CH650800A5 - Process for the preparation of a substrate for the determination of alpha-amylase - Google Patents

Process for the preparation of a substrate for the determination of alpha-amylase Download PDF

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CH650800A5
CH650800A5 CH440183A CH440183A CH650800A5 CH 650800 A5 CH650800 A5 CH 650800A5 CH 440183 A CH440183 A CH 440183A CH 440183 A CH440183 A CH 440183A CH 650800 A5 CH650800 A5 CH 650800A5
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amylase
mmol
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glucosidase
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CH440183A
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Eugen Dr Rer Nat Schaich
Ulfert Dr Rer Nat Deneke
Gerhard Dr Rer Nat Michal
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Boehringer Mannheim Gmbh
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Description

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PATENTANSPRÜCHE Verfahren zur Herstellung eines Substrates für die Bestimmung von a-Amylase der Formel I
OH
OH
CH, Off
HO
OH
worin R eine (l->-4)-verknüpfte Phenylglucopyranosyl-, Mononitrophenylglucopyranosyl- oder Dinitrophenylgluco-pyranosylgruppe darstellt, die eine l-0-(a oder ß)-Position aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man das jeweilige Phenylglucopyranosid bzw. nitrierte Phenylglucopyranosid mit a-Cyclodextrin, Amylose oder löslicher Stärke in Gegenwart von Bacillus macerans-amylase umsetzt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von a-Amylase der im Patentanspruch angegebenen Formel I.
Die Bestimmung des ct-Amylasespiegels im Serum ist ein wichtiger klinischer Parameter für die Bauchspeicheldrüsenfunktion. Die handelsüblichen Reagenzien zur Bestimmung der a-Amylase basieren überwiegend auf einem System, bei dem Stärke durch die a-Amylase abgebaut und die gebildeten Bruchstücke im sichtbaren oder im UV-Bereich bestimmt werden, je nachdem ob man angefärbte Stärke oder native Stärke als Amylasesubstrat in den Test einsetzt. Ein wesentlicher Nachteil dieser Verfahren bzw. Reagenzien beruht darauf, dass die Stärke als Makromolekül nur unzureichend zu charakterisieren und zu standardisieren ist, so dass die Umsatzrate der einzelnen Chargen sehr unterschiedlich ausfällt und bei den Messungen immer ein Standard mitgeführt werden muss. Für bessere Ergebnisse wäre ein einheitlicheres Substrat erforderlich, welches zuverlässige Ergebnisse bei der Spaltung liefert.
Einen Schritt vorwärts in Richtung auf ein einheitlicheres Substrat brachte die Verwendung der Maltopentaose. Diese wird von der a-Amylase zu Maltotriose und Maltose gespalten, Maltotriose und Maltose werden durch die a-Glucosi-dase in Glucose überführt, die dann nach beliebigen Methoden, beispielsweise mit der bekannten Hexokinase-Methode, bestimmt werden kann.
Neben der Maltopentaose wurde auch bereits die Malto-tetraose und die Maltohexaose als Substrat vorgeschlagen (US-PS 3 879 263,4000 042). Dabei wurden jedoch mit der Tetraose deutlich schlechtere Ergebnisse als mit der Pentaose, und mit der Hexaose noch schlechtere Resultate als mit der Tetraose erzielt. So wird für die Maltotetraose und -pentaose noch eine stöchiometrische Reaktion angegeben, während für die Hexaose bereits gerade noch tolerierbare Abweichungen von der stöchiometrischen Reaktion festgestellt wurden.
Ein Nachteil der Maltopentaose, der auch bei der Tetraose gefunden wurde, ist jedoch, dass ein erheblicher Reagentienleerwert auftritt, d.h. die Messreaktion bereits läuft, bevor die zu bestimmende Probe zugesetzt wird. Hinzu kommt, dass auch dieser Reagentienleerwert bei höheren Substratkonzentrationen nicht konstant ist, sondern sich mehr als 25 Minuten lang verändert, ehe Konstanz dieser Nebenreaktion erreicht wird. Auch stellte sich heraus, dass die angenommene unterschiedliche Spaltung der Maltopentaose durch Pankreas-a-amylase und Saliva-a-amylase, die eine Unterscheidung ermöglicht hätte, tatsächlich nicht gegeben ist (J. BC, 1970,245,3917-3927; J. Biochem. 51, p. XVIII 1952).
