP-Sephadex oder Blue Sephalose verwendet wird, zu erhalten.

Es wurde gefunden, dass HE-IF bei physikalischen und chemischen Behandlungen relativ stabil ist. Insbesondere wenn kein Serum für die Herstellung von HE-IF verwendet wird, ist das entstandene Interferon frei von damit vermisch5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

646 875

4

tem Serum, was verglichen mit herkömmlichen Interferonen günstig für die Reinigung ist.

2. Eigenschaften und Aktivität des Interferons gemäss der vorliegenden Erfindung (I) Stabilität (Vergleich mit HF-IF und HL-IF) Tabelle 1 zeigt die Stabilität von HE-IF im Vergleich zur Stabilität von HF-IF und HL-IF. Daraus ist ersichtlich, dass HE-IF stabiler als HF-IF ist.

Tabelle 1

Behandlungsbedingungen

HE-IF

HF-IF

HL-IF

pH 2,0-10,0, 4°C

leicht

2 Tage stabil instabil stabil pH 7,0,4°C,

2 Tage stabil stabil stabil pH 7,0, 37 °C

24 Stunden stabil instabil stabil pH 7,0, 56 °C,

relativ

30 Minuten stabil (stabil

in Gegenwart

von SDS)

instabil stabil

Lagerung unter

Gefrieren während

1 Woche

— 40°C

stabil stabil stabil

— 70°C

stabil stabil stabil

Einfrier-Auftau-Be-

relativ

relativ handlung (— 70 °C, 3 x )

stabil instabil stabil

Behandlung mit

Trypsin (100 (ig/ml)

instabil instabil instabi

(2) pH-Stabilität Probelösungen, die je aus 3 ml Amnion-Interferon mit einer Aktivität von 14 000 Einheiten/ml bestehen und kein oder 0,1% Natriumdodecylsulfat (im weiteren mit SDS bezeichnet) enthalten, werden mit In Salzsäure oder In Natronlauge auf die pH-Behandlung eingestellt, 48 Stunden bei 4 °C stehengelassen und dann wieder auf pH 7 eingestellt. Ihre Restaktivität wird dann mit FL-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Behandlung pH Restaktivität (Einheiten/ml)

kein SDS zugesetzt 0,1 % SDS zugesetzt

2,0 2400(17,1) 12000(85,7)

3,0 3000(21,4) 14000(100)

4,0 3000 (21,4) 13000 (92,9)

7,0 6800(48,6) 13000(92,9)

9,5 4600 (32,9 13000 (92,9)

In den Klammern werden die Anteile an Restaktivität in % nach der Behandlung angegeben, bezogen auf die Aktivität vor der Behandlung.

Wie aus den oben angegebenen Ergebnissen ersichtlich ist, ist HE-IF bei pH 2,0 bis pH 9,5 bemerkenswert stabil, seine Stabilität kann durch Zugabe von 0,1 % SDS noch weiter erhöht werden.

(3) Temperatur-Stabilität Es wurde festgestellt, dass die antivirale Aktivität von HE-IF fast vollständig inaktiviert war als Folge der Inkubation bei pH 7,0 bei 56 °C während einer Stunde. In Gegenwart von 0,04% Natriumdodecylsulfat jedoch konnte mehr als 80% Restaktivität gefunden werden. Die Aktivitätsbestimmung wurde unter Verwendung von FL-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

SDS-Konzentration (%) Restaktivität (Einheiten/ml)

0 10

0,008 500

0,04 1500

0,2 1100 Kontrolle (kein SDS

zugesetzt, 4°C) 1800

(4) Artspezifizität Tabelle 4

Art der Zellen Induktion von antiviraler

Aktivität

Humanzellen

(FL, HEL, FS, HEL-R66, PHA)

ja

Affenzellen

(Vero, LLCMK2, BSC-1)

ja

Hundezellen

(MDCK)

nein

Kaninchenzellen

(RK-13)

nein

Mauszellen

(L, L929, 3T3)

nein

Hamsterzellen

(BHK21)

nein

Hühnchenembryozellen

(CE)

nein

Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, induziert HE-IF einen antiviralen Zustand in Zellen aus Menschen und Affen.

