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PATENTANSPRÜCHE
1. Kollektion von monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Glieder gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten-Interferone (HLI) gerichtet sind.
2. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, welche sich voneinander in ihren Isotypen unterscheiden.
3. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 8 Antikörper vom IgG und ein Antikörper von IgM Isotyp sind.
4. Kollektion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass von den 8 Antikörpern mit IgG Typ 7 eine y1 schwere und einer eine 72b schwere Kette aufweist.
5. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich einzelne monoklonale Antikörper gegenseitig nicht inhibieren, d.h. gemeinsam an HLI binden, andere sich gegenseitig inhibieren, d. h. nicht gemeinsam an HLI binden.
6. Kollektion nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, deren Glieder verschiedene Epitope (antigenische Determinanten) von HLI erkennen.
7. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Antikörper aus der Kollektion HLI y, nicht erkennt.
8. Kollektion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper (IgM) die antivirale Aktivität von HLI nicht neutralisiert.
9. Verwendung von je einem Glied von verschiedenen Gruppen von Antikörpern gemäss Anspruch 6 für einen Festphasen-Sandwich-Test für HLI.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der nicht immobilisierte Antikörper mit Radioaktivität oder einem Enzym markiert ist.
11. Verwendung von einem Antikörper gemäss Kollektion von Anspruch 1 zur Reinigung von natürlichem oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenem HLI.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung affinitätschromatographisch durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Proteine, und zwar gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten-Interferone (HLI).
HLI ist möglicherweise ein wertvolles Therapeutikum zur Behandlung von neoplastischen und viralen Krankheiten. Die Evaluation dieser Substanz und ihre mögliche Entwicklung zu einem weitverbreiteten Medikament wird durch die Schwierigkeit, den Wirkstoff in der erforderlichen Weise zu reinigen und zu charakterisieren, beeinträchtigt. Für die gewünschte Reinigung und die erforderliche Charakterisierung von HLI wäre ein Test, der sich in weniger als 24 Stunden durchführen lässt, eine wertvolle Hilfe.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass sich zum Reinigen und Bestimmen von HLI in vorzüglicher Weise eine Kollektion von monoklonalen Antikörpern eignet, die gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene Leukozyten-Interferone gerichtet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach eine Kollektion von monoklonalen Antikörpern, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ihre Glieder gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene humane Leukozyten Interferone (HLI) gerichtet sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich gezeigt, dass sich einzelne monoklonale Antikörper gegenseitig nicht inhibieren, d. h. gemeinsam an HLI binden, während sich andere gegenseitig inhibieren, d.h. nicht gleichzeitig an HLI binden. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Kollektion aus Gruppen von monoklonalen Antikörpern besteht, deren Glieder verschiedene Epitope (antigenische Determinanten) von HLI erkennen.
Eine Eigenheit der Kollektion von monoklonalen Antikörpern gemäss vorliegender Erfindung besteht darin, dass mindestens ein Antikörper HLI 73 nicht erkennt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich weiter gezeigt, dass die vorerwähnte Kollektion aus einer Gruppe von Antikörpern besteht, welche sich voneinander in ihren Isotypen unterscheiden. 8 Antikörper zeigen IgG-Struktur, wogegen einer IgM-Struktur zeigt. Von den 8 Antikörpern mit IgG-Struktur haben 7 eine y1 schwere Kette und einer eine Y2b schwere Kette.
Eine weitere Besonderheit der Kollektion von monoklonalen Antikörpern gemäss vorliegender Erfindung besteht darin, dass ein Antikörper (IgM) die antivirale Aktivität von humanem Leukozyten-Interferon nicht neutralisiert.
Wie bereits erwähnt, ist die Kollektion dieser monoklonalen Antikörper u. a. dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Gruppen von Antikörpern besteht, deren Glieder verschiedene Epitope von HLI erkennen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demnach die Verwendung von je einem Glied dieser Gruppe von Antikörpern für einen Festphasen-Sandwich-Test für HLI. Beim vorerwähnten Sandwich-Test wird ein Antikörper mit einem geeigneten Label versehen. Hierzu kommt jeder hierfür geeignete Label in Betracht, doch wird ein radioaktiver oder ein Enzym Label bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von einem Antikörper aus der oben erwähnten Kollektion zur Reinigung von HLI. Die Reinigung von HLI mittels des monoklonalen Antikörpers erfolgt vorzugsweise durch Affinitätschromatographie. Hierbei muss für eine Reinigung in kommerziellem Massstab die Affinität genügend hoch sein, damit das Interferon auch bei grossen Volumina, die mit nicht zu kleiner Geschwindigkeit durch die Säulen fliessen, praktisch quantitativ zurückgehalten wird. Mit einem einzigen Antikörper ist dies nicht für alle Arten (Subklassen) von Interferon möglich. Hierzu eignet sich besonders eine Kollektion von monoklonalen Antikörpern, deren einzelne Glieder gegen einzelne Subklassen von Interferon hohe Affinitäten aufweisen.
Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt nach der an sich bekannten Zellfusionstechnik, bei der Myelomzellen mit Milz-Zellen von Mäusen, die mit HLI immunisiert wurden, fusioniert werden. Die erhaltenen Hybridome sezernieren monoklonale Antikörper gegen natürliche oder durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene Leukozyten-Interferone.
Die Durchführung des Festphasen-Sandwich-Tests zur Bestimmung von HLI kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, doch konnte eine wesentliche Vereinfachung gefunden werden, indem im Gegensatz zu den bekannten Festphasen-Sandwich-Verfahren, unmarkierter und markierter Antikörper von Anfang an gemeinsam und nur einmal inkubiert werden.
