CH649844A5

CH649844A5 - Verfahren zur herstellung von autofluorogrammen.

Info

Publication number: CH649844A5
Application number: CH746/80A
Authority: CH
Inventors: Dennis Lynn Fost
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1979-03-30
Filing date: 1980-01-30
Publication date: 1985-06-14
Also published as: BE881400A; GB2046290B; DE3007132C2; FR2452713B1; GB2046290A; SE8000180L; CA1136293A; US4293436A; FR2452713A1; SE444230B; DE3007132A1; ATA108080A; AT368290B; JPH0122316B2; JPS55152779A; NL8000755A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Autofluorogrammen, die auf einem Film ein Trennmittel aufweisen, welches radioaktive Emitter enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man zwecks Steigerung der autofluorographischen Wirkung der Emitter das Trennmittel mit einem fluoreszierenden Stoff als Imprägnierungsmittel imprägniert, der in einem carbonsäurehaltigen Träger enthalten ist.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Imprägniermittel zur Durchführung dieses Verfahrens. Sie erstreckt sich weiterhin auf Autofluorogramme, die aus einem Trennmittel bestehen, das das genannte Imprägnierungsmittel enthält.

Die Erfindung schafft eine praktische, wirtschaftliche und empfindliche Möglichkeit zur Intensivierung der Wirkung schwacher, radioaktiver Strahlen, z.B. Beta-Strahler, wie Tritium und I4C, auf einen Film und eine neue Stoffzusammensetzung.

Zu Beginn seiner Anwendung hing das Verfahren der Au-toradiographie hauptsächlich von der direkten Wirkung der Strahlung radioaktiver Stoffe auf die strahlungsempfindlichen, in die Filmemulsion eingebetteten chemischen Partikelchen unter Bildung eines Photos, z.B. eines Röntgenpho-tos, ab, das entsteht, wenn eine solche radioaktive Materialien enthaltende Schicht oder Platte sandwichartig an die Emulsion angelegt und das Sandwich dabei belichtet wird.

Die verhältnismässig kurze Eindringtiefe schwacher radioaktiver Emitter, z.B. Beta-Strahler wie Tritium, erfordert eine ausserordentlich und unpraktisch lange Belichtungszeit und ergibt eine schlechte Auflösung, insbesondere wenn die die radioaktiven Materialien enthaltende Schicht verhältnismässig dick ist, wie dies bei Polyacrylamid-Elektrophoresege-len der Fall ist, die allgemein in der Autoradiographie verwendet werden.

Andrerseits macht gerade diese Eigenschaft schwacher radioaktiver Emitter sie sicherer und somit ihre Verwendung in der Autoradiographie äusserst erwünscht.

Auch sind diese schwachen Strahler die bevorzugten Ra-dionuclide für eine chemische Kombination mit organischen Verbindungen für viele Markierungs- und Indikatorzwecke.

Die Feststellung und Messung dieser energiearmen Nu-clide wurden mit der Entwicklung hochempfindlicher Geräte und mit der vermehrten Anwendung von Szintillatoren oder fluoreszierende Stoffe benutzenden Systemen drastisch verbessert, wobei durch die Strahlung der Szintillator unter Aussendung von Lichtblitzen oder Lichtemissionen erregt wird, deren Dauer für eine Messung ausreicht und die nicht durch die Materie, z.B. Polyacrylamidgel, welche sie vor ihrer Wahrnehmung durchwandern müssen, gehindert werden.

Diese Methode wurde auf die Autoradiographie angewendet. Obwohl die Bezeichnung Autoradiographie im weiten Sinne zutrifft, ist eine geeignetere Bezeichnung Autofluo-rographie, da die Radioaktivität durch den szintillierenden Stoff in Lichtemissionen umgewandelt wird und diese Lichtemissionen werden dann unter Erzielung der gewünschten Messung photographiert. Gemessen wird die Intensität des auf den photographischen Film gelangten Lichts, und dieses ist ein Mass für den Grad der Radioaktivität und zeigt dadurch z.B. die Reinheit oder die Menge einer radioaktiven

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Komponente oder den Zustand von tierischem Gewebe an. Ausser den vorstehend beschriebenen Nachteilen sollen

Im Fall der Chromatographie und Elektrophorese wird manchmal auch dickere Schichten aus adsorbierendem oder das zu messende radioaktive Material nach üblichen Metho- absorbierendem Material verwendet werden. Bei Anwendung den an oder in organischen oder anorganischen, absorbieren- jeder grösseren Dicke, d.h. einer Dicke von über etwa den oder adsorbierenden Schichten oder Säulen aus einem 5 o, 1 mm, wird durch die Sprühtechnik der fluoreszierende

Material wie z.B. Kieselsäuregel, Aluminiumoxid, Zellulose, oder szintillierende Stoff nicht mehr dicht genug an genug ra-

Polyamid, Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agar-Agar dioaktives Material herangebracht, was einen drastischen usw. absorbiert oder adsorbiert, wobei sich dieses Material in Verlust der Fähigkeit des fluoreszierenden Stoffs, durch die der Regel auf einer Platte, z.B. einer Glas- oder Kunststoff- emittierten Partikelchen erregt zu werden und diese in Licht platte,befindet. Das wird dann ein Chromatogramm oder ein i0 umzuwandeln, mit sich bringt.

