ES2348230T3

ES2348230T3 - Prevención y reducción de la isquemia.

Info

Publication number: ES2348230T3
Application number: ES03757339T
Authority: ES
Inventors: Shirish Hirani; Anthony Williams; Arthur C. Ley; Robert C. Ladner
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2023-06-06
Also published as: PT1941867E; PT2298278E; ATE528014T1; US20140349940A1; EP1941867A1; US10245307B2; EP1531791A4; US20090082267A1; US20080131426A1; US7811991B2; AU2011201811A1; US20080200646A1; US20080076712A1; JP2010155842A; EP2298278B1; US20080152656A1; DK1531791T3; JP5249251B2; ES2528254T3; DE60333758D1

Abstract

Polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática, para su utilización en la prevención o en la reducción de la isquemia o en la prevención o en la reducción de la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] Las proteasas están involucradas en una amplia gama de rutas biológicas. En particular, las proteasas de serina tales como calicreína, plásmido, elastasa, activador de plasminógeno urocinasa, trombina, inhibidor de coagulación humano asociado con lipoproteínas, y factores de coagulación tales como factores VIIa, IXa, Xa, XIa, y XIIa han estado implicados en rutas que afectan al flujo sanguíneo, por ejemplo, isquemia general y focal, invasión tumoral, fibrinólisis, pérdida de sangre perioperatoria, e inflamación. Los inhibidores de proteasas de serina específicos, por lo tanto, han recibido atención como dianas de fármacos potenciales para varias enfermedades isquémicas. [0002] Un inhibidor de este tipo, la aprotinina (también llamado inhibidor de tripsina pancreática bovina o BPTI), obtenido a partir de pulmón bovino, se ha aprobado en los Estados Unidos para su uso profiláctico en la reducción de la pérdida de sangre perioperatoria y la necesidad de transfusión en pacientes que sufren de derivación cardiopulmonar (CPB), por ejemplo, en el transcurso de un procedimiento de derivación de la arteria coronaria con injerto. La aprotinina se encuentra disponible comercialmente bajo el nombre comercial TRASYLOL® (Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut) y se había aprobado previamente para su uso para el tratamiento de la pancreatitis. La eficacia de la aprotinina se asocia con sus capacidades relativamente no específicas para inhibir una variedad de proteasas de serina, incluyendo calicreína plasmática y plásmido. Estas proteasas son importantes en una serie de rutas del sistema de activación por contacto (CAS). [0003] El CAS se activa inicialmente cuando la sangre total contacta con la superficie de los sustratos extraños (por ejemplo, caolín, vidrio, sulfato de dextrano, o superficies dañadas del hueso). La calicreína, una proteasa de serina, es una enzima de plasma que inicia la cascada del CAS, que conduce a la activación de neutrófilos, plasmina, coagulación y varias cininas. La calicreína se secreta como zimógeno (precalicreína) que circula como una molécula inactiva hasta que se activa mediante un evento proteolítico temprano en la cascada de activación por contacto. Claramente, la inhibición específica de la calicreína sería un enfoque muy atractivo para controlar la pérdida de sangre asociada con CPB y el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica (SIR), tal como se encontraría durante, por ejemplo, varios procedimientos quirúrgicos invasivos. [0004] A pesar de ser el único compuesto con licencia para la prevención de pérdida de sangre perioperatoria en CPB para procedimientos de derivación de la arteria coronaria con injerto (CABG), la aprotinina no es tan ampliamente utilizada como cabría esperar. Existe una gran preocupación respecto al uso de este polipéptido bovino en pacientes que requieren CPB, y en particular el uso de este compuesto en procedimientos CABG. La aprotinina no es específica de la calicreína, sino que interactúa con otras enzimas (por ejemplo, plasmina) en múltiples rutas. Así, el mecanismo de acción de la aprotinina es muy especulativo, y la falta de comprensión exacta de lo que se ve afectado durante el tratamiento con aprotinina produce el riesgo de complicaciones durante el tratamiento. Una complicación citada con frecuencia es la trombosis sin control, debido a las acciones de la aprotinina en la ruta fibrinolítica. Existe una preocupación no sólo sobre esos casos hiperagudos, tales como trombosis de los vasos mayores en el período perioperatorio, sino también sobre la permeabilidad del injerto después del procedimiento CABG. Además, como proteína natural obtenida de pulmón bovino, la administración de la aprotinina en humanos puede provocar hipersensibilidad severa o reacciones anafilácticas o anafilactoides después de la primera y, más a menudo, después de la administración repetida a los pacientes. Esto es particularmente preocupante en el gran número de pacientes que tienen procedimientos repetidos de CABG. Además, existe una creciente preocupación pública sobre el uso de materiales procedentes de fuentes bovinas como un vector potencial para la transmisión de la encefalopatía espongiforme bovina a los humanos. [0005] Estas preocupaciones dejan claro que sigue habiendo una necesidad de medios y procedimientos más eficaces y más específicos para prevenir o reducir la pérdida de sangre perioperatoria y el inicio de SIR en un paciente sometido a cirugía que resulta en la activación del CAS, tal como procedimientos CABG en pacientes de CPB, o de reemplazo de cadera. El documento WO 95/21601 se refiere a dominios Kunitz homólogos a BPTI, que inhiben la calicreína, y para el uso terapéutico y de diagnóstico de estas proteínas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente descripción, que incluye la invención, se basa en el descubrimiento de péptidos que inhiben las proteasas de serina. Las proteasas de serina tales como, por ejemplo, calicreína, están implicadas en, por ejemplo, rutas que conducen a la pérdida excesiva de sangre perioperatoria y el inicio de una respuesta inflamatoria sistémica. Los inhibidores de péptido de calicreína preferidos incluyen los descritos en las patentes US 6.333.402 y 6.057.287 de Markland et al. La presente descripción se dirige en parte a la utilización de los péptidos en procedimientos terapéuticos y composiciones adecuadas para su uso en la eliminación o en la reducción de varias isquemias, pero no limitado a la pérdida de sangre perioperatoria y el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica. La pérdida de sangre perioperatoria se produce por procedimientos quirúrgicos invasivos que provocan la activación por contacto de componentes de complemento y los sistemas de coagulación/fibrinólisis. Más específicamente, la presente descripción proporciona procedimientos de utilización de inhibidores de calicreína para reducir o prevenir la pérdida de sangre perioperatoria y una respuesta inflamatoria sistémica en pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos invasivos, especialmente cirugías cardiotorácicas. [0007] En un caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la isquemia en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xas49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1), en el que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o están ausentes; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Asp y Gln; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr; Xaal3 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Gln y Lys; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn y Ile; Xaa21 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Trp, Phe, Tyr, His y Ile; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Asp, Glu, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Gln, Asn Asp, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Phe y Tyr, y en el que el polipéptido inhibe la calicreína. [0008] En un caso particular, la isquemia es pérdida de sangre perioperatoria, debido a un procedimiento quirúrgico que se realiza en el paciente. El procedimiento quirúrgico puede ser una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonal o derivación de la arteria coronaria con injerto. [0009] En un caso particular, las posiciones individuales de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede ser uno o más de los siguientes: Xaa10 es Asp, Xaa11 es Asp, Xaa13 es Pro, Xaa15 es Arg, Xaa16 es Ala, Xaa17 es Ala, Xaa18 es His, Xaa19 es Pro, Xaa21 es Trp, Xaa31 es Glu, Xaa32 es Glu, Xaa34 es Ile, Xaa35 es Tyr, Xaa39 es Glu. [0010] En otro caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1), en el que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o están ausentes; Xaa10 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Gln y Lys; Xaa15 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Pro, Glu, Leu, Ile y Asn; Xaa21 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Trp, Phe, Tyr, His y Ile; Xaa22 es un aminoácido seleccionado del grupo formado por: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado del grupo formado por: Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Gln, Asn Asp, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado del grupo formado por: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un amino ácido seleccionado del grupo consistente en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado del grupo consistente en: Phe y Tyr, y en el que el polipéptido inhibe la calicreína. En un caso particular, el procedimiento quirúrgico puede ser una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria con injerto. En un caso particular, las posiciones individuales de los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede ser uno o más de las siguientes: Xaa10 es Asp, Xaa11 es Asp, Xaa13 es Pro, Xaa15 es Arg, Xaa16 es Ala, Xaa17 es Ala, Xaa18 es His, Xaa19 es Pro, Xaa21 es Trp, Xaa31 es Glu, Xaa32 es Glu, Xaa34 es Ile, Xaa35 es Tyr, Xaa39 es Glu. [0011] En todavía otro caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína. En un caso, el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria con injerto. [0012] En otro caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la isquemia en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína. En un caso particular, la isquemia puede ser la pérdida de sangre perioperatoria debido a un procedimiento quirúrgico en el paciente. En un caso, el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria con injerto. [0013] En todavía otro caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 5-60 de la SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína. En un caso, el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria con injerto. [0014] En otro caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir la isquemia en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 5-60 de SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína. En un caso particular, la isquemia puede ser la pérdida de sangre perioperatoria debido a un procedimiento quirúrgico en el paciente. En un caso, el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria con injerto. [0015] Basada en la descripción aquí contenida, la presente invención proporciona [0016] Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática, para su uso en la prevención o la reducción de la isquemia o el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica asociada a un procedimiento quirúrgico en un paciente. y El uso de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática, en la preparación de un medicamento para prevenir o reducir la isquemia o el inicio de la respuesta inflamatoria sistémica asociada a un procedimiento quirúrgico en un paciente. [0017] Estos aspectos de la presente invención, y realizaciones preferidas de la misma, se indican en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0018]