Die Reinigung von HLI mittels eines monoklonalen Antikörpers kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wobei sich die Affinitätschromatographie als besonders geeignet erwiesen hat. Bei dieser Affinitätschromatographie
wird vorzugsweise Affi-Gel 10 (BioRad Laboratories, Richmond, California) als Träger verwendet.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass nach dem Festphasen-Sandwich-Verfahren gemäss vorliegender Erfindung humanes Leukozyten-Interferon bis zu einer Konzentration von 2 U/ml im Serum nachweisbar ist.
Andererseits hat sich gezeigt, dass mit einem monoklonalen Antikörper gemäss vorliegender Erfindung durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenes humanes Leukozyten Interferon auf einfache Art und Weise derart gereinigt werden kann, dass es für klinische Versuche verwendbar ist.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung der monoklonalen Antikörper
A) Interferon-Präparate
Teilweise gereinigtes humanes Leukozyten-Interferon (IFL) war in genügender Menge zur Immunisierung der Mäuse vorhanden. 5 IFL-Präparate werden verwendet: a) IFL r (a) Hauptpeak der Fraktion gemäss Stufe 8 von Tabelle 3 der DOS No. 2947 134 mit einer ungefähren Reinheit von 10-15% (abgeschätzt durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gel-Elektrophorese) und spezifischer Aktivität im antiviralen Test; b) IFL a; c) IFL ss; d) IFL r; und e) IFL 6.
Die IFL a, ss und r Fraktionen bestehen je aus Gemischen der individuellen (al, a2), (ss1, ss2 p3) und (7l, 72, 73, y4, rS) Spezies. Dies sind Schulterfraktionen der entsprechend gereinigten Spezies, welche von verschiedenen Präparaten gepoolt werden (vgl. Stufe 9 von Tabelle 3 der vorerwähnten DOS). Die IFL 6 Fraktion stellt die Schulter der 6 Spezies dar. Neben den Spezies a, P und r an der Lichosorb Diolsäule (vgl. Stufe 8 von Tabelle 3 der vorerwähnten DOS) zeigt sich gelegentlich eine 8-Fraktion.
Diese wird wie in Stufe 9 gemäss Tabelle 3 der vorerwähnten DOS gereinigt, wobei sich zeigt, dass die Spezies 8 keine Unterspecies zeigt und einheitlich ist. Die Reinheit von b), c) und d) ist zwischen 20 und 40% gemäss spezifischer biologischer Aktivität und gemäss Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Die Reinheit von e) ist höchstens 5%.
Bestimmung von Interferon-Aktivität
Die Interferon-Aktivität wird mittels des cytopathiceffect-inhibition (CPE) Test gemäss U.S. Patentschrift No. 241 174 (Serial No. 963,256) bestimmt.
B) Immunisierung der Mäuse
3 Acht Wochen alte Balb c/J weibliche Mäuse werden zuerst mit IFL r (a) in Freund's vollständigem Adjuvans immunisiert. Jede Maus erhält ungefähr 15011g Gesamtprotein enthaltend 20-25 pg von Interferon in 0,25 ml an 5 verschiedenen Stellen (0,05 ml in jede Stelle): Subkutan in die linke und rechte Leistengegend und in die linke und rechte Achselgegend sowie eine intraperitoneale Injektion.
53 Tage später wird eine Zweitimmunisierung wie folgt durchgeführt: Interferon IFL r (a) wird durch präparative Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid (15%) Gel-Elektrophorese in drei 0,6 x 11 cm zylindrischen Gelen aufgetrennt.
Ungefähr 300 g Gesamtprotein in 0,3 ml (dialysiert gegen Probenpuffer) enthaltend ungefähr 40-501lg von Interferon werden pro Gel geladen. [Diese Reinigung erfolgt im wesentlichen nach der Methode von Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685]. Nach der Elektrophorese werden die Gele in 2 mm dicke Scheiben geschnitten. Diese werden während 10
Minuten in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3; 0,14 M Natrium chlorid) enthaltend 0,1 % Triton X-100 in Propylen-Röhr chen eingetaucht. Der Puffer wird in serienmässiger Verdünnung nach dem CPE-Inhibitionstest nach Interferon-Aktivität untersucht. Die Scheiben 6 und 7 (numeriert vom unteren Ende jedes Gels) zeigen die höchste Interferon-Aktivität (je ungefähr 25% der Aktivität des gesamten Gels).
Je eine Scheibe mit Höchstaktivität wird mit einer Rasierklinge auf einer Glasplatte kleingeschnitten, in eine 1 ml Spritze enthaltend 0,2 ml 0,15 M Natriumchlorid transferiert und in jede Maus eingespritzt. Die Gelsuspension wird intraperitoneal injiziert, worauf 0,2 ml BCG (Bacillus Calmette-Guerin; Serum Institut Bern) injiziert werden.
Nach 12 Tagen wird das Serum jeder Maus auf Interferon-Neutralisationsaktivität untersucht. Das Serum von Maus Nr. 3 zeigt eine 50%ige Neutralisation von 10 Einhei ten/ml von IFL r (a) bei einer Verdünnung von 1 :72 000, neutralisiert jedoch dieselbe Konzentration, von rohem IFL ( < 0,1 % Reinheit) sogar bei einer Verdünnung von 1:100 nicht. Die Mäuse Nr. 1 und Nr. 2 zeigen Neutralisationstiter von weniger als 1:1000 gegen IFL r (a).