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Substrat zu schaffen, das bei der Bestimmung der a-Amylase verwendet werden kann und eine bessere Reinheit und Einheitlichkeit aufweist als die bekannten Substrate, leicht zugänglich ist und hinsichtlich Leerwert ohne Serum, Dauer der Lag-phase und erreichbarer Maximalaktivität den Forderungen entspricht. Ferner soll eine einfache Messung ohne teure und komplizierte Apparaturen möglich und Eignung für Schnelldiagnostika, wie Teststreifen, gegeben sein.
Es wurde gefunden, dass als Substrat eine Verbindung der
I
CH_OH
Oll
HO
verwendet werden kann, worin R eine ( l-»- 4)-verknüpfte Phenylglucopyranosyl*, Mononitrophenylglucopyranosyl- oder Dinitrophenylglucopyranosylgruppe darstellt, die eine l-0-(a oder ß)-Position aufweist.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Verbindungen der Formel I überlegene Eigenschaften als Substrat der a-Amylase haben, obwohl bei den für diesen Zweck bereits vorgeschlagenen Oligomaltosen von der Maltopentaose zur Maltohexaose ein wesentlicher Abfall der Eignung festgestellt wurde, da mit ihr wesentlich schlechtere Resultate als mit der Pentaose erzielt werden. Es war daher zu erwarten gewesen, dass mit einer weiteren Verlängerung der Maltose-oligosaccharidkette nicht mehr tolerierbare Fehler auftreten würden. Überraschenderweise werden jedoch schon mit der Maltoheptaose bessere Ergebnisse als mit der Pentaose erzielt. So beträgt der Reagenzienleerwert bei 0,02 ml Probe mit Maltopentaose als Substrat 73%, mit Maltoheptaose dagegen nur 13%, bezogen auf den Endwert der Bestimmung im Normalbereich.
Ausserdem wurde gefunden, dass anstelle der Maltoheptaose selbst auch die Maltoheptaose-derivate der Formel I als Substrat verwendet werden können, die bei Einwirkung der a-Amylase ein derivatisiertes Spaltprodukt bilden, welches sich besonders vorteilhaft bestimmen lässt.
Die a-Amylase lässt sich in vorteilhafter Weise durch enzymatische Spaltung einer Verbindung der Formel I als a-Amylase-Substrat und Messung eines Spaltproduktes bestimmen. Ein einfaches Verfahren zur Herstellung der Maltoheptaose ist in der DE-OS 2 741 191 beschrieben.
Die Maltoseheptaose-derivate der Formel I werden erfin-dungsgemäss nach den im Patentanspruch angegebenen Verfahren hergestellt.
Die enzymatische Herstellung der Phenylderivate der Formel I erfolgt durch Transglucosidierung des Phenylglucosids bzw. der entsprechenden nitrierten Phenylglucoside mit a-Cyclodextrin, Amylose oder löslicher Stärke in Gegenwart einer Amylase aus Bacillus macerans verwendet. Dabei lässt sich für diese Transglucosidierung die bekannte Amylase von Bacillus macerans (E.C. 2.4.1.19. DSM 24; Isolierung: J.A. de Pinto, L.L. Campbell, Biochemistry 7 (1968) 114; Transferreaktion: Methods in Carbohydr. Chemistry, Vol. II, 347) verwenden, welche neben ihrer hydrolytischen und cyclisieren-den Wirkung offenbar auch eine glucosyltransferierende Wirksamkeit aufweist.
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Wie oben bereits erwähnt, werden die Verbindungen der Formel I als Substrat bei der Bestimmung von a-Amylase verwendet. Dieses Bestimmungsverfahren eignet sich in besonderem Masse bei der Bestimmung der Spaltprodukte mittels a-Glucosidase oder Maltosephosphorylase.