Elektrophoretogramm genannt. Im Fall von radioaktiv mar- Der szintiliierende oder fluoreszierende Stoff muss somit kiertem tierischem Gewebe, z.B. bei der Gewebe-Autoradio- auf irgendeine Weise in das Innere des Trennmittels einge-

graphie, wird das radioaktive Material in der Regel den le- bracht werden. Eine solche Einbringungsmethode erfolgt benden Lebewesen verabreicht und wird dann selektiv in be- durch Tränken des aus absorbierendem oder adsorbierendem stimmten Geweben absorbiert oder adsorbiert, so dass das i5 Material bestehenden Trennmittels mit einem Bad, welches

Gewebe, in der Regel in Form eines Dünnschnitts, als die ab- den fluoreszierenden Stoff, gelöst in einem geeigneten Träger,

sorbierende oder adsorbierende Schicht angesehen werden enthält.

kann. Im Fall der Papierchromatographie bildet das Papier Zwei der für die Elektrophorese am häufigsten verwende-

(Zellulose) das Adsorbens. ten Trennmittel sind wässriges Polyacrylamid und Agargel.

Wenn das adsorbierende Material die Form einer dünnen, 20 Die Gelelektrophorese ist eine Methode zum Trennen gelade-

auf einer Platte befindlichen Schicht hat, spricht man von ner Teilchen, z.B. von Proteinen, wobei die geladenen Teil-

Dünnschichtchromatographie und einem Dünnschichtchro- chen unter der Einwirkung eines angelegten elektrischen Fel-

matogramm. des durch ein Gel wandern, und wobei ihre Bewegung durch

Üblicherweise erfolgt die photographische Aufnahme so, das von dem hydratisierten Gel gebildete Gitter, von der La-

dass die radioaktive Probe sandwichartig an der Filmemul- 25 dung und der Molekülgrösse oder dem Molekulargewicht ab-

sion anliegt. hängt. Wenn das elektrische Feld entfernt wird, befinden sich

Bei der Autoradiographie (in ihrem engeren Sinne) wird die Teilchen in Form einzelner Bänder in dem Gel, die entwe-

somit die Radioaktivität des zu testenden Materials durch ei- der für eine flüssige Szintillationszählung geschnitten werden nen für Radioaktivität empfindlichen Film gemessen. können oder im Falle von Radionucliden, z.B. Tritium, wel-

In der Autofluorographie wird ein fluoreszierender oder 3o ches energieärmere Partikelchen emittiert, vorzugsweise szintillierender Stoff, der durch Radioaktivität zur Aussen- durch Autofluorographie analysiert werden können.

dung von Licht angeregt wird, dicht neben dem radioaktiven Die derzeit am meisten angewendete Methode zur Her-

Material angeordnet und die Intensität des ausgesendeten Stellung von Polyacrylamidgels für die Autofluorographie ist

Lichts wird mittels eines photographischen Films, der für das in Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem., Band 46, Seiten

Licht empfindlich ist, gemessen. 35 83-88,1974, beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird.

Die Autofluorographie besitzt gegenüber der üblichen Bei dieser Methode wird das radioaktiv markierte Protein

Autoradiographie wesentliche Vorteile, deren wichtigster in durch Elektrophorese unter Verwendung eines wässrigen Po-

einer wesentlich kürzeren Belichtungsdauer bei Verwendung lyacrylamidgels abgetrennt, anschliessend wird das Gel in schwach radioaktiver Strahler, z.B. Tritium, besteht (typische dem etwa 20-fachen seines Volumens Dimethylsulfoxid

Verkürzung von 2 Wochen auf 16 bis 24 Stunden). 40 (DMSO) 30 Minuten lang eingeweicht und dann ein zweites

Trotz dieses wichtigen Vorteils besitzen jedoch die derzeit Mal 30 Minuten lang in frisches DMSO eingetaucht, um das bekannten autofluorographischen Methoden schwerwie- gesamte Wasser aus dem Gel zu verdrängen. Die nächste gende Nachteile, besonders in Systemen, bei welchen verhält- Stufe besteht im Einweichen des Gels in einer 20 gew. %igen nismässig dickere Schichten aus adsorbierenden oder absor- 1 Lösung von 2,5-Diphenyloxazol (PPO) in DMSO, um das bierenden Materialien für den Trennprozess verwendet wer- 45 Gel mit dem szintillierenden Stoff zu imprägnieren, welcher den; es trifft dies z.B. auf die Polyacrylamidgel-Elektropho- dann in dem Gel durch Waschen mit Wasser ausgefällt wird,

rese zu, die häufig in der Rezeptor-, Nucleinsäure- und En- Das Gel wird schliesslich getrocknet und der Film wird damit zymforschung angewendet wird. belichtet. Diese Methode besitzt zahlreiche Nachteile, wovon

