CH657140A5 - (amido)n-substituierte bleomycine, deren salze und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue (Amido) N-substituierte Bleomycine, deren Salze und auf ein Verfahren zu deren Herstellung.

Bleomycin ist eine Familie von karzinostatischen antibiotischen Substanzen, die 1966 durch Umezawa, einem der

Erfinder dieser Anmeldung und Mitarbeiter (Journal of Anti-biotics, 19A. S. 200, 1966) entdeckt worden ist. Es wird durch Streptomvces verticillus, einem Actinomvzet, erzeugt und ist ein basisches, wasserlösliches Glycopeptid, das fähig ist, auf 5 leichte Weise ein Atom von bivalentem Kupfer zu chelieren. In gewöhnlichen Kulturen werden 16 Mitglieder der Bleomy-cin-Familie erzeugt und jedes isoliert (s. beispielsweise Umezawa et al., Journal of Antibiotics, 19A, S. 210, 1966). Von diesen Bleomvcinen werden A,. A:, A5, B; und Dimethyl-A; io weitgehend in Form einer kupferfreien Mischung (im nachfolgenden als Bleomvcin-Komplex bezeichnet) im klinischen Bereich der Krebstherapie benutzt. Insbesondere werden sie für die Behandlung von schuppenförmigen Zellkarzinomen als Hauptziel benutzt und für Hautkrebs, Kopf- und Hals-krebs, Lungenkrebs und Pseudoleukämie. Verschiedene Bleomycine wurden auch in US-PS 3 922 262 und in US-PS Re 30 451 beschrieben.

Die Bleomycine werden im allgemeinen in kupferhaltiger Form durch gewöhnliche Fermentation gewonnen. Die kup-2o ferfreie Form wird durch Entfernen des Kupfers von der kup-ferhaltigen Form gewonnen. Der Ausdruck «Bleomycin», wie er im folgenden verwendet wird, schliesst sowohl die kupferenthaltende als auch die kupferfreie Form ein, soweit nichts Besonderes erwähnt wird.

25 Die Bleomycine werden durch die allgemeine Formel (II) dargestellt.

conh,

I 2 ch- nh xch ch-

-X--

n ,n nh2

,ch

\

'conh-

h2n

■mV

CH3 Â A

u nu m \

,hoch2

h

\

c

1

oh ch* h o I J I Î hd ce n c \ / \ / \ S \

0 chi xc ch nh ii i h i i q ch ch-, / \ \2

^CH- v o-"

ch

K

h ch ìh h q \ n h h ch-, ho

(ii)

,0

i I

h

\

Q-h

\

ch20h c

1

ho

/

0 nh oh

C

i h

worin R ein End-Amin-Rest von Bleomycin und das chelierte Kupfer im Falle der kupferenthaltenden Form entfällt.

Es wurde jedoch gefunden, dass die Bleomycine durch die Einwirkung eines Bleomycin-Inaktivierungsenzyms (im folgenden als Inaktivierungsenzym bezeichnet; Umezawa et al., Journal of Antibiotics, Band 27, S. 419, 1974) inaktiviert werden. Es wurde ferner gefunden, dass die Bleomycine relativ-weniger in der Haut und in der Lunge inaktiviert wurden.

wenn sie eine hohe Aktivität aufweisen, während sie im Magen leicht inaktiviert wurden, wo gedacht wurde, dass sie keine Aktivität aufweisen, und dass ein solches Inaktivations-phänomen weniger ausgeprägt ist im Schuppenzellenkarzinom in Mäusen als im Sarkom in der Maus, die beide durch 20-MethylchoIanthren induziert wurden (Umezawa et al., Journal of Antibiotics, Band 25, S. 409, 1972; Band 27, Seite 419, 1974). Es wurde ferner gefunden, dass die Bleomycin-

Inaktivierungsaktion durch den Schuppenzellenkarzinom beim menschlichen Kopf und Hals gezeigt wird, insbesondere bei denjenigen des niedrig-differenzierten Typs, gegen welche die Bleomycine als nicht so effektiv eingestuft wurden (Muel-ler et al., Cancer, Band 40, S. 2787, 1977).