70 Tage nach der zweiten Immunisierung erhält Maus Nr. 3 an drei nacheinanderfolgenden Tagen eine intraperitoneale Booster-Injektion mit einem Gemisch von IFL a, ss und r enthaltend ungefähr 50 llg Interferon und 15 normales Mausserum als Trägerprotein (in 0,2 ml 0,15 M Natriumchlorid). 48 Stunden nach der letzten Injektion wird die Maus getötet und die Milz zur Herstellung der monoklonalen Antikörper entfernt.
C) Zellkulturen und Zellfusionen
Die folgenden Materialien und Medien werden verwendet. Iscove's Modifikation von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (IMDMEM) ist von Gibco erhältlich. Es wird frisch ergänzt mit Natriumpyruvat (1 mM), Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoäthanol (5 x 10-5 M), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100,ug/ml). Vollständiges HAT Medium besteht aus so vervollständigtem IMDMEM sowie Hypoxanthin (10-4 M), Aminopterin (4 x 10-7 7 M), Thymidin (1,5 x 10 - 5 M) und 15% foetales Kälberserum.
Eine 50%ige (w/v) Lösung von Polyäthylenglykol 4000 (PEG 4000, Merck) wird in IMDMEM hergestellt.
Die Fusion mit einer nicht-produzierenden Azaguaninresistenten Myelomzell-Linie wird unter kleinen Modifikationen nach der Methode von Stähli et al. in J. Immunol.
Methods 32, 297-304 durchgeführt. In dieser Fusion werden 48 x 106 kernhaltige Milzzellen mit 25 x 106 Myelomzellen der Linie FO [Fazekas de St. Groth und Scheidegger in J.
Immunol. Methods 35, 1-25 (1980)] fusioniert. Die Milzzellen und Myelomzellen werden in serumfreien IMDMEM gewaschen. Sie werden dann im selben Medium resuspendiert, im oben erwähnten Verhältnis für die Fusion gemischt und in 40 ml serumfreien IMDMEM in einem 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei 200 x g während 15 Minuten sedimentiert, gefolgt durch vollständiges Absaugen des Überstandes. Zum Zellsediment werden unter ständigem Rühren tropfweise 0,5 ml 50%iges PEG 4000 zugesetzt, um die Zellen zu resuspendieren und zu verteilen. Nach ungefähr 90 Sekunden werden bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren während 4-5 Minuten 10 ml serumfreies IMDMEM tropfenweise zugegeben. Nach weiteren 15 Minuten ohne Rühren werden grosse Zellklumpen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 10 ml Pipette getrennt.
Das Fusionsgemisch wird mit vollständigem HAT Medium auf 250 ml verdünnt und dann in 240 Costar cluster wells (1 ml/well) gegeben, die bereits 1 ml komplettes HAT Medium und 105 peritoneale Maus-Zellen als Nährschicht enthalten. Die Kulturen werden in einer 5%gen C02/95% Luft Atmosphäre bei 85% Feuchtigkeit inkubiert. Die Kulturen werden zweimal in der Woche durch Ersetzen des halben Mediums (1 ml) mit frischem HAT Medium gefüttert.
D) Auffinden von Interferon-spezifischen Hybridomen durch einen Festphasen-Antikörperbindungstest (SABA)
Diese Methode ist adaptiert von dem von Catt and Tregear [Science 158, 1570-1572 (1967)] beschriebenen Prinzip und ist geeignet für das Auffinden von Hybridom-Antikörpern [vgl. auch Stähli et al in J. Immunol. Methods 32, 297-304 (1980) sowie Kennet, R.H. in Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, S. 77-91(1978)].
Interferonpräparate von IFL a, ss, 7 und 6 werden individuell in Polypropylen-Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu einer Endkonzentration von ungefähr 0,2 bis 0,5 g Interferon/ml (ungefähr 1-31lg Gesamtprotein per ml;
ausgenommen für IFL 8, wo ungefähr 10-15 g von Gesamtprotein per ml enthalten sind) verdünnt, um damit Polyvinyl-Chlorid Mikrotiter Platten (Cooke Laboratory Products Division, Dynatech Laboratories, Inc.) wie bei Stähli et al. loc. cit. zu beschichten. 50 der Interferonlösung wird in jede Vertiefung gegeben und während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer gelassen oder während 4 "C während mehreren Wochen gehalten. Vor dem Gebrauch werden die Vertiefungen mit 3%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS gefüllt und während 30 bis 60 Minuten so belassen, um alle Proteinbindungsstellen zu blockieren.
Die Platten werden dann viermal mit PBS gewaschen. 50 Überstand der Hybridomkulturen werden in je zwei Vertiefungen während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Kontrollversuche (unspezifische Bindung) werden an Platten durchgeführt, die nur mit 3%igem BSA beschichtet sind.
Nach viermaligem Waschen mit PBS wird zu jeder Vertiefung 50 1ll Schaf-Anti-Maus Ig-Antikörper (durch Affini tätschromatographie gereinigt und mit 125I markiert; 50 000 bis 100 000 cpm pro 20 bis 30 ng Antikörper in PBS enthaltend 1 % BSA) gegeben und während mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden vier- bis fünfmal mit PBS gewaschen und dann in die einzelnen Vertiefungen geschnitten, welche dann in einem Gam- ma-Scintillations-Spektrometer auf Radioaktivität getestet werden.