Eines der Probleme besteht in der Entwicklung einer Me- viele in dem Anhang zu einem Artikel von Laskey and Mills thode, um den fluoreszierenden Stoff dicht an dem radioakti- 50 in Eur. J. Biochem., in Band 56, Seiten 335-341,1975, be-ven Strahler anzubringen und dort zu halten. Wenn er sich schrieben sind, worauf hier Bezug genommen wird. Weniger nicht in nächster Nähe befindet, erreicht ein Teil der emittier- als 2% Polyacrylamid (plus 0,5% Agargel) enthaltende Agar-ten radioaktiven Partikelchen nicht den fluoreszierenden gels oder auch Agar-Agar allein lösen sich in DMSO, wenn Stoff. Im Falle der Dünnschichtchromatographie kann der dieses nicht durch Methanol ersetzt wird. Selbst dieser Ersatz fluoreszierende Stoff in einem geeigneten Träger, z.B. Benzol 55 ist jedoch nur für Gele mit weniger als 2% Polyacrylamid oder Toluol, gelöst und dann auf die das Trennmittel bil- wirksam, da Gele mit höherer Polyamidkonzentration bei dende Dünnschicht, z.B. einen Papierstreifen, welcher die ra- Kontakt mit Methanol stark schrumpfen. Selbst bei einem dioaktive Probe enthält, aufgesprüht werden. Nach dem Gehalt von 30% Methanol kann ein Schrumpfen von Gelen Trocknen wird dann ein Stück eines für das von dem fluorés- mit höherer Polyacrylamidkonzentration eintreten. Ein wei-zierenden Stoff ausgesendete Licht empfindlichen Films auf- 60 terer Nachteil besteht darin, dass bei nicht vollständiger Entgelegt und dieses Sandwich lässt man dann während einer zur fernung des DMSO das Gel an dem Film ankleben kann und Belichtung ausreichenden Zeit stehen. Es ist schwierig, in ei- den Film schwärzt. Ein weiterer Nachteil liegt in der Fähig-nem solchen System eine gleichmässige Verteilung des fluo- keit von DMSO, durch die Haut jeder mit ihm oder dem da-reszierenden Stoffs zu erzielen, auch kann das radioaktive mit getränkten Gel umgehenden Person einzudringen, wo-Material sich ausbreiten und diffundieren und die kleinen 65 durch gelöstes Material mit dem DMSO in die Haut ein-Kristalle des fluoreszierenden oder szintillierenden Stoffs nei- dringt; auch wird dem Atem der damit umgehenden Person gen zu einer so lockeren Bindung, dass bei der Handhabung ein Knoblauchgeruch verliehen. Noch ein weiterer Nachteil der Probe grösste Vorsicht aufgewendet werden muss. besteht darin, dass die Gele für eine vollständige Imprägnie-

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rang 3 Stunden in die DMSO/fluoreszierender Stoff-Lösung eingeweicht werden müssen. Nachteilig ist ferner, dass hohe Konzentrationen an PPO, und zwar typischerweise Konzentrationen zwischen 14 und 19 Gew.-%, in der Imprägnierungslösung verwendet werden müssen. Noch ein Nachteil von DMSO sowie anderen üblichen Trägern besteht darin, dass PPO zwar wirksam absorbierte Strahlung in Photonen umwandelt, jedoch seine Fähigkeit, die von dem radioaktiven Emitter ausgesandte Energie zu absorbieren, begrenzt ist. Ein weiterer Nachteil ist auch, dass das Einweichen in DMSO zur Dehydratisierung des Gels zeitraubend ist.

Eine Methode zur Erhöhung der Absorptionsfähigkeit von PPO bei Anwendung der Dünnschichtchromatographie ist in Bonner and Stedman, Analytical Biochemistry, Band 89, Seiten 247-256,1978, beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird. In diesem Artikel sind drei Methoden zur Feststellung von 3H und 14C in Kieselsäuregel-Dünnschicht-chromatogrammen beschrieben. Bei der ersten Methode wird 2-Methylnaphthalin (2MN) verwendet, welches als Szintilla-tionslösungsmittel zur Verwendung in festen Systemen analog fluiden Szintillationsmedien beschrieben wird, welche häufig ein Lösungsmittel zusätzlich zu dem Szintillator enthalten. Wie in flüssigen Systemen sammeln die Lösungsmit-telmoleküle die Energie der emittierten Beta-Strahlung und übertzragen sie auf PRO-Moleküle, welche dann Photonen aussenden. Als Lösungsmittel sind auf diesem Gebiet der Technik Verbindungen geeignet, welche die von dem radioaktiven Strahler abgestrahlte kinetische Energie in Energie zur Elektronenerregung umwandeln und diese Energie auf den darin gelösten fluoreszierenden Stoff übertragen. Bei der ersten Methode wird die trockene Dünnschichtplatte in eine Lösung von 2MN eingetaucht, die durch Erwärmen verflüssigt wurde und 0,4 Gew./Vol.-% PPO enthält, bis die Platte getränkt ist, worauf sie aus der Lösung entnommen wird. Wenn die Lösung erstarrt ist, wird die Platte an den Film angelegt und belichtet. Wenn andererseits die Sprühmethode günstiger erscheint, werden 10% des 2MN durch Toluol ersetzt, wodurch die Lösung bei Raumtemperatur eine Flüssigkeit bildet. Die zweite Methode umfasst das Eintauchen der Platten in eine zwischen 7 und 30 Gew./Vol.-% PPO enthaltende Ätherlösung, Trocknen der Platten und dann wie vorstehend Belichten, wobei mit zunehmender PPO-Konzentra-tion eine bessere Empfindlichkeit festgestellt wird. Bei der dritten Methode werden die Dünnschichtplatten in geschmolzenes PPO getaucht, bis sie sich vollgesaugt haben, worauf man sie entfernt und dann bis zur Entfernung des Überschusses von PPO erwärmt und den Film wie vorstehend belichtet. Diese Systeme sind zwar für die Dünnschichtchromatographie geeignet, bei Anwendung mit anderen Medien, z.B. Poly-acrylamidgelplatten und verhältnismässig dickeren Trennmitteln, treten jedoch zahlreiche Probleme auf. Ein Problem besteht darin, dass weder PPO noch 2MN in Wasser in merklichem Ausmass löslich oder damit mischbar sind. Wässrige Polyacrylamid- oder Agargele werden daher im hydratisier-ten Zustand weder mit PPO noch mit 2MN imprägniert, noch ist dies im getrockneten Zustand möglich, da die Gitterstruktur beim Trocknen zusammenfällt. Ausserdem kommen PPO und 2MN sehr teuer, selbst wenn sie in solchen Systemen verwendbar wären. Die zweite Methode ist auch mit wässrigen Gelen nicht brauchbar, da Äther und ähnliche Lösungsmittel, z.B. Alkohole, ein drastisches Schrumpfen solcher Gele verursachen. Ferner sind für eine wirksame Fluorographie relativ hohe Konzentrationen (7 bis 30%) an teurem PPO in dem Äther erforderlich.