Wie aus obigem hervorgeht, sind die Bleomycine nicht fähig, eine genügende Aktivität gegen Karzinome zu entwik-keln, die ein Bleomycin-Inaktivierungsenzym mit hoher Aktivität enthalten. Dies ist einer der Gründe für die weitere Verbesserung der Bleomycine. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung überlegten, dass, falls es möglich wäre, einen Bleomycinabkömmling zu entdecken, der nur schwer einer enzymatischen Inaktivierung unterworfen wird, es möglich wäre, effektvoller, beispielsweise Kopf- und Halskrebs, Speiseröhrenkrebs, Lungenkrebs und Schuppenzellenkarzinome in anderen Bereichen zu behandeln und solche Drüsenkrebse wie Magenkrebs, die nicht auf die Behandlung mit herkömmlichen Bleomycine ansprechen. Von diesem Standpunkt aus unternahmen die Erfinder umfangreiche Untersuchungen und fanden als Ergebnis, dass die Bleomycine in einem geringeren Grad inaktiviert wurden, falls ein Substituent (-X) zum Stickstoffatom in der Amid-Verbindung der partiellen Struktur 2,3 Diaminopropanamid

C-nh-ch2-ch-conh2)

von Bleomycin eingeführt wird. Die vorliegende Erfindung ist auf dieser Erkenntnis aufgebaut.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Bleomycine anzugeben, die schwer durch Inaktivierungsenzyme inaktiviert werden und ein Verfahren zur Herstellung derselben anzugeben. Dieses Ziel wird durch das in den Patentansprüchen angegebene Produkt und Verfahren erreicht.

Der Anteil des Bleomycin-Skeletts, dargestellt durch BM, ist der Anteil des Bleomycin-Moleküls, der in den gestrichelten Linien der allgemeinen Formel (II) von Bleomycin eingeschlossen ist und beinhaltet sowohl die kupferenthaltende als auch die kupferfreie Form, soweit es nicht anders bezeichnet wird. Die niederen Alkyle sind Alkyle mit 1 bis 6 Kohlenstoffatome wie Methyl, Äthyl, N-Propyl, Isopropyl, N-Butyl, Isobutyl, N-Penthyl, 3-Methylbutyl, 3-Methylpentyl und N-Hexyl.

Beispiele der individuellen Gruppen, dargestellt durch X in der allgemeinen Formel (I) sind die folgenden:

(A) Alkyle mit 1 bis 18 Kohlenstoffatome: Methyl, Äthyl, N-Propyl, Isopropyl, N-Butyl, Isobutyl, Tertbutyl, N-Pentyl,

3-Methylbutyl, Neopentyl, N-Heptyl, 3-Methylpentyl, N-Hexyl, 1,5-Dimethylhexyl, Isohexyl, N-Octyl, N-Decyl, Lau-ryl, Myristyl, Cetyl und Stearyl.

(B) Aminoalkyle mit 2 bis 12 Kohlenstoffatome: 2-Amino-äthyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 6-Aminohexyl, 12-Ami-nododecyl und 4-Ämino-4-Methyl-l-Dimethylpentyl.

(C) Niedere Alkyle, die als Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatome, (b) 1 oder 2 Phenyl-Gruppen, (c) eine Indolyl-Gruppe oder (d) eine 5- oder ógliedrige heterocyclische Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom, wobei unter den Substituenten-Gruppen die Phenyl-oder Indolyl-Gruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine niedere Alkoxy-Gruppe substituiert sein kann: 2,2,2-Trifluo-roäthyl, 2,2,2-Trichloroäthyl, 2,2-Difluoroäthyl, 2,2-Dichloro-äthyl, Benzyl, Diphenylmethyl, 2-Phenyläthyl, 2,2-Diphenyl-äthyl, 1-Phenyläthyl, 1,2-Diphenyläthyl, 3-Phenylpropyl, 2-Phenylisopropyl, 1,3-Diphenylpropyl, 3,3-Diphenylpropyl,

4-Phenylbutyl, 4,4-Diphenylbutyl, Chlorobenzyl, Dichloro-benzyl, Bromobenzyl, Methoxybenzyl, Dimethoxybenzyl, Äthoxybenzyl, Methylendioxybenzyl, Propoxybenzyl, P-