E) Ergebnisse a) Initialscreening durch Antikörperbindung (SABA) gegen teilweise gereinigte IFL Fraktionen
152 der 240 Kulturen zeigen Wachstum von Hybridomen. Die Überstände werden auf Interferon-spezifische Antikörper im SABA Test geprüft, wenn die Kulturen ungefähr 20-30% konfluent sind (12-29 Tage nach der Fusion). Antikörperbindung wird parallel geprüft mit IFL a, IFL P, IFL 7 und IFL 6. Von den 152 Kulturen zeigen 13 Überstände hohe Antikörperbindung gegen alle vier teilweise gereinigten Interferonpräparate. Das Medium von vier weiteren Hybridomen zeigt niedrige Bindungsaktivität (3-4 mal grösser als unspezifische Bindung) gegen alle vier Interferonpräparate.
Diese Kulturen werden verworfen. Die Medien aller anderen Hybridome (135 wachsende Kulturen) liefern unspezifische Bindungen gegen alle vier IFL Präparate. Von den 13 spezifischen Hybridomen werden für die vorliegende Erfindung 9 repräsentative charakterisiert. Ihre Bezeichnung ist LI-1, LI2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8, LI-9 und LI-12.
Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, zeigt die Antikörperbindung der 9 spezifischen Hybridome zu den 4 teilweise gereinigten Interferonpräparaten ein unterschiedliches Verhalten.
LI-l, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 und LI-8 zeigen eine identische Charakteristik mit der folgenden Bindungsreihenfolge: IFL a < IFL 8 < IFL < IFL ss. Für LI-9 ist die Bindungsordnung IFL 6 < IFL 7 < IFL p. LI-12 ist verschieden von allen übrigen.
b) Antikörperbindung (SABA) gegen hoch gereinigtes
Leukozyten-Interferon
Sechs gereinigte (2 80% rein) Interferonspezies (vgl. Stufe 9 von Tabelle 3 der DOS 2947 134) werden durch Adsorption an Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten immobilisiert. Es handelt sich dabei um IFL al, a2, p2, r2 und y3 sowie um IFL-K der Zell-Linie KG-1 [Koeffler, H.P. et al.
Science 200, 1153-1154(1978)], welches in Analogie zu den Stufen 1 bis 9 von Tabelle 3 der erwähnten DOS gereinigt wird. Da in den Stufen 8 und 9 keine klare Trennung in individuelle Spezies zu beobachten war, wurde die Hauptfraktion mit der Interferonaktivität gepoolt. Sie stellt deshalb ein Gemisch verschiedener Spezies dar. Die Adsorption von Interferon (50111/pro Vertiefung) wird über Nacht bei ungefähr 0,5 llg Interferon und 2 ug BSA pro ml PBS gefolgt durch Abblocken der Proteinbindungsstellen mit 3%igem BSA wie vorhergehend beschrieben, durchgeführt.
Die Antikörperbindung mit Kulturmedium der 9 spezifischen Hybridome gegen die 6 verschiedenen, gereinigten Interferone wird in Figur 2 gezeigt. Es können wiederum verschiedene Gruppen von Antikörpern mit unterschiedlichem charakteristischem Bindungsverhalten unterschieden werden. Die Gruppe 1 umfasst die Antikörper LI-1 und LI-2, die identische Bindungscharakteristik haben, die jedoch IFL y3 nicht erkennen. Die Gruppe 2 umfasst die Antikörper LI3, LI-5, LI-6, LI-7 und LI-8 mit einer möglichen Unterscheidung von zwei Subgruppen. Subgruppe 2a (LI-3, LI-5 und LI-6) zeigt überall höhere Bindung (Figur 1 und Figur 2), als Subgruppe 2b (LI-7 und LI-8), wobei die letztere Subgruppe relativ stärker an gereinigtes IFL al und IFL-K bindet als die erstere.
Nach dem Interferonbindungsverhalten der verbleibenden Antikörper gemäss Figur 2 und Figur 3 hat LI-9 die meisten Charakteristika der Subgruppe 2b. LI-12 scheint wiederum für sich einzigartig zu sein.
Im Hinblick auf die Tatsache der hohen Antikörperbindung zu unterschiedlich gereinigten Interferonen ist es sehr unwahrscheinlich, dass irgendeiner dieser Antikörper nicht gegen Interferon, sondern gegen Kontaminanten gerichtet wäre. Dies wird für die meisten dieser Antikörper auch durch die Fähigkeit gezeigt, die biologische Aktivität von Interferon zu neutralisieren. LI-1, LI-2, LI-3, LI-5, LI-6, LI-7, LI-8 und LI-9 heben die durch Interferon induzierte Inhibition des viralen CPE an MDBK-Zellen auf. Die Interferonneutralisierung wird mit teilweise gereinigtem IFL r (a) und/ oder gereinigtem IFL-K, IFL y1, IFL a2 und rohem Leukozyten-Interferon getestet. Keiner der Antikörper war in der Lage, rohes Leukozyten-Interferon zu neutralisieren. LI-12 neutralisiert keines der getesteten Interferone (vgl. hierzu Tabelle 1).
Die Fähigkeit der erfindungsgemässen Antikörper, durch rekombinierte DNS-Technik erhaltene Interferone mit hoher Affinität zu binden, geht aus der Tabelle 6 hervor.
2) Isotypen der schweren und leichten Ketten der monoklonalen Interferon-Antikörper
Monoklonale Antikörper von Hybridom-Kulturmedium werden zuerst an Interferon-beschichtete Mikrotiterplatten gebunden, wie dies vorgängig für den SABA Test beschrieben wurde. Nach dem Waschen werden sie mit Isotyp-spezifischem Kaninchen Anti-Maus Ig Antiserum (Nordic) inkubiert. Zum Nachweis wird Ziegen Antikaninchen IgG verwendet, welches mit Meerrettich-Peroxidase markiert ist. Als Enzymsubstrate werden 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzothiazolin-sulfat) und Wasserstoffperoxid verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, zweite Kolonne, zusammengefasst.