Die vorliegende Erfindung schafft die Voraussetzungen für eine hochempfindliche und wirkungsvolle autofluorogra-phische Technik, insbesondere für schwach radioaktive Strahler, wie Tritium und 14C, welche die vorstehend aufgezählten Nachteile vermeidet und bei welcher grössere Intensitäten und höhere und gleichmässigere Empfindlichkeiten und Trennschärfe zuverlässiger als bei den bekannten Methoden erzielt werden; die Erfindung ergibt dabei wirtschaftliche, praktische und äusserst anpassungsfähige Arbeitsweisen, indem sowohl die meisten üblichen radioaktiven Materialien und szintillierenden oder fluoreszierenden Stoffe als auch die meisten bekannten wässrigen Chromatogramme, Elektro-phoretogramme und tierische und pflanzliche Gewebe verwendet werden können.

Bevorzugt wird ein wässriges Trennmittel, z.B. ein tierisches oder pflanzliches Gewebe, mit einer wasserlöslichen oder mit Wasser mischbaren niederen Alkylcarbonsäure imprägniert, in welcher ein szintillierender oder fluoreszierender Stoff gelöst oder dispergiert ist, worauf man durch Einweichen in Wasser den fluoreszierenden Stoff innerhalb des Gels oder Gewebes ausfällt.

Vorzugsweise enthält die Dispersion des fluoreszierenden Stoffes in einer Carbonsäurelösung oder -dispersion noch ein Lösungsmittel, welches die Wirkung des fluoreszierenden Stoffs fördert. Bei Verwendung eines Lösungsmittels zusammen mit dem fluoreszierenden Stoff kann die Menge des verwendeten fluoreszierenden Stoffs weit unter die bisher erforderlichen Gehalte erniedrigt werden, ohne dass dabei die Menge des von dem fluoreszierenden Stoff emittierten Lichts wesentlich verringert wird. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel für sich bei Raumtemperatur ein Feststoff, um eine Diffusion des das radioaktive Material enthaltenden Flecks oder Bandes zu vermeiden.

Bei Verwendung wässriger Gele enthält die Lösung aus fluoreszierendem Stoff und Carbonsäure bevorzugt noch einen wasserlöslichen Alkohol, Äther, Glyzerin oder einen Alk-oxyalkohol, um die geringe Quellung, die manchmal bei Verwendung einer Carbonsäure beobachtet wird, herabzusetzen oder auszuschalten.

Stark bevorzugt erfolgt die Belichtung des imprägnierten Chromatogramms oder Elektrophoretogramms oder Gewebes bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise zwischen — 30 und — 100°C und noch besser zwischen — 60 und — 80°C.

Die für die Erfindung verwendete Carbonsäure soll wasserlöslich oder mit Wasser mischbar, gegenüber dem fluoreszierenden Stoff chemisch inert und dieser soll in ihr löslich sein. Da die Funktion der Carbonsäure und von deren Lösung darin besteht, den fluoreszierenden Stoff ins Innere des wässrigen Gels einzubringen, soll sie Wasser verdrängen. Ausserdem soll sie vorzugsweise bei Umgebungstemperatur flüssig sein, so dass das Gel bei Umgebungstemperatur in sie eingetaucht werden kann. Bevorzugte Carbonsäuren, die der vorstehenden Beschreibung genügen, sind niedere aliphatische (1 bis 5 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 3), die gegebenenfalls durch Halogen, Hydroxyl, Alkoxyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Carboxyl substituiert sein können. Besonders bevorzugt ist Essigsäure.