(5) Antivirale Aktivität in verschiedenen Humanzellen Tabelle 5

Zellenart HE-IF-Aktivität

(Einheiten/ml)

Beispiel 1 Beispiel 3

HEL 18* 600*

HEL-R66 100 5000

FL (Zellenart aus Amnion) 400 20000

PHA 3500 500000

HEK (Humanembryo-Nieren-Zellen) 3300 350000

Die mit * markierten Werte wurden durch die CPE-Hemmethode erhalten, andere durch die Plaque-Reduktionsmethode (die Aktivität wird in Werten der IF-Verdünnung gezeigt, die 50% der VSV-Plaque-bildung in jeder Zelle hemmt, angegeben als eine Einheit/ml).

Wie oben gezeigt, weisen zu den Epithelzellen gehörende FL-Zellen eine 4mal grössere Aktivität auf, wogegen PHA eine 35- bis lOOmal grössere Aktivität aufweist, als sie bei Verwendung von zu den Fibroblasten gehörenden HEL-R66 bestimmt wird, was auf die spezifisch starke Aktivität der Epithelzellen hinweist.

(6) Die Hemmung der VSV-Multiplikation

Die spezifische Affinität von HE-IF für Epithelzellen wird auch durch das schnellere Auftreten eines antiviralen s

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Zustands in Epithelzellen als in Fibroblasten gezeigt. Das heisst, zu PHA-Zellen als Epithelzellen und HEL-R66-Zellen als Fibroblastenzellen wurden 7 Einheiten/ml oder 700 Einheiten/ml HE-IF zugegeben.

Nach 5 Minuten oder 360 Minuten wurden die Zellen gewaschen, um Interferon zu entfernen, und mit VSV (moi = 0,1 PFU/Zelle) infiziert (moi = «multiplicity of infection»).

Diesen Stufen folgte dann die Inkubation bei 37 °C. Das Überstandsmedium wurde nach 24 Stunden im Fall von HEL-R66-Zellen oder nach 48 Stunden im Fall von PHA-Zellen geerntet, und die VSV-Ausbeute des Überstands wurde unter Verwendung von HEL-R66-Zellen bestimmt. Das Verhältnis des infektiösen Titers, bestimmt relativ zur Virusausbeute in der Kontrolle ohne Zugabe von HE-IF, wurde berechnet und als Hemmgrad der Virusausbeute angegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, aus der ersichtlich ist, dass ein nur fünfminütiger Kontakt der PHA-Zellen mit HE-IF eine antivirale Aktivität für die Hemmung der Virusausbeute entfalten kann, die praktisch der gleich ist, die aus der Berührung von HEL-R66-Zellen mit HE-IF während 360 Minuten entsteht.

Da HE-IF eine höhere Affinität für Epithelzellen hat und die Aktivität daher schneller auftritt, konnte auch dann eine bemerkenswerte antivirale Aktivität festgestellt werden,

wenn HE-IF gleichzeitig mit der Virusinokulation angewendet wurde ohne vorherige Berührung mit den Zellen. Das heisst, PHA-Zellen, HEL-Zellen und HEL-R66-Zellen wurden mit einem Gemisch von VSV (moi = 0,1) und HE-IF (7, 70, 700 Einheiten/ml) während einer Stunde kontaktiert. Dann wurden die Zellen gewaschen, um HE-IF und nicht adsorbiertes VSV zu entfernen, wonach die Inkubation bei 37 °C während 48 Stunden für PHA-Zellen und während 24 Stunden für HEL-Zellen und HEL-R66-Zellen durchgeführt wurde. Die VSV-Ausbeute in jedem Überstand wurde unter Verwendung von HEL-R66 bestimmt, das Verhältnis, bezogen auf die Virusausbeute in der Kontrolle, in die kein HE-IF zugesetzt worden ist, wurde berechnet und als Hemmgrad der Virusausbeute angegeben.

Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, in der gezeigt wird, dass HE-IF wirkungsvoll die Virusausbeute hemmt, sogar dann, wenn es gleichzeitig mit der Virusinfektion auf PHA-Zellen angewendet wird.

