MC1300A1

MC1300A1 - Proteines purifiees,procede de preparation et compositions pharmaceutiques les contenant

Info

Publication number: MC1300A1
Application number: MC791416A
Authority: MC
Inventors: S Pestka; M Rubinstein
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-21
Publication date: 1980-10-03
Also published as: FI69476C; DK161048B; ES486263A0; AU1586683A; LU88314I2; AR222359A1; IL58759A; RO79132B; KE3347A; ES8100502A1; CA1129409A; IE48882B1; DE2947134C2; NZ192201A; GR72828B; IE792247L; NL193085B; FI793649A7; FR2442054B1; CH654843A5

Description

1

La purification des protéines pose depuis longtemps un problème en chimie des peptides.

Parmi les techniques employées, on citera la précipitation, la filtration sur gel, la chromatographie par 5 échange d'ions, 11électrophorèse sur gel, la chromato graphie par affinité, et beaucoup d'autres, trop nombreuses pour être mentionnées ici.

Les schémas d'isolation de protéines à haut poids moléculaire que l'on trouve dans la na-10 ture, qui sont présentes dans les échantillons biolo giques à des concentrations extrêmement faibles font intervenir des procédés à plusieurs étapes utilisant des"examens effectués grâce aux techniques précédentes. Dans une grande partie de ces cas, il faut ac-15 cumuler des quantités fantastiques de produit de dé

part brut et les traiter à un coût élevé, et généralement déployer de grands efforts, étant donné l'importance des pertes de produit dans les dernières étapes du procédé de purification.

20 On peut en trouver un bon exemple dans l'histoire des nombreuses tentatives visant à isoler et à caractériser 1'interféron. Depuis sa première découverte par Isaacs et Lindenmann en 1957s 1'interféron, que ce soit sous forme de leucocyte ou de fibroblaste, 25 a- résisté aux tentatives de chercheurs appartenant à di verses institutions dans le monde pendant deux décennies, visant à l'isoler sous forme de peptide homogène dans des quantités suffisantes pour permettre une caractéri-sation et une identification de ses propriétés biologi-30 ques et chimiques soécifiques.

Dans le brevet américain n° 3 699 222,

2

qui se rapporte à la recherche originale d'Xsaacs et Lindenmann sur 1'interféron, la purification de la matière active se limite à une précipitation au sulfate d'ammonium suivie par une dialyse. Ces procédés sont 5 relativement non spécifiques et le produit ainsi obte nu est donc toujours dans un état extrêmement brut.

Le brevet américain n° 3 ^-1^- 651 décrit un procédé de purification de l'interféron en plusieurs étapes utilisant une adsorption sélective 10 sur un alumino-silicate amorphe, une élution avec une solution d'iode ou de thiocyanate, puis une précipitation des protéines indésirables avec HC1 aqueux puis p

NaOH aqueux, une précipitation de l'interféron à par-• tir de la solution basique avec des solvants miscibles 15 à l'eau comme le méthanol, 1'éthanol ou l'acétone et enfin une chromatographie de l'interféron redissous sur une résine échangeuse d'anions comme la 2-diéthyl-aminoéthyl-cellulose pour produire un interféron dont l'activité spécifique est enregistrée comme ayant été 20 multipliée par 6 000 par l'ensemble du procédé. Parmi ces exemples d'interférons spécifiques, on trouve les interférons de poulet et de singe.

Le brevet américain n° 3 975 3^ décrit une autre variante de purification où l'on puri-25 fie une solution brute d'interféron de fibroblasts hu main dérivés du milieu d'incubation de la culture de cellules par ultracentrifugation à gradient de densité zonale. On y indique que cette technique donne des rendements et une purification supérieure à ce qu'on ob-30 tient avec le procédé classique de chromatographie sur colonne sur Sephadex G-10.

On trouvera ci-dessous une liste résumée des articles scientifiques récents concernant la purification et les essais de caractérisation des interfé-35 rons. (K

3

Knight, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22. 520-3 ( 1976) ; Tonna, É. T. et al., J.Biol. Chern. 251 , 4810-6 (1976)5 Bridgen, P.J. et al., J. Biol. Chem. 2^2, 6585-7 (1977); DeLaeyer-Guignard, J. et al., Nature 271, 622-5 (1978)ï 5 Kavakita, M. et al., J. Biol. Chem. 253, 598-602X^978);

Berthold, W. et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-11 (1978); Jankowski, W.J. et al., J. Virology _1_6, 1124-30 ( 1975) ; Davey M.W. et al., J.Biol. Chem. 251, 7620-5 (1976); Chadha, K.C. et al., .Biochemistry JT£, 196-200 (1978).

10 Alors que plusieurs de ces articles prétendent avoir purifié jusqu'à 1'homogonéité des inter férons humains, on n'y trouve aucune des preuves classiques d'homogénéité des matériaux protéiques ni aucune description des propriétés des composés prétendus 15 purs.

L'emploi de la chromatographie en phase liquide à haute efficacité /ÊPLC ("high performance li-quid chromatography" )_J7 pour la purification des protéines est généralement connu des spécialistes. Ces ré-20 férences décrivent spécifiquement des colonnes du type

à échange d'ions ou du type à exclusion selon la taille, en matière de purification des protéines. Voir par exemple Regnier, F.E. et al., J. Crhomatog. Sci. 14, 316-20 (1976) et Chang, S.-H. et al., Anal. Chem. 48, 25 1839-45 (1976).

On a employé avec succès du Lichrosorb RP-18 (colonne de microparticules de silice à liaisons octadécyle) dans la chromatographie de partage en phase inversée pour purifier des peptides comme la bêta-end'or-30 phine (voir p. ex. Rubinstein, M. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., USA £4, 4969-72 (1977)).

Enfin, on trouve dans Cabrer, B. et al., J. Biol. Chem. 2 54, 3681-4 ( 15>79) une description de la caractérisation partielle de trois espèces d'interféron 35 provenant de cellules tumorales d'ascite d'Ehrlich chez

k les souris (PM = 33 000, 26 000 et 20 000).

