CH648331A5

CH648331A5 - Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung.

Info

Publication number: CH648331A5
Application number: CH5082/80A
Authority: CH
Inventors: Heinz-Juergen Friesen; Sidney Pestka
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1979-07-31
Filing date: 1980-07-01
Publication date: 1985-03-15
Also published as: FI802400A7; HK40384A; KE3364A; AT372387B; HU185382B; JPH02138226A; IT8023801A0; FI70721B; IE50075B1; FI70721C; DE3028919A1; AR229931A1; ZA803943B; LU82673A1; YU193480A; IE801589L; US5015730A; RO81474A; MY8500274A; SE8005498L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein und ein Verfahren zu dessen Herstellung durch eine Kombination von Affmitäts-Chromato-graphie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).

Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben. Während verschiedene Autoren beanspruchen, Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt zu haben, werden von ihnen keine der klassischen Beweise für die Homogenität von Proteinen geliefert oder Eigenschaften der angeblich reinen Verbindung beschrieben.

Die Anwendung von HPLC zur Reinigung von Proteinen ist allgemein bekannt. In der Literatur sind insbesondere Säulentypen für die Ionenaustausch- und Ausschluss-Chromatographie zur Reinigung von Proteinen beschrieben (z.B. Regnier und Noël, J. Chromatog. Sei. 14,316 [1976] und Chang et al., Anal. Biochem. 48,1839 [1976]). In der Umkehrphasen-Chromatogra-phie wurde z.B. Lichrosorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifiziertem Si02) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie ß-Endorphin, verwendet [siehe z. B. Rubinstein et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 4969-72 (1977)].

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Es ist ferner bekannt, dass man die Affinitäts-Chromatogra- 1M NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 15 % (Volumen-

phie zur Reinigung von Human-Fibroblasten-Interferon heran- teile) Ethylenglykol (ph 7,2) gewaschen und ziehen kann. So beschreiben Davey et al., J. Biol. Chem. 251, (c) Interferon wird mit 1 MNaCl/0,02-0,05 M Phosphat, 7620 (1976), die Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B enthaltend 50 % (Volumenteile) Ethylenglykol (pH 7,2) eluiert.

bei der Herstellung von gereinigtem Human-Fibroblasten-Inter- 5 Das erhaltene Interferon hat eine spezifische Aktivität von feron. Jankowski et al., Biochemistry 15,5182 (1976), verwen- etwa 3 X106 Einheiten/mg und kann in diesem Schritt in einer den Blau Dextran-Sepharose zu dem gleichen Zweck. Schliess- Ausbeute von etwa 80 % erhalten werden.

lieh gelingt gemäss US-Patent 4.172.071 (de Maeyer et al.) die Die in der Affinitäts-Chromatographie verwendete Blau Dex-

Reinigung verschiedener roher Lösungen von Leukozyten- und tran-Sepharose kann durch Kupplung von Blau Dextran (an

Fibroblasten-Interferon durch Affinitätschromatographie an 10 Dextran gekoppeltes Cibacron Blau F3GA) an CNBr-aktivierte einer Blau Dextran-Sepharose-Säule, wobei Präparate mit einer Sepharose 4B bei pH 9,5 erhalten werden.

spezifischen Aktivität zwischen 1 und 5 x 108 internationale Dieses Kupplungsverfahren ist, genauso wie das Waschen und

Interferon-Einheiten erreicht werden. Zusätzliche Reinigungs- Altern des Harzes und die Beladung und Elution der Säule, von schritte werden nicht offenbart, und die erhaltenen Interferon- entscheidender Bedeutung, um maximale Ausbeuten und ein

Präparate sollen noch einen hohen Anteil an Produkten mit 15 hochreines Human-Fibroblasten-Interferon zu erhalten.

Interferon-ähnlicher Aktivität enthalten und lediglich zu einem Stammt das Interferon aus einem Serum-freien Medium, so grossen Teil von verunreinigenden Proteinen befreit sein. wird seine Reinigung durch ein- oder zweimalige Passage durch

Das erfindungsgemässe, verbesserte Verfahren zur Herstel- eine Blau Sepharose-4B-Säule und Elution mit einer gepufferten lung von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein wässrigen Lösung von Ethylenglykol (30-50 %, V/V, pH7,2)

betrifft eine Kombination von Affinitäts-Chromatographie und 20 erreicht.

HPLC und ist dadurch gekennzeichnet, dass man Zur weiteren Reinigung des Interferons wird es nach der

A. eine wässrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in Affinitäts-Chromatographie ein- bzw. mehrmaliger präparativer unreinem Zustand auf eine Affinitäts-Chromatographie-Säule HPLC mit hoher Auflösung und hoher Ausbeute unterworfen, gibt, an der das Interferon adsorbiert wird, das Interferon eluiert Für die HPLC werden Säulen auf der Basis einer porösen Si02-und es in bestimmten Fraktionen des Eluates in höherer Reinheit 25 Matrix, an die Cyclohexyl-, Octyl-, Octadecyl-, Phenyl-, Diphe-erhält und nyl- oder Cyanopropylgruppen gebunden sind, verwendet. Mit-

B. die erhaltenen Interferon-Fraktionen unter HPLC-Bedingun- tels dieser Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen gen über eine oder mehrere mit einem Puffer äquilibrierte pH-Bedinungen sowie mit unterschiedlichen Gradienten des Chromatographie-Säule(n) auf der Basis einer Cyclohexyl-, Phe- organischen Elutionsmittels verwendet werden können, kann nyl-, Diphenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Cyanopropylgruppen- 30 das Human-Fibroblasten-Interferon bis zur Homogenität gerei-enthaltenden Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon adsor- nigt werden. Homogenität des Interferons ist dann gegeben,

biert wird, und es jeweils mit einem Gradienten von mit Wasser wenn bei der Natriumdodecylsulfat (NaDodS04)-Polyacryl-

mischbaren Lösungsmitteln in einem gepufferten sauren wässri- amid-Gelelektrophorese ein einziges Band erhalten wird, eine gen System eluiert, so dass das Interferon in Form eines einzigen konstante spezifische Aktivität erreicht ist und bei der HPLC ein ausgeprägten Peaks in bestimmten Fraktionen des Eluats erhal- 35 einzelner Peak erhalten wird, mit übereinstimmenden Aktivi-

ten wird. täts- und Protein-Banden.