Ausserdem konnte man eine bemerkenswerte antivirale Aktivität beobachten, wenn HE-IF nach der Infektion mit dem Virus ohne vorherigen Kontakt von HE-IF angewendet wurde.

Das heisst, PHA-Zellen, HEL-Zellen und HEL-R66-Zellen wurden jeweils mit VSV (moi = 0,1) inokuliert, und die entstandenen Zellen wurden 60 Minuten auf 37 °C gehalten, wodurch sie mit dem Virus infiziert wurden. Nach dem Waschen der Zellen, um nicht-adsorbiertes VSV zu entfernen, wurden die Zellen dann in die folgenden Gruppen zur Behandlung mit HE-IF (5 Einheiten bzw. 50 Einheiten) aufgeteilt.

1) Sie wurden sofort während 60 Minuten mit HE-IF behandelt, dann gewaschen, um HE-IF zu entfernen, und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.

2) Sie wurden 60 Minuten auf 37 °C gehalten, um ein Fortschreiten der Virusmultiplikation zu gewährleisten,

dann während 60 Minuten mit HE-IF behandelt, anschliessend gewaschen, um HE-IF zu entfernen, und schliesslich 24 Stunden bei 37 °C kultiviert.

3) HE-IF wurde sofort zu den Zellen zugegeben, dann, ohne Entfernung des HE-IF, wurde die Kultivierung während 24 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Jeder Überstand wurde zur Bestimmung der VSV-Ausbeute gesammelt, die unter Verwendung von HEL-R66-Zellen bestimmt wurde, und das Verhältnis, bezogen auf die Virusausbeute in der

646 875

Kontrolle, zu der kein HE-IF zugesetzt worden war, wurde berechnet und als Hemmgrad der Virusmultiplikation angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt, die beweist, dass HE-IF die Virusmultiplikation auch dann wirkungsvoll hemmt, wenn es 60 bis 120 Minuten nach Inokulation mit dem Virus in PHA-Zellen verwendet wird.

Tabelle 6

Anwendung von ange- Hemmung der VSV-Ausbeute

HE-IF (nach Infektion wendete (-LogI0PFU/ml)

mit VSV) Ein-

heiten

PHA-Zellen

HEL-Zellen

HEL-R66-Zellen

1) nur 60 Minuten

5

1,3

0

sofort nach

Infektion

50

2,5

0,1

0

2) nur 60 Minuten

5

1,4

0

nach 60 Minuten

50

2,7

0,1

3) 24 Stunden

5

1,7

0

sofort nach

Infektion

50

4,4

1,1

0,7

Das ist eine günstige Eigenschaft, wenn HE-IF als Medikament verwendet wird. Bisher gibt es keinen Bericht über ein Interferon, das eine solche Aktivität aufweist.

(7) Antigeneigenschaft

Die Spezifität des Interferons kann am positivsten durch den Unterschied in der Antigeneigenschaft angezeigt werden. Folglich wurde der Neutralisationstest, wie er in den folgenden Versuchsbeispielen angegeben ist, unter Verwendung von Anti-HF-IF-Serum und Anti-HL-IF-Serum durchgeführt. Für die Interferonproben als Antigene wurde HL-IF, hergestellt unter Verwendung von Humanleukozyten, HF-IF, hergestellt unter Verwendung von menschlichen Fibroblasten, und HE-IF, hergestellt unter Verwendung von Humanamnion, verwendet. Anderseits wurde als Antiserum für die entsprechenden Interferontypen (hochimmunes Kaninchenserum) ein Immunserum gegen HL-IF (im folgenden mit Anti-HL-IF-Serum bezeichnet) und Immunserum gegen HF-IF (im folgenden als Anti-HF-IF-Serum bezeichnet) verwendet.

