CH650404A5

CH650404A5 - Zedrachborken-extrakt mit antineoplastischer wirksamkeit und verfahren zu dessen herstellung.

Info

Publication number: CH650404A5
Application number: CH5359/81A
Authority: CH
Inventors: Masaki Shimizu; Tadashi Sudo; Takeo Nomura
Original assignee: Terumo Corp
Priority date: 1980-08-19
Filing date: 1981-08-19
Publication date: 1985-07-31
Also published as: DE3132656C2; DE3132656A1; FR2488800A1; GB2082066B; FR2488800B1; GB2082066A; US4515785A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Zedrachborken-Extrakt mit antineoplastischer Wirksamkeit, der dementsprechend zur Bekämpfung von Tumoren geeignet ist.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen antineoplastische Wirksamkeit aufweisenden Zedrachborken-Extraktes.

Aus verschiedenen Teilen des Zedrach-Baumes, der den lateinischen Namen Melia azadirachta trägt, wurden bereits früher Extrakte hergestellt, die verschiedene pharmakologisch aktive Bestandteile enthalten. Bei den bisher bekannten Verfahren wurden die Pflanzenteile direkt extrahiert.

Der erfindungsgemässe Zedrachborken-Extrakt wird aus der Rinde von Zedrach gewonnen. Es handelt sich um einen neuartigen Extrakt, der bestimmte Löslichkeitseigenschaften in Wasser und organischen Lösungsmitteln aufweist.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung dieses neuen Extraktes. Dieses Verfahren unterscheidet sich von den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Extrakten aus Zedrach dadurch, dass zunächst eine Vorextraktion der Rinde von Zedrach mit einem ziemlich unpolaren organischen Lösungsmittel durchgeführt wird und dass der nach dieser Vorextraktionsbehandlung gewonnene Rückstand dann der Extraktion mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel unterworfen wird.

Die erfindungsgemässen Extrakte besitzen eine antineoplastische Aktivität und sind dementsprechend zur Therapie von Geschwülsten, vornehmlich bösartigen Neoplasmen und insbesondere bösartigen Tumoren, geeignet.

Verfahren zur Herstellung von kosmetischen Produkten für die Haut, die aus der Borke, den Blättern, den Blüten, den Früchten, den Zweigen und Ästen, der Wurzelepidermis oder dem Harz des Zedrach entweder durch Extraktion mit Wasser oder einem hydrophilen Lösungsmittel gewonnen werden oder die durch feine Pulverisierung der Materialien erhalten werden, sind bekannt (siehe dazu die Japanischen Patentschriften Nrn. 28853/77,28854/77 und 10125/78). Ebenso ist eine Verfahrensweise zur Isolierung von Inhaltsstoffen aus derartigen Zedrach-Materialien bekannt, welche gastrointestinale und leberfunktions-verbessernde Aktivitäten aufweisen, indem man mit einem hydrophilen Lösungsmittel und/oder heissem Wasser extrahiert (siehe dazu Japanische Patentschrift Nr. 10124/78). Ebenso ist ein Verfahren zur Isolierung von Inhaltsstoffen aus derartigen Zedrach-Materialien bekannt, welche wirksam sind bei der Therapie von dermatologischen und rheumatischen Erkrankungen, indem man die genannten Materialien mit einem hydrophoben Lösungsmittel extrahiert (siehe dazu die Japanische Patentschrift Nr. 13689/78).

Der erfindungsgemässe Zedrachborken-Extrakt unterscheidet sich von bisher bekannten entsprechenden Extrakten durch seine antineoplastische Aktivität und durch seine Löslichkeitseigenschaften.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Zedrachborken-Extrakt, der dadurch gekennzeichnet ist,

dass er eine antineoplastische Aktivität besitzt, ein braunes Pulver ist, das in Wasser eine Löslichkeit von etwa 40 mg pro ml, in Methanol eine Löslichkeit von etwa 50 mg pro ml, in Ethanol eine Löslichkeit von etwa 20 mg pro ml, und in Aceton eine Löslichkeit von etwa 1,5 mg pro ml aufweist und das nahezu unlöslich in den Lösungsmitteln Benzol, Chloroform, Essigsäureäthylester oder n-Hexan ist. Vorzugsweise besitzen die neuen Zedrachborken-Extrakte im Infrarotspektrum Absorptionspeaks bei 3400 cm-1, bei 1600 cm-1 und bei 1435 cm-1.

Bevorzugte erfindungsgemässe Zedrachborken-Extrakte weisen ferner, gelöst in Methanol, ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 279 nm und einem Minimum der Absorption bei 259 nm auf.

Überraschenderweise zeigte es sich ferner, dass bevorzugte

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

650404

erfindungsgemässe Zedrachborken-Extrakte ihre antineoplastische Aktivität nicht verlieren, wenn sie bei 60°C während 30 Minuten in einer wässrigen Lösung eines pH-Wertes von 2 oder 7 oder 9 belassen werden.

Bei bisher bekannten Verfahren zur Gewinnung von Extrakt aus Zedrach wurden vor der eigentlichen Extraktionsstufe keine Vorextraktionen durchgeführt.