La figura 1 es un diagrama simplificado de las principales rutas múltiples y eventos implicados en el sistema de activación por contacto y la respuesta inflamatoria sistémica (SIR) que pueden surgir en un paciente sometido un traumatismo del tejido blando y óseo, tal como el asociado con un procedimiento de derivación de la arteria coronaria con injerto (CABG), especialmente cuando el procedimiento CABG implica la circulación de sanguínea extracorpórea, tal como la derivación cardiopulmonar (Aparato de Derivación). Las flechas indican la activación de un componente o un evento a otro componente o evento en la cascada. Las flechas en ambos sentidos indica la activación de efectos de componentes o eventos en ambas direcciones. Las flechas de trazos indican la probable participación de un componente

o un evento en la activación de otro componente o evento. Las abreviaturas son las siguientes: “tPA” = activador del plasminógeno tisular; “C5a” = un componente de proteína del sistema del complemento: “fXIIa” = activador de la proteína de la precalicreína para formar calicreína activa; “extrínseco” = sistema de coagulación extrínseco, “intrínseco” = sistema de coagulación intrínseco.

La figura 2 muestra una porción de ADN y una secuencia deducida de aminoácidos correspondiente para un polipéptido KI de la presente descripción en plásmido pPIC-K503. El ADN insertado codifica el péptido de señal prepro mata de Saccharomyces cerevisiae (subrayado) fundido en el marco del terminal amino del polipéptido PEP-1 KI que tiene la secuencia de aminoácidos encerrada en el área enmarcada. La secuencia de aminoácidos del polipéptido PEP-1 KI que se muestra en el área enmarcada es SEQ ID NO: 2, y la correspondiente secuencia de codificación del nucleótido del polipéptido KI es SEQ ID NO: 3. Las flechas de trazos indican la localización y la dirección de dos secuencias iniciadoras PCR en las regiones AOX que fueron utilizadas para producir las plantillas de la secuencia. La secuencia de ADN de toda la secuencia de nucleótidos de la figura comprende la secuencia de codificación estructural para la proteína de fusión y se designada SEQ ID NO: 27. La porción con doble subrayado de la secuencia indica una secuencia de sonda de diagnóstico. BstBI y EcoRI indican las posiciones de sus respectivos sitios palindrómicos, hexaméricos, y de endonucleasa de restricción en la secuencia. Los asteriscos indican los codones de parada de traducción.

Las figuras 3A y 3B muestran una alineación de secuencias de aminoácidos de casos preferidos de la presente descripción, la secuencia LACI nativa de la que se derivaron estas variantes (SEQ ID NO: 32), y otros dominios Kunitz conocidos (SEQ ID NOS: 29-31 y 33 a 53). Se destacan los residuos de cisteína.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0019] A continuación se incluye una descripción de casos preferidos de la presente descripción. [0020] La presente descripción, que incluye la invención, se basa en el descubrimiento de un grupo de polipéptidos inhibidores de la calicreína (KI) que inhiben la calicreína plasmática, con una especificidad que permite su uso en procedimientos mejorados de prevención o reducción de la isquemia, tales como, por ejemplo, la pérdida de sangre perioperatoria y/o una respuesta inflamatoria sistémica (SIR) inducida mediante calicreína, especialmente, por ejemplo, en pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos y, en particular, procedimientos quirúrgicos con cirugía cardiotorácica, por ejemplo, derivación cardiopulmonar (CPB), tal como procedimientos de derivación de la arteria coronaria con injerto (CABG). KIs se pueden utilizar específicamente para, por ejemplo, cirugía cardíaca pediátrica, trasplante de pulmón, reemplazo total de cadera y trasplante ortotópico de hígado, y para reducir o prevenir accidentes cerebrovasculares perioperatorios durante CABG, oxigenación de membrana extracorpórea (ECMO) y accidentes cerebrovasculares (ACV) durante estos procedimientos. [0021] La cirugía cardiotorácica es la cirugía de la zona del pecho, más comúnmente el corazón y los pulmones. Las enfermedades típicas tratadas mediante cirugía cardiotorácica incluyen enfermedades de la arteria coronaria, tumores y cánceres de pulmón, esófago y la pared torácica, anomalías de válvulas y vasos del corazón, y defectos de nacimiento que implican el pecho o el corazón. Si se utiliza cirugía cardiotorácica para el tratamiento, el riesgo de pérdida de sangre (por ejemplo, isquemia inducida por la cirugía) y la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica (SIR) que se incurre en SIR inducida por cirugía puede resultar en una disfunción orgánica grave (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; SIRS).

Polipéptidos útiles según la presente descripción

[0022] Polipéptidos KI útiles según la presente descripción comprenden polipéptidos de dominio Kunitz. En un caso, esos dominios Kunitz son formas variantes de la estructura de bucle que comprenden el dominio Kunitz 1 de proteína inhibidora de coagulación asociada a lipoproteínas (ILAC) humana. LACI contiene tres estructuras de bucle de péptidos internas, bien definidas, que son paradigmas de dominios Kunitz (Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). Los tres dominios Kunitz de LACI confieren la capacidad de unirse e inhibir la calicreína, aunque no con una afinidad excepcional. Las variantes de dominio Kunitz 1 de LACI aquí descritas se han cribado, aislado y unido a calicreína con una afinidad y especificidad mejoradas (véase, por ejemplo, las patentes US 5.795.865 y 6057287). Un ejemplo de un polipéptido preferido útil según la presente descripción tiene la secuencia de aminoácidos definida por los aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2. [0023] Cada polipéptido útil según la presente descripción se une a la calicreína, y los polipéptidos preferidos son también inhibidores de la calicreína (KI), tal como se determina usando ensayos de unión e inhibición de la calicreína conocidos en el técnica. La afinidad y la especificidad mejoradas para la calicreína de los polipéptidos de dominio Kunitz variante aquí descritos proporcionan la base para su uso en cirugía cardiotorácica, por ejemplo, procedimientos quirúrgicos CPB y especialmente CABG, para prevenir o reducir la pérdida de sangre perioperatoria y/o la aparición de SIR en pacientes que sufren estos procedimientos. Los polipéptidos KI utilizados según la presente descripción tienen o comprenden la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de dominio Kunitz variante aislado originalmente mediante bibliotecas de cribado de fagos por su capacidad de unirse a la calicreína. [0024] Los polipéptidos KI útiles en los procedimientos y en las composiciones de la presente descripción comprenden un polipéptido de dominio Kunitz que comprende la secuencia de aminoácidos:

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“Xaa” se refiere a una posición en una cadena de péptidos que puede ser cualquiera de una pluralidad de diferentes aminoácidos. Por ejemplo, para los péptidos KI aquí descritos, Xaa10 puede ser Asp o Glu; Xaa11 puede ser Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala o Thr; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln; Xaa15 puede ser Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln; Xaa16 puede ser Ala, Gly, Ser, Asp

o Asn; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln o Thr, Xaa18 puede ser His, Leu, Gln o Ala; Xaa19 puede ser Pro, Gln, Leu, Asn o Ile; Xaa21 puede ser Trp, Phe, Tyr, His o Ile; Xaa31 puede ser Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile o Thr, Xaa32 puede ser Glu, CTV, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val; Xaa34 puede ser Ile, Thr, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o Leu; Xaa35 puede ser Tyr, Trp o Phe; Xaa39 puede ser Glu, Gly, Ala, Ser o Asp. Los aminoácidos Xaa6, Xaa7, Xaa8, Baa9, Xaa20, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27, Xaa28, Xaa29, Xaa41, Xaa42, Xaa44, Xaa46, Xaa47, Xaa48, Xaa49, Xaa50, Xaa52, Xaa53 y Xaa54 pueden ser cualquier aminoácido. Además, cada uno de los prímeros cuatro y los últimos tres aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pueden estar opcionalmente presentes o ausentes y pueden ser cualquier aminoácido, si está presente. [0025] Los péptidos definidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 forman un conjunto de polipéptidos que se unen a la calicreína. Por ejemplo, en un ejemplo preferido de la presente descripción, un polipéptido KI útil en los procedimientos y en las composiciones de la presente descripción tiene las siguientes posiciones variables: Xaa11 puede Asp, Gly, Ser o Val; Xaa13 puede ser Pro, Arg, His o Asn; Xaa15 puede ser Arg o Lys; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 puede ser Ala, Asn, Ser o Ile; Xaa18 puede ser His, Leu o Gln; Xaa19 puede ser Pro, Gin o Leu; Xaa21 puede ser Trp o FA; Xaa31 es Glu; Xaa32 puede ser Glu o Gln; Xaa34 puede ser Ile, Thr o Ser; Xaa35 es Tyr, y Xaa39 puede ser Glu, Gly o Ala. [0026] Un caso más específico de la presente descripción se define por los siguientes aminoácidos en posiciones variables: Xaa10 es Asp; Xaa11 es Asp; Xaa13 puede ser Pro o Arg; Xaa15 es Arg; Xaa16 puede ser Ala o Gly; Xaa17 es Ala, Xaa18