Die antivirale Aktivität des Interferons wurde entsprechend der 50%igen Verminderung der VSV-Plaquebildung in FL-Zellen bestimmt. Für die Neutralisationstests wurden vier Serien von Vierfachserienverdünnungen des Immunserums (je 2 ml) hergestellt. Anderseits wurden Antigene, die je auf 10 Einheiten/ml eingestellt worden waren, für die entsprechenden Interferone hergestellt. Für Einzelheiten bezüglich der Methode zur 50%igen Verminderung der Plaquebil-dung wird auf William E. Steward II: The Interferon System, 1979, Springer-Verlag, Wien-N.Y. und R.R. Wagner: Virology 13, 323 (1961) verwiesen.

Zu den Verdünnungen für jedes Immunserum wurde HL-IF zu der ersten Serie, HF-IF zu der zweiten, HE-IF zu der dritten Verdünnung gegeben und das Verdünnungsmittel (MEM-Medium, das 0,5% Kälberserum enthält) in entsprechenden Mengen mit dem Immunserum vermischt. Anschliessend wurde jedes Gemisch in einem Wasserbad während 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das entstandene Gemisch wurde mit Verdünnungsmittel auf das 4-, 15- und 45fache verdünnt, alle Verdünnungen wurden in einer Menge von 1 ml zu FL-Zellen in einer Kunststoffplatte (12 Löcher mit flachem Boden) zugesetzt. Die Kultivierung wurde bei 37 °C über Nacht in einem C02-Inkubator durchgeführt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

646 875

Dann wurde die Kultur gut gewaschen, mit VSV (50 PFU/ Loch) inokuliert und 2 Tage bei 37 °C zur Bildung von Plaques weiter kultiviert. Nach der Zugabe von Neutralrot wurde die Anzahl der Plaques gezählt und die Aktivität des Serums (Verdünnung), die die antivirale Aktivität von 10 Einheiten Interferon zu neutralisieren vermag, wurde berechnet. Die Antigeneigenschaft wurde folglich aus der Endverdünnung des Immunserums für die entsprechenden Typen geschätzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Antikörper-Titer bei Neutralisation von Immunseren für die entsprechenden Typen

Anti-HL-IF-Serum Anti-HF-IF-Serum

HL-IF 30000 <250

HF-IF <250 20000

HE-IF <250 1000

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass HE-IF eine Reaktivität mit Antikörpern hat, die verschieden ist von den bekannten Interferonen HL-IF und HF-IF.

(8) Physikochemische Eigenschaften Das Molekulargewicht von HE-IF, das gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt worden ist, wurde durch die Gelfiltrationsmethode zu etwa 25 000 bestimmt und ist damit praktisch identisch mit dem von Chymotrypsi-nogen. Beim Messen des isoelektrischen Punkts mit der Methode der isoelektrischen Punkt-Elektrophorese wurde die Aktivität bei etwa pH 6 beobachtet.

(9) Adsorptionseigenschaften Das Interferon HF-IF wird stark an Glaswaren adsorbiert, und wenn eine HF-IF enthaltende Lösung wiederholt in neue Glasgefässe transferiert wird, so ist bekannt, dass die meiste Aktivität durch Adsorption an Glas verloren geht. Im Gegensatz dazu wird ein solches Phänomen im Fall von HE-IF nicht beobachtet, wie in Tabelle 8 unten gezeigt wird.

Tabelle 8

Anzahl der Transfers Restaktivität von HE-IF

(Einheiten/ml)

0 1500

1 1500

2 1500 4 1500 6 600

3. Quantitative Titration des Interferons der vorliegenden Erfindung

Um die starke virale Hemmwirkung des neuen Interferons HE-IF gemäss der vorliegenden Erfindung zu bestätigen, haben die Erfinder eine hochempfindliche Methode zur quantitativen Bestimmung von HE-IF unter Verwendung von primären Amnionzellen eingeführt.

Bisher wurden für quantitative Bestimmungen von Hu-maninterferonen FL-Zellen (Zellart aus Amnion) oder FS-Zellen (Fibroblasten aus menschlicher Vorhaut) verwendet, ohne die Spezifität von Interferon auf Zellen speziell zu beachten. In keinem Fall wurde ein Zellsystem verwendet, das speziell mit dem Interferon für eine quantitativere Bestimmung reagiert.

