CH648291A5 - Composto ammidico e procedimento per la sua utilizzazione nel saggio per leucina amminopeptidasi. - Google Patents
Composto ammidico e procedimento per la sua utilizzazione nel saggio per leucina amminopeptidasi. Download PDFInfo
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- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
- C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
- C07D209/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D209/20—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals substituted additionally by nitrogen atoms, e.g. tryptophane
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Description
La presente invenzione riguarda un composto ammidico con formula:
-RrCH-CO-R2 [II
I
NHa dove Rj è un gruppo alchile inferiore eRjèun gruppo metilammino sostituito o un gruppo D-ammino acido residuo o sale relativo ed il metodo di saggio per leucina amminopeptidasi che utilizza detto composto ammidico.
Leucina amminopeptidasi [a-amminoacil-peptide idro-lasi (citosolo), EC 3. 4. 11. 1., di seguito indicato con LAP; nel passato conosciuto come L-leucilpeptide idrolasi, EC 3. 4. 1. 1.] è distribuito in ogni tessuto e nel siero ed è noto per incrementare nelle condizioni di malattia. Il saggio LAP viene utilizzato nella diagnostica clinica in varie affezioni e controlli nella prognosi.
L'analisi nella chimica clinica di LAP è definita quale unità G-R (Goldbarg Rutenburg). L'unità G-R = 2,72 X unità internazionale LAP (mU/ml). [Cancer. 11, 283 (1958)].
È noto un certo numero di metodi di saggio di LAP. Tuttavia ciascuno di questi metodi presenta degli svantaggi. I metodi di saggio convenzionali sono del tipo colorimetrico del composto amminico prodotto mediante azione enzimatica su un substrato sintetico consistente di L-leucina e del composto amminico. Quando il substrato sintetico come L-leucina-p-nitroanidide viene sottoposto ad incubazione con LAP, ima lunghezza d'onda del colore giallo della p-ni-troanilina formata mediante azione enzimatica, si sovrappone nel saggio colorimetrico ed inoltre la composizione del siero, specialmente il pigmento bilirubina, influenza la colorimetria. Inoltre quando L-leucina-ß-naftilammide viene utilizzata quale substrato, il colore formato viene misurato colorimetricamente ad esempio la ß-naftilammina formata con 5-nitro-2-amminometossibenzene diazotato; accoppiando la ß-naftilammina diazotata mediante sodio nitrato con N-(l-naftil)-etilendiammina; o condensando ß-naftilammina con p-dimetilammino benzaldeide o p-dimetilammino cinnamaldeide. Questi metodi di saggio colorimetrici presentano un certo numero di svantaggi come i procedimenti complessi di reazione e la rigorosità delle operazioni. Inoltre la ß-naftilammina formata presenta una tossicità elevata ed effetti carcinogeni per la vescica urinaria.
Un altro metodo di saggio enzimatico per l'attività LAP è quello in cui L-leucinammide viene utilizzata quale substrato per LAP e l'ammoniaca formata viene sottoposta ad incubazione con a-chetoglutarato glutammato deidrogenasi e NADH2 per la trasformazione dell'acido glutammico,
quindi NADH2 ossidato viene misurato spettrofotometricamente. Quando viene utilizzato il substrato L-leucil-ala-nina, L-alanina liberata mediante LAP viene sottoposta ad incubazione con a-chetoglutarato e con transamminasi glu-tammico-piruvico per formare l'acido piruvico che viene convertito in acido lattico mediante lattato deidrogenasi, NADH, consumato essendo sottoposto a saggio spettrofotometrico. Sono noti anche altri metodi di saggio che utilizzano L-leucina deidrogenasi. L-leucina liberata da L-leucil--glicina mediante LAP viene sottoposta ad incubazione con L-leucina deidrofenasi, quindi viene misurata spettrofoto5
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metricamente con NADE^ (domanda di brevetto giapponese posta a disposizione del pubblico N. 54-119290). Inoltre L-leucinammide viene utilizzata quale substrato e L-leucina formata viene sottoposta ad incubazione con L-ammi-noacido ossidasi per liberare acqua ossigenata che viene sottoposta a saggio colorimetrico [Pharmacia, 14, 872 (1978)].
Questi metodi di saggio enzimatico della tecnicta nota, presentano un certo numero di svantaggi. Ad esempio il sistema di reazione enzimatico è complicato ed il pigmento bilirubina oppure il siero emulsionato influenzano il saggio colorimetrico. Nel metodo di saggio che utilizza L-ammino-acido ossidasi, L-amminoacido nel sangue inibisce il saggio di L-leucina liberata da LAP, inoltre la quantità di L-am-minoacido nel sangue non è costante, ciò che provoca inconvenienti nel saggio.
Si è trovato che LAP idrolizza il substrato sintetizzato da metilammina sostituita, che non esiste nel sangue, come benzilammina, tirammina o butilammina oppure D-amminoacido come D-metionina o D-leucina e L-leucina o L-ala-nina con liberazione con buone rese di metilammina sostituita, come tirammina o D-amminoacido. La metilammina sostituita liberata o D-amminoacido liberato vengono ossidati mediante il corrispondente ossidasi e viene misurata la quantità di ossigeno consumato o acqua ossigenata liberata, saggiando così l'attività di LAP. Si è inoltre trovato un nuovo ed utile substrato sintetico, composto ammidico con formula (I):
-RrCH-CO-R2 [I]
nh2
dove ri e r2 hanno il significato già indicato.
Una attuazione del substrato sintetico consiste nel composto ammidico con formula (I), che viene sintetizzato da L-leucina o L-alanina e da metilammina sostituita o D-am-mino, dove Rt è un alchile inferiore come il gruppo isobutile o metile e R2 è un gruppo metilammino sostituito con formula (II):
-NH-CH2-CH3 [II]
dove R, è un gruppo organico, oppure Rj è un residuo D-amminoacido con formula (III):
* R4
-NH-CHc; [IH]
r5
dove uno tra R4 e R5 è il gruppo carbonile, l'altro essendo *
un residuo organico e C è un atomo di carbonio D-asimme-trico. Esempi di gruppi organici R3 sono i gruppi metile, etile, n-propile, isopropile, n-butile, amile, p-idrossibenzile, 3,4-diidrossibenzile, 5-imidazolmetile, 3-indolmetile o fenile. Esempi di gruppi R4 e Rs sono quelli in cui R4oR5è il gruppo carbossile e l'altro gruppo è il gruppo metiltioetile, isobutile, metile o fenile. Esempi di metilammina sostituita o D-amminoacido sono etilammina, n-propilammina, n-bu-tilammina, iso-butilammina, istammina, triptammina, benzilammina, D-metionina, D-Ieucina, D-alanina o D-fenil-glicina.
