CH653347A5 - Verfahren zur reinigung von proteinen. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Proteinen mit einem Molekulargewicht über 12 000 mit hoher Auflösung und guten Ausbeuten in präparativem Massstab. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des unreinen Proteins durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen Si02-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird. Diese Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen Bedingungen bezüglich pH und organischen Lösungsmitteln verwendet werden können, bieten die Möglichkeit, Proteine, die in natürlichem Material in extrem geringen Mengen vorkommen, bis zur Homogenität zu reinigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Interferon bis zur Homogenität und zwar in Mengen, die ausreichend sind, um erstmals eine genauere Charakterisierung dieser medizinisch wertvollen Substanz zu erlauben. Die Möglichkeit, Interferon chemisch zu charakterisieren, stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Entwicklung dieser Substanz dar, da dies eine Voraussetzung dafür ist, die Substanz zu synthetisieren, sei es durch konventionelle Peptidsynthese, sei es auf dem Wege der Genmanipulation unter Zuhilfenahme geeigneter Organismen, vorzugsweise von Bakterien, und ihre pharmakologischen Aktivitäten zu bestimmen.
Das bevorzugte erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung von Interferon ist dadurch gekennzeichnet, dass man
A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zustand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octyl-
gruppen modifizierten SiO-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktionen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedin-gungen ein- oder mehrmals durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält.
HPLC-Säulen auf der Basis von durch Octyl- oder Glycerylgruppen modifizierter poröser SiO-2-Matrix (Partikelgrösse = 10 jx; mittlerer Porengrösse = 100 Â), die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden, sind Handelsartikel, erhältlich z.B. von EM Laboratories of Elmsford, N.Y., USA, unter der Markenbezeichnung Lichro-sorb RP-8 und Lichrosorb-Diol. Äquivalente Octyl-modifi-zierte poröse Si02-Säulen (Chromegabond C-8 bezeichnet) sind erhältlich von E.S. Industries, Marlton, N.J., USA.
Ein geeignetes HPLC-System, in dem die vorstehend genannten Säulen verwendet werden können, sind in U.S. Patent No. 4116 046 beschrieben.
Erfindungsgemäss wird die Lösung des unreinen hochmolekularen Peptids, vorzugsweise in Gegenwart eines wässrigen Puffers bei einem für das zur Diskussion stehende Protein geeigneten pH, durch die SiO-2-Säule geschickt. Normalerweise geschieht dies unter Druck, vorzugsweise im Bereich von etwa 50-5000 psi (3,4-340 Atm). Das auf der Säulenfüllung adsorbierte Protein wird dann schrittweise und selektiv unter Verwendung eines Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert. Für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel sind z.B. Alkanole, wie n-Propanol, 2-Propanol, Äthanol, Methanol, tert.-Butanol, oder cyclische Äther, wie Dioxan. Die Fraktionierung des Eluats erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei der Gehalt der einzelnen Fraktionen an dem aktiven Protein durch hochempfindliche Monitoren bestimmt wird. Ein für diesen Zweck geeignetes System wird von Bohlen et al., Anal. Biochem. 67,438 (1975), beschrieben. Es ist auch empfehlenswert, die Anwesenheit des Ziel-Proteins durch einen geeigneten Bioassay zu überwachen.
Die Entscheidung, welcher der beiden Säulentypen (Säule für normale Verteilungschromatographie oder Säule für Umkehrphasen-Chromatographie) und in welcher Reihenfolge die Säulen eingesetzt werden, hängt weitgehend von der Natur des zu reinigenden Proteins ab. Es wurde gefunden, dass beispielsweise im speziellen Fall des Human-Leuko-zyten-Interferons die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn man die unreine Interferon-Lösung zunächst durch eine Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02-Matrix (Umkehrphasen-Chromatographie) unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 7,5 (vorzugsweise 1 M Natriumacetat/Essigsäure) schickt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert, dann die gesammelten aktiven Fraktionen durch eine Säule auf der Basis
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einer mit Glycerylgruppen modifizierten SiCh-Matrix in einem 0,1 M Natriumacetat-Puffer schickt und mit einem fallenden n-Propanol-Gradienten eluiert und schliesslich die getrennten Interferon-Komponenten auf eine Säule auf der Basis einer mit Octylgruppen modifizierten SiO-2-Matrix unter Verwendung eines Puffers mit einem pH von etwa 4,0, vorzugsweise 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure, aufgibt und mit einem steigenden n-Propanol-Gradienten eluiert. Auf diese Weise kann jede der drei getrennten Human-Leuko-zyten-Interferone (a, ß und y) weiteraufgetrennt werden, wobei im Chromatogramm scharf voneinander getrennte Peaks erhalten werden, die die homogenen Proteine darstellen. Durch das gesamte Reinigungsverfahren, beginnend mit dem Inkubationsmedium bis hin zur Chromatographie an der zweiten durch Octylgruppen modifizierten SÌO2-Matrix wurde eine Steigerung des Reinheitsgrades um den Faktor 60 000 bis 80 000 erreicht.
In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens zur Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon werden die in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den Hauptpeaks entsprechen, vereinigt, zur Entfernung des n-Propanols mit n-Hexan extrahiert und von Spuren n-Hexan befreit bevor Schritt C) durchgeführt wird.
Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen homogenen Human-Leukozyten-Interferon-Spezies sind gekennzeichnet durch einen scharfen Peak an den vorstehend genannten HPLC-Säulen sowie durch eine einzige enge Bande bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) und 2-Mercap-toäthanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen scharfen Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Die spezifischen Aktivitäten der reinen Interferon-Spezies liegen im Bereich von etwa 0.9-4,0 x 108 Einheiten/mg mit MDBK-Zellen eine von Madin und Darby etablierte Zell-Linie aus Rindernieren, erhältlich bei ATCC und im Bereich von 2 x 106-4 x 108 Einheiten/mg mit der Human-Zellinie AG 1732 (erhältlich beim Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.Y., USA). Die Molekulargewichte lagen zwischen etwa 16 000 und 21000 (vgl. Tabelle 4). Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 5 zusammengefasst (Seite 24).
Interferone besitzen antivirale, antitumor-, wachstumshe-mende- und immunsuppressive Aktivität. Diese Aktivitäten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden bei Verabreichung von 1-10 x 106 Einheiten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger als 1% Human-Interferon enthielten. Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlich gereinigten, homogenen Interferon-Spezies können in der gleichen Weise wie die bereits bekannten Interferon-Präparate verwendet werden unter Anspassung der Dosierung an den erreichten Reinheitsgrad. Die einzelnen Interferon-Spezies können einzeln oder in Gemischen miteinander verabreicht werden. Derartige Gemische können entweder durch Vermischen der isolierten Spezies erhalten werden oder durch Unterbrechung des Reinigungsverfahrens an einer Stelle, an der mehrere Interferon-Spezies aber keine Interferon-inaktive Proteine vorhanden sind.
Das erfindungsgemässe Reinigungsverfahren, obgleich lediglich an Human-Leukozyten-Interferon exemplifiziert, kann auch zur Reinigung anderer Interferone, z.B. von Human-Fibroblasten-Interferonen und Interferonen aus tierischen Quellen sowie zur Reinigung anderer Proteine mit einem Molekulargewicht über 12 000 herangezogen werden.
So ist beispielsweise Pro-Opiocortin (MW ca. 30 000) unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bis zur Homogenität gereinigt worden [vgl. Kimura et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 76,1756-9 (1979)]. Massnahmen, die geeignet sind, das erfindungsgemässe Verfahren optimal zur Reinigung anderer Proteine einzusetzen, liegen im Bereich des Fachwissens des Fachmannes.
Die Induktion der Interferon-Produktion, die Erstkonzentration und Fraktionierung des Interferons einschliesslich der Gelfiltration können nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden. Diese Verfahrensschritte, die eine wässrige Lösung von Interferonen in unreinem Zustand liefern, sind nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele illustriert.
Beispiel 1
Homogenes Human-Leukozyten-Interferon von normalen Spendern
A. Herstellung des Interferons
Interferon wurde hergestellt durch 16-stündige Inkubation von Human-Leukozyten aus dem Blut normaler Spender (107 Zellen/ml) mit Newcastle-Krankheit-Virus (15 Hämag-glutinin-Einheiten/ml) in einem serumfreien Minimalmedium, das 10 mg/ml Casein enthielt. Es wurde ein mittlerer Interferon-Titer von 5000 Einheiten/ml erhalten. Die angewandten Methoden entsprachen den von Mogensen, K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977,369-381; Whee-lock, E.F., J. Bacteriol. 92 1415-1421 (1966) und Cantell, K. et al., Appi. Microbiol. 22,625-628 (1971) angegebenen mit einigen geringfügigen Änderungen. Die Interferon-Titer wurden mit einem Assay auf der Basis der Hemmung des cytopathischen Effekts, der innerhalb von 16 Stunden durchgeführt werden konnte, bestimmt. Alle Interferon-Titer sind in Einheiten/ml angegeben, kalibriert gegen den Referenzstandard für Human-Leukozyten-Interferon vom National Institute of Health (USA).
B. Konzentrierung und erste Fraktionierung von Interferon
Sofern nicht anders angegeben, wurde bei einer Temperatur von 0-4°C gearbeitet. Nach beendeter Inkubation wurden die Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugieren (15 Minuten, 500 x g) entfernt. Casein wurde durch Ansäuern mit HCl auf pH 4,0 präzipitiert. Nach 2 Stunden wurde das Gemisch zentrifugiert (10 Minuten, 12 000 x g) und der Niederschlag verworfen. Der Überstand (101) wurde auf einen Gehalt von 1,5% (w/v) Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Präzipitat abzentrifugiert (10 Minuten, 12 000 x g) und in 50 ml 0,1 M NaHC03 wieder aufgelöst. Nach Zusatz von 0,5 g Triton X-100 und 1,5 ml Essigsäure (tropfenweise unter Rühren) wurde das Gemisch 1 Stunde bei 0°C und anschliessend 16 Stunden bei — 20°C aufbewahrt. Nach Auftauen wurde 10 Minuten mit 17 000 x g zentrifugiert. Der Rückstand wurde verworfen und der Überstand auf 4% Trichloressigsäure eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12 000 x g zentrifugiert und der Niederschlag in 5 ml 0,5 M NaHC03 aufgelöst.
