CH649925A5 - Gewebeklebstoff. - Google Patents

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CH649925A5
CH649925A5 CH1175/80A CH117580A CH649925A5 CH 649925 A5 CH649925 A5 CH 649925A5 CH 1175/80 A CH1175/80 A CH 1175/80A CH 117580 A CH117580 A CH 117580A CH 649925 A5 CH649925 A5 CH 649925A5
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fibrinogen
factor xiii
tissue adhesive
inhibitor
cold
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Otto Dr Schwarz
Yendra Dr Linnau
Franz Loeblich
Thomas Dr Seelich
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Immuno Ag
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Description

Die Erfindung betrifft einen Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen mit einem Gehalt an Faktor XIII und Fibrinogen.
Es ist seit langem bekannt, Blutgerinnungssubstanzen zur Stillung von Blutungen bzw. für Wundversiegelungen heranzuziehen. Nach den ersten derartigen Vorschlägen wurden Fibrintampons bzw. Fibrinplättchen verwendet. Während des Zweiten Weltkrieges wurden Gewebeklebun-gen mit Hilfe von Blutplasma vorgeschlagen.
In letzter Zeit wurde von H. Matras u.a. in der «Wiener Medizinischen Wochenschrift», 1972, Seite 517, ein Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII zur nahtlosen interfaszikulären Nerventransplantation im Tierexperiment beschrieben.
Eine weitere Studie stammt von Spängier u.a. in der «Wiener Klinischen Wochenschrift», 1973, Seiten 1 bis 7. Auch hier wurde in Tierversuchen die Möglichkeit aufgezeigt, mit Hilfe von Fibrinogen als Kryopräzipitat und Thrombin eine Gewebeklebung vorzunehmen.
Die bekannten Präparate haben sich noch nicht als zufriedenstellend erwiesen, weil sie die an einen Gewebeklebstoff zu stellenden Forderungen, welche die folgenden sind: a) hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen sowie sichere und anhaltende Blutstillung, d.h. gute Haftfähigkeit des Klebers an den Wund- bzw. Gewebs-flächen, sowie hohe innere Festigkeit desselben,
b) regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper,
c) vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses,
d) wundheilungsfördernde Eigenschaften,
noch nicht in ausreichendem Mass erfüllen. Dies mag teilweise darauf zurückzuführen sein, dass die für die Blutstillung notwendigen Gerinnungsfaktoren in den bekannten Präparaten nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander vorhanden waren und auch daran, dass die fibrinolytische Aktivität im Klebebereich nur ungenügend beherrscht wurde. Es kam häufig durch enzymatische Einwirkung zu einer vorzeitigen Auflösung der Gewebeklebungen.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, einen Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII menschlichen oder tierischen Ursprungs zu schaffen, der die eingangs angeführten Voraussetzungen erfüllt.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass es erforderlich ist, bestimmte Mengen von Fibrinogen und Faktor XIII vorzusehen und ein bestimmtes Verhältnis zwischen diesen einzuhalten sowie die fibrinolytische Aktivität durch einen Inhibitor zu hemmen.
Dementsprechend ist die Erfindung durch folgende Merkmale gekennzeichnet:
a) dass Faktor XIII in einer Menge von wenigstens 7 Einheiten/ml und Fibrinogen in einer Menge von wenigstens 70 mg/ml enthalten ist, wobei das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt, und b) dass ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor in einer Menge von 20 bis 2000 KIE pro ml enthalten ist.
Vorteilhaft ist der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor Aprotinin.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Gewebeklebstoff kälteunlösliches Globulin, welches, wie festgestellt werden konnte, die Wirksamkeit fördert.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsart der Erfindung enthält der Gewebeklebstoff zusätzlich Albumin, wobei das Gewichtsverhältnis von Fibrinogen, kälteunlöslichem Globulin und Albumin 60 bis 98 : 0,5 bis 20 : 0 bis 15 beträgt. Das Albumin übt eine stabilisierende Wirkung auf die Komponenten des Gewebeklebstoffes aus.