Attuazioni di dette ammine sostituite sono composti consistenti di L-leucina e di metilammina sostituita come L-leucina-benzilammide, L-leucina-p-idrossifeniletilammide, L-leucina-n-butilammide, un composto consistente di L-leucina e D-amminoacido come -L-leucil-D-metionina e -L-leu-cil-D-leucina, oppure un composto consistente di L-alanina e metilammina sostituita come L-alanin-p-idrossifeniletilam-mide. Queste ammine sostituite possono essere utilizzate sotto forma di sale solubile come cloridrato, bromidrato, fosfato, formiate, acetato, propionato o ossalato.
Un composto ammidico della presente invenzione può essere prodotto mediante una sintesi convenzionale del pep-tide, ivi compresa la protezione e l'allontanamento del gruppo protettivo e la reazione di condensazione.
Esempi di gruppo protettivo per il gruppo a-ammino in L-amminoacido, come L-alanina e L-leucina, con formula (IV)
rj-ch-cooh [IV]
nh2
dove Rj ha il significato già indicato, sono gruppi protettivi convenzionali come i gruppi t-butossicarbonile, t-amilossi-carbonile, adamantillossi-carbonile, benzilossicarbonile, o-ni-trofeniltio o benzilossi-carbonile nitro-sostituito. Il gruppo carbonile può essere trasformato nella forma attivata come acido-azide, anidride mista, acido-imidazolide o estere attivato, ad esempio estere cianometilico, estere p-nitrofenilico, estere 2,4-dinitrofenilico, estere N-idrossisuccinimidico, o estere N-idrossiftalimmidico, oppure può essere attivato mediante l'uso di carbodiimmide, N,N'-carbonildiimidazolo o sale di isossazolo mediante il reattivo di Woodward. Queste forme attivate di L-amminoacido vengono fatte reagire con il composto metilammina sostituita o con D-ammino-acido, mediante reazione di condensazione come il metodo della carbodiimmde, con il metodo dell'estere attivato o con il metodo dell'anidride dell'acido. La reazione viene condotta in un solvente inerte come ad esempio dimetil-formammide, dimetilacetammide, dimetilsolfossido e tetra-idrofurano, con rapporto equimolecolare dei composti, ad una temperatura tra — 30°C e ambientale, sotto agitazione. La reazione termina nell'ambito di 5-50 ore. Si può quindi allontanare il gruppo protettivo. Il gruppo t-butossicarbonile può essere allontanato mediante acido trifluoroacetico ed il gruppo benzilossicarbonile viene allontanato mediante riduzione catalitica con palladio su carbone. Il prodotto può essere purificato mediante estrazione, lavaggio, cromatografia o cristallizzazione. Il prodotto così ottenuto viene trasformato nel suo sale, ad esempio un sale inorganico come cloridrato, bromidrato o fosfato, oppure in un sale di acido organico come formiate, acetato, propionato o ossolato.
L'ossidasi corrispondente alla metilammina sostituita e al D-amminoacido liberato per azione di LAP, sul substrato sintetico sopra indicato della presente invenzione è almeno un enzima che idrolizza detta metilammina sostituita o D-amminoacido quale substrato per consumare ossigeno e liberare acqua ossigenata nella reazione enzimatica. Esempi dell'enzima per la metilammina sostituita sono ammina ossidasi come monoammina ossidasi, diammina ossidasi o poliammina ossidasi ed un enzima per D-amminoacido è D-amminoacido ossidasi. Questi ossidasi non sono così limitati, tuttavia monoammina ossidasi è un enzima ottenuto dal siero porcino o bovino e Aspergillus niger; tirammina ossidasi è un enzima di Sorcina lutea IAM 1099 [Biochem. Biophys. Res. Commn., 27, 350 (1967), Methods in Enzy-mology, 17, 722 (1971)]; e D-amminoacido ossidasi è un enzima proveniente dai tessuti animali o da Trigonopsis variavillis.
Questi ossidasi possono essere utilizzati nella forma immobilizzata. L'enzima immobilizzato può essere assemblato in un analizzatore automatico e viene utilizzato in combinazione con un elettrodo ad ossigeno o con un elettrodo ad acqua ossigenata. La forma immobilizzata presenta i vantaggi di ridurre la quantità di enzimi pregiati e costosi.
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Il sensore provvede alla combinazione dell'enzima immobilizzato dell'elettrodo con enzima e gli elettrodi sopra indicati possono essere utilizzati per una misura rapida e multipla senza i vari reagenti. Il sensore può anche vantaggiosamente essere utilizzato in campioni colorati per il saggio dell'attività LAP.
L'enzima immobilizzato può essere preparato mediante tecniche di immobilizzazione note, ad esempio bloccandolo con acrilammide, reticolandolo con proteine mediante miscelazione con albumina, bloccandolo con collagene e fibroina o collegandolo covalentemente ad essi, mediante adsorbimento o legame covalente con polimeri organici porosi o bloccandolo mediante sostanze fotoresistenti. Questi enzimi immobilizzati vengono trasformati in membrana, in forme fibrose, in granuli o in tubi adatti per gli elettrodi con enzima.
Viene ora descritta una attuazione del saggio di attività LAP. Una aliquota a concentrazione della soluzione del substrato sintetico viene sottoposta ad incubazione con un campione di sangue LAP come ad esempio siero in tampone. L'incubazione viene condotta a 37°C. Il tempo di incubazione non è limitato ed è preferibilmente pari al tempo atto a liberare l'ammina sostituita o D-amminoacido dal substrato sintetico mediante LAP. La metilammina sostituita così liberata o D-amminoacido viene ossidata dal corrispondente ossidasi così da consumare l'ossigeno o liberare l'acqua ossigenata. La reazione viene fatta continuare mediante aggiunta della corrispondente soluzione dell'ossidasi o per contatto della miscela di reazione con l'ossidasi immobilizzato a 37°C. L'ossigeno così consumato o l'acqua ossigenata consumata, viene preferibilmente misurato mediante un elettrodo ad ossigeno oppure mediante un elettrodo ad acqua ossigenata. Questo saggio viene convenientemente condotto mediante l'elettrodo con enzima comprendente una combinazione dell'enzima immobilizzato e dell'elettrodo. Il segnale di uscita viene registrato oppure rivelato quale variazione elettrica per la conversione nell'attività LAP. La quantità di acqua ossigenata viene misurata convenzionalmente mediante un reagente per la colorazione, consistente di 4-ammino antipirina, fenolo o perossidasi, oppure mediante un reagente luminescente come luminolo.