C. Gelfiltration
Die erhaltene konzentrierte Interferon-Lösung wurde mit 1,5 g Harnstoff versetzt und auf eine Säule von Sephadex G-100 fein (2,6 x 90 cm), voräquilibriert mit 4 M Harnstoff/ 0,1 M Natriumacetatpuffer, aufgebracht. Die Säule wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. mit 4 M Harnstoff/0,1 M Natriumacetat, pH 7,5, eluiert. Es wurden Fraktionen von 12,5 ml gesammelt. Interferon-Aktivität wurde in den Fraktionen 19-23 eluiert.
D. HPLC
Die vereinigten Fraktionen 19-23 von der Sephadex G-100-Säule wurden direkt über die Pumpe auf eine Lichro-sorb RP-8-SäuIe (10 p,, 4,6 x 250 mm) gegeben. Die Säule wurde voräquilibriert mit einem 1 M Natriumacetatpuffer (pH 7,5), der 0,01% (v/v) Thiodiglycol enthielt, und mit
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einem linearen Gradienten von n-Propanol in dem gleichen Puffer [1 Stunde, 0-20%; 3 Stunden, 20-40% (v/v)] bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen von 0,75 ml gesammelt. Das Interferon wurde in den Fraktionen 23-40 [25-30% (v/v) n-Propanol] eluiert. 5
Die Fraktionen 27-33, die den grössten Anteil der Interferon-Aktivität enthielten, wurden kombiniert, mit n-Propanol bis zu einer Endkonzentration von 80% (v/v) versetzt und direkt über die Pumpe auf eine Lichrosorb-Diol-Säule (10 ji, 4,6 x 250 mm) gegeben, die voräquilibriert wurde mit einer Lösung von 0,1 M Natriumacetat mit einem Gehalt von 80% (v/v) n-Propanol. Die Säule wurde dann während 4 Stunden mit einem linearen Gradienten von 72-50% (v/v) n-Propanol in 0,1 M Natriumacetat bei einer Durchflussrate von 0,25 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,75 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in Form von drei deutlichen Hauptpeaks, die quantitativ von Präparat zu Präparat varierten, eluiert. Diese Peaks wurden in der Reihenfolge ihrer Eluation a, ß und y genannt. Die a-Fraktion wurde bei einer Konzentration von 68% n-Propanol eluiert, die ß-Fraktion bei einer Konzentration von 66,5% n-Propanol und die y-Fraktion bei einer Konzentration von 65,5% n-Propanol. Die gesamte Ausbeute an Interferon-Aktivität war grösser als 80%. M
Die zu jedem Peak gehörenden Fraktionen wurden vereinigt und in Folgestufen weitergereinigt. Da der Peak y der bei weitem grösste war und von anderen Komponenten am besten getrennt zu sein schien, wurde er für die weitere Reinigung ausgesucht. Die Fraktionen 54-56 von der Diolsäule, die den Peak y enthielten, wurden vereinigt, und das n-Propanol wurde durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung wurde auf einer Lichrosorb RP-8-Säule (10 n; 4,6 x 250 mm), voräquilibriert mit 1 M Pyridin und 2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgegeben. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen Gradienten von n-Pro-panol (20-40%) in 1 M Pyridin-Formiat-Puffer bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Der Hauptpeak der Aktivität stimmte überein mit einem Proteinpeak. Die Fraktionen 45 und 46 [32% (v/v) Propanol], die diesem Peak entsprachen, wurden vereinigt und unter gleichen Bedingungen rechroma-tographiert. Interferon wurde in Fraktion 31 eluiert [32% (v/v) Propanol]. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion wurde mit 4 x 108 Einheiten/mg berechnet, verglichen mit Rinderserumalbumin. Dieses Material wurde für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Fluoreszenzprofile der HPLC waren so gut reproduzierbar, dass sie einen ständigen Fingerprint des gesamten Verfahrens lieferten.
Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 zusammen-gefasst. Die gesamte Reinigung, ausgehend vom Inkubationsmedium bis zur zweiten RP-8-Säule war 60 000- bis 80 OOOfach. Die kumulative Ausbeute von Stufe 1 bis zur Diolstufe lag bei 30-50%. Nach dieser Stufe wurde jeder der drei Interferon-Peaks separat weiter gereinigt.
Tabelle 1
Reinigung von Human-Leukozyten-Interferon
Einheiten Protein gefunden gefunden
XIO"
(mg)
Relative spezifische Aktivität (Einh./mg)
Reinheitsgrad Ausbeute pro Stufe
(%)
1.
Inkubationsmedium
50
10,000
5xl03
1
-
2.
pH 4-Überstand
50
2,000
2,5 x 104
5
100
3.
1,5% Trichloressigsäure-
Niederschlag
40
1,000
4xl04
8
80-
-100
4.
Triton X-100/
Essigsäure-Überstand
40
250
l,6xl05
32
70-
-100
5.
4% Trichloressigsäure-
Niederschlag
35
175
2xl05
40
80-
-90
6.
Sephadex G-100
32
57
5,6 xlO5
112
70-
-90
7.
8.
Lichrosorb RP-8 (pH 7,5) Lichrosorb-Diol
28
11
2,5x10«
500
80-
-100
Peak a
11
1,1
lxlO7
5,000
Peakß
2,5
NB
NB
NB
70-
-90
Peak y
12,5
0,21
6xl07
12,000
9.