Der Gewebeklebstoff gemäss der Erfindung besitzt charakteristische Vernetzbarkeitseigenschaften, welche nach der Natriumlaurylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophore-se-Methode bestimmbar sind. Der Test wird derart durchgeführt, dass nach dem Vermischen des Gewebeklebstoffes mit dem gleichen Volumen einer Lösung, enthaltend 40 (iMol CaCl2 und 15 NIH-Einheiten (US National Institute of Health-Einheiten) Thrombin pro ml, die Mischung bei 37 °C inkubiert wird. Der Vernetzungsgrad wird nach Stoppen der Reaktion und reduktiver Spaltung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrücken durch Zugabe eines Gemisches von Harnstoff, Natriumdodecylsulfat und ß-Mercaptoätha-nol durch Gelelektrophorese bestimmt. Charakteristisch für den erfindungsgemässen Gewebeklebstoff ist eine vollständige Vernetzung der Fibrin-y-Ketten nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35%ige Vernetzung der Fibrin-a-Ketten nach 2 Stunden.
Die Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zur Herstellung des beschriebenen Gewebeklebstoffes, wobei man von menschlichem bzw. tierischem Plasmakryopräzipitat ausgeht. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Natriumzitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhi-
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bitor oder Plasmin-Inhibitor enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt und der gereinigte Niederschlag gelöst wird.
Vorteilhaft wird das Kryopräzipitat aus humanem oder tierischem Frischplasma hergestellt, welches bei —20 °C eingefroren wurde. Bei Erhöhung der Temperatur auf 0 bis 2 °C wird das Kryopräzipitat gewonnen und durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Pufferlösung, mit der das Kryopräzipitat behandelt wird, soll einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 aufweisen. Das kältelösliche Plasmaprotein wird durch Zentrifugieren unter Einhaltung einer Temperatur von 0 bis 4 °C abgetrennt. Der gereinigte Niederschlag wird sodann mit der Pufferlösung so lange gewaschen, bis die gewünschten Verhältnisse von Faktor XIII zu Fibrinogen bzw. das angestrebte Verhältnis des Fibrinogens, des kälteunlöslichen Globulins und des Albumins erreicht ist.
Der gelöste gereinigte Niederschlag kann durch Tieffrieren haltbar gemacht werden.
Der Gewebeklebstoff gemäss der Erfindung weist eine universelle Anwendbarkeit auf. Er kann zum nahtlosen Verbinden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen verwendet werden.
Bevorzugte Anwendungsgebiete, auf welchen der erfin-dungsgemässe Gewebeklebstoff erfolgreich eingesetzt werden kann, sind: Indikationen im Bereich der Hals-, Nasen-, Ohren- und Kieferchirurgie, Zahnheilkunde, Neurochirurgie, plastischen Chirurgie, allgemeinen Chirurgie, Abdominalchirurgie, Thorax- und Gefasschirurgie, Orthopädie, Unfallchirurgie, Urologie, Ophthamologie und Gynäkologie.
Vorteilhaft wird vor der Applikation des erfindungsge-mässen Gewebeklebstoffes auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht.
178,51 humanes, bei — 20 °C tiefgefrorenes Frischplasma wurden auf +2 °C erwärmt. Das erhaltene Kryopräzipitat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bei +2 °C mit 81 einer Pufferlösung, enthaltend 6,6 g Na3-Citrat • 2H20, 3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 Glucose • 1H20 und 50 000 KIE Aprotinin pro Liter, und einem pH-Wert von 6,5 behandelt und nochmals bei +2 °C zentrifugiert. Die Behandlung mit der erwähnten Pufferlösung und das anschliessende Zentrifugieren wurden einmal wiederholt. Der abgetrennte Niederschlag wurde durch Erwärmen auf 37 °C verflüssigt.