Una attuazione del sistema di saggio dell'attività LAP, è un sistema di reazione-determinazione comprendente l'iniezione del reattivo che misura l'attività LAP, della soluzione del substrato e del tampone in un recipiente di reazione LAP nel quale viene liberata la metilammina sostituita o D-amminoacido dal substrato sintetico, l'ossidare la metilammina sostituita formata o D-amminoacido con il corrispondente ossidasi ed il determinare la quantità di ossigeno o di acqua ossigenata.
Nel sistema di reazione-determinazione, la parte della colonna dell'enzima immobilizzato dell'ossidasi e la parte dell'elettrodo di determinazione possono preferibilmente essere separate, oppure costruite unitariamente quale elettrodo con enzima nel quale l'enzima immobilizzato è collegato al rivelatore dell'elettrodo. Il sistema di saggio può essere un sistema di reazione-determinazione multiplo nel quale, ad esempio, il campionamento viene effettuato tramite reattori multipli LAP per l'iniezione nel reattore di reazione-determinazione, facendo seguire le determinazioni ed i lavaggi.
Negli esempi viene riportato un sistema di saggio che utilizza l'elettrodo ad ossigeno, tuttavia secondo la presente invenzione può essere vantaggiosamente utilizzato l'elettrodo ad acqua ossigenata.
Il metodo di saggio LAP della presente invenzione è un sistema di saggio molto semplice, rapido e riproducibile e molto utile nelle diagnosi cliniche.
Le abbreviazioni nella presente descrizione hanno il significato seguente:
Boc: t-butossicarbonile HOSu: N-idrossisuccinimmide OSu: N-idrossisuccinimmide estere DCC: N,N'-dicicloesilcarbodiimmide THF: tetraidrofurano DCU: N,N'-dicicloesilurea DMF: dimetilformammide NMM: N-metilmorfolina TFA: acido-trifluoroacetico Z: benzilossicarbonile
Gli esempi che seguono illustrano la presente invenzione senza constituirne limitazione.
Esempio 1
L-Leu-NH-CH2-C6HS (L-leucina-benzilammide)
Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) e benzilammina (1,07 g,
10 mM) disciolti in DMF (30 mi) furono aggiustati a pH 7 mediante aggiunta di NMM e sottoposti ad agitazione per una notte alla temperatura ambiente. DMF fu distillata ed
11 residuo fu disciolto in acetato di etile. La soluzione fu lavata 3 volte con soluzione di sodio bicarbonato al 5% peso/ peso, 2 volte con HCl IN e 2 volte con acqua, disidratata con solfato di sodio e fu quindi distillato l'acetato di etile.
Il residuo fu caricato in una colonna a gel di silice (100 g) e fu eluito con benzene, acetato di etile (1:1) per ottenere Boc-Leu-NH-CH2-CGH5 (1,3 g).
Detto composto (1,2 g) disciolto in TFA (3 mi) fu sottoposto ad agitazione per 30 minuti. Dopo distillazione di TFA, il residuo fu disciolto in acido acetico 0,1 N. La soluzione fu caricata in una colonna di Sephadex LH-20 (97,0 X 3,0 cm) e frazionata in frazioni di 6,3 mi ciascuna. Le frazione N. 28-36 furono raccolte e liofilizzate per ottenere L-leucina-benzilammide acetato (900 mg).
Resa: 32,1% (acetato)
Formula molecolare: C13H20N2O . CH3COOH Analisi elementare:
Calcolato: % C 64,26 H 8,63 N 9,99 Trovato: % C 64,22 H 8,68 N 10,01 Valore Rf: piatto gel di silice (n-butanolo: acido acetico:
acqua = 3:1:1) Rf 1 0,80.
IR (Nujol): 1690, 1620 cm"1 (-CO-NH-)
Esempio 2 L-Leu-D-Met-OH-(L-leucil-D-metionina)
D-Met-OH (1,4 g, 10 mM) e sodio bicarbonato (1,68 g, 20 mM) furono aggiunti ad una miscela di acqua (15 mi) e DMF (5 mi). Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) in DMF (30 mi) fu aggiunto e si sottopose ad agitazione per una notte alla temperatura ambiente. Dopo raffreddamento a 0°C, il pH fu aggiustato al valore di 6,5 mediante HCl IN e si sottopose a concentrazione sottovuoto. Il residuo fu disciolto in acetato di etile -HCl IN (50 ml-50 mi). Lo strato dell'acetato di etile fu lavato con acqua, essiccato per aggiunta di solfato di sodio e fu distillato l'acetato di etile. Il residuo fu caricato in una colonna di gel di silice (100 g) ed eluito con benzene-acetato di etile (1:1) per ottenere Boc-Leu-D-Met-OH (1,6 g).
Il prodotto (1,5 g) fu disciolto in TFA (4 mi) e fu sottoposto ad agitazione alla temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo distillazione di TFA, il residuo fu disciolto in acido acetico 0,1N e caricato in una colonna di Sephadex s
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LH-20 (97,0 X 3,0 cm) per frazionare in frazioni di 6,3 mi ciascuna.
Le frazioni N. 28-36 furono raccolte e liofilizzate per dare L-leucil-D-metionina acetato (1,3 g).
Reso: 40,4%
Formula molecolare: CnH22N2S03 . CH3COOH Analisi elementare:
Calcolato: % C 48,43 H 8,13 N 8,69 S 9,94 Trovato: % C 48,40 H 8,15 N 8,65 S 9,95 Valore di Rf: piatto di gel di silice (n-butanolo: acido acetico: acqua = 3:1:1), Rf = 0,50 IR (Nujol): 1687, 1620 cm"1 (-CO-CH-)
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Resa: 32,5% (acetato)
Formula molecolare: C10H22N2O . CH3COOH Analisi elementare:
Calcolato: % C 58,5 H 10,6 N 11,4 Trovato: % C 58,4 H 10,58 N 11,4 Valore di Rf: piatto di gel di silice (n-butanolo: acido acetico: acqua = 3:1:1), Rf = 0,52 IR (Nujol): 1690, 1620 cm"1 (-CO-NH-)
Esempio 5 L-leucina-p-idrossifeniletilammide
Esempio 3
L-Leu-NH-CH2-CH2-CeHs-OH (L-leucina-p-idrossifenil-etilammide)
Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) e tirammina (1,37 g, 10 mM) disciolti in DMF (30 mi) furono aggiustati a pH 7 mediante NMM a 0°C e furono sottoposti ad agitazione per una notte alla temperatura ambiente. Dopo distillazione di DMF, il residuo fu disciolto in acetato di etile (50 mi), lavato tre volte con soluzione di sodio bicarbonato al 5 % peso/peso, 2 volte con HCl IN e due volte con acqua, quindi fu essiccato per aggiunta di solfato di sodio.
Dopo distillazione dell'acetato di etile, il residuo fu caricato in una colonna di gel di silice (100 g), eluito con ben-zene-acetato di etile (1:1) per ottenere Boc-Leu-NH-CH2--CH2-C6H4-OH (1,58 g).