Es zeigte sich jetzt überraschenderweise, dass die erfindungsgemässen, eine antineoplastische Wirksamkeit aufweisenden Extrakte aus der Rinde von Zedrach gewonnen werden können, indem man diese zunächst einer Vorextraktion mit einem relativ wenig polaren Lösungsmittel unterwirft und den bei dieser Vorextraktionsbehandlung gewonnenen Rückstand dann mit einem stärker hydrophilen Lösungsmittel extrahiert und so den gewünschten Extrakt gewinnt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Zedrachborken-Extraktes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man diesen Extrakt mit antineoplastischer Wirksamkeit herstellt, indem man die Rinde von Zedrach mit der lateinischen Bezeichnung Melia azadirachta einer Vorextraktion mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger unterwirft und den Rückstand aus dieser Vorextraktionsbehandlung mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 extrahiert und so den Extrakt gewinnt.

Bevorzugte organische Lösungsmittel, die eine Dielektrizitätskonstante von höchstens 10 aufweisen und die zur Durchführung der Vorextraktion verwendet werden können, sind Benzol und Essigsäure-ethylester.

Bevorzugte hydrophile organische Lösungsmittel, die eine Dielektrizitätskonstante im Bereich von 15 bis 35 aufweisen und die zur Durchführung der Extraktion aus dem Rückstand der Vorextraktionsbehandlung geeignet sind, sind Methanol und Ethanol.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren gewonnenen Extrakte aus der Rinde von Zedrach können anschliessend noch weiteren Reinigungsverfahren unterworfen werden, beispielsweise einer Adsorptionschromatographie.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens wird dementsprechend aus dem Extrakt, der nach der Extraktion mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das eine Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 aufweist, gewonnen wurde, das Lösungsmittel entfernt, der Rückstand wird in einem niederen Alkohol gelöst und die so erhaltene Lösung wird mit einem nicht-ionischen Harz zur Adsorptions-Chromatographie in Berührung gebracht und anschliessend das der Adsorption dienende Harz mit einer 10% wässrigen Methanollösung behandelt und sodann mit 30 bis 50% Lösung von Methanol eluiert und schliesslich das Lösungsmittel aus den Eluaten entfernt.

Der erfindungsgemässe Zedrach-Extrakt zeigt eine antimitotische, d.h. zellteilungshemmende Wirkung auf befruchtete Seeigeleier und ferner auch eine wachstumsverhindernde Wirkung gegenüber Mäuse-Sarkom 180 Aszites und gegenüber festen Tumoren und Mäuse L-517Y Zellen.

In der Folge wird das Extraktionsverfahren näher erläutert und die Eigenschaften der neuen Extrakte werden näher beschrieben.

Der Zedrachbaum ist ein grosser Baum von 10 m oder grösserer Höhe, welcher in tropischen Gegenden heimisch ist und dessen botanischer Name Melia azadirachta ist. Die Borke dieses Baumes wird bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Borke wird vorzugsweise in getrockneter und fein verteilter Form bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung angewandt.

Zur Herstellung der erfindungsgemässen Extrakte wird ein Extraktionsschritt, bei welchem die Zedrachborke mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger behandelt wird, angewandt als Vorbehandlung für die Extraktion der aktiven Inhaltsstoffe. Typische Beispiele für derartige Lösungsmittel sind Benzol, Toluol, Xylole, n-Hexan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Essigsäure-ethylester, und ähnliche. Die Behandlung vor der eigentlichen Extraktion wird während einer Zeitspanne von einigen Stunden bis über Nacht ausgeführt. Der Rückstand aus der ersten Extraktion wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel extrahiert. Als Beispiele für Lösungsmittel, die bei diesem erfindungsgemässen Schritt angewandt werden können, sind beispielsweise niedere Alkohole, wie z.B. Methanol, Ethanol, Propanole und n-Butanol, Pyridin, Aceton und ähnliche. Die Extraktion wird während mehreren Stunden bis über Nacht in üblicher Weise ausgeführt. Die Entfernung des Lösungsmittels aus dem Extrakt kann beispielsweise durch Destillation erfolgen, und man erhält so den erfindungsgemässen Zedrachborken-Extrakt. Der Zedrachborken-Extrakt, der so erhalten wird, kann, wie er anfällt, bei der Therapie von bösartigen Geschwulstbildungen bzw. Neoplasmen angewandt werden. Alternativerweise kann der Extrakt gereinigt werden, um einen Zedrach-borken-Extrakt einer höheren Reinheit herzustellen, indem man ein Verfahren, wie folgt angegeben, anwendet. Der wie oben beschrieben erhaltene Zedrachborken-Extrakt wird in einer wässrigen Niederalkohol-Lösung, wie z.B. wässrige Methanol- oder Ethanollösung, gelöst und die so erhaltene Lösung wird mit einem nicht-polaren Harz zurAdsorptions-Chromatographie in Kontakt gebracht, wie z.B. mit Amber-lite XAD-2, XAD-4 (Rohme und Haas), Bio Beads SM-1, SM-2 (Biorad), Diaion HP-10, HP-20, HP-30 (Mitsubishi Chemical Industries) oder ähnlichen Materialien, und der adsorptionsdienende Harz wird mit einer 10% wässrigen Methanollösung behandelt, und anschliessend eluiert man die adsorbierten Materialien mit einer 50% wässrigen Methanollösung. Entfernung des Lösungsmittels aus dem Eluat, beispielsweise durch Destillation, ergibt den erwünschten Zedrachborken-Extrakt.