5 es His; Xaa19 es Pro; Xaa21 es Trp; Xaa31 es Glu, Xaa32 es Glu; Xaa34 puede ser Ile

o Ser, Xaa35 es Tyr, y Xaa39 es Gly. [0027] También comprendidos en el ámbito de la presente descripción hay péptidos que comprenden porciones de los polipéptidos aquí descritos. Por ejemplo, los polipéptidos podrían comprender dominios de unión para epítopes específicos de

10 calicreína. Estos fragmentos de los polipéptidos aquí descritos también estarían incluidos. [0028] Los polipéptidos KI útiles en los procedimientos y las composiciones aquí descritas comprenden un dominio Kunitz. Un subconjunto de las secuencias comprendidas en la SEQ ID NO: 1 se describen a continuación (donde no se indica,

15 “Xaa” se refiere al mismo conjunto de aminoácidos que se permiten para la SEQ ID NO: 1)

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[0029] Las figuras 3A y 3B proporcionan una alineación de secuencias de aminoácidos de estas secuencias, la secuencia nativa LACI de la que estas variantes

fueron derivadas (SEQ ID NO: 32), y otros dominios Kunitz conocidos (SEQ ID NOS: 29-31 y 33-53). [0030] El polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 es el polipéptido que se va a utilizar según la presente invención. [0031] Los polipéptidos KI útiles en los procedimientos y las composiciones aquí descritas, que incluyen el polipéptido KI que se va a utilizar según la presente invención, se puede hacer de manera sintética utilizando cualquier protocolo y equipo de síntesis de polipéptidos estándar. Por ejemplo, la síntesis por pasos de un polipéptido KI aquí descrito se puede realizar mediante la eliminación de un grupo de protección de un terminal amino (N) de un aminoácido inicial (es decir, terminal carboxi), y acoplando al mismo el extremo carboxilo del siguiente aminoácido en la secuencia del polipéptido. Este aminoácido está también adecuadamente protegido. El grupo carboxilo del aminoácido entrante se puede activar para reaccionar con el terminal N del aminoácido unido mediante la formación en un grupo reactivo, tal como la formación en un carbodiimida, un anhídrido de ácido simétrico, o un grupo “éster activo”, tal como ésteres de hidroxibenzotriazol o pentafluorofenilo. Los procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida preferidos incluyen el procedimiento BOC, que utiliza terc-butiloxicarbonilo como grupo de protección αamino, y el procedimiento FMOC, que utiliza 9-fluorenilmetloxicarbonilo para proteger el α-amino de los residuos de aminoácidos. Ambos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia (Stewart, J. y Young, J., Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co., San Francisco 1989); Merrifield, J., 1963. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154; Bodanszky, M. y Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York 1984)). Si se desea, se pueden diseñar otros aminoácidos de terminal amino y/o carboxi en la secuencia de aminoácidos y añadidos durante la síntesis de polipéptidos. [0032] Alternativamente, los polipéptidos de dominio Kunitz y los polipéptidos KI útiles en las composiciones y en los procedimientos de la presente descripción, incluyendo el polipéptido KI que se va a utilizar según la presente invención, pueden producirse mediante procedimientos recombinantes utilizando cualquiera de una serie de células y los correspondientes vectores de expresión, incluyendo pero no limitado a vectores de expresión bacterianos, vectores de expresión de levadura, vectores de expresión de baculovirus, vectores de expresión de virus de mamíferos, y similares. Los polipéptidos de dominio Kunitz y los polipéptidos KI útiles en las composiciones y en los procedimientos de la presente descripción, incluyendo el polipéptido KI que se va a utilizar según la presente invención, también se pueden producir transgénicamente utilizando moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de codificación para un dominio Kunitz o un polipéptido KI aquí descrito, en donde la molécula de ácido nucleico puede estar integrada y expresada desde el genoma de un animal huésped utilizando procedimientos transgénicos disponibles en la técnica. En algunos casos, podría ser necesario o conveniente fusionar la secuencia de codificación para un polipéptido de dominio Kunitz o un polipéptido KI que comprende el dominio Kunitz en otra secuencia de codificación en un vector de expresión para formar un polipéptido de fusión que se pueda expresar fácilmente en una célula huésped. Preferiblemente, la célula huésped que expresa un polipéptido de fusión también procesa el polipéptido de fusión para obtener un dominio Kunitz o un polipéptido KI útiles según la presente descrción, que sólo contiene la secuencia deseada de aminoácidos. Obviamente, si cualquier otro aminoácido(s) permanece(n) unido(s) al dominio Kunitz o polipéptido KI expresado, estos aminoácido(s) adicional(es) no debe(n) disminuir la unión de la calicreína y/o la actividad inhibitoria de la calicreína del dominio Kunitz o el polipéptido KI para evitar el uso del polipéptido en los procedimientos o en las composiciones de la presente descripción. [0033] Un sistema preferido de expresión recombinante para la producción de polipéptidos KI útiles en los procedimientos y en las composiciones aquí descritas es un vector de expresión de levadura, lo que permite una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido KI o polipéptido de dominio Kunitz a enlazarse en el mismo marco de lectura con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de péptido líder prepro matα de Saccharomyces cerevisiae, que a su vez está bajo el control de un promotor de levadura operativo. El plásmido recombinante de expresión de levadura resultante puede transformarse entonces mediante procedimientos estándares en las células de un huésped apropiado de levadura compatible, cuyas células son capaces de expresar la proteína recombinante a partir del vector de expresión de levadura recombinante. Preferiblemente, una célula de levadura huésped transformada con este vector de expresión recombinante es capaz de procesar la proteína de fusión para proporcionar un polipéptido KI activo útil en los procedimientos y las composiciones de la presente descripción, por ejemplo, el polipéptido KI que se va a utilizar según la presente invención. Un huésped de levadura preferido para la producción de polipéptidos de dominio Kunitz recombinantes y polipéptidos KI que comprenden estos dominios Kunitz es Pichia pastoris.