Au sens le plus large, l'invention concerne un procédé amélioré de purification des protéines ayant un poids moléculaire supérieur à 12 000 environ 5 avec une haute résolution et un rendement élevé à une

échelle préparative. Le procédé consiste à faire passer une solution aqueuse de ladite protéine à 1'état impur à travers une colonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice poreuse à laquelle sont reliés 10 des groupes cyanopropyle, cyclohexyle, phényle, octyle,

octadécyle ou glycéryle dans des conditions de HPLC de manière à adsorber ladite protéine sur ladite colonne puis à éluer ladite protéine avec un gradient croissant ou décroissant d'un solvant aqueux miscible à l'eau et 15 à obtenir ladite protéine dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pureté améliorée. Ces colonnes, qui peuvent être utilisées séquentiellement et dans des conditions variables de pH et de gradient de solvant organique, offrent la possibilité de purifier 20 jusqu'à l'homogénéité les matières protéiques qui sont présentes à des quantités extrêmement faibles dans les extraits cellulaires ou les milieux de croissance.

Dans un mode de réalisation spécifique préféré de l'invention, on emploie le nouveau'procédé de 25 purification pour purifier l'interféron jusqu'à l'homo généité à des quantités suffisantes pour permettre une caractérisation chimique de cette substance médicalement intéressante, et ce pour la première fois. La possibilité de caractériser chimiquement l'interféron représente 30 une avance significative dans le développement de cette substance cnr elle permettra de préparer le composé soit par des procédés classiques de synthèse des peptides, soit par synthèse de l'ADN correspondant à la séquence d'acides aminés de l'interféron et par introduction de cet ADN 35 dans un organisme approprié, de préférence une bactérie,

>)

5

10

15

20

25

30

par des techniques de recombinaison de 1'ADN. L'organisme obtenu aura alors une capacité de production d'interféron que l'on peut accroître par application de techniques de fermentation pour fournir une source commode de ce composé, rare jusqu'ici, à une échelle commerciale.

terféron sous forme de protéine homogène comprend la combinaison des étapes suivantes :

A) Faire passer une solution aqueuse d'interféron à l'état impur à travers une colonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice liée à des groupes octyle dans des conditions de chromatographie en phase liquide à haute efficacité de manière à adsorber ledit interféron sur ladite colonne puis à éluer ledit interféron

à partir de ladite colonne avec un gradient croissant d'un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et obtenir ledit interféron dans des fractions choisies dudit

éluat dans un état de pureté améliorée; » ^ ^

B) Faire passer les fractions d'interferon choisies obtenues dans l'étape A à travers une colonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice liée à des groupes glycéryle pour adsorber ledit interféron sur ladite colonne puis éluer ledit interféron à partir de ladite colonne avec un gradient décroissant d'un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et obtenir l'interféron sous la forme de grands pics distincts dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pureté améliorée;

c) Faire passer les fractions choisies d'interféron correspondant à l'un desdits grands pics distincts obtenus dans l'étape B dans une solution tamponnée à travers une colonne, équilibrée avec un tampon, de matrice de silice liée à des groupes octyle dans des conditions de HPLC, de manière à adsorber ledit interféron sur ladite colonne avec un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et à

Le procédé spécifique de production d'in-

6

obtenir l'interféron sous la forme d'un seul pic distinct dans des fractions choisies dudit éluat dans l'état d'une protéine homogène et, si on le désire,

répéter le procédé de l'étape C pour obtenir l'ho-5 mogénéité finale.

L'invention concerne également l'espèce d'interféron pure et homogène obtenue par le procédé amélioré.

Les colonnes de micro-particules de 10 silice poreuses modifiée par des groupes octyle ou glycéryle (taille particulaire: 10 microns; taille moyenne des pores: 100 X) utilisées dans la pratique de l'invention sont des articles du commerce que l'on peut se procurer auprès des laboratoires EM d'Elms-15 ford, N.Y., aux Etats-Unis sous les marques Lichrosorb

RP-8 et Lichrosorb diol. On peut trouver chez E.S. Industries, Marlton, N.J., aux Etats-Unis des colonnes équivalentes de silice poreuse modifiée par des octyles (identifiées sous le nom de Chromegabond C-8).

20 Le brevet américain n° 4 116 046 décrit un système commode de chromatographie en phase liquide à haute pression pour utiliser lesdites colonnes.

En exécutant le présent procédé, on fait passer à travers la colonne de matrice de silice la so-25 lution du peptide à haut poids moléculaire impur, de préférence dans un tampon aqueux à un pH compatible avec les propriétés de la protéine en question. Le procédé s'effectue généralement sous pression, de préférence dans un intervalle d'environ 3j5 à 350 kg/cm (3,4-340 a tm) . 30 La protéine est adsorbée dans la colonne puis éluée de façon sélective au moyen d'un gradient d'un solvant aqueux miscible à l'eau. Les solvants miscibles à l'eau convenant à cet effet comprennent les alcanols comme le n-propanol, le 2-propaiiol, l'étlianol, le méthanol, le 35 tert-butanol, ou les éthers cycliques comme le dioxanne.

7

Le fractionnement de 1'éluat s'effectue en utilisant des collecteurs de fraction de façon classique en contrôlant simultanément la teneur de chaque fraction en protéine par des appareils de contrôle des peptides 5 opérant à une sensibilité élevée. Bohlen et al., Bio-

chem. 6_2, 438 (1975) décrivent un système convenant à cet effet. Il est également souhaitable de contrôler la présence de la protéine cible par un examen biologique approprié.

10 La décision d'employer ou non les deux types de colonne (colonnes pour chromatographie de partage "normale" et colonnes pour chromatographie en phases inversées) et si oui l'ordre à adopter dépendent dans une large mesure de la nature de la protéine 15 à purifier. Il s'est révélé, par exemple, que dans le cas spécifique de l'interféron de leucocyte humain, on obti-ent les meilleurs résultats en commençant par résoudre la solution d'interféron impure à travers la colonne de matrice de silice liée à des octyles (chro-20 matographie en phases inversées) en utilisant un pH de tampon d'environ 7>5> de préférence un système acétate de sodium acide acétique 1M, puis en éluant avec un gradient croissant de concentration de n-propanol, puis en faisant passer les fractions actives réunies à tra-25 vers la colonne de matrice de silice liée à des glycé-

ryles dans de l'acétate de sodium 0,1 M et en éluant avec un gradd ent décroissant de n-propanol et enfin en faisant passer les composants séparés de l'interféron à travers la colonne de matrice de silice liée à des oc-30 tyles en utilisant un pH tampon d'environ 4,0, de pré

férence un système pyridine 1 M - acide formique 2 M, et en éluant au moyen d'un gradient croissant de n-propanol. De cette façon, on peut résoudre chacune des trois formes déparées d'interféron de leucocyte humain (alpha, bêta 35 et gamma) en pics aigus séparés représentant les protéi-

8

nés homogènes. Le rapport global de purification entre le milieu d'incubation et la seconde étape chromatogra-phique à matrice de silice liée à des octyles est de 6.0 000 à 80 000, tandis que le rendement cumulé jusqu'à l'étape de chromatographie à matrice de silice liée au glycérol va de 30 à 50°/o.