Die Erfinder haben ausgedehnte Studien über lange Zeit gemacht, um ein Zellsystem zu finden, das für eine quantitative Bestimmung der HE-IF-Aktivität geeignet ist. Es wurde dabei gefunden, dass PHA-Zellen, die durch Kultivierung von Einzelzellen hergestellt worden sind, die durch Behandlung von Amnion mit Trypsin erhalten worden sind, ein Zellsystem sind, das eine überraschend hohe Reaktivität mit HE-IF aufweist. VSV wurde als Virus verwendet. Während es keinen Bericht gibt über die Verwendung von PHA-Zellen zur Bestimmung von Interferon, können sie für eine neue Methode zur quantitativen Bestimmung der Interferonaktivität gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese quantitative Bestimmungsmethode wird unten in Einzelheiten beschrieben.

Ein frisches Amnion wird in Stücke geeigneter Grösse geschnitten, die dann in einem herkömmlichen Verfahren mit einer 0,25%igen Trypsinlösung behandelt und auf diese Weise in einzelne Zellen dispergiert werden. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 1000 UpM während 10 Minuten gesammelt und auf eine Konzentration von 10® Zellen/ml durch Verwendung eines Kulturmediums M 199, zu dem 20% Kälberserum zugesetzt worden sind, eingestellt. Die Zellsuspension wird dann zu je 1 ml in Löchern einer Kunststoffplatte, z.B. «Multi-well plate», 12 Löcher, mit flachem Boden; Linbro Sci. Co.) aufgeteilt. Die Platte wird in einen Kohlendioxidinkubator zur Kultivierung bei 37 °C während 4 bis 5 Tagen eingebracht, um Monoschichten zu bilden. Das Kulturmedium wird dann durch Aspiration entfernt und der Rückstand wird eingehend mit Hanks-Lösung gewaschen. Anschliessend wird eine Interferonprobe, die mit 2% Kälberserum enthaltendem M 199-Medium verdünnt ist, in jedes 1 ml/Loch eingebracht, und die Reaktion wird bei 37 °C ablaufen gelassen. Nach dem Entfernen durch Aspiration der Interferonprobe werden 0,5 ml/Loch mit VSV inokuliert. Das verwendete VSV wird durch Verdünnen mit M 199-Medium so eingestellt, dass es 50 Plaques/Loch bildet. Nachdem das VSV bei 37 °C während 60 Minuten adsorbiert worden ist, wird VSV durch Waschen entfernt, und das M 199-Medium (pH 7,2), das 2% Kälberserum enthält, und 1,0% Agar werden in jedes 1 ml/Loch eingebracht, wonach die Kultivierung bei 37 °C während 2 Tagen durchgeführt wird. In jedes Loch wird eine Neutralrotlösung (1:10 000) zugegeben. Die Anzahl an Plaques wird gezählt und die Interferonaktivität (Einheiten/ml) in Verdünnungen bestimmt, die die Plaques um 50% im Vergleich zur Kontrolle vermindern.

Wird die antivirale Aktivität von HL-IF oder HF-IF mit dieser Methode bestimmt, so ist nur eine Erhöhung der antiviralen Aktivität von 1,8- bis 2,3mal in den IF-Titern festzustellen, bestimmt durch Verwendung von FL-Zellen oder HEL-Zellen. Anderseits sind die unter Verwendung von PHA-Zellen bestimmten Werte von HE-IF 35- bis lOOmal so hoch wie die Werte, die unter Verwendung von HEL-Zellen oder HEL-R66-Zellen bestimmt wurden und auch 8- bis 20mal so hoch wie jene, die unter Verwendung von FL-Zellen bestimmt wurden.

Somit kann man sagen, dass diese Methode für die quantitative Bestimmung von HE-IF-Aktivität geeignet ist.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung von spezifischen Beispielen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Ein frisches menschliches Amnion wurde in Stücke von etwa 10 cm2 geschnitten und mit NDV-Suspension in einer Menge von 5 ml je 1 g Amnionstück in Berührung gebracht. Die verwendete NDV-Suspension enthielt 160 bis 320 HA-Einheiten/ml. Durch Schütteln bei 37 °C während 90 Minuten wurde NDV auf das Amnionstück adsorbiert. Dann wurde nur das Amnionstück in ein Kulturmedium in einer

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

646 875

Menge von 10 ml je 1 g Amnionstück übergeführt. Die Inkubation wurde dann bei 37 °C durchgeführt.