Für die Affinitäts-Chromatographie-Stufe des vorliegenden Die Chromatographie-Säulen auf der Basis einer unregelmäs-Verfahrens kann ein Concanavalin A-Detrangel (Sepharon 4B) sig geformten, völlig porösen Si02-Matrix (Partikelgrösse etwa oder ein Blau-Dextrangel (Blau Dextran-Sepharose) verwendet 10 [x, Porengrösse etwa 10"5 mm) die Cyclohexyl-, Octyl-, Octa-werden, wobei letztere bevorzugt ist, im Hinblick auf wesentlich 40 decyl-, Phenyl- oder Cyanopropylgruppen enthält, sind im Hanhöhere Ausbeuten und ein stabileres Endprodukt. del erhältlich. Ein geeignetes HPLC-System ist in US-Patent Nr.

Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter 4116046 (Stanley Stein) beschrieben.

Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B kann die fol- Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird die durch gende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden: die Affinitäts-Chromatographie gereinigte Lösung des Human-

(a) 20-30 Säulenvolumina rohen Human-Fibroblasten-Interfe- 45 Fibroblasten-Interferons in einem wässrigen Puffer vom pH 4-8 rons (spezifische Aktivität etwa 104 Einheiten/mg) in Eagle's über die Si02-Säule geschickt. Ein für diesen Zweck bevorzugter Minimalmedium, enthaltend 5 % fötales Kälberserum, werden Puffer ist ein Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/Wasser auf eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule bei einer Durch- (8:8:84, V/V). Gewöhnlich wird unter Druck vorzugsweise im flussrate von 30-60 cm/Stunde gepumpt; Bereich von 3,4 bis etwa 340 atm. gearbeitet. Das an die Säule

(b) es wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PPK) 50 gebundene Interferon wird anschliessend in selektiver Weise vom pH 7,2 gewaschen; eluiert unter Verwendung eines wässrigen Puffergemisches mit

(c) es wird mit PPK-0,1 M a-Methylmannosid (a-MM) gewa- einem Gradienten eines mit Wasser mischbaren organischen sehen und Lösungsmittels. Als geeignete, mit Wasser mischbare organische

(d) es wird mit PPK-0,1 M a-MM, enthaltend 50% Ethylengly- Lösungsmittel kommen vor allem Alkanole wie n-Propanol,

kol (Volumenteile), eluiert. 55 Isopropanol, n-Butanol,tert.-Butanol, Ethanol und Methanol in

Das nach Schritt (d) erhaltene gereinigte Interferon weist eine Frage. Besonders geeignet für die Elution von Human-Fibrobla-

spezifische Aktivität von etwa 107 Einheiten/mg auf bei einer sten-Interferon ist ein Gemisch aus Propanol und Butanol.

Ausbeute von etwa 10-30 %. Das Eluat wird in üblicher Weise fraktioniert und der Protein-

Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter gehalt der einzelnen Fraktionen wird ständig durch hochemp-

Verwendung von Blau Dextran-Sepharose kann die folgende 60 findliche Monitoren registriert. Ein für diesen Zweck geeignetes allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden: System haben Bohlen et al., Anal. Biochem. 67,438 (1975),

(a) 10-40 Säulenvolumina eines Kultur-Überstandes (l-3x 104 beschrieben (vgl. auch US-Patent Nr. 3876881).

Einheiten/ml, 0,2-1 mg Protein/ml) werden durch Zusatz von Die Wahl des für die HPLC geeignetsten Harzes hängt von der gesättigter NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 1,25 M NaCl Herkunft und Reinheit des Human-Fibroblasten-Interferons ab.

eingestellt und auf die Säule gepumpt bei einer linearen Durch- 65 Material, das von einer Concanavalin A-Sepharose-Säule flussrate von 20-40 cm/Stunde; stammt, wird zweckmässigerweise durch HPLC an einer Cyclo-

(b) die Säule wird mit 5-15 Säulenvolumina von 1M NaCl/ hexyl-modifizierten Si02-Säule und anschliessend an einer Octyl-0,02-0,05 M Phosphat und dann mit 5-15 Säulenvolumina von modifizierten Si02-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Ande-

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rerseits wird Material, das von einer Blau Dextran-Säule stammt, mittels ein- oder mehrmaliger Passagen durch eine Octyl-modifi-zierte Si02-Säule oder mittels Passage durch eine Octyl-modifi-zierte sowie eine Cyanopropyl-modifizierte Si02-Säule und schliesslich, sofern notwendig, eineDiphenyl-modifizierteSi02-Säule bis zur Homogenität gereinigt. Stammt das Material aus einem Serum-freien Präparat und wird die Affinitäts-Chromato-graphie an einer Blau Sepharose-4B-Säule durchgeführt, so genügt eine einmalige Passage durch eine Octyl-modifizierte Si02-Säule, um Homogenität zu erreichen.