657 140

Chlorophenyläthyl, P-Methoxyphenyläthyl, P-Benzyloxyben-zyl, Furylmethyl, 2-Furyläthyl, 2-Thiazolylmethyl, 2-Pyrazo-lylmethyl, 2-lmidazolylmethyl, 4-Imidazolylmethyl, 2-Thie-nylmethyl, 2-Pyridylmethyl, 3-Pyridylmethyl, 4-Pyridylme-thyl, 3-Indolylmethyl, 2-(3-Indolyl)äthyl, 4-Methoxy-3-Indo-lylmethyl, 2-Pyrimidylmethyl, 2-Pyrimidyläthyl, 4-Pyrimidyl-methyl, 4-PyrimidyläthyI, 2-Piperidylmethyl, 3-Piperidylme-thyl, 4-Piperidylmethyl, 2-(2-Piperidyl)äthyl, 2-(3-Piperidyl) äthyl, 2-(4-Piperidyl)äthyl, l-(2-Piperidyl)äthyl, 1 -(3-Piperi-dyl)äthyl, l-(4-Piperidyl)-äthyl, 2-(Piperidino)äthyl, 2-Pipera-zylmethyl, 2-(2-Piperazyläthyl), 2-(Piperidino)äthyl, 3-Piperi-dinopropyl, 2-(Morpholino)äthyl, 3-(Morpholino)propyl, 2-Morpholinylmethyl, 3-Morpholinylmethyl, 2-(Morpholinyl) äthyl und 3-(Morpholinyl)propyl.

(D) Xr(niedere)Alkyle, worin X,

-N-X2 oder ist: Dimethylaminoäthyl, Diäthylaminoäthyl, Dipropylami-noäthyl, Propylaminoäthyl, Dimethylaminopropyl, Diäthyl-aminopropyl, Dipropylaminopropyl, Propylaminopropyl, Dibutylaminopropyl, Butylaminopropyl, Benzylaminopropyl,

2-Phenyläthylaminopropyl, 1 -Phenyläthylaminopropyl,

3-Phenylpropylaminopropyl, 4-Phenylbutylaminopropyl, Methylaminoäthylaminopropyl, Äthylaminopropylaminopro-pyl, Propylaminopropylaminopropyl, Butylaminopropylami-nopropyl, N-(butylaminopropyl)-N-Methylaminopropyl, Dibutylaminopropylaminopropyl, Penthylaminopropylami-nopropyl, Äthylaminobutylaminopropyl, Propylaminobutyl-aminopropyl, Äthylaminopropylaminobutyl, Butylaminopro-pylaminobutyl, Benzylaminoäthylaminoäthyl, Benzylamino-äthylaminopropyl, Benzylaminopropylaminopropyl, Benzyl-aminobutylaminopropyl, Phenyläthylaminopropylaminopro-pyl, N-(Phenyläthylaminopropyl)-N-Methylaminopropyl, N-(Chlorobenzylaminopropyl)-N-Methylpropyl, N-(Bromo-benzylaminopropyl)-N-Methylpropyl, N-(Chlorophenyläthy-laminopropyl)-N-Methylpropyl, Benzylaminopropyl-N,N-Dimethylaminopropyl, Dibenzylaminopropyl-N,N-Diäthyla-minopropyl und Dibenzylaminopropyl-N-Methyl-N-Benzyla-minopropyl.

(E) Naphthyle: a-naphthyl und ß-naphthyl.

(F) Thiazolyle: 2-Thiazolyl, 3-Thiazolyl und 4-Thiazolyl.

(G) N-Phenyl(niedere)alkylpiperidyle: N-Benzyl-4-Piperi-dyl, N-Phenyläthyl-4-Piperidyl, N-Benzyl-3-Piperidyl und N-Benzyl-2-Piperidyl.