Typische Beispiele für das Infrarot-Absorptionsspektrum von erfindungsgemässen Extrakten sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt.

IRrnax. cm"1:3400,1600,1435.

Ein typisches Beispiel für ein Ultra violett-Absorptionsspektrum ist in Figur 3 dargestellt, wobei Methanol als Lösungsmittel angewandt wurde.

UV Xmax.: 279 nm, /.min.: 259 nm.

Die erfindungsgemässen Zedrachborken-Extrakte sind für die Therapie einer Vielzahl von bösartigen Geschwulstbildungen nützlich. Sie können parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch subkutane, intravenöse oder intramuskulöse Injektion oder oral in Form von Tabletten, Kapseln, Granulaten, Pulvern, Sirupen und ähnlichem. Die Dosierung der erfindungsgemässen Extrakte liegt im Bereich von etwa 1 bis 5 g pro Tag für männliche Erwachsene, doch kann die Dosis variert werden abhängig von dem Alter, dem Körpergewicht und dem allgemeinen Zustand des behandelten Patienten.

Die erfindungsgemässen Extrakte werden in üblicher Weise formuliert. Beispielsweise können erfindungsgemässe getrocknete Pulver in Behälter, wie z.B. in Pulverfläschchen oder Ampullen, abgepackt werden. Daneben sind auch physiologische Kochsalzlösungen, wässrige Glukoselösungen oder Suspensionen mit Carboxymethylcellulose (CMC) herstellbar und zwar in einem Behälter, wie z.B. in einer Ampulle. Die Pulver werden ebenso auch gelöst oder suspendiert, wenn sie angewandt werden. Alternativerweise kann

5

10

is

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

650404

4

der Extrakt in Form einer Emulsion injiziert werden. Im Falle einer Wasser-in-Öl-Emulsion, beispielsweise kann eine Kombination von Mineralöl, wie z.B. ein flüssiges Paraffin oder ein Pflanzenöl, wie z.B. Sesamöl oder Erdnussöl, zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie z.B. aliphatische Sorbitester, angewandt werden.

Die Figuren der Zeichnungen seien nun in Kürze beschrieben. Fig. 1 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des in Beispiel 1 erhaltenen Zedrachborken-Extraktes. Fig. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des in Beispiel 5 erhaltenen Zedrachborken-Extraktes. Fig. 3 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum des gleichen Extraktes wie derjenige, der in Fig. 2 behandelt wurde.

Die Erfindung sei nun anhand der Beispiele und Testbeispiele sowie Formulierungsbeispiele näher erläutert.

'ö

Beispiel 1

Zu 10 g trockener Zedrachborke wurden 100 ml Benzol zugefügt. Die Mischung wurde während 1 Stunde unter gelegentlichem Schütteln stehengelassen, um die Extraktion zu beschleunigen. Die so erhaltene Mischung wurde filtriert, und zum Rückstand wurden 100 ml Benzol zugefügt. Die Mischung wurde in gleicher Weise, wie oben beschrieben, nochmals behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt drei Mal wiederholt. Die vereinigten Benzolextrakte wurden zur Trockenen eingeengt, wodurch man Pulver erhielt. Die Pulver, die so erhalten wurden, bezeichnen wir als Benzolfraktion. Zum Rückstand aus den Benzolextraktionen wurden 100 ml Methanol zugefügt, und die Mischung wurde den gleichen Verfahrensweisen unterworfen, wie dies bei Benzol beschrieben wurde. Die Pulver, welche sodann aus diesem Verfahrensteil erhalten wurden, werden als Methanolfraktion bezeichnet. Ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Methanolfraktion ist in Fig. 1 dargestellt.

Ausbeute an so erhaltenen trockenen Pulvern betrug 48,2 mg für die Benzolfraktion und 385,4 mg für die Methanolfraktion.

Testi

Die antimitotische, d.h. zellteilungshemmende, Aktivität der erfindungsgemässen Zedrach-Extrakte wurde bestimmt, indem man Seeigeleier, wie folgt, anwandte:

5 Befruchtete Eier des Seeigels, Hemicentrotus pulcherrimus oder Anthocidaris crassispina, in einer Anzahl von 200 bis 300 wurden zusammen mit 2 ml Meerwasser in ein Teströhrchen eingebracht. Unmittelbar danach wurden 0,2 ml von einer wässrigen oder DMSO (Dimethylsulfoxid) io Lösung des Testmaterials, wie es im obigen Beispiel erhalten worden war, dem Teströhrchen zugesetzt. Es wurde sodann die Zellteilung der befruchteten Eier mikroskopisch beobachtet. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt. In der Tabelle bedeuten die Symbole + + +,++, ls * und - in der gleichen Reihenfolge folgende Wirkungen: vollständige Verhinderung der Eiteilung, etwa 50 bis 80% Verhinderung der Zellteilung, ein oder zwei Teilungen der Eier sind zugelassen und schliesslich keinerlei Verhinderung der Eiteilung.