Der fluoreszierende Stoff kann jeder Stoff sein, welcher wirksam die Strahlung von der radioaktiv markierten Verbindung aufnimmt und eine Wellenlänge aussendet, welche derjenigen entspricht, für welche die Photoemulsion am empfindlichsten ist, der ferner in der Carbonsäure lösüch und in Wasser im wesentlichen unlöslich und gegenüber der Carbonsäure, radioaktivem Material und dem Gel chemisch inert ist. Bevorzugte fluorezierende Stoffe sind diejenigen mit einer hohen Quantenausbeute, d.h. diejenigen, welche in wirksamer Weise aufgenommene Strahlung in Licht umwandeln. Bevorzugte fluoreszierende Stoffe sind 2,5-Diphenyloxazol (PPO), Isopropyl-phenylbiphenylyloxadiazol (Isopropyl PBD), 2-[Napthyl-(l')]-5-phenyloxazol (a-NPO), tert.-Butylphenyl-biphenylyloxadiazol (Butyl PBD), p-Quaterphenyl oder Di-phenylacetylen. Bei kombinierter Verwendung mit einem Lö4

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sungsmittel, wie dies nachstehend beschrieben wird, und einem Röntgenfilm absorbiert der fluoreszierende Stoff vorzugsweise bei einer Wellenlänge zwischen etwa 270 und etwa 330 nm und emittiert zwischen etwa 340 und etwa 400 nm. Vorzugsweise ist der fluorezierende Stoff bei Umgebungstemperatur fest, um ein Verschmieren und ein mögliches Ausbreiten des Bands bei Ausfällung des fluoreszierenden Stoffs in dem Gel zu vermeiden. Die Imprägnierung kann jedoch auch in einem kalten Raum erfolgen, wenn fluoreszierende Stoffe verwendet werden sollen, die bei Umgebungstemperaturen Flüssigkeiten oder Öle sind.

Vorzugsweise enthält die Carbonsäure auch noch ein Lösungsmittel, welches die Energie von der radioaktiv markierten Verbindung aufnimmt und sie auf den fluoreszierenden Stoff überträgt, welcher dann Lichtquanten emittiert. Obwohl viele der für die vorliegende Erfindung geeigneten Lösungsmittel ebenfalls fluoreszierende Stoffe sein können, bildet die gesuchte Eigenschaft doch ihre Fähigkeit, die von dem radioaktiven Emitter empfangene kinetische Energie in elektronische Erregerenergie umzuwandeln und diese dann auf den fluoreszierenden Stoff zu übertragen. Solche Lösungsmittel sind bekannt und z.B. in der US-Patentschrift 3 068 178 beschrieben, auf welche hier Bezug genommen wird; dort sind die Lösungsmittel als «Zwischenlösungsmittel» («intermediate, solvents») bezeichnet. Das Lösungsmittel soll den fluoreszierenden Stoff lösen, soll in der Carbonsäure löslich, in Wasser im wesentlichen unlöslich und gegenüber dem fluoreszierenden Stoff, der Carbonsäure, dem radioaktiven Material und dem Gel chemisch inert sein. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel, wenn es bei Umgebungstemperatur ausgefällt wird, ein Feststoff; die Imprägnierung kann jedoch in einem kalten Raum erfolgen, wenn Lösungsmittel verwendet werden sollen, die nur bei niedrigeren Temperaturen Feststoffe bilden. Bevorzugte Lösungsmittel sind 2-Methylnaphthalin, 1-Methylnaphthalin, Naphthalin, Anthracen und Fluoren.

Obwohl dies nicht die bevorzugte Ausführungsform bildet, können doch, wenn die photographische Emulsion des Films für andere Wellenlängen als die des primären fluoreszierenden Stoffs empfindlich ist, sekundäre fluoreszierende Stoffe (Spektrumverschieber) zusammen mit dem primären fluoreszierenden Stoff zugegen sein, z.B. p-bis-[2-(4-Methyl-5-phenyloxazolyl)]benzol (Dimethyl-POPOP genannt), oder p-bis-(o-Methylstyryl)benzol (bis-MSB genannt), p-p'Diphenyl-stilben, 9,10-Diphenylanthracen, POPOP und Dibiphenylyloxazol (BBO). Diese sekundären fluoreszierenden Stoffe werden durch die von dem primären fluoreszierenden Stoff emittierte Wellenlänge unter Aussendung der Wellenlänge erregt, für welche die Photoemulsion am empfindlichsten ist, so dass man einen hohen Nutzeffekt erzielt. Eine mögliche Kombination fluoreszierender Stoffe ist ein Gemisch aus PPO und bis-MSB: auch ein Gemisch aus PPO und POPOP oder Dimethyl-POPOP ist geeignet.

Wesentlich ist, dass der fluoreszierende Stoff eine Wellenlänge aussendet, für welche die verwendete photographische Emulsion empfindlich ist.