Bei der Bestimmung mit a-Glucosidase und einer Verbindung der Formel I werden die Spaltprodukte der Maltohep-
taosederivate der Formel I, Maltotetraose und Maltotriose, weitergespalten zu Glucose und letztere dann in an sich bekannter Weise gemessen. Für die Messung der gebildeten Glucose wird dabei in Gegenwart der a-Glucosidase beson-5 ders das Hexokinaseverfahren bevorzugt. Das Prinzip dieses Verfahrens lässt sich durch nachstehende Gleichungen wiedergeben:
Maltoheptaose + HbO "-A"1-'la»e Maltotriose + Maltotetraose Maltotriose + 2 H?0 "-°ll"-'0>"iuse ^3 Glucose
Maltotetraose + 3 H2P "-Cil"c0;''djie ► 4 Gl ucose
7 Glucose+ 7ATP-tü^^ 7 Glucose-6-P
7Glucose-6-P + 7NAD+ I*£2ö-^7 Gluconat-6-P + 7NADH + 7H +
Für dieses Verfahren eignen sich besonders auch die Verbindungen der Formel I. Bei der Einwirkung der beiden Enzyme a-Amylase und a-Glucosidase wird der Substituent, also eine Phenylgruppe, Mononitrophenylgruppe oder Dini-trophenylgruppe, abgespalten und lässt sich leicht bestimmen. Die Phenylgruppen können in a- oder ß-Stellung stehen. Handelt es sich um die a-Stellung, so erfolgt deren Abspaltung durch die Einwirkung von a-Amylase und a-Glucosidase alleine, und die abgespaltenen, substituierten oder unsubstituierten Phenole lassen sich dann nach bekannten Farbreaktionen leicht bestimmen. Dieses Verfahren lässt sich aber auch bei ß-ständigen Substituenten anwenden. Im letzteren Fall wird zusätzlich neben der a-Glucosidase auch noch ß-Glucosidase verwendet.
Bei den Dinitrophenylresten können die beiden Nitro-gruppen in beliebiger Stellung vorliegen, beispielsweise als 2,4-, 2,6- oder 3,5-Substituenten.
Die bei der Abspaltung der Nitrogruppen enthaltenden Substituenten freiwerdenden Nitrophenole bzw. Dinitrophe-nole sind selbst gefärbte Verbindungen, die sich ohne weiteres optisch bestimmen lassen. Wird Phenol selbst abgespalten, so lässt sich dieses nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung mit einem nucleophilen Agens, wie 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK) in Gegenwart von Monophenoloxidase bestimmen. Bei dieser Reaktion wird ein roter Farbstoff gebildet, der gemessen werden kann.
Für die Durchführung des genannten Verfahrens sind im allgemeinen pH-Werte zwischen 5 und 9 geeignet. Bevorzugt wird bei pH-Werten zwischen 7 und 7,5 gearbeitet, da hierbei die besten Resultate und die kürzeste Reaktionszeit erhalten werden. Werden Nitrophenylverbindungen eingesetzt, so ist der Bereich der gut geeigneten pH-Werte etwas enger und liegt im allgemeinen zwischen pH 6 und pH 8,5.
Als Puffer eignen sich insbesondere solche, die im Hauptaktivitätsbereich der eingesetzten Enzyme wirksam sind. Bevorzugt werden Phosphat, HEPES (N-(2-Hydroxyäthyl) -piperazin-N-2-äthansulfonsäure) und Glycylglycin. Bevor-
20 zugte Konzentrationen liegen zwischen 10 und 200 mMol/1.
Die a-Glucosidase wird im allgemeinen in Mengen zwischen 0,1 und 5000 U/ml eingesetzt. Es ist ein besonderer Vorzug des Verfahrens, dass relativ grosse Mengen dieses Enzyms verwendet werden können, so dass die a-Amylase-25 Spaltung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Es ist natürlich auch möglich, noch höhere Mengen an diesem Enzym einzusetzen, hierdurch werden jedoch keine weiteren Vorteile mehr erzielt.
Die Verbindungen der Formel I werden im Test im allge-30 meinen in Mengen zwischen 0,1 und 250 mMol/1 eingesetzt. Bevorzugt werden Mengenzwischen 0,5 und 100 mMol/1.
Substratsättigung der a-Amylase mit Maltoheptaose liegt bei einer Konzentration von 8 bis 10 mMol vor. Zweckmässigerweise wird daher eine Mindestkonzentration von 8 mMol 35 an Maltoheptaose verwendet, falls unter Bedingungen der Substratsättigung gearbeitet werden soll, was in der Regel der Fall ist.