In dem so erhaltenen Produkt war Aprotinin in einer Konzentration von 50 KIE pro ml vorhanden. Das Verhältnis Fibrinogen zu kälteunlöslichem Globulin zu Albumin wurde in dem Produkt mit 86,2 : 6,7 : 2,2 bestimmt. Diese Bestimmung wurde ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, u. zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer mit ß-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebers durchgeführt. An Faktor XIII wurden 13,8 Einheiten/ml gefunden bzw. betrug das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, 152. Fibrinogen war in einer Menge von 90,6 mg/ml enthalten.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten erfolgte mittels eines Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Mass für die darin enthaltene Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Citratplasma erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Der Vernetzungstest nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-elektrophorese-Methode ergab eine vollständige Fibrin-y-Vernetzung nach 5 Minuten und eine 68%ige Fibrin-aVernetzung nach 2 Stunden. Das Endprodukt wurde in Endbehälter abgefüllt und zur Lagerung bei — 20 °C tiefgefroren.
Nach einer abgewandelten Verfahrensweise ist es auch möglich, den Plasminogen-Aktivator-Inhibitor bzw. den Plasmin-Inhibitor in einem späteren Stadium zuzufügen, wie durch das folgende Beispiel 2 erläutert wird:
112,51 humanes, bei —20 °C tiefgefrorenes Frischplama wurden auf +2 °C erwärmt. Das entstandene Kryopräzipitat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bei + 2 °C mit 101 einer Pufferlösung, enthaltend 6,6 g Na3-Citrat • 2H20,3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 g Glucose • 1H20 pro Liter, und einem pH-Wert von 6,5, gewaschen und nochmals bei +2 °C zentrifugiert. Der abgetrennte Niederschlag wurde durch Erwärmen auf 37 °C verflüssigt. Die so erhaltene Lösung wurde mit 50 KIE Aprotinin pro ml versetzt.
In dem so erhaltenen Produkt wurde das Verhältnis Fibrinogen zu kälteunlöslichem Globulin zu Albumin mit 91,0 : 5,3 : 1,1 bestimmt. Diese Bestimmung wurde ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, u.zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer mit ß-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebers durchgeführt. An Faktor XIII wurden 15,7 Einheiten/ml gefunden bzw. betrug das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, 170. Fibrinogen war in einer Menge von 92,1 mg/ml enthalten.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten erfolgte mittels eines Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Mass für die darin enthaltene Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Citratplasma erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Der Vernetzungstest nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-elektrophorese-Methode ergab eine vollständige Fibrin-y-Vernetzung nach 5 Minuten und eine 87%ige Fibrin-a-Vernetzung nach 2 Stunden. Das Endprodukt wurde in Ein-weg-Injektionsspritzen abgefüllt und zur Lagerung bei - 20 °C tiefgefroren.
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Claims (6)

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1. Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen mit einem Gehalt an Faktor XIII und Fibrinogen, gekennzeichnet durch die folgenden Merkmale:
a) dass Faktor XIII in einer Menge von wenigstens 7 Einheiten/ml und Fibrinogen in einer Menge von wenigstens
70 mg/ml enthalten ist, wobei das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt, und b) dass ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor in einer Menge von 20 bis 2000 KIE pro ml enthalten ist.
2. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor Aprotinin ist.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich kälteunlösliches Globulin enthält.
4. Gewebeklebstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich Albumin enthält, wobei das Gewichtsverhältnis von Fibrinogen, kälteunlöslichem Globulin und Albumin 60 bis 98 : 0,5 bis 20 : 0 bis 15 beträgt.
5. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebstoffes nach Anspruch 1 aus Plasmakryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Na-triumcitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt und der gereinigte Niederschlag gelöst wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der gelöste gereinigte Niederschlag durch Tieffrieren haltbar gemacht wird.
CH1175/80A 1979-02-15 1980-02-13 Gewebeklebstoff. CH649925A5 (de)

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