Bei alleiniger Verwendung der Carbonsäure wird manchmal eine leichte Quellung des Gels beobachtet. Um diese Quellung zu verhindern, enthält die Zusammensetzung vorzugsweise noch einen Quellungsinhibitor, d.h. eine Verbindung, welche die Carbonsäure verdünnt und der durch die Carbonsäure verursachten Quellung durch eine Schrumpfung des Gels entgegenwirkt. Der Quellungsinhibitor soll gegenüber der radioaktiv markierten Verbindung, dem fluoreszierenden Stoff, dem Lösungsmittel, dem Gel und der Carbonsäure chemisch inert sein. Er soll vorzugsweise eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur sein und in der Carbonsäurelösung löslich oder damit mischbar sein. Ferner sollen auch der fluoreszierende Stoff und sein Lösungsmittel in dem Quellungsin-

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hibitor löslich sein. Der Quellungsinhibitor ist vorzugsweise eine Verbindung mittlerer Polarität, z.B. ein niederer Alkylal-kohol (1 bis 5 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 3), ein niederer Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 5 3)-äther, ein niederes Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 3)-glycerin oder ein Alkoxy (1 bis 3 Kohlen-stoffatome)-niederes alkyl (1 bis 5 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 3)-alkohol. Ein bevorzugter Quellungsinhibitor ist 2-Äthoxyäthanol.

Im Handel befindliche fluoreszierende Stoffe und Lösungsmittel enthalten manchmal Verunreinigungen, welche während der Lagerung eine Zersetzung, z.B. unter Gelbfärbung usw., verursachen können. Um dies zu verhindern oder zu hemmen, enthält die Zusammensetzung vorzugsweise ein 15 Antioxidationsmittel. Jedes gegenüber den Bestandteilen der Zusammensetzung inerte Antioxidationsmittel kann verwendet werden; ein bevorzugtes Antioxidationsmittel ist butylier-tes Hydroxytoluol (BHT).

Da schliesslich viele der in Betracht kommenden fluores-20 zierenden Stoffe und Lösungsmittel einen unangenehmen Geruch besitzen, kann auch noch ein geeignetes, im Handel befindliches Geruchsmaskierungsmittel zugesetzt werden, das gegenüber dem Gel, der radioaktiv markierten Verbindung und den anderen Bestandteilen der Lösung inert ist. 25 Eine Carbonsäurekonzentration zwischen 47,5 und 95 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 60 und 70 Gew.-%, hat sich als zufriedenstellend erwiesen. Bei gemeinsamer Verwendung mit einem Quellungsinhibitor wird die Konzentration vorzugsweise so gewählt, dass das zu behandelnde Gel weder 30 quillt noch schrumpft, während es sich mit der Lösung in Kontakt befindet.

Der fluoreszierende Stoff kann in Konzentrationen zwischen etwa 0,01 Gew.-% und der höchsten Konzentration, die noch in der Carbonsäure oder der Carbonsäure-Quel-35 lungsinhibitorlösung löslich ist, zugegen sein. Vorzugsweise hegt die Konzentration zwischen etwa 0,05 und etwa 20 Gew.-% und noch besser zwischen etwa 4 und etwa 6 Gew.-%. Im Gegensatz zum Stand der Technik wurde gefunden, dass die Wirkung nur leicht durch eine Abnahme der 40 Konzentration des fluoreszierenden Stoffs bis zum Erreichen einer Konzentration von etwa 5,0 Gew.-% beeinflusst wird.

Das Lösungsmittel kann in Konzentrationen zwischen etwa 0,1 Gew.-% und der Höchstkonzentration, die noch in der Carbonsäure oder der Carbonsäure-Quellungsinhibitor-4S lösung löslich ist, zugegen sein.Vorzugsweise beträgt seine 4 Konzentration zwischen etwa 2 und etwa 20 Gew.-% und noch besser zwischen etwa 4 und etwa 6 Gew.-%. Wenn ein Lösungsmittel einen Teil der Lösung bildet, wird die Konzentration des fluoreszierenden Stoffs zweckmässig um die 50 Menge des zugesetzten Lösungsmittels verringert. Demge-mäss beträgt die Konzentration an fluoreszierendem Stoff plus Lösungsmittel vorzugsweise zwischen etwa 2 und etwa 20 Gew.-% und noch besser zwischen etwa 4 und etwa 6 Gew.-%. In einer solchen Kombination liegt das Verhältnis 55 von Lösungsmittel zu fluoreszierendem Stoff zwischen etwa 10:1 und etwa 50:1 ; vorzugsweise wird so wenig wie möglich fluoreszierender Stoff verwendet.

Bei Verwendung eines sekundären fluoreszierenden Stoffs liegt das Verhältnis von primärem zu sekundärem fluoreszie-60 rendem Stoff in typischer Weise zwischen 100:1 und 5:1, je nach den speziellen fluoreszierenden Stoffen.

Der Quellungsinhibitor ersetzt zweckmässig einen Teil der Carbonsäure, um zu vermeiden, dass die Carbonsäure das zu behandelnde Gel merklich quellen lässt oder schrumpft. Die Konzentration des Quellungsinhibitors hegt vorzugsweise zwischen etwa 1 und 47 Gew.-% und noch besser zwischen etwa 20 und 35 Gew.-%. Vorzugsweise wird so wenig wie möglich des Quellungsinhibitors verwendet, da bei zuneh-

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menden Konzentrationen an Quellungsinhibitor offensicht- ' lieh die Menge des in dem Gel eingelagerten fluoreszierenden Stoffs und Lösungsmittels abnimmt.

Das Antioxidationsmittel wird in einer zur Verzögerung des Zersetzungsprozesses ausreichenden Menge zugesetzt, z.B. in einer Menge zwischen etwa 0,005 und etwa 0,2 Gew.-%.