Ausserdem wird zweckmässig ein Aktivierungsmittel für die a-Amylase zugesetzt. Derartige Aktivierungsmittel sind 40 bekannt. Bevorzugt wird Natriumchlorid oder Kaliumchlorid.
Die Bestimmung der Spaltprodukte kann weiter durch Umsetzung mit Maltosephosphorylase unter Bildung von Glucose-1-phosphat, welches dann in an sich bekannter Weise bestimmt wird, erfolgen. Die Bestimmung des Glucose-45 1 -phosphats erfolgt bevorzugt durch Umwandlung in Glu-cose-6-phosphat mittels ß-Phosphoglucosemutase, Oxidation des gebildeten Glucose-6-phosphats mit NAD in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase unter Bildung von Gluconat-6-phosphat und NADH, wobei die Bildung des 50 letzteren photometrisch leicht verfolgt werden kann. Das Messsignal lässt sich noch verstärken durch Weiteroxidation mit NAD in Gegenwart von 6-Phosphogluconat-dehydroge-nase unter Bildung von Ribulose-5-phosphat und einem weiteren Molekül NADH.
55 Das Prinzip dieser Ausführungsform geben die nachfolgenden Gleichungen wieder:
Maltoheptaose + H;0 "-Amvljse ►Maltotriose + Maltotetraose-"-Maltose Maltose + POr ► Glucose + ß-Glucose-1 -P
ß-Glucose-l-P iipoluM ► Glucose-6-P
Glucose-6-P + N AD+ «£!>"_► Gluconat-6-P+ NADH + H + Gluconat-6-P+ NAD+ 6t'GDH ► Ribulose-5-P+ NADH + H + .
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Ein Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass Maltosephosphorylase spezifischer ist als a-Glucosidase und daher endogene Glucose nicht stört.
Hinsichtlich der Puffer gilt das zum a-Glucosidaseverfah-ren Ausgeführte in gleicher Weise.
Ausser den beiden oben aufgeführten Verfahren kann die Bestimmung der gebildeten Bruchstücke der Maltoheptaose, also Maltotetraose, Maltotriose und daraus gebildete Maltose, auch nach anderen hierfür bekannten Methoden erfolgen.
Ein Reagens zur Bestimmung der a-Amylase enthält ein a-Amylasesubstrat und ein System zur Bestimmung eines aus dem a-Amylasesubstrat durch die a-Amylase gebildeten Spaltprodukts, wobei das Substrat eine Verbindung der Formel I ist.
Ein bevorzugtes System für die Bestimmung der Spaltprodukte ist das a-GIucosidasesystem, welches a-Glucosidase, Alkalichlorid und Puffer enthält. Ist Substrat Maltoheptaose selbst, so werden als Enzyme noch Hexokinase (HK) und Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH) sowie NAD, ATP und Magnesium benötigt.
Bevorzugt besteht ein Reagens auf Basis des a-Glucosida-sesystems aus
5 x 103 bis 3 x 104 U/1 a-Glucosidase,
103 bis 5 x 104 U/1 HK,
103 bis 5 x 104 U/1 G6PDH,
0,5 bis 8 mMol/1 NAD,
0,5 bis 5 mMol/1 ATP,
1 bis 3 mMol/1 Mg2+,
25 bis 100 mMol/1 NaC! oder KCl,
25 bis 200 mMol/1 Puffer, pH 6,2 bis 7,8 und
5 bis 100 mMol/1 Maltoheptaose oder einem Vielfachen oder Bruchteil davon, in trockener oder gelöster Form.
Ein anderes Reagens enthält a-GIucosidase, KCl oder NaCl, Puffer und Substrat. Ein derartiges Reagens enthält insbesondere 102 bis 5x 106 U/1 a-Glucosidase, 1 bis 100 mMol/1 NaCl oder KCl, 10 bis 250 mMol/1 Puffer, pH 5 bis 9 und 0,1 bis 250 mMol/1 Maltoheptaosederivat der Formel I, bezogen auf die Konzentration im Test. Das Reagens kann in trockener, insbesondere lyophilisierter Form, oder in Form einer Lösung, als Mischung aller Bestandteile oder getrennt vorliegen.