Sieben der geprüften Antikörper haben die Immunglobulinketten rl/k, einer y2b/k und einer ll/k. Alle sieben 711k Antikörper wie auch der 72bak neutralisieren Interferon, wogegen der ll/k Interferon nicht neutralisiert, wie ebenfalls aus Tabelle 1 ersichtlich.
3) Klonieren und Stabilisieren der Interferon-spezifischen
Hybridome
Zur Herstellung stabiler Hybridom-Linien werden alle 9 spezifischen Hybridome durch limitierende Verdünnung in Mikrotiterplatten mit Maus-peritonealen Zellen als Nährschicht kloniert [Hengartner H. et al. in Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81, 92-99 (1978)]. Das Klonieren wurde zum Zeitpunkt des Transfers der Originalkulturen in Flaschen oder kurz danach begonnen. Die Klone wurden mit dem SABA Test gegen IFL ss getestet. Die Ergebnisse dieses ersten Klonierens der 9 Hybridome wird in Tabelle 2 gezeigt.
Von jedem Hybridom werden zwei bis vier stark positive Klone hochgezüchtet und sowohl i.p. in Mäuse injiziert für Ascites Produktion als auch gefroren. In den meisten Fällen werden die ausgewählten Klone eines Hybridoms zur Vereinfachung und Reduktion der Arbeit gepoolt. Von allen 9 Hybridomen erhält man Ascites Flüssigkeit für die Produktion von Antikörpern im grossen Massstab. Ascites-Zellen werden ebenfalls in Kulturen transferiert und gefroren.
4) Gruppierung der Antikörper nach ihrer Interaktion mit HLI
Die Hauptgruppe der sieben Hybridome, die yl/k Immunglobuline produzieren, kann in zwei Gruppen unterteilt werden aufgrund ihrer Antikörper-Interaktion mit gereinigten Interferonen. Die erste Gruppe (LI-1 und LI-2) erkennt gereinigtes IFL y3 nicht, wogegen die zweite Gruppe (LI-3 und LI-5 bis LI-8) IFL y3 erkennt. Die relative, quantitative Bindung der monoklonalen Antikörper an sechs unterschiedliche, gereinigte Interferone (vgl. Figur 2) und die Unterscheidung zwischen neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörpern liefert Information zur Unterscheidung unterschiedlicher Epitope (antigenische Determinanten) von HLI und zur Aufzeigung von strukturellen Unterschieden zwischen unterschiedlich gereinigten Interferonen.
Vom Bindungsverhalten der Antikörper (vgl. Figur 2) ist klar, dass LI-1 und LI-2 eine andere Struktur als alle anderen Antikörper erkennen und dass IFL y3 strukturell verschieden ist von allen anderen getesteten Interferonen, da es das von LI-1 und LI-2 erkannte Epitop nicht aufweist. LI12, ein nicht-neutralisierender Antikörper, erkennt mit ungefähr gleicher, obwohl vielleicht geringerer Affinität, eine weniger variable Determinante, welche in allen getesteten Interferonen vorhanden ist. Die Ergebnisse hinsichtlich der Antikörperbindung und der Interferonneutralisation lassen erkennen, dass mindestens drei verschiedene Epitope von HLI durch die Kollektion der monoklonalen Antikörper erkannt und definiert werden können.
Beispiel 2
Bestimmung von Interferon
1) Auswahl eines geeigneten Paars von monoklonalen
Antikörpern
Zur Unterscheidung zwischen kompetitiver Bindung von zwei Antikörpern an dasselbe Epitop und additiver Bindung an verschiedene Epitope wird die Bindung der Antikörper allein und in Paaren und in allen möglichen Kombinationen an immobilisiertem Interferon getestet. Überstände von konfluenten Hybridom-Kulturen werden ohne weitere Reinigung als Antikörperquelle verwendet. Teilweise gereinigtes Leukozyten-Interferon (20-30% reines IFL > wird in begrenzten Mengen (0,1 bis 0,2 yg Interferon/ml) auf Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten gegeben, wie dies in Beispiel 1 für den SABA beschrieben wird.
Es folgt das Abblocken al ler Proteinbindungsstellen mit 3%igem BSA. 50 1 Antikörperlösung bestehend aus je 25 ,u1 zweier Kulturüberstände oder 2 x 25 pI desselben Antikörpers werden während 7 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden mit PBS (0,01 M Kaliumphosphat, pH 7,3; 0,14 M Natriumchlorid) gewaschen und während 5 Stunden mit einem Überschuss von l25I markiertem Schaf-Anti-Maus-Ig Immunglobulin in einem Volumen von 50 L1 pro Vertiefung inkubiert, um die Menge von monoklonalen Antikörpern, die an Interferon gebunden sind, zu messen (Tabelle 3).
Die Bindung zweier Antikörper wird als additiv betrachtet, wenn die Bindung dieser Antikörper diejenige mit 50 ,ul des höher bindenden einzelnen Antikörpers übersteigt. Aufgrund dieses Kriteriums wurde gefunden, dass LI-1 mit fast allen anderen Antikörpern additiv bindet und dass LI-9 die beste additive Bindung mit LI-1 gibt.
LI-l und LI-9 von Ascites-Flüssigkeit werden nach Standardmethoden, d.h. durch Ammoniumsulfatfällung (50%ige Sättigung) und DEAE-Zellulosechromatographie bis mindestens zu 90% gereinigt, wie dies durch Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid Gel Elektrophorese beurteilt wird. 20 lag jedes Antikörpers werden mit 125I nach der Chloramin-T Methode zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 20 Ci/ug markiert. Freies Jod wird von markiertem Antikörper durch Gelfiltration an Sephadex G-25 in Gegenwart von PBS und 1% BSA getrennt.