Im Hinblick auf die Empfindlichkeit von Human-Fibroblasten-Interferon gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Pro-panol, Butanol oder2-Methoxyethanol, bei neutralem pH, wurde die Chromatographie bei sauren pH-Werten durchgeführt. Da Human-Fibroblasten-Interferon hydrophober ist als Leukozyten-Interferon und da ferner andere, mehr hydrophobe Proteine in den teilweise gereinigten Fibroblasten-Interferon-Präparaten vorliegen, bewährte sich ein Gemisch aus Propanol und Butanol als Elutionsmittel in der HPLC an den verwendeten Umkehrphasen am besten. Die Verwendung dieses Gemisches erlaubte es, den Gehalt an organischem Lösungsmittel zu begrenzen und dadurch weniger Artefakte im Eluat zu erhalten.

Das gemäss vorliegender Erfindung erhaltene homogene Human-Fibroblasten-Interferon wurde nach der jeweils letzten HPLC-Säule in Form eines einzelnen Peaks isoliert und lieferte ein einzelnes enges Band bei der NaDodS04-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Jeder übliche Assay zur Bestimmung von Human-Fibroblasten-Interferon-Aktivität kann zu diesem Zweck verwendet werden.

Das Molekulargewicht des homogenen Human-Fibroblasten-Interferons, bestimmt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese, betrug etwa 20500. Die spezifische Aktivität des gereinigten Materials war etwa 4xl08 Einheiten/mg.

Die folgende N-terminale Partialsequenz konnte an einer Probe von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon festgestellt werden: Met1-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe15-Gln-.. .-Gln-Lys19-...

Interferone besitzen antivirale, Antitumor-, wachstumshemmende und immunsuppressive Aktivität. Diese Aktivitäten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden bei Verabreichung von 1-10 X106 Einheiten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger als 1 % Human-Interferon enthielten. Das gereinigte homogene Human-Fibroblasten-Interferon der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen Weise, wie bereits von Interferon-Präparaten bekannt, verwendet werden, unter Anpassung der Dosierung an den gesteigerten Reinheitsgrad.

Die Verfahrens- und Produktaspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele illustriert. Alle in Einheiten/ml oder Einheiten/mg angegebenen Interferon-Titer beziehen sich auf einen Standard für Human-Leulcozyten-Inter-feron (GO 23-901-527) des US National Institutes of Health.

Beispiel 1

Concanavalin A-Affinitäts-Chromatographie 50 ml Concanavalin A-Sepharose 4B (äquilibriert mit PPK vom pH 7,2, enthaltend 0,1M a-MM) wurde in eine 50 ml Polypropylen-Säule mit einer Polyethylenfritte gepackt. Es wurde mit 1,251 roher Interferon-Lösung (2X107 Einheiten, spezifische Aktivität 2 x 104 Einheiten/mg) bei einer Durchflussrate von 180 ml/Stunde (35,5 cm/Stunde) beladen. Die Säule wurde dann mit 150 ml PPK und mit 600 ml PPK, enthaltend 0,1 M a-MM, gewaschen. Das Interferon wurde schliesslich mit dem obigen Puffer, enthaltend 50% (V/V = Volumenteile) Ethylenglykol , eluiert. Ausbeute 9 % (1,8 X106 Einheiten, spezifische

Aktivität etwa 1 x 107 Einheiten/mg). Bei einer grösseren Bandbreite des Peaks werden unter Einschluss weiterer Fraktionen 15 % Ausbeute erhalten (3 x 106 Einheiten, spezifische Aktivität 2-4 xlO6 Einheiten/mg).

HPLC

120 ml des Eluates der Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule (2,5 x 106 Einheiten, etwa 2-4x 106 Einheiten/mg) wurden bei einer Druchflussrate von 0,4-0,8 ml/Min. direkt auf eine 4,6x300 mm-Säule auf der Basis einer Cyclohexylgruppen enthaltenden Si02-Matrix (Chromegabond 10 |x), die vorher mit einem Gemisch von Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/Wasser (8:8:20:64; V/V ; Puffer A) äquilibriert wurde, gegeben, wobei der maximale Druck unter 306 atm. gehalten wurde. Das für die HPLC verwendete System entsprach im wesentlichen dem von Bohlen et al. (Anal. Biochem. 67, 438 [1975]) beschriebenen.

Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min. wurde der folgende Gradient, ausgehend vom Puffer A, für Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/Wasser, 8:8:25:20:29, V/V) verwendet: 0-25% B, 32 Min. ; 25-60% B, 225 Min. ; 60-100% B, 63 Min. Es wurden Fraktionen zu 2,0 ml gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 26-29 (2XlO6 Einheiten) wurden mit 4 ml Pyridin/Ameisensäure verdünnt und direkt auf eine 4,6x300 mm-Säule auf der Basis einer Octylgruppen enthaltenden Si02-Matrix (Chromegabond 10 |i) gegeben. Es wurde unter den für die Cyclohexylsäule angegebenen Bedingungen eluiert. Die spezifische Aktivität im Zentrum des Aktivitäts-Peaks war etwa 4x 108 Einheiten/mg bei einer Gesamtausbeute an gereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon von 106 Einheiten.

Das an einer Concanavalin A-Säule gereinigte Interferon wird bei der HPLC an einer Cyclohexylgruppen- bzw. einer Octyl-gruppen-tragenden Säule sehr nahe beim Haupt-Peak eluiert. Wird bei der HPLC zuerst an der Octyl-Säule chromatogra-phiert, so wird das Interferon direkt vor dem Haupt-Peak eluiert, während es bei Verwendung einer Cyclohexyl-Säule als erster Säule unmittelbar nach dem Haupt-Peak eluiert wird.