Ein Reagens der obigen Art enthält vorzugsweise zusätzlich noch ß-Glucosidase oder/und Phenoloxidase und 3-Methyl-6-sulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (HSK).
Ein anderes Reagens enthält neben a-Glucosidase, NaCl oder KCl, Puffer und Substrat noch Sorbitdehydrogenase oder Gluconat-kinase und 6-Phosphogluconsäure-dehydroge-nase sowie NAD und gegebenenfalls ein Tetrazoliumsalz und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat (PMS).
Ein bevorzugtes Reagens dieser Art enthält 1 x 102 bis 3 x 106 U/1 a-Glucosidase, 2 x 103 bis 5 x 10" U/1 Sorbitdehydrogenase, 1 x 103 bis 5 x 104 U/1 Hexokinase, 0,5 bis 50 mMol/1 ATP, 10 bis 500 U/1 Diaphorase (Chlostridium Kluy-veri), 0,01 bis 0,5 mMol/1 Tetrazoliumsalz, 0,1 bis 10 mMol/1 NAD, 0,2 bis 5 mMol/1 MgCh, 0,5 bis 20 mMol/1 Maltohep-tit, 1 bis 100 mMol/1 NaCl oder KCl und 10 bis 250 mMol/1 Puffer, pH 5,5 bis 8,5.
Gegebenenfalls ist noch ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in einer Menge zwischen 5 und 50 mMol/1 vorhanden.
Ein ebenfalls bevorzugtes Reagens enthält 100 bis 3 x 106 U/1 a-Glucosidase, 10 bis 104 U/1 6-Phosphogluconatde-hydrogenase, 20 bis 2 x 104 U/1 Gluconat-kinase, 0,5 bis 25 mMol/1 ATP, 0,05 bis 1,0 mMol/1 NADP, 1,0 bis 20 mMol/1 Maltoheptagluconsäure, 0,5 bis 5 mMol/1 MgCh, 1 bis 100 mMol/1 NaCl und 10 bis 50 mMol/1 Puffer, pH 5,5 bis 8,5.
Ein weiteres Reagens enthält 0,1 bis 250 mMol/1 a-Nitro-
phenyl-maltoheptaosid oder Dinitrophenyl-maltoheptaosid, 1 x 102 bis 2,5 x 106 U/1 a-Glucosidase, 1 bis 100 mMol/1 Natriumchlorid oder Kaliumchlorid und 10 bis 250 mMol/1 Phosphatpuffer, pH 7.0 bis 8.0.
Noch ein anderes Reagens enthält:
0,1 bis 250 mMol/1 a-Phenylmaltoheptaosid,
1 x 102 bis 1,5 x 106 U/1 a-Glucosidase,
10 bis 105 U/1 Monophenoloxidase,
0,1 bis 10 mMol/1 HSK,
1 bis 100 mMol/1 NaCl oder. KCl und 10 bis 250 mMol/1 Puffer.
Ein anderes bevorzugtes System zur Bestimmung der Spaltprodukte ist das Maltosephosphorylasesystem, welches im wesentlichen aus Maltosephosphorylase, ß-Phosphogluco-mutase (ßPGluM), Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH), Glucose-1,6-diphosphat (G1,6DP), NAD, Puffer, Maltoheptaose und gegebenenfalls 6-Phosphogluconatde-hydrogenase (6PGDH) besteht.
Ein besonders bevorzugtes Reagens mit diesem Nachweissystem besteht aus
0,5 x 103 bis 20 x 103 U/1 Maltosephosphorylase,
lxlO2 bis 1 x 104ß-PGluM,
2 x 102 bis 3 x 104 U/1 Giucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 10mM/l NAD,
0,001 bis 1 mM/1 Glucose-1,6-diphosphat,
0,5 bis 100 mM/1 Puffer, pH 6,0 bis 7,5,
5 bis 50 mM/1 Maltoheptaose und gegebenenfalls
1 x IO2 bis 1 x 104 U/1 6-Phosphogluconat-dehydrogenase.