Il composto (1,4 g) fu disciolto in TFA (5 mi), agitato per 30 minuti alla temperatura ambiente e si distillò quindi TFA. Il residuo disciolto in acido acetico 0,1N fu caricato in una colonna di Sephadex LH-20 (97,0 X 3,0 cm) per frazionare frazioni di 6,3 mi ciascuna. Le frazioni N. 30-38 furono raccolte e liofilizzate per dare L-Ieucina-p-idrossife-niletilammide acetato (1,25 g).
Resa: 40,3% (acetato)
Formula molecolare: C14H22N202. CH3COOH
Analisi elementare:
Calcolato: % C 61,92 H 8,44 N 9,03
Trovato: % C 61,90 H 8,45 N 9,02
Valore di Rf: piatto di gel di silice (n-butanolo: acido acetico: acqua = 3:1:1), Rf = 0,75
IR (Nujol): 1685, 1615 cm"1 (-CO-NH-)
Esempio 4
L-Leu-NH-(CH2)3-CH3 (L-leucina-n-butilammide)
Boc-Leu-OH (2,5 g, 10 mM), n-butilammina (1 mi, 1 mM) e 1-idrossibenzotriazolo (2,7 g) furono disciolti in THF (25 ml) e raffreddati in un bagno a ghiaccio. Carbo-diimmide (1,83 ml, 1 mM) solubile in acqua fu aggiunta e si sottopose ad agitazione per una notte. Dopo distillazione THF, il residuo fu disciolto in acetato di etile (50 mi) che fu lavato tre volte con soluzione di sodio bicarbonato al 5 % peso/peso, due volte con HCl IN e due volte con acqua, quindi essiccato con solfato di sodio e quindi fu distillato l'acetato di etile. Il residuo fu caricato in una colonna a gel di silice (100 g) ed eluito con benzene-acetato di etile (1:1) per ottenere Boc-Leu-NH-(CH2)3 (1,4 g).
Il composto (1,2 g) fu disciolto in TFA (3 mi), agitato per 30 minuti alla temperatura ambiente e quindi fu distillato TFA. Il residuo disciolto in acido acetico 0,1N fu caricato in una colonna di Sephadex LH-20 (97,0 X 3,0 cm) e frazionato in frazioni di 6,3 mi ciascuna. Le frazioni N. 30-35 furono raccolte e liofilizzate per ottenere L-leucina-n-butilammide acetato (800 mg).
Boc-Leu-OH . H20 (49,9 g, 0,2 M) e HOSu (23,0 g, 0,2 M) furono disciolti in THF (300 ml) in un pallone da 15 11t. a fondo arrotondato. DCC (41,3 g, 0,2 M) in soluzione di THF (200 ml) fu aggiunto goccia a goccia a — 10°C per circa 10 minuti e si sottopose ad agitazione alla temperatura ambiente per una notte. DCU precipitato fu filtrato ed il filtrato fu concentrato. Il residuo fu disciolto in ace-20 tato di etile (300 mi), lavato con HCl IN, con soluzione di NaCl e con una piccola quantità di acqua ed essiccato con solfato di sodio anidro. Dopo allontanamento dell'agente essiccante, la soluzione fu concentrata e fu aggiunto n-esa-no per ottenere Boc-Leu-OSu sotto forma di polvere inco-25 lore (punto di fusione 106-110°C, 59,11 g, resa: 90%).
A tirammina (1,51 g, 11 mM) disciolta in DMF (15 mi) furono aggiunti Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) e DMF (5 mi) e si agitò in condizioni di neutralizzazione mediante aggiunta di NMM per una notte. DMF fu distillata sotto-30 vuoto e fu aggiunto acetato di etile (100 mi) al residuo, si lavò quindi con soluzione di bicarbonato di sodio al 5 % peso/peso, con una soluzione di NaCI, con HCl IN, con soluzione di NaCl e con una piccola quantità di acqua e si essiccò su solfato di sodio anidro. L'agente essiccante fu 35 allontanato e la soluzione fu concentrata. Fu aggiunto al residuo n-esano per ottenere la precipitazione di una polvere (3,01 g). Dopo essicamento la polvere fu disciolta in diossano (5 mi), e si aggiunse quindi HCl 4,3 N in diossano (acido cloridrico anidro assorbito in diossano) (5 ml), a 5°C 40 e si agitò per due ore alla temperatura ambiente. Furono distillati sotto vuoto l'acido cloridrico ed il diossano. Fu aggiunto al residuo oleoso n-esano a 0°C per ottenere il precipitato. Il precipitato fu essiccato sotto vuoto per dare L-leucina-p-idrossifenietilammina. HCl in polvere (2,23 g). Resa: 78,0% (da Boc-Leu-OSu)
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Formula molecolare: C14H22N202. HCl
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Analisi elementare:
Calcolato: % C 58,63 H 8,08 N 9,77 Trovato: % C 58,35 H 8,23 N 9,50 Punto di fusione: 125-130°C Spettro IR: Fig. 8
TLC: piatto di gel di silice (Merck, N. 5715)
sviluppatore: (n-butanolo: piridina: acido acetico glaciale: acqua = 15:10:3:12).
ss RF = 0,70
Esempio 6 L-leucina-p-idrossifeniletilammide
60 Etilcloroformiato (0,94 mi, 10 mM) fu aggiunto a Z-Leu-OH (2,7 g, 10 mM) e NMM (1,0 g, 10 mM) disciolti in THF (30 ml) a —20°C si agitò a — 15°C per due minuti. Tirammina (1,4 g, 10 mM) in DMF (20 mi) fu aggiunta e si sottopose ad agitazione alla temperatura ambiente per una not-65 te. Il solvente fu allontanato sottovuoto, fu aggiunto acetato di etile (100 mi) e si sottopose a lavaggio con soluzione di citrato al 10%, con bicarbonato di sodio acquoso al 5% peso/peso e con acqua e si essiccò con solfato di sodio
648 291
6
anidro. Dopo allontanamento dell'agente di essiccamento, fu aggiunto n-esano al residuo oleoso. Il precipitato fu ricristallizzato da acetato di etile-n-esano per dare una polvere bianca (3,0 g, 78%). La polvere fu disciolta in etanolo acquoso al 50% volume/volume (600 mi), fu aggiunto carbone palladiato al 5% peso/peso (600 mi) e HCl IN acquoso (5 mi) e fu introdotto idrogeno gassoso, agitando alla temperatura ambiente. Quando fu cessato lo sviluppo di anidride carbonica, il catalizzatore fu allontanato ed il filtrato fu concentrato. Il prodotto oleoso incoloro fu essiccato per dare L-leucina-p-idrossifeniletilammide. HCl (1,8 g, 62,7%).