Proben des HPLC-gereinigten Human-Fibroblasten-Interferons wurden an 12,5 oder 15 % NdDodSCVPolyacrylamid-Gel in Tris/Glycinpuffer der Elektrophorese unterworfen (1 [ig Protein) . Nach Anfärbung mit Coomassie Blau wurde ein einziges Band erhalten. Durch Assay auf antivirale Aktivität wurde festgestellt, dass das Maximun dieser Aktivität im Zentrum der gefärbten Bande lag. Das Molekulargewicht wurde mit etwa 20500 bestimmt unter Verwendung von Rinderserumalbumin, Chymotrypsin, Cytochrom C und Ribonuclease als Vergleichssubstanzen. Die relative Beweglichkeit der Human-Fibrobla-sten-Interf eron-B ande war nicht von der Anwesenheit von Mer-captoethanol in der Probe abhängig.

Beispiel 2

Herstellung der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule

50 g bepackte Sepharose 4B wurden mit 11 Wasser gewaschen und nochmals in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert. Es wurden 15 g fein verteiltes CNBr unter leichtem Rühren zugesetzt und der pH-Wert auf 11±0,2 durch tropfenweise Zugabe von 10N NaOH eingestellt. Die Temperatur wurde durch Zugabe von Eis auf 20±5° C gehalten. Nach 15-20 Minuten wurde mit einem Volumen Eiswasser versetzt und die Suspension auf einem Buchner-Trichter nochmals mit 5 Volumina 0,01 N HCl gewaschen.

Das aktivierte Harz wurde sofort in 50 ml 0,4 M Natriumcarbo-natpuffer (pH 9,5), enthaltend 1,00 g gelöstes Blau Dextran, suspendiert und über Nacht bei 4° C in einer Rundbodenflasche geschüttelt. Es wurde mit 10 Volumina 1M NaCl, 2 Volumina 50 % (V/V) Ethylenglykol, enthaltend 1M NaCl und 0,05 M Natriumphosphat (pH 7,2), gewaschen, über Nacht in 50%

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25

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35

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55

60

65

5

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(VA') Ethylenglykol stehengelassen, mit einem Volumenteil 80%igem (V/V) Ethylenglykol und 5 Volumina Gibco No. 11 Minimalmedium (MEM) gewaschen und in diesem Medium über Nacht bei 50° C aufbewahrt. Nach nochmaligem Waschen mit 3 Volumina 80%igem (V/V) wässrigem Ethylenglykol, enthaltend 1M NaCl, und anschliessend mit 2 Volumina MEM wurde das Harz in MEM aufgeschlämmt und in eine Säule übergeführt.

Affinitäts-Chromatographie

Ein Gemisch aus 1,51 rohem Human-Fibroblasten-Interferon (2x 104 Einheiten/ml; 1 mg Protein/ml; spezifische Aktivität 2x 104 Einheiten/mg Protein) und 0,27 Volumina gesättigter NaCl-Lösung (etwa 6,3 M) wurde auf eine 50 ml-Polypropylen-Säule mit einer Polyethylen-Fritte, enthaltend 35 ml Blau Dextran-Sepharose 4B, bei einer Durchflussrate von 100 ml/Stunde (20 cm/Stunde) gegeben. Die Säule wurde nacheinander mit 200 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) und 500 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05 M Natriumphosphat (pH 7,2) und 75 ml Ethylenglykol, gewaschen und schliesslich mit 500 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05 M Natriumphosphat (pH 7,2) und 250 ml Ethylenglykol eluiert. Etwa 90 % des Interferons wurde in einem einzigen Peak zusammen mit dem Durchbruch des 50 % Ethylenglykol enthaltenden Lösungsmittels eluiert. Die spezifische Aktivität im Peak-Maximum, mit dem mehr als 50 % des gesamten Interferons eluiert wurde, lag bei 1 x 107 Einheiten/ mg.

HPCL

(A) 125 ml von der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule eluierte Interferon-Lösung (3 X107 Einheiten; 1 x 107 Einheiten/mg) wurden auf eine 4,6X300 mm Säule auf der Basis einer Octylgruppe enthaltenden Si02-Matrix (Chromegabond 10 n) prä-äquilibriert mit 1M NaCl/50 % (V/V) Ethylenglykol, gepumpt. Bei einer Durchflussrate von 0,45 ml/Min. wurde, ausgehend von Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/Wasser, 8:8:20:3,3:60,7, V/V), der folgende Gradient beim Übergang zu Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/Was-ser, 8:8:25:20:39, V/V) eingehalten: 0-25% B, 30 Min.; 25-55% B, 190 Min.; 55-100% B, 20 Min.; 100% B, 60 Min. Die Interferon-Aktivität stimmte im wesentlichen überein mit einem einzigen Protein-Peak in den Fraktionen 18-23 (jede Fraktion enthielt 1,5 ml Elutionsflüssigkeit).

(B) Bei Applikation von etwa einem Viertel der in Stufe (A) applizierten Menge an der gleichen Säule unter den für die Cyclohexyl-Säule in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, stimmte die Interferon-Aktivität mit einem Protein-Peak in den Fraktionen 24-26 überein.

(C) Unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Beladung, Gradient und Durchflussmenge wie in (A) und den gleichen Puffern A und B wie in (B) an einer Octylgruppen-enthaltenden Säule (9,6x500 mm, Chromegabond), so dass 'A der Beladung pro Kolonnenvolumen resultierte, wurde eine bessere Trennqualität erreicht.

(D) Das Material, das die höchste spezifische Aktivität (4x 108 Einheiten/mg) aus Verfahrensschritt (A) enthielt, wurde rechro-matographiert an einer Cyanopropylengruppen-enthaltenden Säule unter Verwendung von Pyridin/Ameisensäure/Wasser (8:8:84, V/V) und einem einstündigen Gradienten bezüglich n-Propanol (0-40 %, V/V), bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/ Min. Es wurde ein symmetrischer Hauptpeak erhalten.