[0034] Tal como se indicó anteriormente, los polipéptidos KI que son útiles en los procedimientos y en las composiciones aquí descritas pueden comprender un polipéptido de dominio Kunitz aquí descrito. Algunos polipéptidos KI pueden comprender una secuencia flanqueadora adicional, preferiblemente con una longitud de uno a seis aminoácidos, en el extremo terminal amino y/o carboxi, siempre y cuando estos aminoácidos adicionales no disminuyan significativamente la afinidad de unión de la calicreína o la actividad de inhibición de la calicreína para evitar su uso en los procedimientos y en las composiciones aquí descritas. Estos aminoácidos adicionales pueden añadirse deliberadamente para expresar un polipéptido KI en una célula huésped recombinante particular o se pueden añadir para proporcionar una función adicional, por ejemplo, para proporcionar un péptido para enlazar el polipéptido KI a otra molécula o para proporcionar una fracción de afinidad que facilita la purificación del polipéptido. Preferiblemente, el aminoácido(s) adicional(es) no incluye(n) cisteína, lo que podría interferir con los enlaces disulfuro del dominio Kunitz. [0035] Un ejemplo de un polipéptido de dominio Kunitz preferido útil en los procedimientos y en las composiciones de la presente descripción tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 30 a 60 de la SEQ ID NO: 2. Cuando se expresa y se procesa en un sistema de expresión de proteína de fusión de levadura (por ejemplo, basado en el plásmido de expresión de integración pHIL-D2), este polipéptido de dominio Kunitz retiene un dipéptido Glu-Ala de terminal amino adicional con la secuencia del péptido líder prepro matα de S. cerevisiae. Cuando secretada desde la célula huésped de levadura, la mayoría del péptido líder se procesa a partir de la proteína de fusión para producir un polipéptido KI funcional (indicado como “PEP-1”) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (véase región enmarcada en la figura. 2). [0036] Los polipéptidos KI particularmente preferidos útiles en los procedimientos y en las composiciones aquí descritas tienen una afinidad de unión a la calicreína, que es del orden de 1000 veces superior a la de la aprotinina, que actualmente está aprobada para su uso en procedimientos de cirugía coronaria para reducir la pérdida de sangre. Las afinidades de unión sorprendentemente altas de estos polipéptidos KI aquí descritos indican que estos polipéptidos KI presentan un alto grado de especificidad para la calicreína para la exclusión de otras dianas moleculares (véase la tabla 1, a continuación). Así, la utilización de estos polipéptidos de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo, la utilización del polipéptido KI según la presente invención, reduce gran parte de la especulación sobre los posibles objetivos terapéuticos en un paciente. El menor grado de especificidad mostrado, por ejemplo, por la aprotinina, provoca posibles efectos secundarios pleiotrópicos y ambigüedad en cuanto a su mecanismo terapéutico. [0037] Los polipéptidos definidos mediante, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 contienen posiciones invariables, por ejemplo, las posiciones 5, 14, 30, 51 y 55 puede ser Cys solamente. Otras posiciones tales como, por ejemplo, las posiciones 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53 y 54 pueden ser cualquier aminoácido (incluidos los aminoácidos que no se producen naturalmente). En un caso particularmente preferido, uno o más aminoácidos corresponden a los de una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 32, véase la figura 3). En un caso preferido, al menos una posición variable es diferente de la de la secuencia nativa. En otro caso preferido, los aminoácidos pueden estar, cada uno de forma individual o colectiva, sustituidos por una sustitución de aminoácido conservativo o no conservativo. Las sustituciones de aminoácidos conservativos reemplazan un aminoácido con otro aminoácido de estructura química similar y pueden no tener ningún efecto sobre la función de las proteínas. Las sustituciones de aminoácidos no conservativas reemplazan un aminoácido con otro aminoácido de estructura química diferente. Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen, por ejemplo, Asn -> Asp, Arg-> Lys, y Ser -> Thr. En un caso preferido, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y/o 21 de estos aminoácidos puede seleccionarse independiente o colectivamente, en cualquier combinación, para corresponder a la posición correspondiente de la SEQ ID NO: 2. [0038] Otras posiciones, por ejemplo, las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 y 45, pueden ser cualquiera de un conjunto seleccionado de aminoácidos. Así, la SEQ ID NO: 1 define un conjunto de secuencias posibles. Cada miembro de este conjunto contiene, por ejemplo, una cisteína en las posiciones 5, 14, 30, 51 y 55, y cualquiera de un conjunto específico de aminoácidos en las posiciones 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 31, 32, 34, 35, 39, 40, 43 y

45. En un caso preferido, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y/o 19 de estos aminoácidos pueden seleccionarse independiente o colectivamente, en cualquier combinación, para corresponder con la posición correspondiente de la SEQ ID NO: 2. El péptido tiene preferiblemente al menos un 80 %, al menos un 85 %, por lo menos un 90% o al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

Procedimientos y composiciones

[0039] La presente descripción se dirige también a procedimientos para prevenir o reducir la isquemia. Se prefieren procedimientos para prevenir o reducir la pérdida de sangre perioperatoria y/o una respuesta inflamatoria sistémica (SIR) en un paciente, especialmente asociadas con la cirugía cardiotorácica. Un procedimiento de tratamiento implica la administración de un polipéptido KI que comprende un dominio Kunitz. Un caso del procedimiento implica la utilización de un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que tiene una afinidad para la calicreína, que es aproximadamente 1000 veces o más mayor que la de una proteasa de serina de amplio espectro, por ejemplo, aprotinina, que se aísla de pulmón bovino y actualmente aprobado para su uso en procedimientos CABG (TRASYLOL®, Bayer Corporation Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut). [0040] Los pacientes sometidos a cualquiera de una serie de procedimientos quirúrgicos, especialmente los relacionados con la circulación extracorpórea, por ejemplo, cirugía cardiotorácica, tal como, por ejemplo, CPB, y/o traumatismos óseos, tales como división esternal o reemplazo de cadera, están en riesgo de pérdida de sangre perioperatoria e inflamación. El contacto de la sangre de un paciente con las superficies de corte de hueso o de equipos de CPB es suficiente para activar una o varias respuestas en cascada indeseables, incluyendo un sistema de activación por contacto (CAS), que puede provocar grandes pérdidas de sangre perioperatoria que requieren transfusión de sangre inmediata, así como una respuesta inflamatoria sistémica (SIR), que, a su vez, puede resultar en un daño permanente en tejidos y órganos. Si bien no se desea estar limitado a un mecanismo o teoría particular, parece que la pérdida de sangre que se produce asociada con la cirugía cardiotorácica, por ejemplo, CPB, tal como en un procedimiento CABG, probablemente resulta en una fuga capilar extensiva, que puede resultar en una pérdida significativa de sangre, que debe reemplazarse de inmediato mediante transfusión de sangre. [0041] Los procedimientos aquí descritos son útiles para prevenir o reducir varias isquemias, incluyendo, por ejemplo, pérdida de sangre perioperatoria y SIR en un paciente sometido a un procedimiento quirúrgico, y especialmente cuando el procedimiento quirúrgico requiere circulación extracorpórea, por ejemplo, cirugía cardiotorácica, tal como, por ejemplo, CPB. Los procedimientos de la presente descripción son particularmente útiles para prevenir o reducir la pérdida de sangre perioperatoria y/o SIR en un paciente sometido a un procedimiento CABG que requiere CPB u otra cirugía cardíaca. [0042] Las composiciones preferidas para uso médico comprenden un polipéptido KI aquí descrito. Dichas composiciones útiles también pueden comprender uno o más tampones, portadores, y excipientes farmacéuticamente aceptables, que pueden proporcionar una característica deseable a la composición, incluyendo, pero no limitado a, la administración mejorada de la composición a un paciente, una vida media circulante mejorada del polipéptido KI de la composición, una compatibilidad mejorada de la composición con los componentes químicos de la sangre del paciente, un almacenamiento mejorado de la composición, y/o una eficacia mejorada de la composición en la administración a un paciente. Además de un polipéptido KI aquí descrito, las composiciones también pueden comprender uno o varios compuestos farmacéuticamente activos diferentes que proporcionan un beneficio profiláctico o terapéutico adicional a un paciente de un procedimiento quirúrgico invasivo. [0043] Las composiciones útiles en los procedimientos de la presente descripción comprenden cualquiera de los polipéptidos de dominio Kunitz o polipéptidos KI que comprenden los polipéptidos de dominio Kunitz aquí descritos. Particularmente preferidos son los polipéptidos KI que comprenden un polipéptido de dominio Kunitz que tienen una secuencia de 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de este tipo de polipéptido KI particularmente preferido útil en los procedimientos y las composiciones de la presente descripción es el polipéptido KI PEP-1 que tiene la secuencia de 60 aminoácidos de la SEQ ID NO:

2. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 se proporciona en la SEQ ID NO: 3 (véase, por ejemplo, los nucleótidos 309-488 en la figura 2). Se entiende que, basándose en el código genético conocido, la presente descripción también proporciona formas degeneradas de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 sustituyendo simplemente uno o más de los codones conocidos degenerados para cada aminoácido codificado mediante la secuencia de nucleótidos. Los nucleótidos 7-180 de la SEQ ID NO: 3, y sus formas degeneradas, codifican el polipéptido de dominio Kunitz que no se produce naturalmente que tiene la secuencia de 58 aminoácidos de los aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2. [0044] Cualquiera de una variedad de moléculas de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 7-180 de la SEQ ID NO: 3, formas degeneradas, y porciones de los mismos, incluyendo pero no limitado a, genomas de fagos recombinantes, vectores virales recombinantes de mamíferos, vectores recombinantes virales de insectos, mini cromosomas de levadura, y varios plásmidos. Estos plásmidos incluyen los utilizados para clonar y/o expresar estas secuencias de codificación de nucleótidos. Los vectores de expresión proporcionan un promotor, que se puede enlazar operativamente a una secuencia de nucleótidos particular y a una célula huésped apropiada, que es capaz de transcribir la secuencia de codificación de nucleótidos particular en un ARN mensajero funcional (ARNm), así como traducir el ARNm en el polipéptido correspondiente. Un polipéptido así producido se puede aislar a continuación de la célula huésped. Las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio Kunitz o un polipéptido KI aquí descrito se pueden hacer mediante procedimientos de síntesis de ácidos nucleicos, metodologías de ADN recombinante, procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y cualquier combinación de los mismos.