20

Tabelle I

Wirksamkeit gegenüber der Zellteilung bei Seeigel-Zygoten

Anteil des Fraktion Konzentration der

Zedrachbaumes (Beispiel Nr.) Testlösung (mg/ml)

25

0,25 0,50 1,0

Borke Benzol (1)

Methanol (1) 30 Ethylacetat (3)

Methanol (3) Benzol (4) Ethanol (4)

35 Blätter Benzol (2)

Methanol (2)

+ + + + + + + + + + - * + +

Beispiel 2

Es wurde das gleiche Extraktionsverfahren wie im Beispiel 1 auf 10 g trockene Zedrachblätter angewandt. Es wurden 120,2 mg einer Benzolfraktion und 682,5 mg einer Methanolfraktion je welchen Form von trockenen Pulvern erhalten.

Beispiel 3

Es wurde die gleiche Verfahrensweise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wiederholt, und zwar mit 10 g trockener Zedrachborke, jedoch mit der Ausnahme, dass Essigsäure-ethylester anstelle von Benzol angewandt wurde. Es wurden 86,0 mg einer Essigsäure-ethylesterfraktion und 360,3 mg einer Methanolfraktion jeweils in Form von trockenen Pulvern erhalten.

Beispiel 4

Es wurde die gleiche Verfahrensweise, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 10 g trockener Zedrachborke wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass Ethanol anstelle von Methanol angewandt wurde. Es wurden 43,9 mg einer Benzolfraktion und 334,8 mg einer Ethanolfraktion jeweils in Form von trockenen Pulvern erhalten. Die wie oben beschrieben hergestellten Zedrach-Extrakte wurden untersucht, indem man Seeigeleier, Mäuse L-5178Y Zellen und Mäuse-Sarkom 180 Aszites und feste Tumore anwandte. Die Aktivitäten, wirksame Dosierungsniveaus und Effekte im Vergleich mit bekannten Antitumormitteln wurden beurteilt. Die Resultate der Tests sind in der Folge näher beschrieben.

40 Es kann aus den obigen Resultaten des Tests in der Tabelle I deutlich gesehen werden, dass die Borkenfraktion Methanol (1), Methanol (2) und Ethanol (4) und die Blattfraktion Methanol (2) wirksam die Zellteilung von befruchteten Seeigeleiern verhindern im Vergleich mit anderen Frak-45 tionen.

Insbesondere sind Methanol (1)- und Methanol ^-Fraktionen, welche die Zellteilung der Eier vollständig verhindern bei einer Konzentration der Testlösung von 1 mg/ml. 50 bis 80% Inhibierung wird beobachtet mit der Ethanol (4)-Frak-50 tion, und nur ein bis zwei Zellteilungen waren zugelassen bei der Methanol-Fraktion (2) der Blätter. Die Benzol (^-Fraktion in der obigen Tabelle entspricht dem pharmakologisch aktiven Bestandteil des Zedrach, wie er in der Japanischen Patentschrift Nr. 13 689/78 beschrieben wurde. Es ist 55 dementsprechend offensichtlich, dass die erfindungsgemässen Zedrach-Extrakte eine wesentlich höhere pharmakologische Wirksamkeit aufweisen als frühere.

Test II

«0 Folgender Test wurde an der Methanol (l)-Frakition ausgeführt, welcher eine hohe antimitotische Aktivität gegenüber befruchteten Eiern des Seeigels im Test I zeigte.

Eine Testlösung wurde zu Seeigeleiern zugegeben und anschliessend wurden Spermazellen zugefügt. Sodann wurde 65 beobachtet, ob die Befruchtung verhindert wurde. Wurde eine 100%- bzw. 80%-Verhinderung der Befruchtung von Seeigeleiern beobachtet, wenn man die Testlösungen in Konzentrationen von 0,8 mg/ml bzw. 0,16 mg/ml jeweils

5

650404

anwandte. Die Testlösung mit einer Konzentration von 0,032 mg/ml verhinderte die Befruchtung nicht, aber die Teilung der Eizellen hörte nach einer Teilung auf.

Wenn man die Testlösung in einer Konzentration von 0,8 mg/ml 15 Min. nach der Befruchtung der Eier zufügte, wurde die Zellteilung nach zwei Teilungen abgebrochen.

Die Resultate des Tests, wie sie oben beschrieben wurden, zeigten, dass die erfindungsgemässen Zedrach-Extrakte nicht nur die Zellteilung verhindern, sondern ebenso die Befruchtung der Eier. Diese pharmakologisch aktiven Bestandteile, welche die Befruchtung und Teilung von Eizellen verhindern, können ein weites Anwendungsfeld als Agrochemikalien und Pharmazeutika finden. Wirksame Dosierungsniveaus, Formulierungen und Toxizitätsüberlegungen können angestellt werden je nach dem Verwendungszweck der erfindungsgemässen Extrakte.

Test III (Wirkung auf Mäuse L-5178Y Zellen)

(1) Herstellung des Zellkulturmediums:

Ein Medium, welches 1 x 105 Zellen/ml enthielt, wurde hergestellt, indem man Mäuse L-5178Y Zellen verwendete, welche in einem RPMI-1640 Medium, welches 10% Rinderfötenserum enthielt, während 3 Tagen kultivierte. Das Medium wurde in einer Mikroplatte Typ-U mit 96 Vertiefungen eingebracht, und zwar in einer Menge von 50 jxl pro Vertiefung.