Lichrosorb RP-8 (pH 4)
1,6
0,0064
3xl08
60,000
40-
-60
10.
Lichrosorb RP-8 (pH 4)
8,2
0,021
4xl08
80,000
40-
-60
Zur Bestimmung des in dieser Fraktion enthaltenen Proteins wurde Rinderserumalbumin als Standard herangezogen. Die absolute spezifische Aktivität, die durch Aminosäureanalyse des homogenen Peaks von Stufe 10 bestimmt wurde, war 2-4 x 108 Einheiten/mg (siehe Text). Stufe 9 wurde mit Peak y aus Stufe 8 durchgeführt. Stufe 10 wurde mit dem vereinigten Material aus Stufe 9 von verschiedenen Präparaten durchgeführt. NB = nicht bestimmt.
E. Polyacrylamid Gel-Elektrophorese Interferon-Proben (1,5 x 105 Einheiten) wurden mit NaDodSC>4 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach der Elektrophorese wurde nach Färbung mit Coomassie-Blau eine einzige scharfe Bande erhalten. Das scheinbare Molekulargewicht wurde mit 17 500 65 (im Vergleich zu Standardproteinen) bestimmt. Das Gel wurde in Streifen von 1 mm geschnitten, jeder Streifen wurde in 0,4 ml 0,5 M NaHCCb/0,1% NaDodSOt homogenisiert und auf Interferon-Aktivität hin untersucht. Es wurde ein
653 347
einziger Peak mit antiviraler Aktivität gefunden, der mit der einzigen Proteinbande übereinstimmte.
F. Aminosäureanalyse
Die Aminosäureanalyse des homogenen Human-Leuko-zyten-Interferons (Peak y) wurde mit dem Fluorescamin-Aminosäure-Analysator an 0,5 bis 1 (ig Proben von nativem und S-carboxymethyliertem Interferon durchgeführt. Zur Bestimmung des Cystein/Cystin-Verhältnisses wurde natives Interferon carboxymethyliert und dann in 6 M HCl unter reduzierenden Bedingungen (0,1% Thioglycolsäure) hydroly-siert. Unter diesen Bedingungen wird Cystein als S-Carboxy-methylcystein und Cystin als freies Cystein gemessen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 2 zusam-mengefasst. Die spezifische Aktivität, berechnet auf den Aminosäuregehalt, wurde mit 2-4 x 108 Einheiten/mg bestimmt.
Tabelle 2
Aminosäurezusammensetzung von Human-Leukozyten-Interferon
10
Aminosäure
Reste
Asx
15,2+1,2
Thr*
7,5±0,5
Ser*
8,0±0,5
Glx
24,0+0,6
Pro
6,3 ±0,3
Gly
5,5±0,5
Ala
8,2±0,2
Cys (Total)
3,3±0,7
1/2 Cystin+
1,8±0,2
Cystein+
1,5±0,5
Val
7,8±0,2
Met
3,9+0,2
Ile
8,9+0,4
Leu
21,8±1,3
Tyr
5,1±0,2
Phe
9,1 ±0,3
His
3,3 ±0,4
Lys
11,6±0,5
Arg
7,3±0,5
Trp++
0,7 ±0,1
* Korrigiert auf die Zeit 0.
+ Gemessen nach Carboxymethylierung von nativem Interferon. ++ Gemessen nach Hydrolyse in 6 M HCl/4% Thioglycolsäure.
Beispiel 2
Homogenes Human-Leukozyten-Interferon aus Leukozyten von leukämischen Patienten
Das Interferon wurde erhalten durch Inkubation von Human-Leukozyten, isoliert aus dem Blut von leukämischen Patienten (chronisch myelogene Leukämie, CML) durch Leukophoresis mit Newcastle-Krankheiten-Virus in einem serumfreien, caseinhaltigen Medium. Die Interferon-Titer lagen bei 5000-40 000 Einheiten/ml.
Das Reinigungsverfahren war das gleiche wie das in Beispiel 1 beschriebene für Interferon aus Blut von normalen
Spendern und umfasste die selektive Präzipitation durch 0,5 M Essigsäure in Gegenwart von Triton X-100, Gelfiltration an Sephadex G-100 in 4 M Harnstoff, HPLC bei pH 7,5 an Lichrosorb RP-8, HPLC an Lichrosorb-Diol und HPLC an Lichrosorb RP-8 bei pH 4,0.
Die Fraktionen, die den a-, ß- und y-Peaks der Lichrosorb-Diolsäule entsprachen, wurden zusamengefasst und dann getrennt voneinander in weiteren Schritten gereinigt.
Aus den vereinigten Fraktionen 43-46 (a-Peak) wurde n-Propanol durch zwei Extraktionen mit gleichen Mengen n-Hexan entfernt. Spuren von Hexan wurden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Es wurde Pyridin und Ameisensäure bis zur Endkonzentration von 1 M bzw. 2 M zugesetzt und die Lösung auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (10 (i, is 4,6 x 250 mm), die voräquilibriert war mit 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure (pH 4,0), aufgebracht. Die Säule wurde während 3 Stunden mit einem linearen n-Propanol-Gradienten (20-40%, v/v) in 1 M Pyridinformiat-Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. eluiert. Es wurden 20 Fraktionen zu 0,6 ml gesammelt. Die Interferon-Aktivität wurde in breiten Peaks bei Konzentrationen zwischen 31 und 35% (v/v) n-Propanol eluiert. Diese Fraktionen wurden kombiniert und unter gleichen Bedingungen rechromatogra-phiert. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks 25 (ai und (X2) bei 31 und 32% (v/v) n-Propanol eluiert. Untergeordnete Komponenten wurden bei einer Konzentration von 34% (v/v) n-Propanol eluiert.