Der End-Amino-Rest der Bleomycine, dargestellt durch R kann irgendeine der substituierten oder unsubstituierten aliphatischen Amino-Gruppen sein, doch ist es gewöhnlicherweise eine aliphatische primäre Amino-Gruppe basischer Natur, dargestellt durch die allgemeine Formel (III)

R2-R,-NH- (III)

worin R, (1) eine Kette von Alkylen-Gruppen, die ein Stickstoffatom zwischen Alkylen-Gruppen in der Kette haben kann [Beispiele von einer solchen Gruppe sind solche dargestellt durch die Formeln -R12-Yi-Ri3- und -Ri2-Yi-R13-Y2-Ri4-, worin R12, R ,3 und R14 Alkylen-Grup-pen und Y, und Y2 je eine Gruppe der Formel r 1

~N~ oder j© r.

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

657 140

sind (worin R3 und R4 Wasserstoffatome oder niedere Alkyle, welche Substituenten haben können, sind)], (2)

-N N-

oder (3) Phenyl en sind; und R2 eine der Gruppen basischer Natur ist [Beispiele solch einer Gruppe sind solche, dargestellt durch die Formeln l6

-S-R,

5'

r

-n-r,

8

f2

-N-R-, -NH-C=NH,

©I 6

r5

-o

-N O

-N^JI-R^

h n-

"0 ' "O ' °c jö<

worin R4 die obige Bedeutung hat, R5, Ré und R9 je ein niederes Alkyl sind, die ein Substituent haben können; und R7 und Rs je ein Wasserstoffatom oder ein Alkyl mit 1 bis 10 Wasserstoffatome, die ein Substituent haben können, darstellen]. Das Alkylen der obigen Amino-Gruppe ist dasjenige mit 1 bis 8 Kohlenstoffatome, wie beispielsweise -CH2-, -(CH2)2-,

CH.

CH.

Cyclooctylaminopropylamino, 3-[N-Methyl-N-(3-Cyclooctylmethylaminopropyl)amino]propylamino, 3-Cyclodecanylmethylaminopropylamino, 3-{N-Methyl-N-[3-(p-Chlorophenyläthylamino)propyl]amino}-Propylamino, 3-5 {N-Methyl-N-[3-(m,p-Dibenzyloxybenzyl)aminopropyl] aminofpropylamino, 3-}N-Methyl-N-[3-(p-Cyanobenzylamino)propyl]amino}propylamino, 3-{N-Methyl-N-[3-(Cycloundecanylmethylamino)propyl]aminol-propylamino, 3-{N-Methyl-N-[bis(m,p-Dibenzyloxybenzyl) io aminopropyI]amino}propyIamino, 3-{N,N-DimethyI-N-[3-(Dibenzylamino)propyI]amino}propylamino, 3-{N,N-Diäthyl-N-[3-(DibenzylaminopropyI)]amino}propylamino, 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(N,N-Dimethyl-N-(3-Dibenzylaminopropyl) amino)-propyl]amino}propylamino, 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-15 (N,N-DimethyI-N-(3-Cyclooctylmethylaminopropyl)amino) propyl]amino}propylamino, 3-[4-(3-Dibenzylaminopropyl) piperidyl]propylamino und 3-{4-[3-(Cyclooctylmethylamino) propyl]piperidyl}propylamino.

Als wünschenswerte Verbindungen können solche 20 benannt werden, in welchen R 3-[(S)-l'-Phenyläthyl]amino-propylamino oder 3'-(n-Butylaminopropyl)aminopropyl-amino ist und solche mit einem Amin-Rest, dargestellt durch die Formel (IV)

I

-CH-, -(CH2)3-, -CH2-CH-,

-(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6- und -(CH2)8-, obwohl die Alky-lene mit 2 bis 4 Kohlenstoffatome am meisten verwendet werden. Die Substituenten an den obigen Alkyl-Gruppen schlies-sen ein: Hydroxyl, Alkoxy (beispielsweise Methoxy, Äthoxy, Propoxy und Butoxy), Phenyl, [das 1 oder mehrere Substituenten ausgewählt aus Halogene, Cyano, niedere Alkyle, Ben-zyloxy und substituierte Benzyloxy-Gruppen (z.B. Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Substituierte)] und Cycloalkyle mit 5 bis 13 Kohlenstoffatome.