NaDodS04-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Elektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben von Interferonproben, die in den Verfahrensschritten (A), (B) und (C) erhalten wurden, lieferte eine Hauptbande vom Molekulargewicht 20500, die im Assay auf Interferon-Aktivität mit der Mitte des Aktivi-tätspeaks übereinstimmte. Eine zweite Bande, die ein Molekulargewicht von etwa 10500 aufwies und 20-50 % des gesamten Materials, bezogen auf die Färbungsintensität, enthielt, variierte von Probe zu Probe und besass keine antivirale Aktivität. Wenn die Proben nicht mit Mercaptoethanol behandelt wurden, wurde 5 eine Bande mit einem Molekulargewicht von 40 000 beobachtet, die aber nur untergeordnete Aktivität aufwies. Die Aminosäureanalysen der Banden mit den Molekulargewichten 20000 und 40 000 unterschieden sich nicht, während die Analyse derjenigen Bande, die ein Molekulargewicht von 10000 aufwies, sehr deut-io lieh differierte.

Die Elektrophorese einer gemäss Verfahren (D) erhaltenen Interferon-Probe lieferte ein Molekulargewicht von etwa 20 500 und eine spezifische Aktivität von 4x 10® Einheiten/mg. Die Aminosäureanalyse dieses homogenen Peptids lieferte nach 15 24stündiger Hydrolyse in 6 N HCl die folgenden, auf Leucin mit 25,0 bezogenen Werte:

20

Asx Thr'

Ser*

Glx Pro Gly

25 * korrigierter Wert

15,4±0,2

Ala

11,8±0,4

Tyr

9,6±0,2

7,8±0,3

Cys n. best.

Phe

7,3±0,1

7,7±0,2

Val

6,9±0,1

His

4,5±0,1

24,1±0,4

Met

2,8±0,4

Lys

11,6±0,4

2,8±0,4

Ile

8,7±0,1

Arg

8,8±0,4

4,9±0,3

Leu

25,0

Trp n. best.

n. best. = nicht bestimmt

35

Beispiel 3

Blau Dextran-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie 30 (a)51 Kulturüberstand, enthaltend 19 400 Einheiten/ml Fibro-blasten-Interferon, wurden durch ein 0,31*. Filter filtriert und dann auf eine Säule mit 275 ml Blau Dextran-Sepharose gegeben. Der Überstand wurde vorher durch Zugabe von 1350 ml einer gesättigten Lösung von NaCl (6,3 M) auf 1,25 M NaCl eingestellt und auf die Säule bei einer Durchflussrate von 360 ml/Stunde gepumpt. Etwa 4-6% des Interferons passierten die Säule ohne adsorbiert zu werden.

(b) Die Säule wurde dann bei einer Durchflussrate von 420 ml/ Stunde mit 1300 ml einer wässrigen Lösung, die 15 % (V/V)

40 Ethylenglykol, 1M NaCl und 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, gewaschen. Etwa 1 % des adsorbierten Interferons wurden von der Säule eluiert.

(c) Das Interferon wurde dann bei einer Durchflussrate von 420ml/Stunde mit einer wässrigen Lösung, die 50 % (V/V) Ethy-

s lenglykol, 1M NaCl und 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, eluiert. Mit den ersten 200 ml des Eluates wurde wenig Interferon eluiert. Das meiste Interferon wurde mit den nächsten 300 ml des Eluates eluiert, wie die folgende Tabelle zeigt:

45

55

60

Fraktion No.

Fraktion Volumen [ml]

Protein [Hg/ml]

Interferon-Titer [Einh./ml]

Spez. Aktivität [Einh./mg]

1

200

n. best.

122

—

2

50

43

3,8 xlO5

9,02xl06

3

50

82

ll,64xl05

1,42 xlO7

4

50

63

7,72xl05

l,23xl07

5

50

62

l,94xl05

3,13 xlO6

6

50

49

9,7 xlO4

1,97 xlO6

7

50

41

3,64xl04

8,87xl05

Es wurden insgesamt 114% der eingesetzten Interferon-Aktivität wiedergefunden.

HPLC

65 Die Fraktionen 2-6 der Blau Dextran-Sepharose-Kolonne (250 ml; 13 x 107 Einheiten; spezifische Aktivität 8,12x 106 Einheiten/mg) wurden auf eine Säule (9,5 x 500 mm) auf der Basis einer Octylgruppen-enthaltenden Si02-Matrix bei einer Durch

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6

flussrate von 4 ml/Min. gepumpt. Während 12 Minuten wurde Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/n-Butanol-Wasser, 8:8:20:2,5:61,5, V/V), bei einer Durchflussrate von 2 ml/Min., durch die Säule gepumpt. Anschliessend wurde mit dem folgenden Gradienten bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/1-Propanol/n-Butanol-Wasser, 8:8:25:25:34, VA'), bei einer Durchflussrate von 1,25 ml/Min., eluiert: 0-20 % B, 18 Min. ; 20-29 % B, 57 Min. ; 29 % B isokratisch während 27 Min. ; 29-30% B, 3 Min.; 30-100% B, 36 Min.; 100% B, 54 Min.

Die Interferon-Aktivität wurde im isokratischen Bereich des Gradienten eluiert, und zwar gemeinsam mit einem Peak, der mit einem Fluorescamin-Monitor-System nachgewiesen wurde. 45 x 106 Einheiten Interferon (Ausbeute 35 %) mit einer spezifischen Aktivität von 2x 108 Einheiten/mg wurden im Pool zusam-mengefasst (50 ml). Nach zweimonatiger Aufbewahrung bei-20° C in verschlossenem Polpropylen-Ampullen war die Aktivität auf 10% des Wertes nach HPLC zurückgegangen. Proteinverlust trat nicht ein.