Als Kulturmedium wurde ein im Handel erhältliches M 199-Medium verwendet, es wurde kein Serum zugesetzt. In diesem Beispiel 1 wurden Versuche verglichen, bei denen 5 verschiedene Zusätze zugegeben worden sind und eine Kontrolle, zu der kein Zusatzmittel zugegeben worden ist.

Einige Zusätze wurden am Anfang der Inkubation zugegeben mit Probenentnahme des Kulturmediums nach 24 oder 48 Stunden, wogegen andere nach 24 oder 48 Stunden 10 nach Anfang der Inkubation zugegeben worden sind mit

Probenentnahme des Kulturmediums nach 48 oder 72 Stunden.

Die Kulturprobe wurde auf pH 2,0 mit In HCl eingestellt und unter Kühlen bei 4°C während 2 Tagen gelagert, um NDV zu inaktivieren. Dann wurde sie auf pH 7,0 mit In NaOH eingestellt und unter Einfrieren bei —70 °C gelagert. Die gefrorene Probe wurde unmittelbar vor der Bestimmung aufgetaut, um eine rohe HE-IF-Probe zu erhalten, deren Aktivität dann gemäss der oben beschriebenen Methode bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 unten angegeben.

Tabelle 9

Zusatz Konzentration Zeitpunkt Interferon-Aktivität (Einheiten/ml)

der Zugabe

24 h Kultivierung 48 h Kultivierung 72 h Kultivierung keiner

1,5 x 105

2,5 x IO5

2,2 x IO5

Coffein

20 ng/ml

Anfang

7,5 x 105

Xanthin lO-'mMol

Anfang

8,4 x 104

1,1 x IO6

3,8 x IO5

Alloxan

10"1 mMol

Anfang

3,8 x 105

8,4 x IO5

9,3 x 10s

Indolessigsäure

10-2mMol

Anfang

9,3 x 104

9,2 x IO5

6,5 x IO5

Indol

10~2 mMol

Anfang

4,1 x IO5

9,3 x IO5

9,0 x IO5

24 h

1,3 x IO6

3,8 x 10s

Barbital

10-1 mMol

Anfang

2,8 x IO5

7,0 x 10s

3,0 x IO5

Imidazol

10-1 mMol

Anfang

2,2 x IO5

3,8 x IO5

7,1 x IO5

Carbazol

10_I mMol

Anfang

2,3 x IO5

9,5 x IO5

2,0 x IO5

Amantadin

10"1 mMol

2,2 x IO5

1,4 x 10®

5,3 x IO5

ACTH

1 internationale

Anfang

7,5 x IO5

Einheit/ml

Insulin

1 internationale

24 h

1,5 x IO6

Einheit/ml

Beispiel 2

Wurden entsprechend Beispiel 1 mit NDV behandelte Amnionstücke bei 37 °C während 48 Stunden inkubiert und anschliessend weiter bei 27 °C während 72 Stunden inkubiert, dann wurde festgestellt, dass der HE-IF-Titer gestiegen war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten angegeben. Jedoch wurde keine deutliche Wirkung festgestellt, wenn die Inkubation bei 27 °C während 72 Stunden nach einer Inkubation bei 37 °C während 24 Stunden durchgeführt wurde.

Tabelle 10

Inkubations- Inkubations- Interferon-Aktivität (Einheit/ml) temperatur zeit (h)

24 h

48 h

72 h

37°C

0-

72

1,6 x IO5

2,8 x

IO5

2,1 x IO5

27°C

0-

72

2,1 x IO4

1,4 x

IO4

2,1 x IO4

37°C

0-

48

1,4 x IO5

2,8 x

IO5

-

27°C

48-

72

—

-

1,3x10«

37"C

0-

24

1,6 x IO5

-

2TC

24-

72

-

1,3 x

IO5

3 x IO4

Wurde die oben angegebene Inkubation unter Zugabe von Substanzen, wie Insulin, Indol, Alloxan, Indolessigsäu-re, Barbiturat, Amantadin, Imidazol, Carbazol, usw., durchgeführt, so wurde festgestellt, dass der HE-IF-Titer weiter verbessert ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben. Die Inkubation wurde bei 37 °C während 48 Stunden, dann aber bei 27 °C durchgeführt.