Dans un mode de réalisation spécifique du procédé de purification de l'interféron de leucocyte humain on rassemble les fractions à pic choisies de l'étape B, on retire le n-propanol par extraction avec du n-hexane et on retire les traces de n-hexane de la phase aqueuse avant de procéder à l'étape C.

Les espèces d'interféron de leucocyte humain homogènes obtenues par la pratique du procédé de l'invention présentent chacune un pic aigu sur la colonne de HPLC ci-dessus mentionnée et une seule bande étroite à 1'électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (NaDodSO^) en présence de 2-mercaptoéthanol. L'extraction du gel donne un seul pic aigu d'activité antivirale coïncidant avec la bande protéique. On trouve que l'activité spécifique de l'espèce d'interféron pure se situe aux environs de 2,6-4,0

g x 10 avec les cellules de boeuf MDBK et aux environs de 8

1,5-4 x 10 avec la lignée cellulaire humaine Ag 1732. Les poids moléculaires vont d'environ 16 000 à 21 000 comme on le voit au tableau 4. Les résultats des analyses des acides aminés sont résumés au tableau 5«

Les interférons présentent une activité antivirale, antitumorale, d'inhibition de la croissance et d'irnmunosuppression. Ces activités ont été

6

obtenues même au niveau clinique en utilisant 1-10 x 10 unités par jour avec des préparations relativement brutes, dont moins de 1 °/o est constitué d'interféron humain. Les interférons homogènes purifiés qui sont un aspect de l'invention peuvent être utilisés de la même manière

9

que les préparations brutes précédemment employées avec des ajustements dans la posologie pour fournir le niveau désiré d'unités d'interféron. Les différentes espèces peuvent être utilisées telles quelles ou sous 5 forme de mélanges de deux ou plusieurs d'entre elles.

On peut obtenir des mélanges de ce genre en mélangeant les espèces isolées comme on le désire ou en arrêtant le procédé de purification lorsqu'on se trouve en présence de plusieurs espèces d'interféron mais hors la 10 présence de protéines actives en dehors des interfé

rons, si bien que la composition est un mélange de protéines d'interférons homogènes.

On peut également employer le procédé de purification ci-dessus mentionné, dont le cas de l'inter-15 féron de leucocyte humain constitue un exemple, pour purifier d'autres interférons y -compris l'interféron de fibroblaste humain et les interférons provenant de sources animales ainsi que d'autres protéines ayant un poids moléculaire supérieur à 12 000 environ. Ainsi, par exem-20 pie, on a purifié la pro-opiocortine (PM environ 30 000)

jusqu'à 1'homogéniété en utilisant le procédé de l'invention (voir Kimura et al.,Proc ,j\ratl .Acad. Sci „USA 76 , 1758-9 (1979)). Les spécialistes savent comment choisir les conditions spécifiques appropriées pour donner la ré-25 solution optimum pour chacun des différents types de pro téines à purifier.

L'induction de production d'interféron, la concentration initiale et le fractionnement de l'interféron y compris la filtration sur gel peuvent s'effectuer en 30 utilisant des procédés bien connus des spécialistes. Ces procédés, qui donnent une solution aqueuse d'interféron à l'état impur, ne relèvent pas de l'invention.

Le procédé et les aspects de l'invention constitués par des produits sont illustrés plus précisément par 35 référence aux exemples suivants :

10

Exemple 1

Interféron de leucocyte humain homogène provenant de donneurs normaux

A. - Production d'interféron

On produit l'interféron par incubation de leucocytes humains provenant du sang de donneurs normaux

7

(10 cellules/ml) avec le virus de la maladie de New-castle (15 unités d'hémagglutination/ml) dans un milieu essentiel minimum sans sérum contenant de la caséine (10 mg/ml) pendant 16 h. On obtient un titre moyen d'interféron de 5000 unités/ml. Les procédés employés sont exécutés comme il est mentionné dans Mogensen,

K.E. et al., Pharmacology and Therapeutics A, 1977»

369-381 ; Vheelock, E.F., J. Bacteriol. £2, 1415—1^21 (1966) et Cantell, K. et al., Appl. Microbiol. 22,

625-628 (1971) avec quelques faibles modifications. On détermine les titres d'interféron par un examen d'inhibition de l'effet cytopathique qui peut s'effectuer en 16 heures. Tous les titres d'interféron sont exprimés en termes d'unités de référence par ml, étalonnées par rapport à la norme de référence pour l'interféron de leucocyte humain fournie par l'Institut National de la Santé des Etats-Unis.

B. Concentration et fractionnement initial de l'interféron

Sauf indication contraire, ces différents procédés s'effectuent à 0-4°C. A la fin de l'incubation, on enlève les cellules et les débris par centrifugation à basse vitesse (15 min, 500 g). On précipite la caséine par acidification à pH 4,0 avec HC1. Au bout de 2 h, on centrifuge le mélange (10 min, 12 000 g) et on jette le culot. On ajuste le surnageant (10 l) à 1,5?^ (p/v) d'acide trichloracétique. Au bout d'1 h on recueille le précipité par centrifugation (10 min, 12 000 g) et on le redissout dans 50 ml de NaHCO^ 0,1 M. On ajoute du Triton X-100 (0,5 g) puis on ajoute goutte à goutte de l'a-

11

cide acétique (l,5 ml) tout en agitant. On garde le mélange à 0°C pendant 1 h puis pendant lé h à -20°C. Ensuite on le dégèle et on le centrifuge (10 min, 17 000 g). On jette le culot et on ajuste le surna-5 géant à 4% d'acide trichloracétique. Au bout d'1 h,

on centrifuge le mélange (10 min, 12 000 g). On recueille le précipité et on le redissout dans 5 ml de NaHCO^ 0,5 M.