Dieser 50 ml-Pool (spezifische Aktivität etwa 0,2 x 108 Einheiten/mg) wurde mit 1 ml Thiodiglykol und 20 ml n-Propanol versetzt. Mittels Assay wurden für dieses Gemisch insgesamt 4,26x 106 Einheiten festgestellt. Dem Gemisch wurden 100 ml 0,1 % TritionX-100/0,3% Thiodiglykol zugesetzt. Dieses Gemisch, das gemäss Assay insgesamt 5,1 x 106 Einheiten enthielt, wurde innerhalb von 30 Minunten auf eine Säule auf der Basis einer CN-Gruppen-enthaltenden Si02-Matrix (4,6x250 mm,5 |j./8xl0"6mm, Spherisorb), äquilibriert mit einem Gemisch von Pyridin/AmeisensäureAVasser, 8:8:84, VA', Puffer A), bei einer Durchflussrate von 1,5 ml/Stunde, gepumpt. Der folgende Gradient bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisen-säure/n-Propanl/Wasser, 8:8:50:34, V/V) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. wurde eingestellt: 0-25 % B, 30 Min. ; 25-50 % B, 210 Min. Die Interferon-Aktivität wurde mit dem einzigen festgestellten Peak eluiert. Es wurden 4,2x 106 Einheiten (82%) in drei 1 ml-Fraktionen wiedergefunden.

Dieser Pool, der 69% des gesamten, auf die erste CN-Säule aufgegebenen Proteins darstellt, wurde mit 2 ml 0,1 % Triton X-100 vermischt und nochmals auf die gleiche CN-Säule aufgegeben. Es wurde mit dem gleichen Gradienten in der halben Zeit eluiert. Die gesamte Aktivität (11,75 x 106 Einheiten; Ausbeute 280%) wurde in einem einzigen Peak eluiert.

'Die die Interferon-Aktivität von der zweiten CN-Säule enthaltenden Fraktionen (4 ml) wurden auf eine 4,6 X 250 mm-Säule auf der Basis einer Diphenylgruppen-enthaltenden Si02-Matrix, die vorher mit einem zweistündigen linearen Gradienten von Puffer A zu Puffer B (gleiche Puffer wie für die CN-Säule) vorbehandelt und mit Puffer A äquilibriert war, bei einer Durchflussrate von 1,5 ml/Min. gepumpt. .

Es wurde der folgende Gradient bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. verwendet: 0-25 % B, 22 Min. ; 25-50 %, 98 Min. Der zweite Peak, der eluiert wurde als das Gradient-Instrument 33 % Puffer B anzeigte, stimmte mit dem Interferon- Aktivitäts-Peak überein. Es wurden insgesamt 2,6 x 106 Einheiten (22 %) und 40 [xg Protein mit diesem Peak eluiert.

Die Diphenylgruppen-tragende Si02-Säule wurde folgender-massen hergestellt:

Si02 (10~2 mm, 10~D mm Porengrösse) wurde in 6N HCl (10:1, V/G) während 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln eingeweicht. Es wurde dann mit Wasser neutral gewaschen und anschliessend durch Waschen mit Aceton und Methanol das Wasser entfernt. Nach Trocknen unter vermindertem Druck über Nacht wurde die Kieselsäure (10 g) in 100 ml trockenem Toluol, das 10 ml Dichlordiphenylsilan enthielt, 6 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die so modifizierte Kieselsäure wurde zunächst mit 200 ml Toluol gewaschen und anschliessend in einem Soxhlet-Extraktor nacheinander mit 250 ml Toluol, Aceton und Methanol jeweils während 8 Stunden behandelt.

Schliesslich erfolgte Behandlung mit Trimethylchlorsilan in der vorstehend angegebenen Weise.

Je 3 g Trägermaterial wurden dann in 10,7 ml Chloroform und 2,3 ml n-Butanol suspendiert und in 4,6 x 250 mm-Säulen aus rostfreiem Stahl unter einem Druck von 340 atm. gefüllt. Die Säulen wurden anschliessend mit 75 ml Ethanol gewaschen.

Aminosäureanalysen der Mittelfraktion des erhaltenen Inter-feron-Peaks nach Hydrolyse in 5,7 N HCl lieferten die folgenden Ergebnisse:

Asx

15,4

17,6

17,95

15,2

Thr*

7,8

8,6

8,4

7,3

Ser

7,7

8,3

9,1

9,9

Glx

24,1

21,1

21,4

n.b.

Pro

2,8

n.b.

3,36

Gly

4,9

6,9

6,6

7,4

Ala

11,8

10,7

9,9

Cys n.b.

3,96

3,4

n.b.

Val

6,9

7,84

8,2

6,9

Met

2,8

4,5

3,7

Ile

8,7

8,6

8,9

7,8

Leu

25,0**

25**

Tyr

9,6

10,3

9,0

8,1

Phe

7,3

9,5

9,8

9,0

His

4,5

7,5

6,9

6,1

Lys

11,6

12,3

11,8

11,25

Arg

8,8

11,25

10,6

8,8

Trp n.b.

n.b.

2,93

24 Std.

24 Sdt.

48 Std.

24 Std.

TGS

TGS Thioglykolsäure

* unkorrigierter Wert

** Bezugswert n.b. nicht bestimmt

Hexosaminanalyse nach 6-, 14- und 24stündiger Hydrolyse des Interferons mit 5,7 N HCl, enthaltend 0,02 % Thioglykolsäure, bei 110°C, unter Verwendung der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule lieferte 3 Glucosaminreste pro Molekül. Es wurde weder Galactosamin noch Mannosamin -gefunden.

Die Endgruppenbestimmung wurde mit einer 90 pMol-Probe aus der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von der Diphenyl-säure durchgeführt und ergab Met als N-terminale Aminosäure.