Die vereinigten Fraktionen 47-50 (Peak ß) der Lichrosorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an 30 Lichrosorb RP-8 chromatographiert, wie sie für den Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in zwei Hauptpeaks eluiert: ß2 bei 32% (v/v) n-Propanol und ß3 bei 34% (v/v) n-Propanol. Rechromatographie war in diesem Falle nicht nötig. In einigen Präparaten konnte ein Peak ßi 35 bei 31% (v/v) n-Propanol festgestellt werden.
Die vereinigten Fraktionen 52-54 (Peak y) der Lichrosorb-Diolsäule wurden in der gleichen Weise aufgearbeitet und an Lichrosrob RP-8 chromatographiert, wie sie für den Peak a beschrieben wurde. Die Interferon-Aktivität wurde in fünf 40 Hauptpeaks eluiert: yi (bei 31% n-Propanol, v/v), y2 (bei 32% n-Propanol, v/v), y3 (bei 34% n-Propanol, v/v), y4 (bei 35% n-Propanol, v/v) und y s (bei 35,5% n-Propanol, v/v). Rechromatographie war in diesem Fall nicht notwendig.
Die Ergebnisse der Reinigung zur Herstellung der ein-45 zelnen Interferon-Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Die Spezies <X2 und ß2 können ferner unterschieden werden durch ihre Elutionscharakteristiken an Lichrosorb-Diol: (X2 wird eluiert mit 68%igem (v/v) n-Propanol und ß mit 66,5%igem (v/v) n-Propanol.
so Proben der Interferon-Spezies (1,5 x 105 Einheiten) wurden mit NaDodSo4 und 2-Mercaptoäthanol inkubiert und auf ein Plattengel aufgebracht. Nach Elektrophorese lieferten die Peaks ai, 012, ß2, yi, ji und y4 jeweils eine einzige Bande, während die Peaks ß3, yi und ys jeweils zwei Banden lieferten. Die 55 scheinbaren Molekulargewichte lagen zwischen 16 000 und 18 000 mit Ausnahme von ß3, das eine Bande bei 16 500 und eine bei 21 000 aufwies, und y4, das eine Bande bei 21 000 lieferte (siehe Tabelle 4).
Tabelle 3
Reinigung von Leukozyten-Interferon aus CML-Zellen
Stufe
Einheiten Protein gefunden gefunden xlO"6 (mg)
Spezifische Aktivität**) (Einh./mg)
Reinheitsgrad Ausbeute (%)
1. Inkubationsmedium 800 20xl03 4xl04 1 100
2. pH4-Überstand 800 4xl03 2xl05 5 1 00
7
653347
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Reinigung von Leukozyten-Interferon aus CML-Zellen
Stufe Einheiten Protein Spezifische Reinheitsgrad Ausbeute gefunden gefunden Aktivität**)
xlO-6 (mg) (Einh./mg) (%)
3. 1,5% Trichloressigsäure-
Niederschlag
780
2xl03
3,9x 105
9,8
97
Triton X-100/
Essigsäure-Überstand
760
510
l,5xl06
37,5
95
4% Trichloressigsäure-
Niederschlag
810
350
2,3 xlO6
57,5
100
Sephadex G-100
660
130
5,1 xlO6
128
82
Lichrosorb RP-8 (pH 7,5),
(2 Ansätze)
510
26
2xl07
500
64
Lichrosorb-Diol
Peak a
149
5
3 xlO7
750
Peakß
148
3
5 xlO7
1250
Peak y
139
1,7
8xl07
2000
Total 436 54
9. Lichrosorb RP-8 (pH 4,0)
Peak cu*
9
35X10"3
2,6 xlO8
6,500
Peak a.2*
26
65X10"3
4,0 xlO8
10,000
Peak ß2
30
75 xlO"3
4,0 xlO8
10,000
Peak ß3
13
32 xlO"3
4,0 xlO8
10,000
Peak yi
15
58 xlO"3
2,6x 108
6,500
Peak jz
31
77 xlO"3
4xl08
10,000
Peak Y3
26
74X10"3
3,5xl08
8,750
Peak y4
3,5
lOxlO"3
3,5xI08
8,750
Peak Ys
4,5
50 xlO"3
0,9 xlO8
2,250
Total 158 20
* nach Rechromatographie
** Aktivität bestimmt an MDBK-Zellen (Rind), Protein gemessen mit Serumalbumin als Standard
Tabelle 4
MWr Spez. Akt. an MDBK Spez. Akt. an Ag 1732 Wachstumshem-
(Rinderzellen, (Human-Zellen; mende Aktivität**
Einh./mg) Einh./mg)
+ 1000 +25% +50%
ai
16,500
2,6 xlO8
2,6 x 108
+
(X2
16,200
4 xlO8
3 xlO8
+
ß2
16,500
4 xlO8
2 xlO8
+
ß3*
21,000
4 xlO8
3 xlO8
+
Y>
17,700
2,6 xlO8
2 xlO8
+
y 2
17,700
4 xlO8
l,5xl08
+
y 3*
17,200
3,5 x 108
l,5xl07
+
Y"
21,000
3,5xl08
4 xlO8
+
ys*
16,500
0,9 xlO8
2 xlO6
+
* 2 Banden bei NaDodSO-i-Polyacrylamidgelelektrophorese; MW der Hauptbande ** Methode von Stewart et al., Nature 262,300(1976)