C. Filtration sur gel

10 On ajoute de l'urée (1,5 g) au concen tré d'interféron et on introduit la solution dans une colonne de Sephadex G-100 fine (2,6 x 90 cm) pré- équilibrée avec un tampon urée 4M/acétate de sodium 0,1 M. On élue la colonne avec de l'urée h M/acétate de so-15 dium 0,1 M, pH 7>5> à la température ambiante à un dé

bit de 0,5 ml/min. On recueille des fractions de 12,5 inl. ~ L'activité d'interféron est éluée dans les fractions

19-23.

D. Chromatographie en phase liquide à haute efficacité

20 On combine les fractions 19"23 de l'opé

ration avec Sephadex G-100 et on les introduit directement au moyen de la pompe dans une colonne de Lichrosorb RP-8 (10 microns, 4,6 x 250 mm). On pré-équilibre la colonne avec un tampon d'acétate de sodium 1 M (pH 7»5) 25 contenant 0,01% (v/v) de thiodiglycol puis on élue avec un gradient linéaire de n-propanol dans le même tampon (l h, 0-20%; 3 b, 20-40% (v/v)) à un débit de 0,25 ml/min, On recueille des fractions de 0,75 ml. On élue l'interféron dans les fractions 23 à 40 (25-30% (v/v) de n-pro-30 panol).

On combine les fractions 27-33* contenant la plus grande partie de l'activité d:interféron, on a-joute du n-propanol jusqu'à une concentration finale de 80% (v/v), et on fait passer la solution au moyen de la 35 pompe à travers une colonne de Lichrosorb diol (10 mi-

12

crons, 4,6 x 250 mm) préalablement équilibrée avec une solution d'acétate de sodium 0,1m contenant 80% (v/v) de n-propanol. On élue alors la colonne avec un gradient linéaire de 4 h de 72-50% (v/v) de n-propanol 5 dans l'acétate de sodium 0,1 M à un débit de 0,25 ml/

min. On recueille des fractions de 0,75 ml. On élue l'activité d'interféron sous la forme de trois grands pics distincts qui varient quantitativement d'une préparation à l'autre. Les pics sont appelés alpha, bêta 10 et gamma d'après leur offre d'élution. La fraction alpha est éluée à une concentration de 68% de n-propa-nol, la fraction bêta à 66,5% de n-propanol, la fraction gamma à 65,5% de n-propanol. La récupération totale d'activité d'interféron est supérieure à 80%.

15 On rassemble séparément les fractions contenant chaque pic et on les purifie individuellement en plusieurs étapes. Comme le pic gamma est présent en grande abondance et semble être mieux résolu par rapport aux autres composants, on le choisit aux 20 fins de purification ultérieure. On rassemble les frac tions 54-56, comprenant le pic gamma de la colonne de diol, et on retire le 1-propanol par deux ectractions avec un volume égal d'hexane. On retire des traces d'hexane sous un courant d'azote. On ajoute 'de la pyri-25 dine et de l'acide formique à des concentrations finales de 1 M et 2 M, respectivement, et on introduit la solution dans une colonne de Lichrosorb RP-8 (10 micromètres; 4,6 x 250 mm) préalablement équilibrée avec de la pyridi-ne I M et de l'acide formique 2 M (pH- 4,c) . On élue la 30 colonne avec un gradient linéaire de 20-40% de 1-propanol dans le tampon Pyridine 1 M/formiate en 3 h à un débit de 0,2 ml/min. On recueille des fractions de 0,6 ml. Le principal pic d'activité coïncide avec un pic protéique. On combine les fractions 45 et 46 (32%, v/v, propanol) 35 comprenant ce pic et on les rechromatographie dans des h

13

10

conditions analogues. L'interféron est élué dans la fraction 31 "(32%, v/v, propanol). On calcule que l'ac-

g tivité spécifique de cette fraction est de h x 10

produit est utilisé aux fins de caractérisation ultérieure. Les profils de fluorescence des étapes à haute efficacité sont si remarquablement reproductibles qu'ils fournissent une empreinte continue de 1' ensemble du procédé.

Le tableau 1 résume les résultats de la purification. Le rapport global de purification depuis le milieu d'incubation jusqu'à la seconde colonne de RP-8 est de 60 000 à 80 000. Le rendement cumulé de l'étape 1 jusqu'à l'étape de diol va de 30 à 50%. Au-delà de cette étape, chacun des trois pics d'interféron est purifié séparément.

unités/mg par rapport à la sérumalbumine de boeuf. Ce

Tableau 1. Purification de l'interféron de leucocyte humain

Etape

Unités recueillies x 10"6

Protéine Activité recueillie spécifi-

, que

/ \ (unités/

(ms)

Degré de purification

Intervalle de récupération par étape (c/o)

1.

Milieu d'incubation

50

10 000

5x103

1

2.

,Surnageant à pH

k

50

2 ooo :

2,5x10^

5

100

3.

Précipité d'acide tique à 1 , 3°/>

trichloroacé-

40

1 000

4x10^

8

80-100

4,

Surnageant Triton ac étique

X-

■ 100/acide ko

250

1 ,6x105

32

70-100

5.

Précipité d'acide tique à h°/0

trichloroacé-

35

175

2x105

40

80-90

6.

Sephadex G-100

32

57

5,6x105

112

70-90

7.

Lichrosorb RP-8

(pH

7,5)

28

11 ;

2,5x106

500

80-100

8.

Lichrosorb diol Pic ck-

1 1

1,1

7

1x10

5000

Pic /3

1

2,5

ND

70-90

Pic f

12,5

0,21

6x 10^

12000

9.

Lichrosorb RP-8

(pH

4)

1,6

0,0064

3xio8

60000

k0-60

10.

Lichrosorb RP-8

(pH

M

8,2

0,021

4x108

80000

k0-60

15

Pour la détermination des protéines recueillies dans chaque fraction, on utilise la sérumalbumi-ne du boeuf comme référence. On trouve que l'activité spécifique absolue déterminée par analyse des acides

7

5 aminés du pic homogène de l'étape 10 est de 2-4 x 10

unités/mg (voir texte). L'étaoe 9 s'effectue sur le pic gamma de l'étape 8. L'étape 10 s'effectue sur une matière rassemblée à partir de. l'étape 9 de plusieurs préparations. ND = non déterminé.