Esempio 7 L-leucina-p-idrossifeniletilammide
Boc-Leu-OSu (3,28 g, 10 mM) e si tirammina (1,37 g, 10 mM) furono disciolti in DMF (30 mi), si aggiustò il pH a 7 mediante aggiunta di NMM e si agitò alla temperatura ambiente per una notte. Dopo allontanamento di DMF, il residuo fu disciolto in acetato di etile (50 mi) e fu lavato tre volte con bicarbonato di sodio acquoso al 5 % peso/peso, due volte con HCl IN, due volte con acqua e solfato di sodio. L'acetato di etile fu allontanato ed il residuo fu caricato in una colonna a gel di silice (100 g), quindi eluito con benzene-acetato di etile (1:1) per ottenere Boc-Leu-NH-CH2-CH2-C6H4-OH (1,59 g). Il composto (1,4 g) fu disciolto in acido trifluoroacetico (5 mi), agitato per 30 minuti alla temperatura ambiente e si allontanò l'acido trifluoroacetico. Il residuo fu disciolto in acido acetico 0,1N e fu caricato in una colonna di Sephadex LH-20 (97,0 X 3,0 cm) e fu quindi frazionato in frazioni di 6,3 mi ciascuna. Le frazioni N. 30-38 furono raccolte e liofilizzate per dare L-leucina-p-idrossifeniletilammide acetato [1,25 g, resa 40,3%, formula molecolare: C14H22N202. CH3COOH, TLC: (piatto di gel di silice, n-butanolo: acido acetico: acqua = 3:1:1), Rf = 0,75].
Esempio 8 L-alanìna-p-idrossifeniletilammina
Boc-Ala-OH (37,8 g, 0,2 M) e HOSu (23,0 g, 0,2 M) furono dissolti in THF (300 ml) in un pallone da 1 litro a fondo arrotandato. DCC (41,3 g, 0,2 M) in soluzione di THF (200 ml) fu aggiunto goccia a goccia a — 10°C, per circa 10 minuti e si agitò alla temperatura ambiente per una notte. DCU precipitato fu filtrato ed il filtrato concentrato. Il residuo fu disciolto in acetato di etile (300 mi), lavato con HCl IN, con soluzione di NaCl e con una piccola quantità di acqua ed essiccato con solfato di sodio anidro. Dopo allontanamento dell'agente essiccante, la soluzione fu concentrata e fu aggiunto ad essa n-esano per ottenere una polvere incolore (52,7 g, punto di fusione 140-143°C, resa: 91%).
Boc-Ala-OSu (2,86 g, 10 mM) e DMF (5 mi) furono aggiunti a tirammina (1,51 g, 11 mM) disciolta in DMF (20 mi) e si agitò in condizioni di neutralizzazione mediante aggiunta di NMM per una notte. Fu distillata DMF sottovuoto e fu aggiunto al residuo acetato di etile (100 mi), quindi si lavò con soluzione di bicarbonato di sodio al 5 % peso/ peso, con soluzione di NaCl, con HCl IN, con soluzione di NaCl e con una piccola quantità di acqua e si essiccò con solfato di sodio anidro. L'agente di essiccamento fu allontanato e la soluzione fu concentrata. Fu aggiunto n-esano al residuo oleoso per ottenere una polvere (2,55 g).
La polvere fu disciolta in diossano (5 mi) e fu aggiunto HCl 4,3 N in diossano (5 ml) a 5°C, quindi si agitò alla temperatura ambiente. L'acido cloridrico ed il diossano furono distillati sottovuoto. Fu aggiunto n-esano al residuo oleoso a 0°C per ottenere il precipitato. Il precipitato fu essiccato sottovuoto per dare una polvere L-alanina-p-idros-sifeniletilammide. HCl (1,81 g).
Resa: 74,0% (da Boc-Ala-OSu)
Formula molecolare: CnH16N202 . HCl
Analisi elementare:
Calcolato: % C 53,99 H 6,95 N 11,45
Trovato: % C 53,78 H 7,11 N 11,23
Punto di fusione: 105-110°C
Spettro IR: Fig. 9
TLC: piatto di gel di silice (Merck, N. 5715)
sviluppatore (n-butanolo: piridina: acido acetico glaciale: acqua = 15:10:3:12)
Rf = 0,64
Esempio 9 L-alanina-p-idrossifeniletilammide
Etil cloroformiato (0,94 mi) fu aggiunto a Z-Ala-OH (2,2 g, 10 mM) e NMM (1,0 g, 10 mM) in THF a -20°C e si agitò a — 15°C per 2 minuti. Tirammina (1,4 g, 10 mM) in DMF (20 mi) fu aggiunta e si agitò alla temperatura ambiente per una notte. THF fu distillato e fu aggiunto acetato di etile (100 mi). La soluzione fu lavata con citrato acquoso al 10% peso/peso, con bicarbonato di sodio acquoso al 5% peso/peso e con una piccola quantità di acqua e si essiccò con solfato di sodio anidro. Dopo allontanamento dell'agente essiccante fu aggiunto n-esano al residuo oleoso per ottenere una soluzione concentrata. Il precipitato fu cristallizzato da acetato di etile-n-esano per ottenere una polvere bianca. La polvere fu disciolta in etanolo acquoso al 50% (600 mi), fu aggiunto carbone palladiato al 5% (600 mg) e HCl IN (5 mi) e fu introdotto idrogeno gassoso, agitando alla temperatura ambiente. Alla fine dello sviluppo dell'anidride carbonica, il catalizzatore fu allontanato ed il filtrato fu concentrato ed essiccato sotto vuoto per dare L-alanina-p-idrossifeniletilammide. HCl (1,1 g, 46,1%).
Esempio 10
Attività LAP utilizzando L-leucina-benzilammide e ammina ossidasi
Una soluzione tampone fosfato (pH 7,0 1 mi) di L-leu-cina-benzilammide (50 mM) fu aggiunta in un recipiente di reazione collegato con l'elettrodo ad ossigeno. Furono aggiunti campioni di LAP (50 (il, 50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml e 250 U/ml (Boehringer G.m.b.H.) e si sottopose ad incubazione a 37°C per 15 minuti sotto agitazione. Fu aggiunta ammina ossidasi (2 U/ml, Miles Lab. 50 p,l) e si sottopose ad incubazione per un minuto a 37°C. La benzilammina formata mediante LAP fu ossidata e la quantità di ossigeno consumata fu misurata mediante l'elettrodo ad ossigeno quale variazione della corrente elettrica.
Il risultato viene riportato nella fig. 1 nella quale la variazione della corrente elettrica è posta in funzione dell'attività di LAP. L'attività di LAP può essere determinata mediante misura della variazione della corrente elettrica.