(2) Verfahren der Auswertung:

s Ein Teil des Testmaterials, welches einer der oben beschriebenen erfindungsgemässen Extrakte war, wie er in den obigen Beispielen erhalten wurde, wurde in dem Medium bis zu einer Endkonzentration im Medium gelöst, wie sie in Tabelle II in der Folge angegeben ist. Die Menge der Lösung io pro Vertiefung betrug 60 p.1. Das Testmaterial, das hergestellt wurde, wurde in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37°C während 2 Tagen inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und Loch für Loch ausgezählt, und die Zellenzahlen wurden mit den Zellenzahlen von Verls gleichsversuchen verglichen, welche kein Testmaterial enthielten. Zellenzahlen der Vergleichsproben betrug ungefähr 8,6 x 10s/ml. Um Aktivitätsvergleiche zu erhalten, wurde der gleiche Test mit Mitomycin C (MMC) oder mit Bleomycin (BLM) ausgeführt. In der folgenden Tabelle bedeutet das 20 T/C Verhältnis, das Verhältnis der Anzahl Zellen, welche mit dem Testmaterial behandelt wurden, zu derjenigen Anzahl ohne Behandlung mit Testmaterial. Mit IDso wird die Konzentration an Testmaterial bezeichnet, welche benötigt wird, um die Konzentration der Zellen auf die Hälfte derjenigen 25 Zahl im Vergleichsversuch herabzudrücken.

Tabelle II

Wirksamkeit gegenüber Mäuse L-5178 Y Zellen

Anteil des Zedrachbaumes

Fraktion (Beispiel Nr.)

Konzentration an

Testmaterial

([ig/ml)

T/C (%)

IDso (Hg/ml)

Borke

Benzol (1)

100

98,1

30

105

-

15

114

Essigsäureethylester (3)

100

94,5

30

99,8

-

15

100,0

Methanol (1)

100

1,0

30

15,0

21

20

60,0

Ethanol (4)

100

17,5

31

58,0

38

15

83,0

Blätter

Benzol (2)

100

102,4

31

110,3

-

15

108,4

Methanol (2)

100

94,8

31

99,2

-

15

115

Vergleichsversuch

MMC

1,0

13,4

0,3

24,7

0,09

0,1

47,9

BLM

100

8,8

10

46,1

7,8

5

57,1

(3) Resultate:

Die Resultate mit verschiedenen Fraktionen, wie sie in den oben erwähnten Beispielen hergestellt wurden, und mit den Vergleichsproben sind in der Tabelle II zusammengestellt. Die Benzol- und Essigsäureethylester-Fraktionen der Zedrachborke und die Methanol-Fraktion der Blätter zeigten jeweils geringe Aktivitäten. Es wird erwartet, dass die Aktivitäten sehr gering sind und dementsprechend zu sehr hohen 6s IDso Werten führen. Auf der anderen Seite waren die Methanol- oder Ethanol-Fraktionen sehr stark aktiv. Obwohl die Aktivitäten unterhalb denjenigen von MMC und BLM1 liegen, können sie als hoch genug angesehen werden, wenn

650404

6

man an den aktiven Bestandteil, welcher in der Methanoloder Ethanol-Fraktion enthalten ist, denkt.

Test IV (Wirksamkeit gegenüber Sarkom 180 Aszites Tumor)

( 1 ) Herstellung des Testmaterials:

Ein Anteil von allen Extraktionsfraktionen wurde suspen-siert oder gelöst in einer 0,5% Suspension von Carboxyme-thylcellulose (CMC) in einer Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS handelsüblich erhältlich von GIBCO Laboratories, welche ca. 9,5 mM Phosphat enthielt) und zwar bis zu einer vorbestimmten Konzentration.

(2) Transplantation von Sarkom 180 Tumorzellen:

Mäusesarkom-180-Tumorzellen, welche intraperitoneal subkultiviert wurden in ICR Mäusen, wurden von den Mäusen zusammen mit den Aszites entnommen und man verdünnte mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Zellenzahl von 108 pro ml. Die Tumorzellen-Suspension, die so hergestellt worden war, wurde mittels einer Spritze intraperitoneal in 4 Wochen alte männliche ICR Mäuse mit einer Dosierung von 0,1 ml verabreicht. Dementsprechend war die trans-plantierte Zellenzahl pro Maus 1 x 107

(3) Verabreichung des Testmaterials:

Das Testmaterial, das wie oben hergestellt wurde, wurde intraperitoneal mit einer Dosierung von 0,1 ml pro Maus während 4 Tagen einmal täglich beginnend mit dem Tag nach der Transplantation der Mäusesarkom-180-Tumor-zellen verabreicht. Eine Gruppe von sechs Mäusen wurde für jede Konzentration eines jeden Testmaterials angewandt. Als aktive Vergleichssubstanzen wurden MMC, BLM, Actino-

mycin D (ACD), 5-Fluoruracil (5-Fu) und Cyclophosphamid (CYP) angewandt. Als inaktiver Vergleichsversuch wurde das CMC-enthaltende PBS, wie oben beschrieben, in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, verabreicht ohne wei-5 teren Zusatz. Die Dosen sind angegeben als Gewicht pro kg Körpergewicht der Mäuse.

(4) Verfahren der Auswertung:

io Am.7ten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen wurde das Körpergewicht jeder Maus bestimmt (X). Sodann wurde das Aszites gründlich aus der Maus entfernt und anschliessend wurde deren Körpergewicht (Y) nochmals bestimmt. Der Wert X-Y wurde als die Menge an Aszites is angenommen.