Tabelle 11

Zusatz Zugabezeit Interferon-Aktivität (Einheit/ml) 40 (Konz.) (h)

24 h

48 h

72 h keiner

1,4 x IO5

2,8 x IO5

1,3 x IO6

Insulin

0

1,9 x IO5

3,8 x IO5

2,9 x IO6

(1 U/ml)

24

4,3 x IO5

2,8 x IO6

Indol

0

4 x IO5

7,5 x IO6

9 x IO5

(IO-2 mMol

24

-

3,1 x IO6

6,3 x IO5

50 Beispiel 3

Ein frisches Amnion wurde in Stücke geeigneter Grösse geschnitten, die dann mit 0,25% Trypsinlösung in herkömmlicher Weise behandelt wurden, um sie in einzelne Zellen zu dispergieren.

55 Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1000 UpM während 10 Minuten gesammelt und in Kulturmedien suspendiert, die aus im Handel erhältlichem Eagle's MEM-Medium (kein Serum enthaltend) bestehen, denen 20 jag/ml Coffein zugesetzt worden sind bzw. kein solches Zusatzmit-60 tel zugegeben worden ist, wobei die Zellzahlen auf 4 x 107/ ml eingestellt wurden.

Zu den entstandenen Zellsuspensionen wurden gleiche Mengen an NDV-Suspensionen (160 bis 320 HA-Einheiten/ ml) zugegeben. Jedes Gemisch wurde dann bei langsamer 65 Geschwindigkeit bei 37 °C während 60 Minuten geschüttelt, um NDV auf die Amnionzellen zu adsorbieren.

Dann wurde jedes Testmedium so eingestellt, dass es 5 x 106 Zellen/ml enthielt, die Kultivierung wurde unter langsa

646 875

mem Schütteln bei 37 °C während 24 Stunden durchgeführt. Der Überstand wurde durch Zentrifugieren des Kulturmediums abgetrennt, auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 inaktiviert und unter Gefrieren gelagert. Das Produkt wurde als HE-IF-Probe zur Bestimmung der Interferonaktivität verwendet, die wie oben beschrieben durchgeführt wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Aktivität 6 x 104 Einheiten/ml bei Versuchen ohne Zusatz und 4,5 x 105 Einheiten/ml für Versuche mit Zusatz betrug.

Beispiel 4

Eine Amnionzellsuspension wurde gemäss der in Beispiel 2 beschriebenen Methode hergestellt. Die einzelnen Zellen des Amnions wurden durch Zentrifugieren bei 1000 UpM während 10 Minuten gesammelt. Die Zellsuspension wurde bei 3 x 106 Zellen/ml in ein Kulturmedium aufgeteilt, das ein im Handel erhältliches M 199-Medium (pH 7,0) war, dem 20% Kälberserum zugesetzt worden war. Während der Behälter mit einem Gummistopfen verschlossen wurde, wurde die Kultivierung bei 37 °C während 5 Tagen durchgeführt, um Monoschichten zu bilden. Nachdem das Medium durch Aspiration entfernt worden war, wurden die Kulturen mit 5 ml einer NDV-Suspension (160 bis 320 HA-Einheiten/ ml) inokuliert und 60 Minuten bei 37 °C stehengelassen, um das NDV auf die Amnionzellen in der Kultur zu adsorbieren. Nach Entfernen der NDV-Suspension wurden 7,0 ml eines im Handel erhältlichen M 199-Mediums (pH 7,2), das kein Serum enthielt, und das gleiche Medium, das 10% Kälberserum enthielt, zu den getrennten Kulturen zugegeben, und die Kultivierung wurde bei 37 °C während 24 Stunden durchgeführt. Die Kulturmedien wurden gesammelt, und jedes wurde unter Kühlen bei 1000 UpM während 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Diese Stufe wurde von einer Inaktivierung des NDV, die entsprechend Beispiel 1 durchgeführt wurde, gefolgt. Die Bestimmung der Interferonaktivität mit der oben beschriebenen Methode ergab 7,5 x 103 Einheiten/ml für das serumfreie Medium und 1,0 x 10s Einheiten/ml für das Medium, das 10% Kälberserum enthielt.