Pérdida de sangre perioperatoria y flujo de sangre cardíaca reducida

[0045] Debido a los muchos avances en la medicina, una serie de procedimientos quirúrgicos muy invasivos se llevan a cabo cada día que se traducen en pérdida de sangre, o se colocan pacientes en un alto riesgo de pérdida de sangre. Estos pacientes deben monitorizarse cuidadosamente para restablecer y mantener el suministro normal de sangre y la hemostasia, y pueden necesitar transfusiones de sangre. Los procedimientos quirúrgicos que implican la pérdida de sangre incluyen los que implican procedimientos de circulación extracorpórea, tal como la cirugía cardiotorácica, por ejemplo, CPB. En estos procedimientos, el corazón de un paciente se detiene y la circulación, la oxigenación, y el mantenimiento del volumen de sangre se llevan a cabo artificialmente mediante un circuito extracorpóreo y un oxigenador de membrana sintética. Estas técnicas se utilizan comúnmente durante la cirugía cardíaca. Además, es evidente que la cirugía implica un trauma extensivo de los huesos, tales como la división esternal necesaria en procedimientos CABG o reemplazo de cadera, también se asocia con la activación del CAS, lo cual puede resultar en una variedad de trastornos en la sangre y la vasculatura. [0046] La enfermedad de la arteria coronaria aterosclerótica (CAD) provoca un estrechamiento del lumen de una o varias de las arterias coronarias, lo que limita el flujo de sangre al miocardio (es decir, el músculo cardíaco) y puede causar angina de pecho, insuficiencia cardíaca e infartos de miocardio. En la etapa final de la aterosclerosis coronaria, la circulación coronaria puede ocluirse casi completamente, causando peligro para la vida por angina o insuficiencia cardíaca, con una mortalidad muy alta. Los procedimientos CABG pueden requerir derivar el vaso sanguíneo ocluido y restablecer el flujo sanguíneo al corazón, que son potencialmente esclavos para la vida. Los procedimientos CABG se encuentran entre las cirugías más invasivas en las que una o varias venas o arterias sanas se implantan para proporcionar una “derivación” alrededor de la zona ocluida del vaso enfermo. Los procedimientos CABG llevan consigo un riesgo perioperatorio pequeño pero importante, pero tienen mucho éxito en proporcionar a los pacientes un alivio inmediato de la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. A pesar de estos resultados muy alentadores, con frecuencia son necesarios repetidos procedimientos CABG, tal como se indica mediante un claro aumento en el número de pacientes que eventualmente sufren un de segundo e incluso tercer procedimientos; la mortalidad perioperatoria y la morbilidad apreciada en los procedimientos CABG primarios aumenta en estos procedimientos adicionales. [0047] Han habido mejoras en las técnicas quirúrgicas mínimamente invasivas para CAD sin complicaciones. Sin embargo, casi todos los procedimientos CABG realizados para enfermedad cardíaca valvular y/o congénita, trasplante de corazón, y los principales procedimientos de la aorta, se siguen realizando en los pacientes con el apoyo de CPB. En CPB, grandes cánulas se insertan en los vasos mayores de un paciente para permitir el bombeo mecánico y la oxigenación de la sangre usando un oxigenador de membrana. La sangre se devuelve al paciente sin que fluya a través de los pulmones, que están hipoperfundidos durante este procedimiento. El corazón se detiene usando una solución de cardiopléjica, el paciente se enfría para ayudar a prevenir daños cerebrales, y el volumen periférico circulante aumentado en un circuito extracorpóreo, es decir, el circuito CPB, que requiere “cobertura” con sangre de donantes y las mezclas salinas que se utilizan para rellenar el circuito extracorpóreo. CPB ha sido ampliamente utilizado en una variedad de procedimientos realizados durante casi medio siglo con resultados exitosos. La interacción entre las superficies artificiales, las células sanguíneas, las proteínas de la sangre, el endotelio vascular dañado y los tejidos extravasculares, tal como el hueso, perturban la hemostasia y con frecuencia se activa el CAS, que, como se señaló anteriormente, puede resultar en una variedad de trastornos en la sangre y la vasculatura. Estos tratornos conducen a un exceso de sangrado perioperatorio, que a su vez requiere una transfusión de sangre inmediata. Una de las consecuencias de hacer circular toda la sangre a través de un circuito extracorpóreo en CPB también puede incluir la respuesta inflamatoria sistémica (SIR), que se inicia mediante la activación por contacto de la coagulación y los sistemas de complemento. Incluso, gran parte de la morbilidad y la mortalidad asociadas a los procedimientos quirúrgicos CPB satisfactorios aparentemente mecánicos éxito es el resultado de los efectos de la activación de la coagulación, la fibrinólisis, o sistemas de complemento. Dicha activación puede dañar el sistema pulmonar, conducir al síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), insuficiencia de riñón y circulación esplácnica, y la inducción de una coagulopatía general que lleva a la pérdida de sangre y la necesidad de transfusiones. Además de los peligros de la pérdida de sangre perioperatoria, patologías adicionales asociadas con SIR incluyen déficits neurocognitivos, accidentes cerebrovasculares, insuficiencia renal, infarto agudo de miocardio, y daño del tejido cardíaco. [0048] Las transfusiones de sangre también presentan un riesgo significativo de infección y elevan el costo de CABG u otros procedimientos similares que requieren CPB. En ausencia de cualquier intervención farmacológica, normalmente deben gastarse de tres a siete unidades de sangre en un paciente, incluso con excelentes técnicas quirúrgicas. En consecuencia, hay un incentivo considerable para el desarrollo de nuevos y mejores compuestos farmacológicamente eficaces para reducir o prevenir el sangrado perioperatorio y el SIR en pacientes sometidos a procedimientos CPB y CABG.

Consideraciones de Administración y Dosificación para polipéptidos KI

[0049] Los polipéptidos KI aquí descritos pueden administrarse a un paciente antes, durante y/o después de un procedimiento quirúrgico en una composición farmacéuticamente aceptable. El término composición “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador o excipiente no tóxico que se puede administrar a un paciente, junto con un compuesto de la presente descripción, por ejemplo, con el polipéptido KI que se utiliza según la presente invención, y en donde el portador o excipiente no destruye la actividad biológica o farmacológica de la composición de los polipéptidos KI aquí descritos se puede administrar de forma local o sistémica mediante cualesquiera medios adecuados para el suministro de una cantidad inhibidora de la calicreína de los polipéptidos KI a un paciente, incluyendo pero no limitado a administraciones sistémicas tales como, por ejemplo, por vía intravenosa e inhalación. La administración parenteral se prefiere particularmente. [0050] Para la administración parenteral, los polipéptidos se pueden inyectar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, prefiriéndose la administración intravenosa. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Otros portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, solución salina, y salino tamponado (incluyendo tampones tales como fosfato o acetato), alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina, etc. En caso necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local, tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes, etc., siempre y cuando no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos. De manera similar, la composición puede comprender excipientes convencionales, por ejemplo sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, enteral o intranasal, que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos activos. Generalmente, los ingredientes se suministrarán por separado o mezclados entre sí en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en forma de polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o sobre indicando la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composición debe administrarse en infusión, se puede prescindir de una botella de infusión que contiene “agua inyectable” estéril de grado farmacéutico

o salino. Cuando la composición debe administrarse por inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o salino puede proporcionarse de manera que los ingredientes puedan ser mezclados antes de su administración. [0051] Preferiblemente, los procedimientos de la presente descricpión comprenden la administración de un polipéptido KI a un paciente tal como una infusión intravenosa según cualquier procedimiento aprobado. Por lo tanto, un polipéptido KI aquí descrito puede administrarse a un paciente sometido a un procedimiento CABG en los momentos similares a los utilizados actualmente en los protocolos aprobados para la administración de aprotinina, y en una cantidad necesaria para proporcionar a un paciente un número o concentración requeridos de unidades inhibitoria de la calicreína (KIU). De acuerdo con la presente descripción, un polipéptido KI aquí descrito también puede administrarse a un paciente en el período postoperatorio inmediato, cuando pueden producirse anormalidades en el sangrado como consecuencia de efectos posteriores al SIR, por ejemplo, en un procedimiento que implique CPB, un polipéptido KI aquí descrito se puede administrar a un paciente como dosis de carga inicial, por ejemplo, una cantidad efectiva en el transcurso de un momento conveniente, tal como 10 minutos, antes de la inducción de la anestesia. A continuación, en la inducción de la anestesia, puede inyectarse una segunda dosis de polipéptido KI en el líquido de cebado CPB (“volumen principal de bombeo”). El paciente puede colocarse en una dosis de infusión continua y controlada intravenosa durante la duración del procedimiento quirúrgico, y después del procedimiento si está indicado. [0052] En la actualidad existen dos regímenes aprobados en los Estados Unidos para la administración de aprotinina a un paciente sometido a un procedimiento CABG (véase la etiqueta del producto y el prospecto de TRAYSOL® de la División de Bayer Pharmaceutical Corporation, West Haven, Connecticut). Un régimen aprobado de este tipo utiliza 2 millones de KIU de dosis de carga intravenosa, 2 millones de KIU en el volumen principal de bombeo, y 500.000 KIU por hora de la cirugía. Otro régimen aprobado utiliza 1.000.000 de KIU de dosis de carga inicial intravenosa, 1 millón de KIU en el volumen principal de bombeo, y 250.000 KIU por hora de la cirugía. Como estos regímenes se basan en KIU, los regímenes se adaptan fácilmente a cualquier polipéptido KI aquí descrito una vez que la actividad específica y KIU de un polipéptido KI determinado hayan sido determinados mediante ensayos estándar. Debido a la afinidad de unión y actividad inhibitoria mejoradas en el polipéptidos KI representativos aquí descritos relativos a la aprotinina, se espera que tales composiciones y procedimientos de la presente descripción probablemente requieran menos miligramos (mg) por paciente para proporcionar a un paciente el número o la concentración requeridos de KIU. [0053] Varias consideraciones respecto a la dosis con un polipéptido KI en los procedimientos de la presente descripción se puede ilustrar a modo de ejemplo con el polipéptido KI PEP-1 representativo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (peso molecular de 7.054 daltons), que es el polipéptido que se va a utilizar según con la presente invención. [0054] La Tabla 1, a continuación, proporciona una comparación de afinidad (Ki,app) del polipéptido KI PEP-1 para la calicreína y once otras proteasas de plasma conocidas.