Die entfernten Aszites wurden in ein Hämatocritröhrchen übergeführt und man zentrifugierte sodann beil5000G während 5 Minuten unter Anwendung eines Hämatocritrotors bei einer niederen Temperatur. Es wurde so eine Bestimmung 20 des Aszitocritwertes möglich, das ist der Anteil an Zellen, der im Aszites anwesend ist, und er entspricht dem Hämatocrit-wert in der Hämatologie. Dieser Wert multipliziert mit dem Volumen des Aszites ergibt das Volumen an Zellen, welche im Aszites anwesend sind. Dieser Wert wird als totales 25 gepacktes Zellvolumen (TPCV) bezeichnet. Im Falle des Vergleichsversuchs war das Gesamtvolumen des Aszites 6-10 ml und der TPCV-Wert betrug 1,6-2,5 ml.

Der Effekt auf dem Tumor wurde als unwirksam (—) bezeichnet, wenn das TPCV-Verhältnis von behandelt zu 30 unbehandelt (T/C) 100 bis 66% war, als plus 1 (+), wenn der Wert 65 bis 41% betrug, als plus 2 (+ +), wenn der Wert 40 bis 11% ausmachte und als plus 3 (+ + +), wenn der Wert 10 bis 0% betrug. Testresultate für die erfindungsgemässen Materialien im Vergleich mit bisher bekannten Materialien sind in 35 der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Wirksamkeit gegenüber Sarkom 180 Aszites Tumor

Anteil des Zedrachbaumes Fraktion Dosis T/C Bewertung

(Beispiel Nr.) (mg/kg) (%)

Borke

Blätter

Vergleichssubstanzen

Benzol (1)

100

97,6

-

Benzol (4)

100

95,2

-

Ethylacetat (3)

100

96,8

-

Methanol (1)

20

94,8

—

84,8

-

50

34,3

+ +

32,2

+ +

100

4,8

+ + +

10,8

+ +

12,4

+ +

Methanol (3)

100

8,5

+ H- +

Ethanol (4)

100

14,8

+ +

18,5

+ +

Benzol (2)

100

94,8

—

Methanol (2)

100

76,8

—

MMC

0,5

0

+ + +

1,5

0

+ + +

BLM

10

0

+ + +

ACD

0,1

0

+ + +

5-Fu

20

0

+ + +

CYP

33

0

+ + +

67

0

+ + +

7

650 404

(5) Resultate:

Keinerlei Effekte wurden mit Benzol und Essigsäure-ethyl-ester-Fraktionen der Zedrachborke und ebenso bei allen Zedrachblattfraktionen beobachtet. Andererseits wurde eine hohe Aktivität bei den Methanol- und Ethanolfraktionen der Zedrachborke beobachtet. Obwohl die Aktivitäten unterhalb der Aktivitäten der aktiven Vergleichsversuche, MMC, BLM, und ähnlichen lagen, können sie als hoch genug angesehen werden, wenn man das in derartigen Fraktionen enthaltene aktive Material in Betracht zieht. Weitere Reinigung dieser Fraktionen ergeben reinere aktive Bestandteile und dementsprechend erhöhte Aktivität. Die minimale wirksame Dosis für die Methanolfraktion (1) wurde aufgrund des Dosis-T/C Verhältnisses in der obigen Tabelle mit ungefähr 30 mg/kg ermittelt.

Test V (Wirksamkeit gegenüber festen Sarkom 180 Tumoren)

(1) Herstellung des Testmaterials:

Das Testmaterial wurde in der gleichen Weise wie in Test IV unter Absatz (1) hergestellt.

(2) Transplantation der festen Sarkom 180 Tumorzellen:

Eine Zellsuspension, welche 1 x 108 Zellen pro ml enthielt,

wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Test IV unter Absatz (2). Vier Wochen alte ICR Mäuse wurden subkutan am Rücken mit 0,1 ml der Suspension mittels einer Spritze angeimpft.

5

(3) Verabreichung des Testmaterials:

Wie in Test IV, Absatz (3) wurde eine Gruppe von sechs Tieren für jede Konzentration und für jedes Testmaterial angewandt.

10

(4) Verfahren der Auswertung:

Die gewachsenen Tumorgewebe wurden am 15. bzw. am 21. Tag nach der Tumorzellen-Transplantation reseziert und gewogen. Für die Berechnung wurde ein Durchschnittswert is aus der Gruppe der sechs Tiere angewandt. Der Effekt wurde auf Basis des Verhältnisses des durchschnittlichen Gewichtes bei den behandelten Tieren zu denjenigen Tieren aus dem inaktiven Kontrollversuch ermittelt. Das durchschnittliche Gewicht für die Tiere aus dem inaktiven Vergleichsversuch 20 betrug 1,5 bis 3,5 g. Verhältnisse (T/C) von 100 bis 71% wurden als unwirksam (—), von 70 bis 51% als plus 1 (+), von 50 bis 21% als plus 2 (+ +) und von 20 bis 0% als plus 3 (+ + +) angegeben. Die Resultate mit den erfindungsgemässen Testmaterialien und mit bisher bekannten Mitteln sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

25

Tabelle IV

Wirksamkeit gegenüber festen Sarkom 180 Tumoren

Anteil des Fraktion Dosis T/C Bewertung

Zedrachbaumes (Beispiel Nr.) (mg/kg) (%)