Beispiel 5

Das gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellte Kulturmedium (100 ml) wurde auf einer Kolonne adsorbiert, die mit 1 ml SP-Sephalose (Pharmaceia, Inc.) gepackt war, und, nach dem Waschen mit Wasser, mit einem Eluat (pH 8,3) eluiert, das 0,01m NaHP04 und 0,135m NaCl enthielt. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und die Interferonaktivität des Kulturmediums wurde auf 104 Einheiten/ml festgestellt, bestimmt mit einer Methode der 50%igen Verminderung von VSV-Plaquebildung, wobei FL-Zellen verwendet wurden. Die spezifische Aktivität des Kulturmediums, das 700 (xg/ml Proteine enthielt, betrug 1,4 x 104 Einheiten/mg Protein, während die des Eluats auf 2,1 x 10s Einheiten/mg Protein erhöht werden konnte, d.h. das 15fache der ersteren.

Beispiel 6

Das in Beispiel 4 verwendete Kulturmedium (100 ml) wurde auf einer Säule adsorbiert, die mit 1 ml Blue Sephalo-se (Pharmaceia, Inc.) gepackt war, und mit einem Gemisch eluiert, das gleiche Mengen einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,02m NaHP04 und 1,0m NaCl, und von Äthylengly-kol bei pH 7,2 enthielt. Dieser Elution folgte das Sammeln der aktiven Fraktionen.

Gemäss dieser Massnahme stieg die spezifische Aktivität auf etwa das 70fache des Wertes vor der Massnahme, d.h., auf 1,0 x 106 Einheiten/mg Protein, bestimmt mit der gleichen Methode wie in Beispiel 4.

Wie aus dem Vorhergehenden ersichtlich ist, ist das Interferon gemäss der vorliegenden Erfindung, das aus menschlichem Amnion stammt, sehr stabil und ausserdem hat es eine hohe Aktivität zur Hemmung der Virusausbeute, und deshalb kann man erwarten, dass es grosse Verwendungsmöglichkeiten hat, insbesondere für solche Krankheiten, wie Virusinfektionskrankheiten und bösartige Tumore, deren Ursprünge in den Epithelzellen gefunden werden können.

Insbesondere ist ein typisches Beispiel von Humanepithelzellen, nämlich das Amnion, relativ leicht erhältlich und kann dazu verwendet werden, ein Interferon mit hohem Titer zu produzieren.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

S

2 Blatt Zeichnungen

Claims

646875

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gewinnung eines Interferons, dadurch gekennzeichnet, dass menschliche Epithelzellen mit einem Interferon-Inducer in Berührung gebracht werden und dann in einem Kulturmedium inkubiert werden, um ein Interferon, das eine starke antivirale Aktivität in menschlichen Epithelzellen aufweist, zu produzieren.
2. Verfahren zur Gewinnung eines Interferons gemäss Anspruch 1, in dem die menschlichen Epithelzellen menschliche Amnionzellen, Epithelzellen aus menschlicher amniotischer Flüssigkeit oder Epithelzellen aus Humannieren sind.
3. Verfahren zur Gewinnung eines Interferons gemäss Anspruch 1, in dem der Interferon-Inducer ein Virus ist.
4. Verfahren zur Gewinnung eines Interferons gemäss Anspruch 1, in dem dem Medium ein schleimabsonderndes Hormon, Insulin, Kaffein, Xanthin, Alloxan, Indol, Indoles-sigsäure, Barbiturat, Amantadin, Imidazol oder Carbazol zugesetzt wird.
5. Verfahren zur Gewinnung eines Interferons gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die Inkubation bei 37 °C während 38 bis 58 Stunden und danach bei 27 + 2 °C durchgeführt wird.
6. Interferon, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.