10 E. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

On fait incuber des échantillons d'interféron ( 1 , 5 x 10~* unités) dans du NaDodSO^ et du 2-mercaptoéthanol et on les introduit dans un gel en biseau. Après électrophorèse, on obtient une seule bande 15 accusée après coloration au bleu de Coomassie. On estime que le poids moléculaire apparent est de 17 500 par comparaison avec des protéines de référence. On découpe alors le gel en tranches d'.1 mm. On homogénéise chaque tranche dans 0,4 ml de NaHCO^ 0,5 M/NaDodSO^ à 0,1% et 20 on examine l'activité d'interféron. On obtient un seul pic d'activité antivirale coïncidant avec la seule bande protéique. On n'observe aucun autre pic d'activité.

F. Analyse des acides aminés

On procède à l'analyse des acides aminés 25 d'un interféron de leucocyte humain homogène (pic gamma)

avec l'analyseur d'acides aminés à la fluoréscamine sur des échantillons de 0,5 à. 1 microgramme d'interféron natif et S-carboxyméthy.lé . Pour mesurer le rapport cystéine/ cystine, on carboxyméthyle l'interféron natif puis on l'hy-30 drolyse dans HC1 6 M dans dos conditions réductrices (acide thioglycolique à 0,1%). Dans ces conditions, la cystéine est mesurée sous forme de S-carboxyméthylcystéine a-lors que la cystime est mesurée sous forme de cystine libre. Les analyses des acides aminés sont résumées au Tableau 2.

35 On trouve que l'activité spécifique basée sur la teneur en

8

acides aminés est de 2-4 x 10 unités/mg.

16

Tableau 2

Composition en acides aminés de l'interféron de leucocyte humain

Acide aminé Résidus

5 Asx 15.2+1,2

Thr* 7,5+0,5

Ser* 8,0+0,5

Glx . 24,0+0,6

Pro 6,3+0,3

10 Gly 5,5+0,5

Ala 8,2+0,2

Cys (total) 3,3+0,7

1/2 cystine"1" 1,8+0,2

Cystéine+ 1,5+0,5

15 Val 7,8+0,2

Met 3,9+0,2

Ile . - 8,9+0,4

Leu 21,8+1,3

Tyr ■ 5,1+0,2

20 Phe 9,1+0,3

His 3,3+0,4

Lys 11,6+0,5

Arg 7,3+0,5

Trp++ . 0,7+0,1

25 * Corrigé au temps 0.

+ Mesuré après carboxyméthylation de l'interféron natif.

++ Mesuré après hydrolyse dans

HC1 6 M d'acide thioglycolique

30 Exemple 2

Interféron de leucocyte humain homogène provenant de leucocytes de malades leucémiques.

On produit l'interféron par incubation de leucocytes humains, isolés à partir du sang de

17

malades lGucemiquôs (leucemie myelogène chroniqus^ LMC) par leucophorèse, avec le virus de la maladie de Newcastle dans un milieu sans sérum contenant de la caséine. On obtient comme d'habitude des titres d'interféron de 5 000-40 000 unités/ml.

Le procédé de purification est le même que celui décrit pour l'interféron provenant de sang normal (exemple l) et comprend la précipitation sélective par l'acide acétique 0,5 M en présence de Triton x-100, la filtration sur gel sur Sephadex G- 100 dans l'urée 4 M, la CPLHE à pH 7»5 sur Lichrosorb RP-8, la HPLC sur Lichrosorb diol et la CPLHE sur Lichrosorb RP-8 à pH 4,0.

On rassemble séparément les fractions contenant les pics alpha, bêta et gamma de la colonne de Lichrosorb diol et on les purifie individuellement par des étapes ultérieures.

On rassemble les fractions 43-46 (pic alpha) et on retire le n-propanol par deux extractions avec un volume égal de n-hexane. On retire les traces d'hexane sous un courant d'azote. On ajoute de la pyri-dine et de l'acide formique jusqu'à une concentration finale de 1 M et 2 M respectivement, et on introduit la solution dans une colonne de Lichrosorb RP-8 (10 microns, 4,6. x 250 mm) préalablement équilibrée avec de la pyridi-ne 1 M/acide formique 2 M (pH 4,o). On élue la colonne avec un gradient linéaire de 20-40°/o (v/v) de n-propanol dans le tampon pyridine 1 M-formiate en 3 h à un débit de 0,2 ml/min. On recueille des fractions de 0,6 ml. L's.ctivité d'interféron est éluée sous forme de larges pics dans un intervalle de 31 à. 35% (v/v) de n-propanol . On combine ccs fractions et on les rechromatographie dans des conditions identiques. L'activité d'interféron est éluée en deux pics principaux (alpha^ et alpha^) à 31 et 32°/o (v/v) de n-propanol. Les composants secondaires sont élués à 34°/o (v/v) de n-propanol.

18

On rassemble les fractions 47-50 (pics bêta) de la colonne de Lichrosorb diol et on les traite et on les chromatographie sur Lichrosorb RP-8 comme il est dit pour le pic alpha ci-dessus. L'activité d'interféron est éluée en deux pics principaux: bêta^ à 32% (v/v) de n-propanol et bêta^ à 34% ( v/v) de n-propanol. La rechromatographie n'est pas nécessaire dans ce cas. Dans certaines préparations on observe un pic désigné bêta^ s'éluant à 31% (v/v) de n-propanol.

On rassemble les fractions 52-54 (pic gamma) de la colonne de Lichrosorb diol et on les traite et on les chromatographie sur Lichrosorb RP-8 comme il est dit pour le pic alpha ci-dessus, élue l'activité d'interféron en 5 grands pics, à savoir : gamma^ (à 31% de n-propanol, v/v), gamma^ (à 32% "de n-propanol, v/v), gamma^ (à 34% de n-propanol v/v), gamma^ (à 35% de n-propanôl, v/v) et gamma^ (à 35,5% de n-propanol, v/v). La rechromatographie n'e pas nécessaire dans ce cas.

Tableau 3» Purification de l'interféron de leucocytes de cellules CML

Ltape

•

Unités recueillies x 10"6

Protéines recueillies

(m g)

Activité

spécifique**

unités/mg)

Degré de purification

Récupéra tion q/

%

1.