150 pMol-Proben sowohl von Fibrolasten- wie von Leukkozy-ten-Interferon wurden dem tryptischen Abbau unterworfen und anschliessend chromatographiert. Es wurden in den beiden Proben keine identischen Peptidfragmente gefunden.

Durch Sequenzierung einer 1,25 nMol-Probe von Fibrobla-sten-Interferon wurde Met als N-terminale Aminosäure bestätigt, wie auch die von Hunkapillar und Hood, Biochemistry 17, 2124 (1978), berichtete Sequenz 3-10, nämIichTyr3-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10. Sequenzierung einer weiteren 5,9 nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon lieferte die folgende N-terminale Aminosäuresequenz:

H2N-Met1-Ser-Tyr-Asn-LeuJ-Leu-Gly-Phe-Leu-GlnI0-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe12-Gln-... .-Gln-Lys19-....

Beispiel 4

Rohes Interferon wurde aus menschlichen Fibroblasten (Zell-Linie GM 2504A) gewonnen. Das rohe Material wurde 1M bezüglich Natriumchlorid durch Zugabe gesättigter Natriumchloridlösung gemacht. Dieses Material wurde durch eine Säule von Blau Sepharose-4B (Volumen 20-25 ml, Durchmesser 2,5 cm, Durchflussmenge 2,5 ml/Min.) gegeben. Während des Beiadens wurde das Rohmaterial mit Eis gekühlt. Nach der Beladung

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

648 331

wurde die Säule mit 250 ml der folgenden Lösung (2,5 ml/Min.) gewaschen:

30% Ethylenglykol, 1 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Schliesslich wurde das Interferon bei einer Durchflussrate von 2,5 ml/Min. mit 250 ml der folgenden Lösung eluiert:

50% Ethylenglykol, 1 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Typische Ergebnisse des Assays waren:

5 % Aktivität im Durchfluss

10 % Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung 85 % Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung

Die Fraktionen des Interferon-Peaks aus der ersten Blau Sepharose-Säule wurden zusammengefasst und mit der folgenden Lösung auf einen Ethylenglykolgehalt von 10 % (VA') gebracht:

2 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).

Dieses Material wurde auf eine Blau Sepharose-Säule gegeben (Volumen 20-25 ml, 2,5 cm Durchmesser, Durchflussrate 2,5 ml/ Min). Es wurde mit 250 ml einer Lösung, enthaltend 2 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) und 30 % (V/V) Ethylenglykol gewaschen und eluiert mit einer Lösung, enthaltend 2 M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) und 50% (V/V) Ethylenglykol.

Typische Ergebnisse des Interferon-Assays waren: 19 % Aktivität im Durchfluss 30 % Aktivität in der 30 %igen Ethylenglykol-Lösung 60% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.

HPLC

Zunächst wurde die Probe aus dem 50 %igen (V/V) Ethylen-glykol-Eluat von Blau Sepharose untersucht. Es folgten Proben, die zweimal über die Blau Sepharose-Säule gegeben wurden, in welchen Fällen die 30 %igen oder die 50 %igen Ethylenglykol-Eluate verwendet werden konnten.

Es wurde eine 25 x 0,46 cm-Säule auf der Basis einer durch Octylgrupen modifizierten Si02-Matrix (Lichrosorb RP-8) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Wasser gewaschen und dann mit dem Eluat der Blau Sepharose-Säule beladen. Vor die Pumpe wurde eine Mischkammer (5 ml) geschaltet. Es wurde bei einer Durchflussrate von 22 ml/Std. mit dem folgenden stufenweisen Gradienten von n-Propanol, bei einem konstanten, durch 1M Ameisensäure/0,8 M Pyridin gewährleisteten pH von 4,2 gearbeitet:

0% 10 Min.; 30% 40 Min.; 32% 40 Min.

Schliesslich wurde die Säule mit 60 %igem n-Propanol gewaschen und vor der nächsten Verwendung mit 1M Ameisensäure und 0,8 M Pyridin äquilibriert.

Das Interferon wurde mit dem 32 %igen n-Propanol-Eluat (zwischen 80 und 90 Minuten) eluiert. Dieses Material war homogen aufgrund der NaDodS04-Acrylamid-Gelelektropho-rese (Färbung mit Coomassie Blau oder vorheriger Markierung der Probe mit Fluram).

Aminosäureanalysen (24stündige Hydrolyse, 0,2 % TGS, 5,7 5 N HCl) wurde an neun verschiedenen Proben aus vier unterschiedlichen Präparaten durchgeführt. Die mittlere Aminosäurezusammensetzung, bezogen auf einen Leucinwert von 22,0, geht aus der folgenden Tabelle hervor:

io Asx

15,1 ±0,7

Met

4,5 ±0,7

Thr*

7,0 ±0,5

Ile

9,4 ±0,1

Ser*

7,5 ±0,5

Leu

22,0

Gly

22,2 ± 0,5

Tyr

8,8 ±0,2

Pro nicht best.

Phe

8,0 ±0,3

15 Cys

3,0 ±0,3

His

4,5 ±0,1

Gly

6,9 ±0,7

Lys

11,0 ±0,6

Ala

7,4 ±1,0

Arg

11,9 ±0,7

Val

5,7 ±0,5

Trp nicht best.