Das Reagens kann in trockener oder gelöster Form vorliegen, es kann auch auf einem blattförmigen Träger, z.B. einer Folie, einem saugfähigen Papier oder dergleichen, imprägniert vorliegen. Im letzteren Falle besteht es zweckmässig aus wenigstens drei Schichten bzw. Lagen, wobei eine erste Schicht das Substrat enthält, die zweite Schicht als Sperrschicht dient und die dritte Schicht das System zur Bestimmung der Spaltprodukte enthält. Wird ein derartiges mehrschichtiges Reagensmaterial, welches sich für einen einfachen Schnelltest auf a-Amylase eignet, mit einer flüssigen, a-amy-lasehaltigen Probe in Berührung gebracht, so spaltet die a-Amylase das Substrat, und die Bruchstücke diffundieren durch die Zwischenschicht in die dritte, das Bestimmungssystem enthaltende Schicht. Als Nachweisreaktion wird in diesem Falle zweckmässig eine farbbildende Reaktion verwendet, um anhand der auftretenden Verfärbung die Konzentration der a-Amylase visuell sichtbar zu machen, falls die Spaltprodukte nicht selbst schon gefärbt sind.
Wie bereits erwähnt, wird durch die Verwendung der Verbindungen der Formel I als Substrat zur Bestimmung von a-Amylase nicht nur ein rasches und spezifisches Verfahren zur Bestimmung der a-Amylase ermöglicht, sondern insbesondere wird die lag-phase ganz oder weitgehend beseitigt, was von besonderer Bedeutung bei der Anwendung des Verfahrens auf Analysenautomaten ist. Ausserdem lässt sich die Bestimmung der a-Amylase in vielen Ausführungsformen ohne komplizierte Apparaturen für die Auswertung durchführen und eignet sich daher insbesondere für Schnelldiagno-stica und zur optischen Bestimmung im sichtbaren Bereich. Gleichzeitig lassen sich die verschiedenen Ausführungsformen des Bestimmungsverfahrens jedoch auch mit UV-Messgeräten durchführen. Weitere Vorteile sind strenge Proportionalität und keine Störung durch chemisch verwandte Inhaltsstoffe des Bluts.
Die Substate der Formel I sind erfindungsgemäss gut und in hoher Reinheit zugänglich.
Die Bestimmung der a-Amylase kann in biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Serum, Heparinplasma, Urin und dergleichen, oder in anderen flüssigen oder festen Materialien durchgeführt werden.
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Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel p-Nitrophenyl-a-maltooligosaccharide durch enzymatische Synthese mit Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24).
Bacillus macerans-amylase hat neben hydrolytischer und cyclisierender Wirkung auch Glycosyl-transferierende Eigenschaften, die zur Synthese von Oligosacchariden und -deriva-ten ausgenützt werden können (Methods in Carbohydrate Chemistry II, 347). Für die Synthese von p-Nitrophenyl-oli-gosacchariden wurde dieses Verfahren wie folgt optimiert:
680 mg Bacillus macerans-amylase (E.C.2.4.1.19 aus Bac. mac. DSM 24) (Lyophilisat) (0,46 U/mg Einwaage, Proteingehalt der Einwaage 28,5%, frei von p-Nitrophenyl-a-D-glu-cosid-spaltenden Aktivitäten), 400 mg «-D-p-Nitrophenylglucosid,
3,5 g a-Cyclodextrin, und
70 ml Soerensen Phosphat-puffer, pH 6,2; 0,01 M werden gemischt. Der Ansatz wird 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zur Aufreinigung wird dann a- und entstandenes ß-Cyciodextrin zunächst über die Tetrachloräthylen-ein-schlussverbindung abgetrennt. Nach Chromatographie an vernetztem Dextran (Sephadex LH20) erhält man 50 mg Lyophilisat von im Amylase-test hochaktivem p-Nitrophenyl-maltoheptaosid.
Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Maltohep-taose-derivate
I. Nachweis von a-Amylase mit Phenyl-a-maltoheptaosid als Substrat
Phenyl-a-maltoheptaosid wird von der a-Amylase in Phe-nyl-a-maltotriid oder -tetraid gespalten, welche durch a-Glucosidase zu Phenol und Glucose umgesetzt werden. Das freigesetzte Phenol wird durch Monophenoloxidase oxidativ mit dem nucleophilen Reagens 3-Methyl-6-sulfonyI-benzthiazo-lon-hydrazon-(2) (HSK) zu einem roten Farbstoff gekuppelt, dessen Bildungsgeschwindigkeit proportional zur Amylase-aktivität in der Probe ist und photometrisch verfolgt werden kann.
Testprinzip:
la) Phenyl-a-maltoheptaosid + H2O " Am'lase ► Phenyl-a-D-tri-(tetra)-glucopyranosid + Maltotetra-(tri)-ose b) Phenyl-a-D-tri-(tetra)-gIucopyranosid + 3(4)HiO «-Cjiucosidase phénol + 3(4)Glucose c) Phenol + HSK + O? ► Farbstoff + 2H2O
Messbedingungen :
25 °C, Messwellenlänge 492 nm, 1 cm Küvetten; die Reagenszusammensetzung zeigt folgende Tabelle.
Tabelle
Reagens Konzentration im Test
Phosphatpuffer, pH 7,4 0,05 Mol/1
Natriumchlorid 0,05 Mol/I
Phenyl-a-D-maltoheptaosid 10 mMol/1
HSK I mMol/1
Monophenoloxidase 1 U/ml a-Glucosidase 10 U/ml
Testvolumen: 2,0 ml
Anstelle von Phosphatpuffer erwiesen sich auch Glycin-, Glycylglycin-, Hepes-, Tris-, Tra- und andere Puffer als brauchbar.
2. Bestimmung von a-Amylase mit p-Nitrophenyl-malto-heptaosid.
Testprinzip:
p-Nitrophenyl-a-maltoheptaosid "-Am-'lase ►
(Glucose)0 + p-Nitrophenyl-a-(glucose)m f'-°llu:oslda>e ► n Glucose+ p-Nitrophenol.
Nach der Spaltung des Maltoheptaosids werden die Spaltprodukte zu Glucose und p-Nitrophenol abgebaut. Das p-Nitrophenolatanion ist in alkalischer Lösung gelb gefärbt und kann daher direkt optisch gemessen werden.
Testsystem:
Reaktionsgemisch:
50 mM/1 Phosphatpuffer, pH 7,4
50 mM/1 Natriumchlorid
5 bis 50 U/ml a-Glucosidase
5 bzw. 10 mM/1 p-Nitrophenyl-a-maltoheptaosid
Testansatz:
1 ml Reaktionsgemisch + 50 ^1 Probe (Serum)
Temperatur: 30 °C Wellenlänge: 405 nm
Serumstart nach Erreichen der Messtemperatur (10 Minuten Vorinkubation).
3. a-Amylase-Bestimmung mit Maltoheptit
Testprinzip:
Maltoheptait + H2O "•Amyhlse ► Maltotriit + Maltotetraose Maltotriit+ H2O Sorbit + Maltose
Sorbit +NAD+-512ÜK Fructose + NADH + H + NADH-t-INT+H+-!i!üE!HHiL^ NAD + SDH = Sorbitdehydrogenase
Testsystem:
Reaktionsansatz ml
Konzentration im Test
N a-/ K- PO4- Puffer 0,02 Mol/1
1,92
12,8 mMol/1 P04
+ Triton XI00 2 ml/100 ml
+ NaCl 10 mMol/1, pH 6,9
6,4
mMol/1
MgCh 0,3 Mol/1
0,01
0,01
1,0 mMol/1
Maltoheptit 100 mMol/1
0,10
3,3 mMol/1
NAD c = 40 mg/ml
0,05
1,0 mMol/1
INT c = 0,6 mg/ml
0,20
0,09 mMol/1
Diaphorase (Clostr. Kluyveri)
0,05
167 U/1
5 mg/ml+
ATP c = 50 mg/ml
0,10
3,29 mMol/1
Hexokinase 280 U/ml +
0,05
4666 U/1
SDH 180 U/ml*
0,30
18000 U/1
a-Glucosidase 1120 U/ml*
0,20
74670 U/1
Probe (Serum)
0,02
in Testpuffer
Start durch Probezugabe: Messung erfolgt bei 92 nm; Temperatur: 25 °C
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