Borke

Blätter

Vergleichssubstanzen

Benzol (1)

100

86,4

-

92,0

-

Benzol (4)

100

91,3

-

Ethylacetat (3)

100

94,2

-

Methanol (1)

20

105,4

—

128,2

-

50

83,9

-

88,0

-

100

40,7

+ +

65,0

+

200

24,1

+ +

Methanol (3)

100

50,8

+

Ethanol (4)

100

68,2

+

51,3

+

Benzol (2)

100

93,8

_

Methanol (2)

100

95,9

—

MMC

0,5

71,0

1,5

32,5

+ +

50,2

+

BLM

10

43,5

+ +

52,3

+

ALD

0,1

102,4

—

5-Fu

20

47,8

+

CYP

33

0

+ + +

67

0

+ + +

(5) Resultate:

Während bei den Benzol- und Essigsäureethylester-Frak-

tionen der Zedrachborke wie auch bei allen Fraktionen der

Zedrachblätter keine Aktivität beobachtet werden konnte, waren die Methanolfraktionen der Zedrachborke mit einer hohen Aktivität gekennzeichnet. Die minimale wirksame

Dosis für die Methanolfraktion (1) wurde aufgrund des 65 Dosis-T/C Zusammenhanges ermittelt, und zwar zu etwa 65 mg/kg. Obwohl die Aktivitäten niedrig sind im Vergleich mit den aktiven Vergleichsversuchen, wie z.B. MMC und BLM, ergibt eine Reinigung der erfindungsgemässen

650404

8

Extrakte bezüglich des aktiven Bestandteiles sicherlich höhere Aktivitäten.

Akute Toxizität

Der LD50 Wert für die Methanolfraktion bei intraperitonealer Verabreichung an männliche ICR Mäuse mit einem Gewicht von 19 bis 21 g betrug 1100 mg/kg Körpergewicht.

Beispiel 5

Zu 100 g trockener Zedrachborke wurde 11 Benzol zugefügt. Die Mischung wurde während 5 Stunden unter gelegentlichem Schütteln stehengelassen, um die Extraktion zu beschleunigen. Die so erhaltene Mischung wurde filtriert und zum Rückstand wurde 1 Liter Benzol zugefügt. Die Mischung wurde sodann in der gleichen Weise wie oben nochmals behandelt. Die Benzolextraktion wurde insgesamt dreimal wiederholt.

Zu dem Rückstand, der nach diesen Benzolextraktionen zurückblieb, setzte man 1 Liter an Methanol zu und unterwarf diese Mischung den gleichen Arbeitsverfahren, die bereits im Zusammenhang mit der Benzolextraktion beschrieben wurden. Aus den vereinigten Methanolextrakten wurde das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer entfernt, wodurch man 3,9 g an einem Extrakt in Form eines trockenen Pulvers erhielt. Vom so erhaltenen pulverförmigen Extrakt wurden 2,1 g in 1110% Methanol gelöst, und anschliessend mischte man gründlich mit 300 ml Amberlite X AD-2. Die Mischung wurde in eine Kolonne von 3,0x40 cm Grösse gepackt. Durch die Kolonne wurde sodann eine 10% wässrige Methanollösung, eine 50% wässrige Methanollösung und schliesslich 100% Methanol durchgeleitet. Jedes der Eluate wurde zur Trockenen eingeengt. Es wurden 0,81 g in der 10% Methanolfraktion, 0,84 g in der 50% Methanolfraktion und 0,22 g in der 100% Methanolfraktion jeweils in Form von Pulvern erhalten.

Beispiel 6

Die gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 5 wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass 11 Ethanol anstelle von 11 Methanol als Extraktionsmittel angewandt wurde. Es wurden dementsprechend 0,69 g in der 10% Methanolfraktion, 0,80 g in der 50% Methanolfraktion und 0,33 g in 5 der 100% Methanolfraktion jeweils in Form eines pulverförmigen Extraktes erhalten.

Beispiel 7

10 Die gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 5 wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass 11 Essigsäure-ethylester anstelle von 11 Benzol bei der Extraktionsbehandlung angewandt wurden. Es wurden 0,78 g in der 10% Methanolfraktion, 0,82 g in der 50% Methanolfraktion und 0,24 g in xs der 100% Methanolfraktion jeweils in Form eines pulverförmigen Extraktes gefunden.

Die Zedrach-Extrakte, welche in den Beispielen 5 bis 7 hergestellt wurden, wurden bezüglich ihrer Wirksamkeit auf L-5178Y Zellen, Sarkom 180 Aszites und Festtumoren getestet,und zwar nach den Methoden, wie sie in den Tests II bis IV beschrieben sind. Die Resultate sind in den Tabellen V und VI zusammengestellt.

Tabelle V

25 Wirksamkeit gegenüber L-5178Y Zellen

Testmaterial

IDso

Beispiel Nr.