Unmarkierte Antikörper LI- 1 und LI-9 zu ungefähr 201lg pro ml PBS werden über Nacht an PVC-Mikrotiterplatten (Cooke Laboratory, Products Division, Dynatech Laboratories, Inc.) adsorbiert (100111/Vertiefung). Während 30 bis 60 Minuten werden alle Proteinbindungsstellen mit 3%igem BSA in PBS blockiert. Gereinigtes Leukozyten Interferon der KG-1 myeloiden Zell-Linie bei einer Konzentration von 10 Einheitenll00 la1 PBS und 1 %ges BSA werden zusammen mit einem der 125I markierten Antikörper (1,3 x 105 cpm) in Antikörper-beschichteten Vertiefungen inkubiert. Kontrollvertiefungen enthalten markierten Antikörper, aber kein Interferon.
Nach Inkubation während 3 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flüssigkeit entfernt und die Vertiefungen der Platten viermal mit PBS gewaschen und dann in einem Gamma-Scintillations-Spektrometer auf Radioaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Kombination von LI-I mit LI-9 gibt Interferonabhängige sandwich-artige Antikörperbindung. Die bessere Kombination ist immobilisierter LI-9 mit markiertem LI-1 in Lösung. Aus diesem Grunde sind die weiteren Experimente mit immobilisiertem LI-9 und markiertem LI-l durchgeführt worden.
a) Einstufeninkubationsverfahren
Jede Vertiefung einer PVC-Mikrotiterplatte wird mit 100 val LI-9 (1511g/ml in PBS) bei Raumtemperatur über Nacht oder bei 4 "C während Tagen oder Wochen in einer befeuchteten Kammer beschichtet. Vor Gebrauch wird die Lösung von LI-9 entfernt und die Vertiefungen werden mit 3%igem BSA während 30 bis 60 Minuten gefüllt und dann viermal mit PBS gewaschen. Ungefähr 140 000 cpm l25I markierter LI- 1 (ungefähr 4 ng, spezifische Aktivität ungefähr 20 IlCi/llg) in 0,1 ml PBS enthaltend 1 %ges BSA und 100 bis 150 llg humanes IgG pro ml werden in jede Vertiefung gegeben.
Entsprechend verdünnte Interferonlösungen (1-20 lal) werden in die Vertiefungen gegeben und durch kurzes Schütteln gemischt. Nach 2 bis 3 stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Flüssigkeit auf Absorptionspapier abgegossen. Die Platte wird vier- bis fünfmal mit PBS gewaschen und die einzelnen Vertiefungen werden in einem Gamma-Scintillations-Spektrometer auf Radioaktivität getestet. Bei höheren Interferonkonzentrationen ( > ca.
5000-6000 U/ml) tritt eine partielle Inhibition auf. Die erhaltenen Resultate sind in Figur 3 und Tabelle 5 wiedergegeben.
b) Zweistufeninkubationsverfahren
LI-9 beschichtete und BSA-gesättigte PVC-Mikrotiterplatten werden wie vorgehend beschrieben hergestellt. 50 pro Vertiefung einer Interferonlösung in PBS enthaltend 1 %ges BSA werden während 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, worauf die Platten viermal mit PBS gewaschen werden. Darauf werden 50 lal l25I LI-1 (ungefähr 150 000 cpm/4 ng) PBS enthaltend 1 %ges BSA und 150 lag humanes IgG per ml in jede Vertiefung gegeben, worauf die Platten während 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten werden und dann viermal mit PBS gewaschen und wie oben erwähnt auf Radioaktivität getestet werden. Die erhaltenen Resultate sind in Figur 4 wiedergegeben.
Im Gegensatz zum Einstufenverfahren zeigt sich keine partielle Inhibition bei hoher Interferonkonzentration.
c) Bestimmung von antiviral inaktiviertem Interferon
Hitzeinaktivierung von Interferon
Eine Lösung (2,411g/ml) von Interferon A (Goeddel et al., Nature Vol. 290, März 1981) in Eagle's minimal essential medium enthaltend 10% foetales Rinderserum und 1 mg/ml Rinderserumalbumin wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,14 M NaCI, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 3 mM KC1, 0,9 mM CaCl2 und 0,5 mM Mg1,) 1:480 verdünnt. Die verdünnte Lösung enthält Interferon A in einer Konzentration von 5 ng/ml. Nach Erhitzen auf 65 "C während einer bestimmten Zeit werden 0,14 ml Proben bis zur Bestimmung in einem Eisbad gehalten. Sowohl die antivirale wie die immunologische Bestimmung werden am selben Tag durchgeführt.
Von den 0,14 ml Proben werden 0,1 ml für das Radioimmunverfahren und 10 lal für die antivirale Bestimmung (im Doppel) verwendet. Das Radioimmunverfahren erfolgt nach dem unter B. beschriebenen 2 Stufen-Inkubationsverfahren. Die antivirale Bestimmung erfolgt nach dem CPE-Inhibitionstest. Die erhaltenen Resultate sind in Figur 6 wiedergegeben. Aus diesem Beispiel geht hervor, dass das Antikörperpaar Li 1 /Li 9 antiviral aktives und antiviral inaktives Interferon unterscheiden kann. Aus der Figur geht weiterhin hervor, dass die antivirale Aktivität und die Immunreaktivität gleichzeitig abnehmen.
d) Hochempfindliche Interferonbestimmung in
Humanplasma oder Serum (Radioimmunverfahren)
Es wird eine einzige Inkubation von 0,1 ml 40%igem Humanplasma oder Serum (neutraler pH) enthaltend ungefähr 250 000 cpm (1,5 ng) 1251 LI-l (spezifische Aktivität 100 bis 110 IlCi/pg LI-l) bei Raumtemperatur während 14 bis 16 Stunden in PVC-Mikrotiterplatten durchgeführt, welche wie vorgehend beschrieben mit LI-9 beschichtet sind. Nach viermaligem Waschen mit PBS werden die Vertiefungen wie vorhergehend erwähnt gezählt. Es wird ein Experiment mit Interferon durchgeführt, das zu Citratplasma eines gesunden Probanden zugegeben wird.