Tabla 1

imagen4

Sustrato de proteasa: PEP-1Ki,app (pM) Aprotinina Ki,app (pM)

calicreína de plasma humano: 44 3,0 x 104

calicreína de orina humana: > 1 x 108 4,0 x 103

calicreína pancreática porcina: 2,7 x 107 550

C1r humano, activado: > 2,0 x 108 > 1,0 x 107

C1s humano, activado: > 2,0 x 107 > 1,0 x 108

factor XIa de plasma humano: 1,0 x 104 ND

factor XIIa de plasma humano: > 2,0 x 107 > 1,0 x 108

plasmina humana: 1.4 x 105 894

tripsina pancreática humana: > 2 x 107 ND

quimotripsina pancreática humana: > 2,0 x 107 7,3 x 105

elastasa de los neutrófilos humanos: > 2,0 x 107 1,7 x 106

trombina de plasma humano: > 2,0 x 107 > 1,0 x 108

ND = no determinado: imagen1 imagen1

[0055] Claramente, el polipéptido KI PEP-1 es altamente específico para la calicreína de plasma humano. Por otra parte, la afinidad (Ki,app) de PEP -1 para la calicreína es aproximadamente 1000 veces mayor que la afinidad de la aprotinina para 5 la calicreína: Ki,app de PEP-1 para la calicreína es aproximadamente de 44 pM (Tabla 1), mientras que el Ki,app de la aprotinina para la calicreína es de 30.000 pM. Por lo tanto, una dosis de PEP-1 podría ser aproximadamente 1000 veces menor que la utilizada para la aprotinina en una base por mol. Sin embargo, la consideración de otros factores puede proporcionar una estimación más precisa de la dosis de PEP-1 10 requerida en la práctica. Tales factores incluyen la cantidad de calicreína activa durante CPB en un paciente particular, la concentración de calicreína requerida para obtener un SIR, y la biodisponibilidad y distribución farmacológica del PEP-1 en un paciente. Sin embargo, el uso de un polipéptido KI en los procedimientos de acuerdo con la presente descripción y proporcionado en dosis actualmente aprobadas para el uso de la 15 aprotinina todavía se prevé que proporcione mejoras significativas en el uso actual de

la aprotinina bovina menos específica de menor afinidad. [0056] Por ejemplo, la cantidad total de precalicreína que circula en el plasma se estima en aproximadamente 500 nM (Silverberg, M. et al, “The Contact System and its Disorders”, en Blood: Principles and Practice of Hematology, Handin, R. et al, eds, Co. JB Lippincott, Filadelfia, 1995). Si todas las precalicreínas se activaron, por lo menos 500 nM de PEP-1 serían necesarios para una inhibición estequiométrica de la calicreína. Un individuo que tenga 5 litros de plasma, por lo tanto, requeriría aproximadamente 18 mg de PEP-1 para conseguir una concentración de plasma de 500 nM. [0057] Otro factor a considerar es la concentración límite de calicreína necesaria para inducir un SIR en un paciente. Si la concentración de la calicreína activa debe mantenerse por debajo, por ejemplo, 1 nM, entonces debido a su alta afinidad para la calicreína, PEP-1 ofrece una ventaja significativa sobre la aprotinina en la cantidad de proteína que se requiere para inhibir el SIR. En particular, una concentración de PEP-1 de 1 nM inhibiría el 99,6% de la calicreína presente en 1 nM (es decir, solamente 0,4 pM de calicreína libre que permanece en la sangre), mientras que una concentración aprotinina de 1 nM sólo inhibe el 24,5% de la calicreína presente en 1 nM. Para que la aprotinina inhiba el 99% de la calicreína en 1 nM, se requiere una concentración de aprotinina en el plasma de al menos 3 µM (es decir, una concentración 3000 veces mayor que de PEP-1). [0058] Para un paciente sometido a CPB, una dosis clínica inicial de PEP-1 puede estimarse a partir de un régimen de dosis recomendada de aprotinina (1 x 106 KIU) antes mencionada. La aprotinina se indica en un prospecto que tiene como actividad específica inhibidora de 7143 KIU/mg determinada usando un ensayo de presión de sangre de perro. Por lo tanto, 1 x 106 KIU de aprotinina es equivalente a 140 mg de aprotinina (es decir, 1 x 106 KIU/7143 KIU/mg = 140 mg de aprotinina). En un paciente que tiene un volumen de plasma sanguíneo de 5 litros, 140 mg corresponde a aproximadamente 4,3 µM de aprotinina (el peso molecular de la aprotinina es de 6512 daltons). La actividad específica de la aprotinina en el ensayo inhibidor estándar utilizado para PEP-1 es de 0,4 KIU/mg del polipéptido. Una dosis de 140 mg correspondería a una dosis de carga de aprotinina de 56 KIU (140 mg x 0,4 KIU/mg = 56 KIU). Por el contrario, ya que la actividad específica del polipéptido KI PEP-1 es de 10 KIU/mg en el ensayo de inhibición estándar, se requiere una dosis de sólo 5,6 mg de PEP-1 para proporcionar el número de KIUs equivalente a 140 mg de aprotinina. En un paciente con un volumen de plasma de 5 litros, esto corresponde a aproximadamente 160 nM PEP-1 (el peso molecular de PEP-1 es 7054 Daltons), aunque una dosis más alta del polipéptido KI PEP-1 puede ser necesaria si se activa toda la calicreína plasmática (500 nM) y/o si este polipéptido KI está mal distribuido en un paciente. [0059] Además, los polipéptidos KI pueden no producirse de manera natural, y se pueden producir de forma sintética o recombinante, tal como se indicó anteriormente, evitando así la contaminación potencial de las enfermedades transmisibles que pueden surgir durante el aislamiento de una proteína de una fuente animal natural, tal como en el caso de la aprotinina, que se aísla de pulmón bovino. Cada vez más importante para la aceptación administrativa y pública de una composición de tratamiento o farmacéutica que comprende un polipéptido es evitar la posible contaminación y la transmisión a pacientes humanos de varios agentes patógenos. De particular interés para la seguridad de las proteínas aisladas de un tejido bovino es la eliminación de los posibles riesgos de exposición a enfermedades mediadas virales, enfermedades mediadas bacterianas, y, especialmente, encefalopatías espongiformes bovinas. [0060] Como variantes del dominio Kunitz 1 de la proteína LACI humana, se esperan menos efectos secundarios de la administración de polipéptidos KI a los pacientes que para la aprotinina, que es una proteína bovina que está documentado que causar reacciones anafilácticas y respuestas anafilactoides en pacientes, especialmente en administraciones repetidas, tales como procedimientos CABG de segunda vez. Además, la unión muy específica de los polipéptidos KI aquí descritos a la calicreína limitará o eliminará efectivamente las tendencias trombóticas observadas con la aprotinina, y reducirá los problemas observados con la permeabilidad del injerto después de los procedimientos CABG. [0061] La invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLIFICACIÓN

Ejemplo 1: Un polipéptido KI representativo.

[0062] Un polipéptido KI que no se produce de manera natural (PEP-1) útiles en las composiciones y en los procedimientos de la presente descripción fue identificado como un polipéptido que se une a la calicreína mostrado en un fago recombinante a partir de una librería de visualización de fagos. PEP-1 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe He Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2). El peso molecular de PEP-1 es 7.054 Daltons. [0063] La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) del ADN del fago recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos de PEP-1 (SEQ ID NO: 2) fue aislada y secuenciada mediante procedimientos estándar determinados a partir del ADN del fago recombinante. PEP-1 se produce en cantidades útiles para la caracterización adicional como proteína recombinante en células huésped de fenotipo His4-de la cepa de levadura Pichia pastoris.

Ejemplo 2: Construcción de un plásmido recombinante para expresar polipéptidos KI.

[0064] El plásmido inicial, pHIL-D2, es resistente a la ampicilina y contiene un alelo de tipo salvaje de His4 de P. pastoris. La secuencia final de ADN que comprende la secuencia codificante para la proteína de fusión mata Prepro-PEP-1 en el plásmido de expresión recombinante pPIC-K503 que se muestra en la figura 2. La secuencia de ADN de pHIL-D2 fue modificada para producir pPIC-K503, de la siguiente manera:

1.: El sitio BstBI en la región AOX1 3' de pHIL-D2, que se encuentra aguas abajo del gen His4, fue eliminado mediante digestión de restricción parcial, rellenado, y ligado, alterando la secuencia de TTCGAA (SEQ ID NO: 23) a TTCGCGAA (SEQ ID NO: 24). Esta modificación se hizo para facilitar y dirigir la clonación del casete de expresión en el plásmido.