Milieu d'incubation

800

20x1O3

4x10^

1

100

2.

Surnageant

à pH 4

800

" 4x103

2x105

5

100

3.

Précipité d acétique à

. 'acide 1 , 5c/o trichloro-

780

2x103

3,9x105

9,8

97

4.

Surnageant acide acéti

Triton que

X-100/

760

510

1 ,5x106

37,5

95

5.

Précipité d acétique à

. 'acide b°/0

trichloro-

810

350

2,3x106 5, 1x106

57,5

100

6.

Sephadex G-

100

660

130

128

82

7-

Lichrosorb

RP-8 (pH 7,5)

510

26

2x107

500

64

8.

Lichrosorb

Diol

Pi c

149

5

7

3x10'

750

Pic A Pic T

148 139

3

1,7

5xio7 8x107

1250 2000

Total

436

54

J7

Tableau 3 (suite

Etape

Uni tés recueillies x 1C ^

Protéines recueillies

(mg)

Activité Degré de Récupé-

spécifique** purifica- ration

/ ■ i. ' / \ tion (unites/mgj

9. Lichrosorb RP-8 (pH 4,0) Pic kK *

Pic^C 2*

2

Pic pic r

1

Pic y2 Pic r3 Pic piç_r5

Total

9

35x1o"3

O

2,6x10

6

500

26

65x1o"3

4,ox1o8

10

000

30

* 75x1o"3

4, 0x1.08

10

000

13

32x10~3

4,Ox1o8

10

000

15

58x1O-3

2,6x108

6

500

31

77x1O-3

4x108

10

000

26

74x1O-3

3,5x1o8

8

750

3,5

10x10~3

3,5x108

8

750

4,5

50x1o"3

Q .

0,9x10

2

250

O

20

* après rechromatographie

** activité déterminée sur des cellules MDBK (de boeuf); protéines mesurées avec le sérum-albumine de boeuf comme référence.

21

Les résultats de la purification pour produire chaque espèce d'interféron sont résumés au Tableau 3»

On peut en outre distinguer les espèces 5 alpha^ et bêta^ par leurs caractéristiques d'élution

. sur la colonne de Lichrosorb diol; alpha^ est éluée avec 6Sc/o (v/v) de n-propanol et bêta^ avec 66,5% (v/v) de n-propanol.

On l'ait incuber des échantillons de 10 l'espèce d'interféron (1,5 x 10 unités) dans du

NaDodSO^ et du 2-mercaptoéthanol puis on les introduit dans une gélose en biseau. Après électrophorèse les pics alpha ^ , alpha^, bêta^, gamma .j, gamma^ et garama^ donnent des bandes uniques tandis que les pics bêta^, 15 gamma^ et garnma^ donnent deux bandes. Les poids molé

culaires apparents sont tous dans un intervalle de 16 000 à 18 000 sauf bêta^ qui donne une bande à 16 500 et line à 21 000 et gamraa^ qui donne une bande à 21 000 (voir tableau 4).

20 L'analyse des acides aminés des frac tions d'interféron de leucocyte humain purifiés s'effectue avec l'analyseur d'acides aminés à la fluores-camine sur des échantillons de 0,5~1 microgramme d'interféron. L'hydrolyse s'effectue dans HC1 6 N dans des 25 conditions réductrices (0,1 °/o d'acide thioglycolique) .

Les résultats des analyses sont résumés au tableau 5«

Tableau 4

PM

+ 1000

Act.Spéc.sur MBBK (cellules de boauf, unités/mg)

± 25%

Açt. Spéc. sur AG- 1732 (cellules humaines, unités/mg)

+ 50%.

Activité d'inhibition de la croissance**

«S

(A2

& 2 fi 3*

r,

r2

r3*

T4

T5*

16 500 16 200

16 500 21 000

17 700. 17 700 17 200 21 000 16 500

2,6 x 10 4x10

4 X 10

4 x 10

2 6 x 10

4 x 10

3,5 X 10

3,5 x 10

0,9 x 10

2,6

x

0

00

+

3

x

0

00

+

2

X

co 0

+

3

X

108

+

2

X

0

00

+

1,5

X

0

! 00

+

1,5

X

10'

+

4

X

O

00

+

2

X

106

+

w w

* 2 bandes à 1 ' électropliorèse sur gel de polyacrylamide au NaDodSO^; PM de la principale bande donn

** Procédé de Stewart et al., Nature 262, 300 (1976)

i|

Tableau 5» Analyses des acides aminés d'interférons de leucocytes humains

Espèce ^ j

N 2

fi

' 2

fi3.

r,

r2

T3 *

n

TV

PM 16 500

r

16 200

16 500

21 000

17 700

17 200

21000

16 500

Résidus 142

139

142

181

153

148

180

142

Asx 13,8

11,7

11,5

18,2

13, 1

13,3

15,0

17,9

13,8'

Thr 7,7

8,3

9,0

9,9

8,4

9,6

8,6

7,3

7,6

Ser 9,2

10,0

14,5

10, 2

7,8

10, 1

13,5

9,0

Glx 20,3

20,5

... 21,9

28,5

23,9

25,0

22,8

27,0

20,8

Pro 6,1

4,9

5,0

5,9

4,5

4,8

6,5

4,2

Gly 5,1

4,5

5,0

3,6

5,7

5,0

3,2

4,8

4,0

Ala 8,4

8,3

7,9

11,5

8,7

8,1

9,3

10,4

9,3

Val 7,4

6,2

6,7

7,5

7,3

7,0

5,5

7,9

5, 1

Met 3,7

3,8

4,4

6, o

4,3

3,9

5,6

4,9

4,7

ILeu 7,4

7,0

7,4

9,5

7,9

8,0

6,8

9,7

6,6

Leu 18,0

18,0

18,9

24,4

20,3

20, 1

20,5

24, 1

19,6

Tyr 4,0

4,4

4,6

5,0

4,8

3,7

5,0

3,6

Phe 6,9

8,0

8,7

9,9

8,6

9,0

7,2

9, 1

6,4

His 3,0

2,8

3,0

3,8

3,7

3,3

2,9

3,8

2,8

Lys 10,5

9,0

8,5

9,3

10, 1

10,0

7,6

12,3

12,0

Arg 6,2

7, 1

8,0

10,8

8,0

8,5

10, 1

8,5

9,0

Cys 3,9

4,0

1,8

2,3

3,3

2,9

3, 1

4,1

2,3

ji ro

LO

Précision + 1,5 résidus

* Composition du mélange des deux bandes

24

On dissout les diverses espèces d1 in terféron de leucocyte humain purifié (300 pmol, 6 microgrammes) dans du bicarbonate de sodium aqueux (50 mM, pH 8,5, 50 microlitres). On ajoute de la 5 trypsine (0,1 microgramme dans 2 microlitres d'HCl,