Die Aminosäureanalyse der gereinigten Human-Leukozyten- Hydrolyse wurde in 6N HCl unter reduzierenden Bedin-Interferon-Fraktionen wurde mit einem Fluorescamin-Ami- gungen (0,1 % Thioglycolsäure) durchgeführt. Die Ergebnisse nosäure-Analysator an 0,1 -1 p.g Proben durchgeführt. Die der Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
653347 8
Tabelle 5
Aminosäureanalyse von Human-Leukozyten-Interferon
Species
Ctl
<X2
ß*
ß3*
r>
Y2
y3*
Y4
ys*
MWr
16,500
16,200
16,500
21,000
17,700
17,700
17,200
21,000
16,500
Reste
142
139
142
181
153
153
148
180
142
Asx
13,8
Thr
7,7
Ser
9,2
Glx
20,3
Pro
6,1
Gly
5,1
Ala
8,4
Val
7,4
Met
3,7
ILeu
7,4
Leu
18,0
Tyr
4,0
Phe
6,9
His
3,0
Lys
10,5
Arg
6,2
Cys
3,9
11,7
11,5
8,3
9,0
10,0
10,0
20,5
21,9
4,9
5,0
4,5
5,0
8,3
7,9
6,2
6,7
3,8
4,4
7,0
7,4
18,0
18,9
4,4
4,6
8,0
8,7
2,8
3,0
9,0
8,5
7,1
8,0
4,0
1,8
18,2
13,1
9,9
8,4
14,5
10,2
28,5
23,9
5,9
4,5
3,6
5,7
11,5
8,7
7,5
7,3
6,0
4,3
9,5
7,9
24,4
20,3
5,0
4,8
9,9
8,6
3,8
3,7
9,3
10,1
10,8
8,0
2,3
3,3
13,3
15,0
9,6
8,6
7,8
10,1
25,0
22,8
4,8
4,8
5,0
3,2
8,1
9,3
7,0
5,5
3,9
5,6
8,0
6,8
20,1
20,5
4,8
3,7
9,0
7,2
3,3
2,9
10,0
7,6
8,5
10,1
2,9
3,1
17,9
13,8
7,3
7,6
13,5
9,0
27,0
20,8
6,5
4,2
4,8
4,0
10,4
9,3
7,9
5,1
4,9
4,7
9,7
6,6
24,1
19,6
5,0
3,6
9,1
6,4
3,8
2,8
12,3
12,0
8,5
9,0
4,1
2,3
Genauigkeit ±1,5 Reste * Gemische beider Banden
Trypsin-Spaltungund HPLC der Fragmente
Jeweils 300 pMol der gereinigten Human-Leukozyten-Interferon-Spezies wurden in wässrigem Natriumbicarbonat (50 mMol, pH 8,50 jxl) gelöst. Nach Zusatz von jeweils 0,1 ug Trypsin in 2 |i,l HCl (pH 3) wurde 14 Stunden bei 37°C inkubiert, mit 5 jxl Essigsäure versetzt und das Gemisch auf eine Lichrosorb RP-8-Säule (Teilchengrösse 10 (i; 6 x 250 mm) aufgebracht. Die Säule wurde während einer Stunde mit einem linearen Gradienten von 0-40% (v/v) n-Propanol in einem 0,1 M Ameisensäure/0,03 M Pyridin-Puffer (pH 3) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. eluiert.
Die Fragmente wurden nach der Fluorescamin-Methode nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammenge-fasst, wobei die Position der Peaks als % n-Propanol und die relative Grösse der Fragmente angegeben sind (S = klein; M = mittelgross; L = gross).
Tabelle 6
Tryptische Peptide der Human-Leukozyten-Interferone Spezies Elution bei % n-Propanol cu 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 20S,
21S, 22,5S, 29M «2 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 27S, 29M
ßa 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,5S, 18M, 29M
ß3 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S,
18L, 19,5M, 27M, 32M yi 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,5S, 11,5S, 12,5S, 14,5M,
16S, 17,5M, 18M, 29M y2 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 11,5S, 12,5S, 14,5S, 16S, 18L, 29M
ys 3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 13,5S, 14,5M, 16S, 18L, 20S, 32M
ys 3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,5S, 10S, 11,5L, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 24,5S, 25,5S, 32S
Die gereinigten Human-Leukozyten-Interferone-Spezies wurden einer Aminozuckeranalyse unterworfen, mit der Aminozucker im Bereich von 50-100 pMol festgestellt werden können. In allen Fällen wurde weniger als ein Rest 35 Glucosamin, Galactosamin bzw. Mannosamin pro Molekül gefunden. In den meisten Fällen interferierte eine Anzahl kleiner Peptide, die in der Nähe der Aminozucker eluiert wurden, mit der Analyse. Es ist daher möglich, dass die den Aminozuckern zugeordneten Peaks teilweise oder sogar ganz 40 Peptiden zuzuordnen sind.