Beispiele der obigen Amino-Gruppen sind 2-Aminoäthyi-amino, 3-Aminopropylamino, 2-Dimethylaminoäthylamino,

2-Diäthylaminoäthylamino, 3-DimethylaminopropyIamino,

3-Diäthylaminopropylamino, 3-(3-Butylaminopropylamino) propylamino, 3-(2-Oxypropylamino)propylamino, 3-Piperidinopropylamino, 3-(l-PhenyIäthylamino)

propylamino, 2-Aminopropylamino, 3-Methylaminopropylamino, 3-Butylaminopropylamino, 3-(6-Aminohexylamino)propylamino, 3-Trimethylaminopropylamino, 3-(3-Dimethylaminopropylamino)propylamino, 3-(3-Aminopropylamino)propylamino, 3-[N-Methyl-N-(3-Aminopropyl)aminojpropylamino, 3-Pyrrolidinylpropylamino, 3-Piperidinylpropylamino, 3-Morpholinopropylamino, 3-Piperazinylpropylamino, 3-[4-(3-Aminopropylpiperazinyl)]propylamino, 3-(3-Pyrrolidinylpropylamino)propylamino, 3-(3-Piperidinylpropylamino)propylamino, 3-(3-Morpholinylpropylamino)propyIamino, 3-(3-Oxypropylamino)propylamino, 3-(3-Methoxypropylamino) propylamino, 3-Benzylaminopropylamino, m-Aminomethylbenzylamino, p-Aminomethylbenzylamino, 2-Cyclopentylaminoäthylamino, 3-Cyclohexylaminopropylamino, 4-Cyclohexylaminobutylamino,

Cycloheptylaminopropylamino, 3-

25

30

-NH-(CH2)3-A-(CH2)3-B,

fio fio

(IV)

worin A-N-, -N -,-N N-

R11

fio

1

rio1

oder -N (CH- ) ,-N S-I ^ -3 I

X11

11'

(worin R|0, Rio', Rn und Rn', welche gleich oder verschieden 40 sein können, jede ein niederes Alkyl, Benzyl oder ein Halo-gen-substituiertes Benzyl sein können) und B

45

I13

-N-R.

12

ist [worin R|2 (1) ein Phenyl(niederes)alkyl, (2) ein Phenyl(nie-deres)alkyl, das auf dem Phenylkern ein oder mehrere Substituenten aufweist, ausgewählt aus (a) Halogene, (b) niedere 5n Alkyle, (c) niedere Alkoxy-Gruppen, (d) Cyano, (e) Trifluoro-methyl, (f) Benzyloxy, die auf dem Phenylkern solche Substituenten wie Halogene, Alkoxy und Phenoxy aufweisen können, (g) Di(nieder)alkylamino-Gruppen und (h) Phenyl, (3) Cyclohexyl, (4) Triphenylmethyl, (5) Naphthylmethyl, (6) 55 Furylmethyl, (7) Thiophenmethyl, (8) ein niederes Alkyl substituiert durch ein Cycloalkyl mit 5 bis 13 Kohlenstoffatome oder (9) Norbornen-2-MethyI; und R|3 ist (1) Wasserstoff, (2) Benzyl oder (3) Benzyl mit auf dem Phenylkern ein oder mehrere Halogene oder Benzyloxy-Gruppen als Substituenten]. Diese Verbindungen sind wünschenswert wegen ihrer relativ-niedrigen Lungen-Toxizität. In den obigen Formeln schlies-sen die niederen Alkyle ein Methyl, Äthyl und Butyl; Phe-nyl(niedere)alkyle schliessen ein Benzyl, 2-Phenyläthyl, l-Phenyläthyl, 3-Phenylpropyl, 2,2-Diphenyläthyl und Diben-zylmethyl; Phenyi(niedere)alkyle mit Substituenten auf dem Phenylkern schliessen ein 2-p-Chlorophenyläthyl, p-Chloro-benzyl, o-Chlorobenzyl, m-Chlorobenzyl, l-(p-Chlorophenyl) äthyl, o,p-Dichlorobenzyl, m,p-Dichlorobenzyl, p-Bromo-

60

657 140

benzyl, p-Fluorobenzyl, Pentafluorobenzyl, m-Trifluorome-thylbenzyl, p-Methylbenzyl, p-Diäthvlaminobenzyl. p-Methoxybenzyl, o,p-DimethoxybenzyI, m,p-Dibenzyloxyben-zyl, p-Cyanobenzyl und p-Phenylbenzyl; und niedere Alkyle substituiert bei einem Cvcloalkvl mit 5 bis 11 Kohlenstoffatome schliessen ein Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl, Cycloheptylmethyl, Cyclooctylmethyl, Cycloundecanylme-thyl und 2-Cyclohexyläthyl.