PH 3) et on fait incuber le mélange pendant 14 h à 37°C. On ajoute de l'acide acétique (5 microlitres) et on introduit le mélange dans une colonne de Li-crosorb RPr-8 (taille particulaire 10 microns, 4,6 x 10 250 mm). On élue la colonne à 0,5 ml/min en utili sant un gradient linéaire d ' 1 h de 0 à 40°/o (v/v) de n-propanol dans un tampon acide formique 0,1 M/ pyridine 0,03 M (pH 3). On détecte les peptides par un système de détection à la fluorescamine. Les 15 résultats sont donnés au tableau 6 et exprimés en pourcentage de n-propanol et en taille relative des pics (s - petit, M = moyen, L = grand).

Tableau 6

Peptides tryptlques d'interférons de leucocyte humain 20 Espèce Positions d'élution (°/o de n-propanol)

c^1 3l,4L,4,2m,11,5m,12,5s,A4,5m,16s,18m,20s,

21s, 22,5s, 29m

3l, 4l, 4,2M, 11,5M, 12,5s, 14,5M, 16s, 18M, 27S, 29M

25 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16s,

17,5s, 18m, 29m

3l, 4l, 4,2m, 4,5s, 1om, 12,5s, 14s, 14,5m, 16s, 18l, 19,5m, 27m, 32m y1 3l, 4l, 4,2m, 4,5s, 5S, 6,5s, 11,5s, 12,5s,

30 14,5s, 16s, 17j 5M, 18M, 29m

3L, 4L, 4,2M, 4;5S, 5S, 11,5s, 12,5s, 14,5s

16s, 18l, 29m

2

fi

1 3

Ï2

y3 3m, 4m, 4,2m, 11,5m, 12,5s, 13,5s, 14,5m,

16s, 18L, 20S, 32m 35 3l, 4l, k,m, 4, 5m, 7s, 7,5s, 10s, 11,5l,

12,5s, 14s, 14,5m, 16S, 18L, 24,5s, 25,5s, 32s

On soumet l'espèce d'interféron de leucocyte humain purifiée à une analyse des sucres aminés capable d'identifier les sucres aminés au niveau de 50-100 prnoles. Dans tous les exemples, la glucosamine et la galactose/mannose aminé sont en dessous d'un résidu par molécule. Dans la plupart des cas un certain nombre de petits peptides qui s'éluent aux environs des sucres aminés gênent l'analyse. Il est donc possible que même les pics considérés comme ceux de sucre aminés soient au moins en partie de nature peptidique.

Enfin, un essai de détermination de la séquence de 1 nmol d'interféron gamma^ pur par un procédé manuel d'Edmen qui comprend une contre-hydroly-se et une analyse des acides aminés utilisant le fluo-rescamine ne donne pas d'acides aminés sur.les cycles 1 et 2. Le traitement de 100 pmol d'interféron de leucocyte humain gamma pur avec la leucine-aminopeptidase et 11aminopeptidase M pendant 20 h à 37°C n'affecte pas l'activité biologique et on ne détecte pas d'acides a-minés dans le milieu d'incubation. Lorsque l'on traite un surnageant d'un milieu d'induction (leucocyte et virus de la maladie de Newcastle dans un milieu essentiel minimum) avec les aminopeptidases, on n'observe aucune perte d'activité d'interféron. Ceci indique que la molécule d'interféron possède une extrémité NH^ bloquée même avant le procédé de purification. A titre de témoin, on fait incuber l'interféron brut ainsi que l'interféron pur et la chaîne bêta de l'insuline avec 1'amino peptidase M. Tandis que l'insuline est partiellement digérée comme le montre la libération d'acides aminés, on n'observe aucune perte d'activité d'interféron.

Exemple 3

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1 on prépare des leucocytes de boeuf rassemblés, on les -induit à produire de l'interféron de boeuf et on purifie l'inter éron de boeuf obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes. U

26

Exemple k

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1, on prépare des leucocytes de porc rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de porc et on purifie l'interféron de porc obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes .

Exemple 5

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1, on prépare des leucocytes de mouton rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de mouton et on purifie l'interféron de mouton obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes.

Exemple 6

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1 , on prépare des leucocytes de cheval rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de cheval et on purifie l'interféron de cheval obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes.

Exemple 7

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1 , on prépare des leucocytes de chien rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de chien et on purifie l'interféron de chien obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes.

Exemple 8

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1 , on prépare des leucocytes de chat rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de chat et on purifie l'interféron de chat obtenu jusqu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes.

27

Exemple 9

Par analogie avec les procédés de l'exemple 1 , on prépare des leucocytes de primate rassemblés, on les induit à produire de l'interféron de pri-5 mate et on purifie l'interféron de primate obtenu jus qu'à homogénéité sous la forme d'espèces distinctes de protéines homogènes.

Exemple 10

a) On dissout au total 3 d'interféron de 10 leucocyte humain homogène ayant une activité spécifi-

g que de 2 x 10 unités/mg dans 25 ml de sérum-albumine humaine normale à 5On fait passer la solution à travers un filtre bactériologique et on répartit asep-tiquement la solution filtrée dans 100 flacons. Cha-15 que flacon contient 6 x 10^ unités de l'interféron pur convenant à l'administration parentérale. Il est préférable que les flacons soient gardés à basse température (-20°C) avant l'emploi.

b) On fait passer à travers un filtre bac-20 tériologique une solution aqueuse contenant 1,5 mg d'espèces d'interféron homogènes rassemblées cC oC ^2'

et 2' chacune étant présente proportionnellement à son abondance naturelle approximative, le mélange g

rassemblé ayant une activité spécifique d'environ 2 x 10 25 unités/mg, et 100 mg de sérum-albumine normale, et on répartir la solution filtrée de façon aseptique entre g

100 flacons. Chaque flacon contient environ 3 x 10 unités des interférons rassemblés purs et 1 mg de sérum-albumine humaine. Il est préférable que les flacons con-30 tenant l'interféron convenant pour l'administration parentérale soient gardés à basse température (-20°c) avant 1'emploi.