Die zugesetzte Menge des Maskierungsmittels soll ausreichen, um den unerwünschten Geruch der Lösung herabzusetzen oder zu verbergen und seine Konzentration beträgt in typischer Weise zwischen etwa 0,05 und 0,5 Gew.-%.

Übliche Methoden zur Herstellung von Gewebeschnitten für die Gewebemikroskopie sind dem Fachmann bekannt. Der erhaltene Gewebeschnitt wird dann auf die gleiche Weise wie ein Gel behandelt.

Obwohl die Erfindung auf jedes radioaktive Material anwendbar ist, eignen sie sich doch besonders für schwache Alpha* und Beta-Strahler mit geringer Intensität, z.B. Tritium, I4C und35 Schwefel.

Theoretisch existieren Tausende verschiedener organischer Verbindungen, die radioaktiv markiert und erfindungs-gemäss behandelt werden können. Eine Aufzählung dieser Verbindungen erübrigt sich daher.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.

Beispiel

Ein Elektrophoretogramm wurde in üblicher Weise mit einer 1,5 mm dicken Platte aus Polyacrylamidgel mit einem linearen Acrylamidgefälle von 7,5 bis 20% auf einem Bogen aus Gelbond, einem im Handel befindlichen Kunststoffbogen aus Mylar mit einem hydrophilen Überzug, der von der Marine Colloids in Rockford, Maine, verkauft wird, hergestellt. Eine 3H-markierte Proteine enthaltende, zu analysierende Lösung, die durch Übertragung von Boten-Ribonukleinsäureex-trakt aus mit Adenovirus-2 infizierten HeLa-Kulturzellen unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocytlysat und 3H-Leucintracer (110 Ci/mmol), verkauft unter der Bezeichnung NET-460 von der New England Nuclear in Boston, Massachusetts, erhalten worden war, wurde in der Celplatte abgelagert und auf bekannte Weise einer Elektrophorese bei konstanter Stromzufuhr von 20 mA unterworfen.

Das radioaktiv markierte Protein wurde der Länge nach mit einer Geschwindigkeit durch das Gel transportiert, die hauptsächlich von der Molekülgrösse abhängt. Die Proteine mit verschiedenen Molekülgrössen trennten sich während ihrer Längswanderung in einzelne Bänder auf, wobei die Intensität jedes Bandes proportional zu der Menge an darin enthaltenem markiertem Protein war.

Nach der Elektrophorese wurde das Gel über Nacht in einer wässrigen Lösung eingeweicht, die 10 Gew./Vol.-% Tri-chloressigsäure, 10 Vol.-% Eisessig und 30 Vol.-% Methanol enthielt, wobei die Proteine in dem Gel fixiert wurden. Bei einem anderen identischen Beispiel wurde das Gel nur 1 Stunde unter Erzielung vergleichbarer Ergebnisse eingeweicht. Obwohl die Proteine bevorzugt auf diese Weise in dem Gel fixiert werden, kann diese Verfahrensstufe ausgelassen werden, in welchem Falle das Gel dann direkt von der Elektrophorese in die im nächsten Absatz beschriebene Lösung gebracht wird.

Eine 67 Gew.-% Eisessig, 28 Gew.-% 2-Äthoxyäthanol, 4,9 Gew.-% 2-Methylnaphthalin (2Mn) und 0,1 Gew.-%

2,5-Diphenyloxazol (PPO) enthaltende Lösung wurde hergestellt.

Das Gel wurde 1 Stunde in dieser Lösung eingeweicht und dann 1 Stunde in destilliertes Wasser zur Ausfallung des 2MN und des PPO innerhalb des Gels und somit in engem Kontakt mit dem radioaktiv markierten Protein eingetaucht. Die Ausfällung machte das Gel undurchsichtig, besass jedoch einen geringen oder gar keinen Einfluss auf die Autofluorographie. Obwohl es genügt, nur so viel der den fluoreszierenden Stoff enthaltenden Lösung zu verwenden, dass das Gel bedeckt ist, wird jedoch bevorzugt mindestens das Dreifache des Gelvolumens verwendet.

Die Platte wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Trockners für Gelplatten unter Verwendung von What-man # 1 Filterpapier als Unterlage getrocknet.

Nach vollständiger Trocknung wurde das Gel unter Bildung einer sandwichartigen Struktur an Kodak XR-5 X-OMat R Film angelegt und 24 Stunden bei -76°C belichtet, worauf man nach üblichen Methoden für Röntgenfilme entwickelte. Die durch Erregung der Beta-Strahlung des Tritiums in den mit Tritium markierten Proteinen erregte Lichtemission des fluoreszierenden Stoffs zeigte sich in Form schwarzer Bänder, deren Intensität und Grösse von der Intensität und Grösse der radioaktiven Bänder abhing, welche wiederum ein Mass für die Konzentration des jeweiligen radioaktiv markierten Proteins sind,das sich in jedem Band angesammelt hat.