Jede 0,1 ml PBS-Testmischung enthält 40 lal Plasma, 1,3 ng 125I LI-l (256 000 cpm) und verschiedene Mengen von rohem humanem Leukozyten-Interferon (ungefähr 0,1% rein) von chronisch myologenen Leuk ämiezellen. Die Resultate sind in Figur 5 wiedergegeben, wo der Anteil an Interferon als Abszisse aufgetragen ist. Als rohes Leukozyten-Interferon wird Inkubationsmedium gemäss Stufe 1 von Tabelle 3 der DOS No. 2947 134 verwendet.
Beispiel 3
Hochempfindliche Bestimmung von Interferon in
Patientenserum (Enzym-Immunverfahren)
In die entsprechende Anzahl Teströhrchen (10 x 75 mm) werden je 0,05 ml Testlösung (0,1 mol/l Natriumphosphat, pH 6,5 mit 10 g/l BSA und 0,5 llg/ml monoklonales LI-1 Anti-Interferon-Peroxidase-Konjugat in Interferon-freiem Humanserum) pipettiert, 0,2 ml der zu analysierenden Patientenplasmen respektive der Interferon-Standards (0 U/ml, 12,5 U/ml, 25 U/ml und 50 U/ml Interferon) und des Interferon-Kontrollserums (z.B. 30 U/ml Interferon) zugemischt, je eine mit monoklonalem LI-9 Anti-Interferon-beschichtete Polystyrolkugel ( = 6,5 mm) zugefügt und bei Raumtemperatur (18-26 "C) während 16 Stunden inkubiert.
Anschliessend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2 bis 5 ml destilliertem Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/l Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/l H202 und 20 mmol/l o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-26 "C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Lichtabsorption werden 0,5 ml 4 N HCI zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte einer Interferon-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit den Interferon-Standards erhalten wurden.
Als Interferon-Standard wird rohes Leukozyten-Interferon (Inkubationsmedium gemäss Stufe 1 von Tabelle 3 der DOS 2947 134) verwendet.
Tabelle
Probenmaterial AE492 nmlRT/30 Min.
Interferon-Standard 0 U/ml Interferon 0,065/0,070
12,5 U/ml Interferon 0,245/0,235
25 U/ml Interferon 0,425/0,430
50 U/mlInterferon 0,775 0,790
Kontrollserum (30 U/ml Interferon) 0,505/0,490
Patientenplasmen
No 8327 0 U/ml Interferon
No 8328 0 U/ml Interferon
No 8336 9 U/ml Interferon
No 8338 0 U/ml Interferon
No 8339 5 U/ml Interferon
No 8363 0 U/ml Interferon
No 8341 2 U/ml Interferon
No 8344 16 U/ml Interferon
Beispiel4
Reinigung von durch rekombinierte DNS-Technik erhalte nem Leukozyten-Interferon (Interferon A; vgl. Goeddel et al. Nature, vol. 290, März 1981) a) Vorreinigung des durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenen Human-Leukozyten-Interferons
Alle Schritte werden bei 4 C durchgeführt. Gefrorene Bakterien-Zellen (1 kg) werden durch Druckzertrümmerung zerstört.
Der Extrakt wird nach Standardverfahren aufgearbeitet, d. h. durch Polyäthylenimin (Polymin P)- und Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von einer Dialyse des 65%igen Ammoniumsulfatniederschlages gegen 25 mM Tris HCI, pH 7,8; 0,01% Thiodiglykol; 0,1% Triton X-100; 10 ,uM Phenylfluorid. Es folgt eine Zentrifugation zur Entfernung unlöslicher Anteile.
b) Herstellung des Immunoadsorbens
In Analogie zu Beispiel 2 gereinigte Antikörperlösung enthaltend LI-8 wird gegen 0,2 M Natriumcarbonat/0,3 M Natriumchlorid Puffer bei Raumtemperatur dialysiert. Die dialysierte Lösung wird bei 20 000 x g während 15 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die Proteinkonzentration wird auf ca. 25 mg/ml mit dem obenerwähnten Puffer eingestellt. Affi-gel 10 (BioRad Laboratories, Richmond, California) wird dreimal mit eiskaltem Isopropanol an einem gesinterten Glasfilter gewaschen und dann dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen.