Methanolfraktion

(g/ml)

30

5

10% MeOH

>100

50% MeOH

16,5

100% MeOH

67,5

35 ^

50% MeOH

35,0

7

50% MeOH

C5 OO

20

Tabelle VI

Effekt auf transplantierte Sarkom 180 Tumoren bei Mäusen

Art des Tumors Testmaterial Dosis T/C Bewertung

Beispiel Nr. Methanolfraktion (mg/kg) (%)

Aszites Tumor 5 10%MeOH 25 100,5 —

50 99,2

100 98,8

50% Meo H 25 77,5

50 38,0 + +

100 7,9 + + +

100%MeOH 25 102,5

50 99,8

100 107,3

6 50% MeOH 50 41,3 +

100 10,2 + + +

7 50% MeOH 50 40,2 + +

100 8,5 + + +

Fester Tumor 5 10% MeOH 25 101,3 —

50 89,2

100 76,9

50% MeOh 25 63,6 +

50 60,7 +

100 37,5 + +

9 650404

Tabelle VI (Fortsetzung)

Effekt auf transplantierte Sarkom 180 Tumoren bei Mäusen

Art des Tumors Testmaterial Dosis T/C Bewertung

Beispiel Nr. Methanolfraktion (mg/kg) (%)

100% MeOH

6 50% MeOH

7 50% MeOH

25

99,9

-

50

98,4

-

100

91,7

-

50

59,0

+

100

45,0

+ +

50

53,5

+

100

41,2

+ +

Auf den Tabellen V und VI ist klar ersichtlich, dass die 50% Methanolfraktion eine hohe antineoplastische Aktivität aufweist. Der Extrakt hat eine minimale wirksame Dosis von 30 mg/kg bei Mäusen für den Aszites Tumor und eine minimale wirksame Dosis von 25 mg/kg bei Mäusen für den festen Tumor. Die akute Toxizität, angegeben als LDso Wert, bei männlichen Mäusen war 390 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung.

Formulierungsbeispiel 1

In 500 ml einer sterilen 5% Glukoselösung für die Injektion wurden 1000 mg Zedrachborken-Extrakt, wie er in Beispiel 1 hergestellt wurde, suspendiert. Die Suspension wurde aseptisch auf verschiedene Ampullen in einer Menge von 5 ml pro

Ampulle verteilt, und man unterwarf der Gefriertrocknung. Es wurde eine Formulierung erhalten, welche 10 mg des Zedrachborken-Extraktes pro Fläschchen bzw. Ampulle ent-20 hielt. Bei Verwendung wurde das Material in destilliertem Wasser zur Injektion suspendiert.

Formulierungsbeispiel 2

Eine Formulierung in Fläschchen wurde in der gleichen 2s Weise, wie im obigen Beispiel beschrieben, hergestellt. Es wurden 500 ml einer 0,5% Suspension von CMC J.P. in physiologischer Kochsalzlösung zur Injektion anstelle der 500 ml steriler Glukoselösung für die Injektion angewandt. Bei der Verwendung wurde eine Suspension in destilliertem Wasser 30 zur Injektion verwendet.

B

3 Blatt Zeichnungen

Claims

650404

1. Zedrachborken-Extrakt, dadurch gekennzeichnet, dass er eine antineoplastische Aktivität besitzt, ein braunes Pulver ist, das in Wasser eine Löslichkeit von etwa 40 mg pro ml, in Methanol eine Löslichkeit von etwa 50 mg pro ml, in Ethanol eine Löslichkeit von etwa 20 mg pro ml, und in Aceton eine Löslichkeit von etwa 1,5 mg pro ml aufweist und das nahezu unlöslich in den Lösungsmitteln Benzol, Chloroform, Essigsäureäthylester oder n-Hexan ist.

2. Zedrachborken-Extrakt nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er im Infrarotspektrum Absorptionspeaks ^bei 3400 cm-1, bei 1600 cm-1 und bei 1435 cm~1 aufweist.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Zedrachborken-Extrakt nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er im Ultraviolett-Absorptionsspektrum, gelöst in Methanol, ein Absorptionsmaximum bei 279 nm und ein Minimum der Absorption bei 259 nm aufweist.

4. Zedrachborken-Extrakt nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er seine anti-neoplastische Aktivität nicht verliert, wenn er bei 60°C während 30 Minuten in einer wässrigen Lösung eines pH-Wertes von 2 oder 7 oder 9 belassen wird.

5. Verfahren zur Herstellung des Zedrachborken-Extraktes gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Extrakt mit antineoplastischer Wirksamkeit herstellt, indem man die Rinde von Zedrach mit der lateinischen Bezeichnung Melia azadirachta einer Vorextraktion mit einem organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 10 oder weniger unterwirft und den Rückstand aus dieser Vorextraktionsbehandlung mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 extrahiert und so den Extrakt gewinnt.

6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Vorextraktion verwendete organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von höchstens 10 Benzol ist.

7. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Vorextraktion verwendete organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von höchstens 10 Essigsäure-ethylester ist.

8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Extraktion verwendete hydrophile organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 Methanol ist.

9. Verfahren nach einem der Patentansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Extraktion verwendete organische Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 Ethanol ist.

10. Verfahren nach einem der Patentansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Extrakt, der nach der Extraktion mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das eine Dielektrizitätskonstante von 15 bis 35 aufweist, gewonnen wurde, das Lösungsmittel entfernt und den Rückstand in einem niederen Alkohol löst und die so erhaltene Lösung mit einem nicht-ionischen Harz zur Adsorptions-Chromatographie in Berührung bringt und anschliessend das der Adsorption dienende Harz mit einer 10% wässrigen Methanollösung behandelt und sodann mit 30 bis 50% Lösung von Methanol eluiert und schliesslich das Lösungsmittel aus den Eluaten entfernt.