Esempio 11
Attività LAP utilizzando L-leucina-p-idrossifeniletilammide e tirammina ossidasi
La soluzione del substrato e l'enzima dell'esempio 10 furono sostituiti con soluzione in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0, 1 ml) di L-leucina-p-idrossifeniletilammide (50 mM) e con tirammina ossidasi (3 U/ml, prodotto da Sorcina lutea
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IAM 1099, 50 |xl), ed il procedimento fu condotto nel modo indicato nell'esempio 10 per il saggio dell'attività di LAP. L'andamento illustrato nella fig. 2 mostra un buon risultato.
Esempio 12
Attività di LAP utilizzando L-leucil-D-metionina e D-amminoacido ossidasi
La soluzione del substrato e l'enzima dell'esempio 10 furono sostituiti con soluzione in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0,1 ml) di L-leucil-D-metionina (50 mM) e con D-amminoacido ossidasi (11,5 U/ml-Boehringer G.m.b.H., 10 (il) ed il procedimento fu condotto nel modo indicato nell'esempio 10 per il saggio di attività di LAP. Il risultato viene illustrato nella fig. 3.
Esempio 13
Attività di LAP utilizzando L-leucina-n-butilammide ed ammina ossidasi
La fig. 4 illustra il diagramma di flusso per il sistema di saggio dell'attività di LAP.
Il campione per il saggio dell'attività di LAP aggiunto tramite l'iniettore del campione 1 e la soluzione del substrato 2 vengono introdotti nel recipiente del reattore LAP 3. Il campione viene introdotto mediante una micropipetta
0 autocampionatore e la soluzione del substrato viene aggiunta tramite la pompa a volume costante 4. Dopo incubazione la miscela di reazione viene trasferita alla colonna dell'enzima immobilizzato 5 alla quale viene simultaneamente alimentata la soluzione del tampone nel recipiente del tampone 6, tramite la pompa a volume costante 7.
La soluzione fatta passare attraverso la colonna dell'enzima immobilizzato viene trasferita ad una cella di flusso dove è montato un elettrodo 8, come un elettrodo ad ossigeno oppure un elettrodo ad acqua ossigenata, per misurare l'ossigeno consumato oppure l'acqua ossigenata liberata in seguito ad azione enzimatica. Questi vengono mantenuti a temperatura costante nel recipiente a temperatura costante 10. La variazione elettrica determinata dall'elettrodo viene registrata nel registratore 12, nel memorizzatore digitale 13 o nel registratore digitale 14 tramite l'amplificatore 11.
Nel diagramma di flusso sopra indicato, furono utilizzati
1 seguenti elementi.
Soluzione del substrato: tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0) di L-leucina-n-butilammide (50 mM); campione di saggio per l'attività LAP: soluzione di LAP a varie concentrazioni (50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml e 250 U/ml); colonna dell'enzima immobilizzato: 2,8 X 30 mm, contenente 100 mg di ammina ossidasi immobilizzato (15 U/g supporto), collegato covalentemente con una ammina ossidasi e polimero poroso (supporto: poliacril nitrile; reagente di reticolazione: glutaraldeide, brevetto Gran Bretagna,
2 015 001); e cella di flusso: volume interno 0,1 mi, collegata con un elettrodo ad ossigeno.
Il campione LAP (10 (il) fu aggiunto nella soluzione del substrato (50 [1,1) e fu sottoposto ad incubazione a 37°C per 15 minuti. Fu fatto fluire il tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0) alla velocità di 1 ml/minuto nella colonna dell'enzima immobilizzato, dal recipiente del tampone. Quando la quantità di ossigeno disciolto determinata tramite l'elettrodo ad ossigeno divenne costante nella cella di flusso, la miscela sottoposta ad incubazione (10 [il), fu trasferita nella colonna dell'enzima immobilizzato. La n-butilammina formata mediante LAP fu ossidata dall'enzima immobilizzato e la quantità consumata dell'ossigeno disciolto nella reazione enzimatica fu misurata tramite l'elettrodo ad ossigeno collegato con la cella di flusso quale variazione della corrente elettrica che fu registrata tramite l'amplificatore.
L'andamento viene riportato nella fig. 5 dove si nota 5 che furono ottenuti buoni risultati, vantaggiosi per l'analisi automatica.
Esempio 14
10 Saggio dell'attività di LAP utilizzando L-leucil-D-metionina e D-amminoacido ossidasi
Un campione di LAP (50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml e 250 U/ml) (10 ni) fu aggiunto ad una soluzione 15 tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0, 50 [il) di L-leucil-D-metionina (50 mM) e fu sottoposto ad incubazione a 37°C per 15 minuti. L'attività LAP fu misurata tramite il sistema illustrato nella fig. 6. Nella fig. 6 il numero 15 indica un iniettore della miscela di incubazione LAP, il numero 16 20 indica il recipiente del tampone fosfato 0,1 M, il N. 17 indica la pompa a volume costante che trasferisce il tampone con una velocità di flusso di 1 m/minuto ed il numero 18 indica la cella di flusso. La cella di flusso consiste di un reattore-misuratore collegato con l'elettrodo ad ossigeno 25 20, collegato a sua volta con la membrana dell'enzima immobilizzato di D-amminoacido ossidasi 19 (supporto: membrana di poliacrilonitrile contenente gruppi amminici, reagente di reticolazione: glutaraldeide, brevetto Gran Bretagna 2 015 001) (30 U/g supporto, diametro 5 mm, 0,8 mg, 30 attività del D-amminoacido ossidasi 2,4 mU). La variazione della corrente elettrica tramite l'elettrodo ad ossigeno fu registrata nel registratore 22 tramite l'amplificatore 21. Il N. 23 indica l'uscita del prodotto esausto.
Nell'apparecchiatura sopra descritta, il tampone fosfa-35 to 0,1 M (pH 7,0) fluiva alla velocità di 1 ml/minuto e dopo stabilizzazione dell'ossigeno disciolto, la miscela di incubazione LAP sopra descritta (10 [il) fu iniettata tramite l'iniettore. D-metionina liberata per azione di LAP fu ossidata per azione enzimatica della membrana dell'enzima 40 immobilizzato fino a consumare l'ossigeno disciolto che fu determinato tramite l'elettrodo ad ossigeno e fu registrata la variazione della corrente elettrica.
L'andamento riportato nella fig. 7 mostra un buon risultato, adatto per un sistema di saggio automatico. 45 L'attività LAP fu saggiata in modo continuo per 100 volte utilizzando campioni di saggio dell'attività LAP (100 U/ml e 200 U/ml). Dopo ogni saggio, la quantità di ossigeno disciolta presentava immediatamente (1 minuto dopo la fine della determinazione) il valore originale stabile ed 50 ogni 100 saggi rivelava i buoni risultati e la riproducibilità.