Das Gel wird in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurze Zentrifugation sedimentiert. Der Überstand wird abgesaugt. Das Gel wird mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und Kopf über Fuss während 5 Stunden bei 4 "C rotiert. Nach der Reaktion wird das Gel zentrifugiert und dann zweimal mit Puffer (0,1 M NaHCO3/ 0,15 M NaCI) gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Proteinbestimmung der vereinigten Waschwasser zeigt, dass ca. 24 mg an Antikörper pro ml Gel gebunden wurde.
c) Affinitätschromatographische Reinigung des vorgereinigten, durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenen Leukozyten-Interferons
Die in Schritt a) erhaltene Lösung (700 ml enthaltend 37 g Protein) wird mit 50 ml/h auf die mit PBS äquilibrierte Immunoadsorbens Säule (2,5 x 3,5 cm; 17 ml Bettvolumen enthaltend ca. 400 mg gereinigter monoklonaler Antikörper LI-8); aufgetragen. Man wäscht mit 20 Säulen-Volumen an Puffer (0,5 M NaCI; 0,02 M Tris HCI, pH 7,5; 0,2% Triton X-100), dann wird die Säule mit 5 Säulen-Volumen von 0,15 M NaCI, 0,1% Triton X-100 gewaschen und dann mit 0,2 M Essigsäure, 0,15 M NaCI, 0,1% Triton X-100 (pH 2,5) eluiert. Die Interferon-Aktivität wird in ca. 30 ml in einer durchschnittlichen Konzentration von ungefähr 1 mg Protein/ml eluiert.
Diese Lösung wird mit 1 M Tris Base auf pH 4,5 eingestellt und vierfach mit Wasser verdünnt. Die Probe wird auf eine Carboxymethylcellulose (CM 52 Whatman) Säule (1,3 x 3 cm) geladen, die mit 0,1 M Ammoniumacetat (pH 5,0) äquilibriert ist. Die Säule wird mit 20 ml 0,1 M Ammoniumacetat (pH 5,0) gewaschen und das Interferon mit 20 ml 0,5 M Ammoniumacetat (pH 5,0) eluiert. Das Ergebnis der Reinigung ist in Tabelle 7 wiedergegeben.
In ähnlicher Weise und mit vergleichbarer Ausbeute lässt sich Interferon A auch mit den Antikörpern LI-3, LI-5, LI-6, LI-7 und LI-9 reinigen.
Tabelle 1
EMI6.1
<tb> Epitop <SEP> Monoklonale <SEP> Isotypen <SEP> Ketten <SEP> Neutralisation
<tb> <SEP> Antikörper
<tb> I <SEP> J <SEP> <SEP> LI- <SEP> 1 <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> LI-2 <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> LI-3 <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> II <SEP> LI-6 <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> LI-7 <SEP> IgG <SEP> ,/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> LI-8 <SEP> IgG <SEP> rl/k <SEP> Ja
<tb> <SEP> LI-9 <SEP> IgG <SEP> 72bak <SEP> Ja
<tb> III <SEP> { <SEP> LI-12 <SEP> IgM <SEP> p/k <SEP>
Nein
<tb>
Tabelle 2 Kultur Zellen pro geprüfte Klone Anzahl Anzahl
96 wells oder wells Positive Negative LI-I 100 6 6 0 LI-2 100 11 6 5 LI-3 100 7 7 0 LI-5 100 13 13 0 LI-6 100 12 12 0 LI-7 100 10 8 2 LI-8 100 9 8 1 LI-9 100 10 8 2 LI-12 100 4 0 4 LI-12 300 48 6 42
Tabelle 3
Ll-l LI-2 LI-3 LI-5 LI-6 LI-7 LI-8 LI-9 LI-12 LI-I 15800 14980 17620 17730 15950 17670 17970 19550 18260 LI-2 11880 15120 16750 14570 16440 16150 16250 15460 LI-3 11600 13440 10320 11900 13270 9710 15490 LI-5 13640 11690 13230 14720 11820 16710 LI-6 7300 10290 10860 6540 12240 LI-7 12090 13480 8630 14610 LI-8 14700 10270 17680 LI-9 4900 10870 LI-12 9940
Tabelle 4 Antikörper Kombination 1251 markierte Antikörper Bindung (cpm) Festphasen 1211 mar- Mit Inter-
ohne spezifische Antikörper kierter Anti- feron (10 U) Interferon Bindung körper LI-1 LI-9 922 440 482 LI-9 LI-I 2465 251 2208
Tabelle 5 Interferon Spezies Interferon Einheiten CPM[I2sI]LI-l pro Bestimmung Bindung α1 100 2202 a2 100 1633 ss1 100 822 ss2 100 8135 ss3 100 70 #1 100 7036 72 100 4804 r3 100 101 74 100 198 75 100 121 6 100 5498
Tabelle 6
Antikörper Interferon Li-l Li-3 Li-5 Li-6 Li-7 Li-8 Li-9 A + + + + + + + B + - - - - - - D + + + + + + F - - - <RTI
ID=7.16> - + - - Die mit A bis F gekennzeichneten Interferone sind die durch rekombinierte DNS-Technik erhaltenen und in der Arbeit von DavidV. Goeddel et al. in Nature Vol. 290, März 1981, beschriebenen Interferone.
Ein + bedeutet, dass das entsprechende Interferon durch eine mit dem jeweiligen Antikörper beladenen Säule vollständig adsorbiert wird, wogegen ein - keine Adsorption bedeutet. Ein + bedeutet partielle Adsorption.
Tabelle 7 Stufe Volumen Total Protein Total spezifische Reinigungs- Ausbeute (ml) (mg) Aktivität Aktivität faktor (%) (units) (units/mg) Ammoniumsulfatfällung 700 37,100 7,4 x 109 2 x 105 1.0 100 Antikörper-Säule Pool 30 30 7 x 109 2,3 x 108 1150 95 CM-52 20 20 6x109 3x108 1500 81 Die spezifische Aktivität wurde nach dem früher erwähnten CPE-Inhibitions-Verfahren bestimmt. Gemäss Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist das Interferon nach dem Immunadsorptionsschritt über 90% rein. Nach der CM-52 Säule erschien es praktisch homogen.