Schliesslich lieferte ein Versuch, 1 nMol reines j2 Interferon durch einen manuellen Edman-Abbau, der Rückhydro-lyse und Aminosäureanalyse unter Verwendung von Fluor-45 escamin beinhaltet, zu sequenzieren, keine Aminosäuren in den ersten beiden Zyklen. Die Behandlung von 100 pMol reinem y2 Human-Leukozyten-Interferon mit Leucinamino-peptidase und Aminopeptidase M während 20 Stunden bei 37°C beeinflusste die biologische Aktivität nicht; im Inkuba-50 tionsmedium konnten keine Aminosäuren festgestellt werden. Durch Behandlung des Überstandes eines Induktionsmediums (Leukozyten und Newcastle-Krankheit-Virus in Minimalmedium) mit Aminopeptidase M konnte ein Verlust an Interferon-Aktivität nicht beobachtet werden. Dies 55 deutet daraufhin, dass das Interferon-Molekül bereits vor dem Reinigungsverfahren eine blockierte aminoendständige Aminosäure enthält. Zur Kontrolle wurden rohes Interferon, reines Interferon und die ß-Kette von Insulin gemeinsam mit Aminopeptidase M inkubiert. Während Insulin teilweise 60 abgebaut wurde (Aminosäuren nachweisbar), trat kein Verlust an Interferon-Aktivität auf.
Beispiel 3
65 In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Rinder-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
9
653347
Beispiel 4
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Schweine-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 5
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Schafs-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 6
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Pferde-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 7
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Hunde-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 8
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Katzen-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form einzelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 9
In Analogie zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Affen-Leukozyten zur Interferon-Produktion angeregt und das Interferon bis zur Homogenität in Form ein-5 zelner Spezies homogener Proteine gereinigt.
Beispiel 10
(a) 3 mg homogenes Human-Leukozyten-Interferon mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 10S Einheiten/mg wurde io in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 x 106 Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis
15 zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei — 20°C) aufbewahrt.
(b) Eine wässrige Lösung, enthaltend 1,5 mg der vereinigten homogenen Human-Leukozyten-Interferon-Spezies
20 o», <X2, ß2, yi und yi (jedes etwa im Verhältnis zu seiner natürlichen Häufigkeit), mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 10s Einheiten/mg, und 100 mg normales Human-Serum-albumin, wird durch ein bakteriologisches Filter gegeben und die Lösung aseptisch auf 100 Ampullen gleichmässig verteilt.
25 Jede Ampulle enthält etwa 3 x 106 Einheiten reines Human-Leukozyten-Interferon und 1 mg Serumalbumin. Die Ampullen, die für parenterale Applikation geeignetes Interferon enthalten, werden zweckmässigerweise kühl (-20°C) gelagert.
B
Claims (3)
1. Verfahren zur Reinigung von Proteinen mit einem Molekulargewicht über 12 000, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des unreinen Proteins durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Cyanopropyl-, Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen SiCh-Matrix unter HPLC-Bedingungen schickt, wobei das Protein zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden oder fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels eluiert wird, so dass es schliesslich in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird.
2
s
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer durch Octyl- oder Glycerylgruppen modifizierten porösen SiCh-Matrix arbeitet.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur Reinigung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man
A) eine wässrige Lösung von Interferon in unreinem Zustand unter HPLC-Bedingungen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octyl-gruppen modifizierten SiCh-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem steigenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
B) diese in Schritt A) erhaltenen bestimmten Fraktionen durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Glycerylgruppen modifizierten SiCh-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem fallenden Gradienten eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in einem Puffer eluiert wird, so dass es in ausgeprägten Hauptpeaks in bestimmten Fraktionen des Eluats in reinerer Form erhalten wird;
C) diese in Schritt B) erhaltenen Fraktionen, die den ausgeprägten Hauptpeaks entsprechen, unter HPLC-Bedingungen ein- oder mehrmals durch eine mit einem Puffer äquilibrierte Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten SiCh-Matrix schickt, wobei das Interferon zunächst adsorbiert und dann mit einem Gemisch eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels und eines wässrigen Puffers eluiert wird, so dass man es in einem einzigen, ausgeprägten Peak in bestimmten Fraktionen des Eluats als homogenes Protein erhält.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man von Human-Interferon ausgeht.
5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man von Human-Leukozyten-Interferon ausgeht.
6. Verfahren gemäss Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel ein Alkanol oder einen cyclischen Äther verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel n-Pro-panol, in Schritt A) einen Puffer mit einem pH von etwa 7,5 und in Schritt B) einen Puffer mit einem pH von etwa 4,0 verwendet.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem in Schritt A) verwendeten Puffer um 1 M Natriumacetat/Essigsäure handelt und der n-Propanol-Gradient von 0 auf 40% (v/v) ansteigt, dass es sich bei dem in Schritt B) verwendeten Puffer um 0,1 M Natriumacetat handelt und der n-Propanol-Gradient von 72,5 auf 50% (v/v) abnimmt und dass es sich bei dem in Schritt C) verwendeten Puffer um 1 M Pyridin/2 M Ameisensäure handelt und ein von 20 auf 40% (v/v) ansteigender n-Propanol-Gradient eingestellt wird.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die bestimmten, den ausgeprägten Hauptpeaks zuzuordnenden Fraktionen zusammengefasst werden, das n-Propanol durch Extraktion mit n-Hexan entfernt wird und vor Schritt C) Spuren von n-Hexan aus der wässrigen Phase entfernt werden.