2.: El sitio AatII que lleva el gen bla situado aguas abajo de His4 fue eliminado mediante digestión de restricción, rellenado, y ligado modificando la secuencia de GACGTC (SEQ ID NO: 25) a GACGTACGTC (SEQ ID NO: 26). Esta modificación se hizo para facilitar la clonación de casetes de expresión que tenían sitios AatII en el plásmido. El ADN que codifica PEP-1 se sintetizó basado en la secuencia de nucleótidos del fago de visualización de unión a la calicreína original y consistió en 450 pares de bases (bp). La secuencia de ADN final de la inserción en el plásmido pHIL-D2 está flanqueada por una secuencia AOX1 5' y una secuencia AOX1 3' (cuyas porciones se muestran en la figura 2) y codifica una proteína de fusión que comprende el péptido de señal prepro matα de S. cerevisiae fusionada a la secuencia de

codificación estructural para el polipéptido KI PEP-1. El péptido de señal se ha añadido para facilitar la secreción de PEP-de las células huésped de levadura. Los oligonucleótidos para formar la inserción fueron sintetizados y se obtuvieron comercialmente (Genesis Labs, The Woodlands, TX), y la inserción se generó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN sintético enlazado que codifica la proteína de fusión mata prepro/PEP-1 se incorporó a continuación mediante ligado en el plásmido pHIL-D2 modificado entre los sitios BstBI y EcoRI. [0065] Los productos del ligado se utilizaron para transformar la cepa Escherichia coli XL1 Blue. Un ensayo PCR se utilizó para la cribar transformantes E. coli para la construcción de plásmido deseado. Se amplificó ADN a partir de extractos de células mediante PCR utilizando cebadores que contienen las secuencias AOX1 5’ y AOX1 3' (ver arriba y la figura 2). Se secuenciaron los productos de PCR del número correcto de pares de bases. Además, aproximadamente 20-50 bp a cada lado de los sitios de clonación fueron secuenciados y se obtuvo la secuencia prevista. La secuencia final de ADN de la inserción en el plásmido pHIL-D2 (para obtener el plásmido pPIGK503) se muestra en la figura 2 junto con las porciones de flanqueo de las secuencias 5' y 3' AOX1 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión que comprende el péptido de señal mata prepro de S. cerevisiae fusionado con la secuencia estructural de codificación para el polipéptido KI PEP-1. Un transformante con la construcción del plásmido de expresión deseado, el plásmido pPIC-K503, fue seleccionado para la preparación de líneas celulares de levadura para la producción de rutina de PEP-1.

Ejemplo 3: Fabricación de PEP-1 de la línea celular de levadura recombinante.

[0066] Esferoplastos de P. pastoris GS 115 que tiene el fenotipo His4-se transformaron con el plásmido de expresión pPIC-K503 (arriba) después de la linealización del plásmido en el sitio SacI y la recombinación homóloga de ADN de plásmido en el locus 5’ AOX1 del huésped. El fenotipo de la cepa de producción es His4+. Todo el plásmido se insertó en la secuencia genómica 5' AOX1 de la levadura. [0067] Los aislados de la transformación se cribaron para el crecimiento en ausencia de histidina exógena con metanol como única fuente de carbono. Más del 95% de los transformantes conservaron la capacidad de tipo salvaje para crecer con metanol como la única fuente de carbono, demostrando de esta manera que el plásmido se había insertado en el genoma del huésped mediante recombinación homóloga en lugar de trasplante. Estos transformantes no requerían histidina exógena para el crecimiento, demostrando así que el plásmido se había integrado en el genoma del huésped. Se clonaron las colonias seleccionadas. Se realizaron pequeños estudios de expresión de cultivo para identificar los clones secretores de los mayores niveles del PEP-1 activo en el medio de cultivo. Se cuantificaron los niveles de secreción de PEP1 en soluciones sobrenadantes de cultivo clarificado se cuantificaron para niveles de PEP-1 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y evaluado para la inhibición de la calicreína. Un clon de levadura fue seleccionado para la producción de PEP-1 basado en su alto nivel de expresión de PEP-1 entre los cultivos de la muestra. [0068] Se prepararon comercialmente bancos de células maestro y de trabajo de P. pastoris que producen PEP-(MDS Pharma Services, Bothell, Washington). Una producción estándar de PEP-1 en levadura comprendía tres etapas de la siguiente manera: (1) preparación del cultivo sembrado, (2) fermentación, y (3) recuperación del cultivo. [0069] La etapa del cultivo sembrado consistió en la inoculación de seis frascos (300 ml cada uno) que contienen caldo de inóculo estéril (base de nitrógeno de levadura, fosfato de potasio, y glicerol, pH = 5) con el contenido de un único vial de un banco de células de trabajo de P. pastoris que produce Pep-1. Los frascos fueron inoculados en un agitador orbital (300 rpm) durante aproximadamente 13 horas a 30°C ± 2°C. [0070] Las fermentaciones se realizaron en un fermentador Braun de 100 litros cerrado lleno con caldo estéril. Cada fermentación se inició con la transferencia de los contenidos de los seis frascos de cultivo sembrado al fermentador. Después de aproximadamente 24 horas, el glicerol en el fermentador se agotó y el glicerol adicional fue añadido durante aproximadamente 8 horas adicionales. [0071] Una fase de alimentación mezclada, que duró aproximadamente 83 horas, se inició a continuación, mediante la adición de una alimentación de glicerol y metanol. Al final de este tiempo, la fermentación se terminó, y el contenido del fermentador se diluyó con agua purificada. La purificación y el procesamiento de PEP1 consistía en cinco etapas de la siguiente manera: (1) cromatografía de lecho expandido, (2) cromatografía de intercambio catiónico, (3) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), (4) ultrafiltración y diafiltración, y (5) filtración final y embalaje. [0072] La etapa inicial de purificación consistió en cromatografía de lecho expandido. El cultivo del fermentador diluido se aplicó a la columna equilibrada empaquetada con resina Streamline SP (columna de cromatografía Amersham Pharmacia Streamline 200, Amersham Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey). La columna se lavó a continuación (50 mM de ácido acético, pH = 3,0 a 3,5) en un modo de flujo superior para limpiar las células de levadura del lecho expandido. El adaptador superior fue levantado sobre el lecho expandido para mejorar el lavado. El flujo se detuvo y el lecho se dejó asentar. El adaptador se movió hacia abajo de modo que estaba un poco por encima del lecho asentado. La dirección del flujo se invirtió. El efluente se recogió. El lavado continuó en un modo a la baja usando 50 mM de acetato de sodio, pH 4,0. El efluente se recogió. PEP-1 fue eluato de la columna con 50 mM de acetato de sodio, pH 6,0. El eluato se recogió en un contenedor de 50 litros. El eluato se filtró a continuación a través de un filtro de 0,22 µ en un contenedor limpio situado en el sitio de purificación. Se recogieron muestras adicionales para la determinación de la concentración PEP-1. Una etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realizó a continuación, utilizando el eluato filtrado de la columna del lecho expandido. PEP-1 fue eluido de la columna usando 15 mM de citrato trisódico, pH 6,2. [0073] Se retiraron proteínas adicionales de la preparación PEP-1 mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Antes de la HIC, el eluato de la columna de intercambio catiónico se diluyó con sulfato de amonio. El eluato se aplicó a la columna, y el PEP-1 se eluyó utilizando sulfato de amonio (0,572 M) en fosfato de potasio (100 mM), pH 7,0. El eluato se recogió en fracciones basado en valores A280. Todas las fracciones se recogieron en botellas de PETG estériles, previamente pesadas. [0074] Las fracciones seleccionadas se combinaron en un recipiente limpio. El baño se concentró mediante ultrafiltración. La preparación de PEP-1 concentrado fue diafiltrada inmediatamente contra diez volúmenes de PBS, pH 7,0. [0075] Una etapa de filtración final se realizó antes de su envasado para minimizar la carga biológica en el volumen de PEP-1. El volumen de la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 µ y se recogió en una botella de PETG estéril, previamente pesada. Una muestra fue retirada para una prueba de liberación. El resto del volumen se dispensó asépticamente en botellas estériles de PETG y se almacenó a 20°C.

Ejemplo 4: Ensayo de inhibición de la calicreína.