Ein Vergleichsversuch ergab, dass bekannte Imprägnierlösungen von PPO in DMSO eine Einweichzeit von 3 Stunden zur Erzielung optimaler Ergebnisse erfordern, während die Imprägnierungslösung gemäss der Erfindung nur 1 Stunde zur Erzielung optimaler Ergebnisse benötigt. Wenn die Einweichdauer auf 1/2 Stunde für die jeweiligen Zusammensetzungen herabgesetzt wird, ergibt die vorliegende Erfindung das Doppelte der beim Stand der Technik erzielten Steigerung. Bei einstündiger Einweichdauer für die jeweiligen Zusammensetzungen ergibt die Erfindung um 10 bis 15% Leistungssteigerung gegenüber dem Stand der Technik.

Obwohl die Erfindung vorstehend im Zusammenhang mit verhältnismässig dickeren Trennmitteln beschrieben wurde, kann sie auch gegebenenfalls in der Dünnschichtchromatographie Anwendung finden. Die Lösung könnte in diesen Fällen auch aufgesprüht werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wurde zwar vorstehend in bezug auf Trennmittel beschrieben, welche die radioaktive Probe bereits enthalten, es kann jedoch auch zur Behandlung vor Abscheidung der Probe in dem Trennmittel angewendet werden. Bei einer solchen Vorbehandlung würde das Trennmittel in der Carbonsäure oder der Carbonsäure-Quellungs-inhibitorlösung, welche den fluoreszierenden Stoff oder fluoreszierenden Stoff und Lösungsmittel enthält, eingeweicht und dann würde der fluoreszierende Stoff oder fluoreszierender Stoff und Lösungsmittel durch Kontaktieren des Mittels mit Wasser ausgefällt. Das vorbehandelte Gel kann dann entweder wie es ist aufbewahrt oder getrocknet und zur Verwendung als Trennmittel später wieder hergestellt werden. Das ist im Gegensatz zu bekannten Behandlungsmethoden, bei welchen die Fähigkeit des behandelten Mittels, insbesondere Agargel, für Trennzwecke verwendbar zu sein, weitgehend zerstört wird.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von Autofluorogrammen, die auf einem Film ein Trennmittel aufweisen, welches radioaktive Emitter enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man zwecks Steigerung der autofluorographischen Wirkung der Emitter das Trennmittel mit einem fluoreszierenden Stoff als Imprägnierungsmittel imprägniert, der in einem carbonsäurehaltigen Träger enthalten ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den fluoreszierenden Stoff im Trennmittel ausfallt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel mit dem fluoreszierenden Stoff in der Carbonsäure weniger als 3 Stunden kontaktiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der fluoreszierende Stoff in einer Konzentration zwischen 0,05 und 20 Gew.-% zugegen ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass noch ein Lösungsmittel für den fluoreszierenden Stoff zugegen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel in einer Konzentration zwischen 0,1 und 20 Gew.-% zugegen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kombination aus fluoreszierendem Stoff und Lösungsmittel zwischen 0,1 und

20 Gew.-% und das Verhältnis von Lösungsmittel zu fluoreszierendem Stoff 10:1 bis 50:1 beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich noch ein Quellungsinhibitor in einer zur Herabsetzung der Quellung oder des Schrumpfens des Trennmittels ausreichenden Konzentration verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Trennmittel ein wässriges Agargel, Polyacrylamid- oder Agar-Agar-Polyacrylamidgel verwendet wird.

10. Imprägnierungsmittel zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bestehend aus einem fluoreszierenden Stoff in einem Carbonsäureträger.

11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der fluoreszierende Stoff in einer Konzentration zwischen 0,05 und 20 Gew.-% zugegen ist.

12. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es noch ein Lösungsmittel für den fluoreszierenden Stoff enthält.

13. Mittelnach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel in einer Konzentration zwischen 0,1 und 20 Gew.-% zugegen ist.

14. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kombination aus fluoreszierendem Stoff und Lösungsmittel zwischen 0,1 und 20 Gew.-% und das Verhältnis von Lösungsmittel zu fluoreszierendem Stoff 10:1 bis 50:1 beträgt.

15. Mittel nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es noch einen Quellungsinhibitor in einer zur Herabsetzung der Quellung oder des Schrumpfens eines Quellmittels ausreichenden Konzentration enthält.

16. Autofluorogramm, bestehend aus einem wässrigen, mit einem Mittel gemäss Anspruch 10 imprägnierten Trennmittel, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

17. Autofluorogramm nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel weniger als 5 Gew.-% fluoreszierenden Stoff enthält.

18. Autofluorogramm nach Anspruch 16, bestehend aus einem wässrigen, mit einem fluoreszierenden Stoff und einem Lösungsmittel imprägnierten, einen radioaktiven Emitter enthaltenden Trennmittel, wobei der fluoreszierende Stoff und das Lösungsmittel in unmittelbarer Nähe des radioaktiven

Emitters zur Intensivierung des autofluorographischen Effekts angeordnet sind.

19. Autofluorogramm nach Anspruch 16 als radioaktiv markiertes tierisches oder pflanzliches Gewebe, enthaltend einen radioaktiven Emitter, imprägniert mit einem Mittel gemäss Anspruch 10, sowie ein Lösungsmittel, wobei der fluoreszierende Stoff und das Lösungsmittel in unmittelbarer Nähe des radioaktiven Emitters zur Intensivierung des autofluorographischen Effekts angeordnet sind.