Die Reinigung von Proteinen ist seit langem ein Problem in der Peptidchemie. Die zu diesem Zweck angewandten Techniken umfassen die Präzipitation, Gelfiltration, Ionen-austauschchromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie und viele andere. Verfahren zur Isolierung natürlich vorkommender, hochmolukularer Proteine, die in biologischem Material in extrem geringen Konzentrationen vorkommen, umfassen eine Vielzahl der vorstehend genannten Methoden. In vielen Fällen müssen ausserordentlich grosse Mengen des Rohmaterials eingesetzt und verarbeitet werden im Hinblick auf die grossen Verluste während des gesamten Prozederes. Daraus ergibt sich, dass die Reinigungsverfahren für derartige Proteine ausserordentlich aufwendig und teuer sind. Ein gutes Beispiel stellen diesbezüglich die verschiedenen Versuche der Isolierung und Charakterisierung des Interferons dar. Seit seiner Entdek-kung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, die unternommen wurden, um es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben würden.
Im U.S. Patent 3 699 222, welches die ersten Arbeiten von Isaacs und Lindenmann über das Interferon zum Gegenstand hat, besteht die Reinigung des aktiven Materials lediglich in einer Ammonsulfatfällung und anschliessender Dialyse. Da ein derartiges Verfahren relativ unspezifisch ist, ist das erhaltene Produkt noch ausserordentlich unrein.
Ein Mehrstufenverfahren zur Reinigung von Interferon wird in U.S. Patent 3 414 651 beschrieben, dass die folgenden Schritte umfasst: selektive Adsorption an amorphen Alu-mino-silikat, Elution mit Jod- oder Thiocyanat-Lösung, weitere Fällung unerwünschter Proteine mit wässriger HCl und wässriger Natronlauge, Fällung des Interferons mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Aceton und schliesslich Chromatographie des wieder aufgelösten Interferons an einem Ionenaustauschharz wie 2-Diäthylaminoäthyl-cellulose. Durch dieses Reinigungsverfahren konnte die spezifische Aktivität des Interferons um den Faktor 6000 erhöht werden. Als spezifische Interferone wurden in dem U.S. Patent Kücken- und Affen-Interferon genannt.
Eine weitere Reinigungsmethode wird in U.S. Patent 3 975 344 beschrieben, gemäss dem eine Lösung von ungereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon durch Dichtegra-dient-Ultrazentrifugation gereinigt wurde. Es wurde angegeben, dass nach dieser Methode eine höhere Ausbeute und Reinheit erzielt wird als nach der Methode unter Verwendung von Säulenchromatographie an Sephadex G-100.
Die im folgenden aufgeführten Publikationen beschäftigen sich ebenfalls mit der Reinigung und der versuchten Charakterisierung von Interferonen:
Knight, E., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,520-3 (1976); Törmä, E.T. et al., J. Biol. Chem. 251,4810-6 (1976); Bridgen, PJ. et al., J. Biol. Chem. 252,6585-7 (1977); DeMaeyer-Guig-nard, J. et al., Nature 271,622-5 (1978): Kawakita, M. et al.,
3
653347
J. Biol. Chem. 253,598-602 (1978); Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253,5206-11 (1978); Jankowski, WJ. et al., J. Viro-logy 16,1124-30 (1975); Davey M.W. et al., J. Biol. Chem. 251,7620-5 (1876); Chadha, K.C. et al., Biochemistry 17, 196-200(1978).
Obwohl in zahlreichen der oben genannten Publikationen behauptet wird, dass Mäuse- oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, ist weder einer der klassischen Nachweise der Homogenität von Proteinen angegeben, z.B. Kristallisierbarkeit, Löslichkeitskinetiken, einheitliches Verhalten in der Ultrazentrifuge und/oder in der Elektrophorese, eindeutige Aussagen bei der Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung, oder Aminosäuresequenz oder Einheitlichkeit in chromatographischen Verfahren,
noch sind die Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.
Die Anwendung der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) zur Reinigung von Proteinen ist in der Fachwelt allgemein bekannt, wobei besonders Ionenaustausch-und Ausschluss-Chromatographie beschrieben werden [siehe z.B. Regnier, F.E. et al., J. Chromatog. Sei. 14,316-20 (1976) und Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 1839-45 (1976)].
In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z.B. Lich-rosorb RP-18 (Säulen auf der Basis von Octadecyl-modifi-ziertem SÌO2) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie ß-Endorphin, verwendet [siehe z.B. Rubinstein, M. et al.,
Proc. Nati. Acad. Sei., USA 74,4969-72 (1977)].
Schliesslich wurde die teilweise Charakterisierung von drei Interferon-Spezies aus Ehrlich Ascites-Tumorzellen von Mäusen (MG = 33 000,26 000 und 20 000) durch Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 254,3681-4 (1979), beschrieben.
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