Esempio 15
Specificità del substrato rispetto a vari substrati sintetici 55 tramite LAP e amminopeptidasi
Furono utilizzati i seguenti substrati sintetici. L-leucin-ammide (50 mM), L-leucina-p-nitrianilide (50 mM), L-Ieu-cina-ß-naftilammide (soluzione satura), L-leucina-n-butil-60 ammide (50 mM) e L-leucina-p-idrossifeniletilammide (50 mM).
Una soluzione di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0, 15 [il), contenente LAP (300 U/ml) fu aggiunta ad una soluzione tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0, 50 [il) del substrato sopra 65 indicato e si sottopose ad incubazione a 37°C per 15 minuti.
Fu anche utilizzato nelle stesse condizioni amminopeptidasi (20 U/ml, 10 [il, Boehringer G.m.b.H.).
648291
8
L-leucina liberata da LAP e l'amminopeptidasi furono misurati mediante il sistema di flusso illustrato nella fig. 4 in relazione all'esempio 13 (L-amminoacido ossidasi fu utilizzato in luogo di ammina ossidasi). Tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0) fu fatto fluire alla velocità di 1 ml/minuto mediante una pompa a volume costante e dopo che l'ossigeno disciolto nella cella di flusso ebbe raggiunto uno stato costante, fu iniettata la miscela di incubazione sopra indicata (10 (il). Furono utilizzate fibre di L-amminoacido ossidasi immobilizzato in colonna (28 U/g-supporto, 100 mg. 2,8 X 30 mm). Fu determinato un consumo di ossigeno corrispondente alla formazione di L-leucina da L-amminoacido ossidasi mediante l'elettrodo ad ossigeno nella cella di flusso, il segnale fu amplificato con il variare della corrente elettrica e fu saggiata l'azione di LAP e di amminopeptidasi su vari substrati. I risultati sono riportati nella tabella 1.
TABELLA 1
LAP amminopeptidasi
L-leucinammide
+ + +
+ + +
L-leucina-p-nitroanilide
+
+ + +
L-leucina-ß-naftilammide
+
+ + +
L-leucina-n-butilammide
+ + +
+
L-leucina-p-idrossifenil-etilammide
+ + +
+ ±
Come illustrato nella tabella 1, L-leucinammide, N-L--leucil-p-nitroanilide e L-leucina-ß-naftilammide della tecnica nota, furono idrolizzate non solo da parte di LAP, ma anche da parte di amminopeptidasi e pertanto questi substrati sono meno preferibili per il saggio di attività LAP nel siero, dato il contenuto di LAP e di amminopeptidasi. Al contrario, poiché L-leucina-n-butilammide e L-leucina--p-idrossifeniletilammide della presente invenzione furono idrolizzate da LAP e praticamente non idrolizzate da amino-peptidasi, questi substrati sono preferibili per il saggio LAP del siero.
Esempio 16
Saggio di attività di LAP utilizando L-leucina-p-idrossifenil-etilammide e ammina ossidasi
La soluzione del substrato (50 mM) fu preparata disciogliendo L-leucina-p-idrossifeniletilammide cloridrato ottenuto nell'esempio 5, in tampone fosfato 0,1 M (ph 7,0). Fu preparata la soluzione (I) che segue.
Tampone tris-HCl 0,2 M (pH 8,0) 0,1 ml
4-amminoantipirina 0,3%, 0,05 ml
Fenolo 0,2%, 0,05 ml
Perossidasi 0,5 mg/ml (Sigma Chem.
Co. tipo-I) 0,05 mi
Cloruro di magnesio 0,1 M, 0,025 mi
Soluzione del substrato 50 mM (L-leucina-
-p-idrossifeniletilammide) 0,025 mi
Acqua distillata 0,1 mi
Soluzione [I] 0,4 mi
La soluzione della composizione di reazione [II] (0,45 mi) fu preparata aggiungendo ammina ossidasi (5 U/ml. Miles Lab. 50 (il) nella soluzione [I] sopra descritta (0,4 mi).
Siero* normale di topo, siero** di topo del tipo affezione parenchimale del fegato e siero*** di topo del tipo colestasi extraepatica del fegato, ciascuno rispettivamente pari a 50 (il, furono aggiunti alla soluzione della composizione di reazione [II] (0,45 mi), sottoposti ad incubazione a 37°C per 30 minuti e misurati spettrofotometricamente a 480 nm.
Siero con attività LAP (Seraclea N, 122 G-R unità, Nihon Shoji Co.) fu trattato nello stesso modo sopra indicato e si calcolò l'attività LAP. I risultati sono riportati nella tabella 2.
Il confronto con il metodo di saggio sopra indicato, il metodo di saggio dell'attività LAP antecedentemente noto (Wako Pure Chem. Co., Codice 274-41901, substrato: L-leu-cina-p-dietilammino anilide) fu applicato allo stesso campione di siero.
I risultati sono illustrati nella tabella 2.
TABELLA 2
Substrato
Campione^^ di siero
L-leucina-p-idrossi-fenil-etilammide (Unità G-R)
L-leucina-p-dietil-ammino anilide (Unità G-R)
Topo normale
331
148
Topo del tipo affe
zione parechimale
del fegato
2486
237
Topo del tipo co
lestasi extraepatica
del fegato
379
241
Come illustrato nella tabella L-leucina-p-idrossifenil-etilammina della presente invenzione può essere utilizzata quale substrato vantaggioso per la diagnosi di affezioni pa-renchimali del fegato.
Esempio 17
Saggio LAP utilizzando L-alanina-p-idrossifeniletìlammide ed ammina ossidasi
L-alanina-p-idrossifeniletilammide cloridrato ottenuta nell'esempio 8, fu disciolta in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0) per prerarare una soluzione del substrato (50 mM). La soluzione del substrato (0,25 mi) fu utilizzata in luogo della soluzione del substrato dell'esempio 16 e fu preparata la soluzione [I] e la soluzione della composizione di reazione [II] nello stesso modo dell'esempio 16. L'attività LAP fu saggiata come nell'esempio 16.1 risultati sono riportati nella tabella 3.
* Siero di topo Wister, maschio, con peso pari a circa 250 g.
f * Carbonio tetracloruro, olio di oliva 50% (volume/volume) (1 ml/Kg/giorno) fu iniettato per via sottocutanea due volte alla settimana per 4 settimane nella parte posteriore del topo Wister, maschio, con peso pari a circa 250 g. Il siero fu raccolto 48 ore dopo l'ultima somministrazione.
*** Topo Wister, maschio, con peso pari a circa 250 g, fu trattato con etere e fu legato il canale ordinario della bile. Il siero fu raccolto dopo 48 ore a partire dalla legatura.