Besonders wünschenswerte Verbindungen sind solche, die durch die allgemeine Formel (1) dargestellt sind, in welcher R 1 -Phenyläthylaminopropylamino, Butylaminopropylamino oder eine Amino-Gruppe ist, dargestellt durch die allgemeine Formel (Vj

-NH-(CH2)3-AI-(CH:)3-B, (V)

R.

10

R.

10

worin -n- oder ist,

10

*11

ist (worin R|0' und Rn'je ein niederes Alkyl oder Benzyl ist) und B|

f13'

-N-R12'

ist [worin R,2' ist (1 ) ein Phenyl(niederes)alkyl, das auf dem Phenylkern einen oder zwei Substituenten aufweisen kann, einschliessend (a) Halogene, (b) Cyano und (c) eine Benzyl-oxy-Gruppe oder (2) ein niederes Alkyl substituiert durch ein

25

Cvcloalkvl mit 5 bis 13 Kohlenstoffatome: und R,,' Wasserstoff oder Benzyl ist, das eine oder zwei Benzyloxy-Gruppen als Substituenten aufweisen kann].

Die Kombinationen von X und R, die eine besonders niedrige Lungen-Toxizität aufweisen, sind die folgenden:

(Amido)N-substituierte Bleomycine, in welchen X ist Isopropyl, (S)-l-Phenyläthyl, Diäthylamino-l-Methylbutyl, Dibutylaminopropyl oder n-Butylaminopropylaminopropyl-amino und R ist 1-Phenyläthylamino oder N-(niederes)Alkyl-N-(Halobenzylaminopropyl)aminopropylamino; Salze davon; (Amido)N-substituierte Bleomycine, in welchen X ist ein Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatome, 1,5-Dimethylhexyl, Benzyl, 1-Phenyläthylaminopropyl, Di-n-Butylaminopropyl, n-Butylaminopropylaminopropyl, N-Methyl-N-Benzyl-N-(Dibenzylaminopropyl)aminopropyl oder N-Methyl-N-(Halophenyläthylaminopropyl)aminopropyl und R ist N-Methyl-N-(Halophenyläthylaminopropyl)aminopropylamino, N-Methyl-N-Benzyl-N-(Dibenzylaminopropyl)aminopropyl-amino, N-Methyl-N-[bis(m,p-Dibenzyloxybenzyl)aminopro-pyl]aminopropylamino, N-Methyl-N-Methyl-N-(Dibenzyl-aminopropyl)aminopropylamino, N-Äthyl-N-Äthyl-N-(Dibenzylaminopropyl)aminopropylamino, N-Methyl-N-(Cyclooctylmethylaminopropyl)aminopropylamino oder N-Methyl-N-(Cyanobenzylaminopropyl)aminopropylamino; und Salze davon.

Als Beispiele von Verbindungen dieser Erfindung, können die von Tabelle 1 erwähnt werden. In Tabelle 1 steht «BLM» im Namen der Verbindung für «Bleomycin» und die Verbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist bezeichnet als «Name von R (Amino-Rest)-(Amido)N-[Name von X]-BLM».

Tabelle 1

Verbindung Nr.

Name der Verbindung

Abkürzung

1

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 ->1

23

24

25

26

27

28

29

2-(4'-lmidazolyl)äthylamino-(amido)N-[methyl]-BLM dH-MMA

2-(4'-Imidazolyl)äthylamino-(amido)N-[äthyl]-BLM dH-MEA

2-(4'-Imidazolyl)äthylamino-(amido)N-[isopropyl]-BLM dH-IPA

2-(4'-Imidazolyl)äthylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM dH-BA

2-(4'-Imidazolyl)äthy!amino-(amido)N-[3-((S)-l'-phenyläthyl)-aminopropyl]-BLM dH-PEP