* unkorrigierter Wert

20

Basierend auf den zu verschiedener Zeit durchgeführten Analysen verschiedener Proben, die durch unterschiedliche, in diesem und den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfah-25 ren erhalten wurden (24stündige Hydrolyse in 6 N HCl mit 0,2 % Thioglykolsäure, TGS, und bezogen auf einen Wert von Leucin von 22,0), weist homogenes Human-Fibroblasten-Interferon die folgende Aminosäurezusammensetzung auf:

Asx

15,1±2,3

Gly

6,9±1,0

Tyr

8,8±1,3

Thr*

7,0±1,0

Ala

7,4±1,1

Phe

8,0±1,2

Ser*

7,5±1,1

Val

5,7±0,8

His

4,5±0,7

Glx

22,2±3,3

Met

4,5±0,7

Lys

11,0±1,6

Pro

3,0±0,4

He

9,4±1,4

Arg

11,9±1,8

Cys

3,0±0,4

Leu

22,0

Trp

3,0±0,4

* unkorrigierter Wert

** Bezugswert

Beispiel 5

Homogenes Human-Fibroblasten-Interferon (1,5 mg) mit 40 einer spezifischen Aktivität von 4 x 108 Einheiten/mg wurde in 25 ml 5 %igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 x 106 Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei —20° C) aufbewahrt.

M

Claims

648 331

PATENTANSPRÜCHE

1. Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein, gekennzeichnet durch

(a) eine spezifische Aktivität von etwa 4x 108 Einheiten/mg; 5

(b) ein Molekulargewicht von etwa 20500 gemäss Natriumdode-cylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;

(c) die folgende relative Aminosäurezusammensetzung basierend auf 24-stündiger Hydrolyse in 6.0 N HCl, enthaltend 0,2 % Thioglycolsäure und bezogen auf einen Wert für Leucin von 22,0:10

Asx

Thr*

Ser*

Glx

Pro

Cys
15.1±2.3 7.0±1.0 7.5±1.1 22.2±3.3 3.0±0.4 3.0±0.4

Gly

Ala

Val

Met

Ile

Leu

6.9±1.0 7.4±1.1 5.7±0.8 4.5±0.7 9.4±1.4 22.0+

* unkorrigierter Wert

Tyr Phe His Lys Arg Trp

8.8±1.3 8.0±1.2 4.5±0.7 11.0±1.615 11.9+1.8 3.0±0.4

(d) die Aminosäure-Teilsequenz H2N-Met1-Ser-Tyr-Asn-Leu5- 20

Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe1:>-Gln- -Gin-

Lys19... und

(e) höchstens 3 Glucosaminreste, 0 Galaktosamin- und 0 Manno-saminreste pro Molekül. 25
2. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man
A. eine wässrige Lösung von Human-Fibrolasten-Interferon in unreinem Zustand auf eine Affinitäts-Chromatographie-Säule gibt, an der das Interferon adsorbiert wird, das Interferon eluiert und es in bestimmten Fraktionen des Eluates in höherer Reinheit erhält und
B. die erhaltenen Interferon-Fraktionen unter Hochdruckflüs-sigkeitschromatographie-Bedingungen über eine oder mehrere mit einem Puffer äquilibrierte Chromatographie-Säulen auf der Basis einer Cyclohexyl-, Phenyl-, Diphenyl-, Octyl-, Octadecyl-oder Cyanopropylgruppen-enthaltenden Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon adsorbiert wird, und jeweils mit einem Gradienten von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln in einem gepufferten sauren wässrigen System eluiert, so dass das Interferon in Form eines einzigen ausgeprägten Peaks in bestimmten Fraktionen des Eluats erhalten wird.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

dass man für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie Säulen auf der Basis einer Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Cyanopropylgruppen-enthaltenden Si02-Matrix verwendet.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

dass die Affinitäts-Chromatographie an einem Concanavalin A-Dextrangel und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie zuerst an eine Cyclohexylgruppen-enthaltenden Si02-Säule mit 50 steigendem n-Butanol-Gradienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/ 2-Propanol / n-Butanol / Wasser und anschliessend an einer Octylgruppen-enthaltenden SiOrSäule unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

dass bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:20:0:64 (Volumenteile) und dessen Endzusammensetzung 8:8:25:20:39 (Volumenteile) ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

dass die Affinitäts-Chromatographie an einem Blau Dextran und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Octylgruppen-enthaltenden Si02-Säule mit steigendem n-Butanol-Gra-dienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/2-Propa-nol/n-Butanol/Wasser durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,

dass bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten

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35

40

45

Gemischs 8:8:20:3,3:60,7 (Volumenteile) und dessen Endzusammensetzung 8:8:25:20:39 (Volumenteile) ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Octylgruppen-enthaltenden Si02-Säule elu-ierten, vereinigten Interferon-aktiven Fraktionen anschliessend an einer Cyanopropylgruppen-enthaltenden Si02-Säule rechro-matographiert werden mit steigendem n-Propanol-Gradienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/n-Propanol/Wasser.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:0:84 (Voumenteile) und dessen Endzusammensetzung 8:8:40:44 (Volumenteile) ist.
10. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:20:2,5:61,5 (Volumenteile) und dessen Endzusammensetzung 8:8:25:25:34 (Volumenteile) ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die von einer Cyanopropylgruppen-enthaltenden Si02-Säule eluierten, vereinigten Interferon-aktiven Fraktionen an der gleichen Säule rechromatographiert und anschliessend an einer Diphenylgruppen-enthaltenden Si02-Säule chromatogra-phiert werden.
12. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das rohe Human-Fibroblasten-Interferon aus einem serumfreien Präparat stammt, die Affinitäts-Chromatographie an einem Blau Dextrangel und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Octylgruppen-enthaltenden SiOz-Säule mit einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/n-Propanol/Wasser und diskontinuierlichem, stufenförmigem n-Propanol-Gradien-ten durchgeführt wird.
13. Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass folgender n-Propanol-Gradient eingehalten wird: 10 Minuten 0 Vol. ■- %, 40 Minuten 30Vol.-%und40 Minuten 32 Vol. ■- %, wobei das Interferon zwischen der 80. und 90. Minute eluiert wird.
14. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines homogenen Human-Fibroblasten-Interferons, gemäss Anspruch 1.
15. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 14 zur Behandlung viraler und neoplastischer Erkrankungen.

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