28

Claims

REVENDICATIONS

l) Procédé de purification de protéines ayant des poids moléculaires supérieures à 12 000 environ qui implique de faire passer une solution aqueuse 5 de ladite protéine à l'état impur à travers une cofonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice poreuse à laquelle sont reliés des groupes cyanopropyle, cyclo-hexyle, phényle, octyle, octadécyle ou glycéryle dans des conditions de chromatographie en phase liquide à 10 haute efficacité (HPLC) de manière à adsorber ladite protéine sur ladite colonne puis à éluer ladite protéine avec un gradient croissant ou décroissant d'un solvant aqueux miscible à l'eau et à obtenir ladite protéine dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pu-15 reté amélioré.
2) __ Procédé de purification de protéines ayant des poids moléculaires supérieurs à environ 12 000, qui implique de faire passer une solution aqueuse de ladite protéine dans un état impur à travers une colonne,

20 équilibrée par un tampon, de matrice de silice poreuse à laquelle sont reliés des groupes octyle ou glycéryle dans des conditions de HPLC de manière à adsorber ladite protéine sur ladite colonne puis d'éluer ^Ladite protéine à partir de ladite colonne avec un gradient 25 croissant ou décroissant d'un solvant aqueux miscible

à l'eau et d'obtenir ladite protéine dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pureté amélioré.
3) Procédé de production d'interféron sous forme de protéine homogène qui comprend la combinaison

30 des étapes suivantes :

A) Faire passer une solution aqueuse d'interféron à l'état impur à travers une colonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice liée à des groupes octyle dans des conditions de chromatographie en phase liquide à

haute efficacité de manière à adsorber ledit interféron sur ladite colonne puis à éluer ledit interféron à partir de ladite colonne avec un gradient croissant d'un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et obtenir ledit interféron dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pureté améliorée;

B) Faire passer les fractions d'interféron choisies obtenues dans l'étape A à travers une colonne, équilibrée par un tampon, de matrice de silice liée à des groupes glycéryle pour adsorber ledit interféron sur ladite colonne puis éluer ledit interféron à partir de ladite colonne avec un gradient décroissant d'un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et obtenir l'interféron sous la forme de grands pics distincts dans des fractions choisies dudit éluat dans un état de pureté améliorée;

C) faire passer les fractions choisies d'interféron correspondant à l'un desdits grands pics distincts obtenus dans l'étape B dans une solution tamponnée à travers une colonne, équilibrée avec un tampon, de matrice de silice liée à des groupes octyle dans des conditions de HPLC, de manière à adsorber ledit interféron sur ladite colonne puis à éluer ledit interféron à partir de ladite colonne avec un solvant aqueux tamponné miscible à l'eau et à obtenir l'interféron sous la forme d'un seul pic distinct dans des fractions choisies dudit éluat dans l'état d'une protéine homogène et, si on le désire, répéter le procédé de l'étape C pour obtenir l'homogénéité finale.
4) Procédé de la revendication 3 où ledit interféron est un interféron humain.
5) Procédé de la revendication k où ledit interféron humain est un interféron de leucocyte humain.

30
6) procédé de la revendication 5 où ledit solvant miscible à l'eau est choisi parmi les alcanols ou les éthers cycliques.
7) Procédé de la revendication 6 où ledit solvant miscible à l'eau est le n-propanol, ledit^tam-pon de l'étape A donne un pH d'environ 7j5j et ledit tampon de l'étape C fournit un pH d'environ 4,0
8) Procédé de la revendication 7 où ledit tampon de l'étape A est de l'acétate de sodium 1 M/acide acétique et où l'on augmente ledit gradient de n-propanol de O à environ hO°/o (v/v), ledit tampon de l'étape B est de l'acétate de sodium 0,1 M et ledit gradient de n-propanol baisse d'environ 72,5 à environ 50% (v/v), ledit tampon de l'étape C est de la pyridine 1 M/acide formique 2 M et ledit gradient de n-propanol augmente d'environ 20 à environ ko°/o (v/v).
9) Procédé de la revendication 8 où l'on rassemble les fractions à pic choisies de l'étape B, on retire le n-propanol par extraction avec du n-hexane et on enlève les traces de n-hexane de la phase aqueuse avant de procéder à l'étape C.
10) Procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5 à 9 où l'on isole l'interféron alpha^.
11) Procédé tel que revendiqué dans l'une quel conque des revendications 5 à 9 où l'on isole'1'interfé-ron alpha^.
12) Procédé tel que revendiqué dans l'une quel conque des revendications 5 à. 9 où l'on isole l'interféron bêta^.
13) Procédé tel que revendiqué dans l'une queâ conque des revendications 5^9 où l'on isole l'interféron bêta^.
14) Procédé tel que revendiqué dans l'une quel conque des revendications 3 à 9 où l'on isole l'interféron gamma t

31
15) Procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5 à 9 où l'on isole l'interféron gamma^.
16) Procédé tel que revendiqué dans l'une 5 quelconque des revendications 5 à 9 où 1 ' on isole=~l ' interf éron gamma^.
17) Procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5 à 9 où l'on isole l'interféron gamma^.
10 18) Procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 5^9 où l'on isole l'interféron gamma j..
19) Procédé de préparation de préparations pharmaceutiques qui implique de mélanger un interféron

15 homogène tel que décrit ci-dessus comme ingrédient ac tif avec des supports solides ou liquides non toxiques, inertes, thérapeutiquement compatibles communément utilisés dans de telles préparations„
20) Préparation pharmaceutique contenant un 20 interféron homogène tel que décrit ci-dessus associé avec un support solide ou liquide non toxique, inerte, thérapeutiquement compatible.
21) Interféron homogène lorsqu'il est préparé par le procédé revendiqué dans l'une quelconque des

25 revendications 3 à 9 comprise ou par un équivalent chi mique évident de ce procédé.
22) L'invention telle que décrite ci-dessus.

ORIGINAL ^

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