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TABELLA 3
Substrato
Siero
L-alanina-p-idrossi-feniletilammide (Unità G-R)
Topo normale
117
Topo del tipo affezione parenchi-
male del fegato
165
Topo del tipo colestasi extra
epatica del fegato
219
Come illustrato nella tabella L-alanina-p-idrossifeniletil-ammide della presente invenzione costituisce un substrato sintetico preferibile nella diagnostica di colestasi extra-epatica del fegato.
Esempio 18
Tampone tris-HCl 0,2 M (pH 8,0) 0,1 ml
4-ammino antipirina 0,3 % 0,05 ml
Fenolo 0,2% 0,05 ml
Perossidasi 0,05 % (Sigma Chem. Co.
Tipo II) 0,05 mi
Cloruro di magnesio 0,1 M 0,025 ml L-leucina-p-idrossifeniletilammide 50 mM 0,025 mi
Ammina ossidasi (7,6 U/ml) 0,01 mi
Acqua distillata - 0,14 mi
Totale
0,45 mi utilizzando la curva standard sopra riportata. Il coefficiente di correlazione y = 0,984 [n = 24] e l'equazione di regressione Y = 1,024X — 2,898 portarono a buoni risultati. La curva di correlazione è illustrata nella fig. 11.
Breve spiegazione dei disegni:
Fig. 1:
Fig. 2:
io
Fig. 3:
15 Fig. 4:
20
25
30 Fig. 5:
Fig. 6:
Fu aggiunto siero standard [Wako Pure Chem. Co., siero standard di saggio LAP, LAPC-Test Wako (Metodo con substrato L-leucina-p-dietilamminoanilide), 50 jxl] nella soluzione della composizione di reazione sopra indicata e si sottopose ad incubazione a 37°C per 30 minuti. Fu aggiunto etanolo (2,5 mi) per bloccare la reazione. La sostanza sedimentata fu separata e la soluzione del supernatante fu misurata colorimetricamente a 480 nm. La curva standard viene riportata nella fig. 10. La relazione lineare tra l'attività LAP e l'assorbimento a 480 nm risulta evidente. Il metodo può essere utilizzato quale metodo di saggio quantitativo dell'attività LAP del siero e quale equipaggiamento per il saggio.
L'attività LAP del siero di pazienti umani fu saggiata
35
40
45
50
Fig.
7:
Fig.
8:
Fig.
9:
Fig.
10:
Fig.
11:
saggio LAP mediante elettrodo ad ossigeno utilizzando L-leucina-benzilammide e ammina ossidasi.
saggio LAP mediante elettrodo ad ossigeno utilizzando L-leucina-p-idrossifeniletilammide e tirammina ossidasi.
saggio LAP mediante elettrodo ad ossigeno utilizzando L-leucil-D-metionina e D-amminoacido ossidasi.
diagramma di flusso per il sistema di saggio di attività LAP.
1: iniettore del campione di saggio LAP soluzione del substrato reattore LAP pompa a volume costante colonna dell'enzima immobilizzato recipiente del tampone pompa a volume costante elettrodo cella di flusso contenitore a temperatura costante amplificatore registratore registratore digitale.
saggio LAP utilizzando l'elettrodo ad ossigeno nel diagramma di flusso (fig. 4) e L-leucina-n--butilammide e ammina ossidasi, equipaggiamento per il saggio LAP 15: iniettore per la miscela di saggio LAP 16: soluzione tampone 17: pompa a volume costante cella a flusso membrana dell'enzima immobilizzato 20: elettrodo ad ossigeno 21: amplificatore 22: registratore
23: condotto dei prodotti esausti.
saggio LAP utilizzando l'elettrodo con enzima collegato con l'enzima immobilizzato e con l'elettrodo ad ossigeno L-leucil-D-metionina e D-amminoacido.
spettro IR di L-leucina-p-idrossifeniletilammide spettro IR di L-alanina-p-idrossifeniletilammide curva standard utilizzando L-leucina-p-idrossi-feniletilammide curva di correlazione utilizzando L-leucina-p-idrossifeniletilammide e campione commerciale.
2: 3: 4: 5: 6: 7: 8: 9: 10: 11: 12: 14:
18: 19:
v
3 fogli disegni
Claims (11)
1. Composto ammidico con formula (I)
-ri-ch-co-r, [i]
I
NH2
dove Ri è un gruppo alchile inferiore e R2 è un gruppo me-tilammino sostituito o un gruppo D-amminoacido residuo, oppure un sale relativo.
2. Composto ammidico [I] o sale relativo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che RL è il gruppo isobutile.
2
RIVENDICAZIONI
3. Composto ammidico [I] o sale relativo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che Rx è il gruppo metile.
4. Composto ammidico [I] o sale relativo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che R2 è il gruppo metilammino con formula (II):
-NH-CH2-CH3 [II]
dove R3 è un gruppo organico.
5. Composto ammidico [I] o sale relativo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che R3 è un gruppo metile, etile, n-propile, isopropile, n-butile, amile, p-idrossi-benzile, 3,4-diidrossibenzile, 5-imidazoImetile, 3-indolme-tile o fenile.
6. Composto ammidico [Il o sale relativo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che R2 è un residuo D-amminoacido con formula (III):
* R
-nh-chc; 4 [iii]
r5
dove uno tra R4 e R5 è il gruppo carbossile, l'altro essendo
*
un gruppo metiltio etile, isobutile, metile o fenile e C è un atomo di carbonio D-asimmetrico.
7. Composto ammidico o sale relativo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che uno tra R4 e R5 è
il gruppo carbossile, l'altro essendo un gruppo metiltio etile,
*
isobutile, metile o fenile e C è un atomo di carbonio D-asim-metrico.
8. Procedimento di saggio per leucina amminopeptidasi caratterizzato dal fatto di far reagire un composto ammidico di substrato o sale relativo con formula:
-RrCH-CO-R2 [I]
I
nh2
dove Rj è un gruppo alchile inferiore e R2 è un gruppo metilammino sostituito o un residuo D-ammino acido, con un campione per il saggio di leucina amminopeptidasi, il sottoporre ad incubazione il prodotto di reazione composto da metilammina sostituita o D-ammino acido con il corrispondente ossidasi ed il misurare l'ossigeno così consumato oppure l'acqua ossigenata liberata.
9. Procedimento di saggio secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto ossidasi è un enzima immobilizzato.
10. Procedimento di saggio secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto saggio viene condotto mediante elettrodo ad ossigeno, elettrodo ad acqua ossigenata oppure elettrodo con enzima relativo.
11. Procedimento di saggio secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto metodo comprende la misura dell'acqua ossigenata mediante reagente colorante op- ' pure mediante reagente luminescente.
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