[0076] Una prueba cinética se utilizó para medir la actividad inhibitoria de los polipéptidos KI, tal como PEP-1. La prueba cinética mide la fluorescencia después de la división mediada con calicreína de un sustrato, cumarina metil amino prolilfenilalanilarginilo. Una cantidad conocida de calicreína se incubó con un polipéptido KI diluido en serie de referencia estándar o muestras de prueba de polipéptido KI diluido en serie, en un tampón de reacción adecuado sobre una placa de microtitulación. Cada muestra se realizó por triplicado. Se añadió la solución de sustrato, y la placa se leyó inmediatamente usando una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Al menos dos de cada una de las curvas de referencia estándar y de muestra se requirieron que tuvieran un valor Rcuadrado de 0,95 para ser consideradas válidas. [0077] Aunque la presente invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, se entenderá por los expertos en la materia que pueden realizarse en los mismos varios cambios en la forma y en los detalles sin apartarse del ámbito de la invención que abarcan las reivindicaciones adjuntas.

Listado de secuencias [0078]

<110> Dyax Corp.

<120> PREVENCIÓN Y REDUCCIÓN DE LA PÉRDIDA DE SANGRE

<130> F63195PCEP

<140> EP 03757339.1-2114

<141> 2003-06-06

<150> 60/387,239

<151> 2002-06-07

<150> 60/407,003

<151> 2002-08-28

<160> 54

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Polipéptido inhibidor de la calicreína

<221> VARIANTE

<222> 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 56, 57, 58

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> VARIANTE

<222> 10

<223> Xaa = Asp o Glu

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala o Thr

<221> VARIANTE

<222> 13

<223> Xaa = Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln

<221> VARIANTE

<222> 15

<223> Xaa = Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln

<221> VARIANTE

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Ala, Gly, Ser, Asp o Asn

<221> VARIANTE

<222> (17)...(17)

<223> Xaa = Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln o Thr

<221> VARIANTE

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = His, Leu, Gln o Ala

<221> VARIANTE

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Pro, Gln, Leu, Asn o Ile

<221> VARIANTE

<222> (21)...(21)

<223> Xaa = Trp, Phe, Tyr, His o Ile

<221> VARIANTE

<222> (22)...(22)

<223> Xaa = Tyr o Phe

<221> VARIANTE

<222> (23)...(23)

<223> Xaa = Tyr o Phe

<221> VARIANTE

<222> (31)...(31)

<223> Xaa = Glu, Asp, Glu, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile o Thr

<221> VARIANTE

<222> (32)...(32)

<223> Xaa = Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val

<221> VARIANTE

<222> (34)...(34)

<223> Xaa = Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o Leu

<221> VARIANTE

<222> (35)...(35)

<223> Xaa = Tyr, Trp o Phe

5 <221> VARIANTE

<222> (39)...(39)

<223> Xaa = Glu, Gly, Ala, Ser o Asp

<400> 1

10

imagen1

<210> 2

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión aislado

20

<400> 2

imagen1

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<211> 179

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia de codificación de Pep-1

<400> 3

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión Aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión Aislado

<400> 5 <211> 58

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión Aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión Aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión aislado

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<210> 15

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión aislado

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión aislado

<400> 18

<210> 19

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15

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido de unión aislado

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

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<223> Sitio de Clonación Modificado

<400> 23 ttcgaa 6

<210> 24

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<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

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<223> Sitio de Clonación Modificado

<400> 24 ttcgcgaa 8

<210> 25

<211> 6

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5

<220>

<223> Sitio de clonación Modificado

<400> 25 10 gacgtc 6

<210> 26

<211> 10

<212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sitio de Clonación Modificado

20 <400> 26 gacgtacgtc 10

<210> 27

<211> 548 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de proteína de fusión

imagen6

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína de fusión

<400> 28

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia BPTI

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Secuencia ITI-D1

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Secuencia ITI-D2

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Secuencia LACI-D1

<400> 32

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia LACI-D2

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia LACI-D3

<400> 34

imagen3

<210> 35

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia HKI B9

<400> 35

imagen7

20 <211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Secuencia C alfa 3

<400> 36

imagen8

<210> 37

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia TFPI-2 D1

<400> 37

imagen1

<210> 38

<211> 61

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia TFPI-2 D2

<400> 38 <210> 39

imagen1

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia TFPI-2 D3

<400> 39

imagen1

<210> 40

<211> 59

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia APP-I

<400> 40

imagen1

<210> 41

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia EpiNE7

<400> 41

imagen1

<210> 42

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia ICIB-E7-141

<400> 42

imagen1

<210> 43

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia MUTT26A

<400> 43 <210> 44

imagen1

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia MUTQE

imagen9

<210> 45

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia MUT1619

<400> 45

imagen1

<210> 46

<211> 62

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia EPI-HNE-1

<400> 46

imagen1

<210> 47

<211> 56

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia EPI-HNE-2

<400> 47

imagen1

<210> 48

<211> 56

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia EPI-HNE-3

<400> 48 <210> 49

imagen1

<211> 56

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia EPI-HNE-4

imagen10

<211> 60

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia DPI14 KR

<400> 50

imagen1

<210> 51

<211> 60

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia DPI24 KR

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 60

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia DPI68 KR

<400> 52

imagen1

<210> 53

<211> 60

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia DPI84 KR

<400> 53 <210> 54

imagen1

<211> 58

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> VARIANTE

<221> VARIANTE

<222> 10

<223> Xaa = Asp o Glu

<221> VARIANTE

<222> 11

<223> Xaa = Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala o Thr

<221> VARIANTE

<222> 13

<223> Xaa = Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys o Gln

<221> VARIANTE

<222> 15

<223> Xaa = Arg, Ala, Ser, Gly, Met, Asn o Gln

<221> VARIANTE

<222> 16

<223> Xaa = Ala, Gly, Ser, Asp o Asn

<221> VARIANTE

<222> (17)...(17)

<223> Xaa = Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln o Thr <221> VARIANTE

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = His, Leu, Gln or Ala

<221> VARIANTE

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Pro, Gln, Leu, Asn o Ile

<221> VARIANTE

<222> (21)...(21)

<223> Xaa = Trp, Phe, Tyr, His o Ile

<221> VARIANTE

<222> (31)...(31)

<223> Xaa = Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile o Thr

<221> VARIANTE

<222> (32)...(32)

<223> Xaa = Glu, Gln, Asp, Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly o Val

<221> VARIANTE

<222> (34)...(34)

<223> Xaa = Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly o Leu

<221> VARIANTE

<222> (35)...(35)

<223> Xaa = Tyr, Trp o Phe

<221> VARIANTE

<222> (39)...(39)

<223> Xaa = Glu, Gly, Ala, Ser o Asp

<400> 54 ??

imagen1

5 ?? ?? ?? 19

10 1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

•: WO 9521601 A [0005]

•: WO 6333402 A [0006]

•: WO 6057287 A, Markland [0006]

•: US 5795865 A [0022]

•: US 6057287 A [0022]

•: EP 0375733912114 A [0078]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

•: Girard, T. et al. Nature, 1989, vol. 338, 518-520 [0022]

•: Stewart, J.; Young, J. Solid-Phase Peptide Synthesis.

W.: H. Freeman Co, 1989 [0031]

•: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, vol. 85, 2149-2154 [0031]

•: Bodanszky, M. ; Bodanszky, A. The Practice of Peptide Synthesis. Springer-Verlag, 1984 [0031]

•: The Contact System and Its Disorders. Silverberg,

M.: et al. Blood: Principles and Practice of Hematology. JB Lippincott Co, 1995 [0056]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática, para su utilización en la prevención o en la reducción de la isquemia o en la prevención

o en la reducción de la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente.
2.

Polipéptido según la reivindicación 1, para su utilización en la prevención o en la reducción de la isquemia asociada con la pérdida de sangre perioperatoria debido a un procedimiento quirúrgico realizado en un paciente.
3.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en la reivindicación 2, en el que el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardiotorácica.
4.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en la reivindicación 3, en el que la cirugía cardiotorácica es una derivación cardiopulmonar o una derivación de la arteria coronaria con injerto.
5.

Polipéptido según la reivindicación 1, para su utilización en la prevención o en la reducción de la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con una cirugía cardiotorácica.
6.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en la reivindicación 5, en el que la cirugía cardiotorácica es una derivación cardiopulmonar o una derivación de la arteria coronaria con injerto.
7.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento quirúrgico es una cirugía cardíaca pediátrica.
8.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que el procedimiento quirúrgico es un trasplante de pulmón o un trasplante de hígado ortotópico.
9.

Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento quirúrgico incluye la utilización de circulación extracorpórea.
10. Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se indica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento quirúrgico incluye un traumatismo óseo.
11. Polipéptido según la reivindicación 1, para la utilización que se

indica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que el procedimiento 5 quirúrgico incluye el reemplazo de cadera o una fractura esternal.
12. Utilización de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys

10 Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática, en la preparación de un medicamento para prevenir o reducir la isquemia o para la prevención o la reducción de la aparición de una respuesta inflamatoria sistémica asociada con un procedimiento quirúrgico en un paciente.

15 13. Utilización según la reivindicación 12, tal como también se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.