2-(4'-Imidazolyl)äthylamino-(amido)N-[2-aminoäthyl]-BLM dH-EDA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[isopropyl]-BLM dB2-IPA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[r,6'-dimethylheptyl]-BLM dB2-DHA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[2',2',2'-trifluoroäthyl]-BLM dB2-TFEA 4-Guanidinobuty!amino-(amido)N-[octyl]-BLM dB2-OCT 4-GuanidinobutyIamino-( amido )N-[3-((S)-l'-phenyläthyl )aminopropyl]-BLM dB2-PEP 4-Guanidinobutylamino-( amido )N-[3-(di-n-butylamino)propyI]-BLM dB2-BPA 4-Guanidinobutylamino-( amido )N'-[lauryl]-BLM dB2-LAA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM dB2-BA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[diphenylmethyl]-BLM dB2-ADPM 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[l',2'-diphenyläthyl]-BLM dB2-DPE 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[ß-naphtyl]-BLM dB2-NA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[2-furylmethyl]-BLM dB2-FFA 4-Guanidinobutylamino-(amido)N-[3-pyridylmethyl]-BLM dB2-AMPY 4-Guanidinobutyiamino-(amido)N-[2-thiazolylmethyl]-BLM dB2-AT2

3-((S)-r-phenyläthyl)aminopropylamino-(amido)N-[isopropyl]-BLM dPEP-IPA 3-((S)-r-phenyläthyl)aminopropylamino-(amido)N-[3-

((S)-l'-phenylethyl)aminopropyl]-BLM dPEP-PEP

3-((S)-l'-phenyläthyl)aminopropylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM dPEP-BA

3-((S)-r-phenyläthyDaminopropvlamino-(amido)N-[p-chlorobenzyl]-BLM dPEP-CBA

3-(( S )-l'-phenyläthyl amino )propylamino-(amido)N-[stearyl]-BLM dPEP-STE

3-((S)-l'-phenyläthylamino)propylamino-(amido)N-[lauryl]-BLM dPEP-LAA

3-((S)-r-phenyläthylamino)propylamino-(amido)N-[octylj-BLM dPEP-OCT

3-((S)-l'-phenyläthylamino)propylamino-(amido)N[5-methoxyindol-3-yläthyl]-BLM dPEP-MTA

3-((S)-r-phenyläthyiamino)propyJamino-(amido)N[12-aminododecanyl]-BLM dPEP-DAD

657 140

8

Verbindung Nr.

Name der Verbindung

Abkürzung

30

3-((S )-1 '-phenyläthylamino )propylamino-(amido ) N[ 1 ',2'-diphenyläthyl]-BLM

dPEP-DPE

31

3-((S)-r-phenyläthylainino)propylamino-(amido)N[dipheny!methyI]-BLM

dPEP-ADPM

32

3-((S)-r-phenyläthylamino)propyIamino-famido)N[l,6-dimethylheptyl]-BLM

dPEP-DHA

33

3-((S)-r-phenyläthyIamino)propyIamino-(amido)N[2-( 1-piperazinyl )äthyl]-BLM

dPEP-APZ

34

3-((S)-r-phenyläthylamino)propylamino-(amido)N[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM

dPEP-BPA

35

3-((S)-r-phenyläthylamino)propylamino-(amido)N[N-benzylpiperazin-4-yl]-BLM

dPEP-ABP

36

3-((S)-l'-phenyläthyIamino)propylamino-(amido)N[4-diäthylamino-l-methylbutyl]-BLM

dPEP-ADP

37

3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminopropyl)amino]propylamino(amido)N-[isopropyl]-BLM

dBAPP-IPA

38

3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminiopropyl)amino]propylamino-

(amido)N-{3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminopropyl)amino]propylj-BLM

dBAPP-BAPP

39

3-{N-methyl-N-[3-(p-chlorobenzyI)aminopropyl]aminof-

propylamino-(amido)N-[3-(S)-r-phenyläthyl)aminopropvlJ-BLM

dMCLBZ-PEP

40

3-{N-methyl-N-[3-(p-chlorobenzyl)aminopropyl]amino}-

propyIamino-(amido)N-[octyl]-BLM

dMCLBZ-OCT

41

3-{N-methyIN-[3-(p-chIorobenzyl)aminopropyl]

amino}propylamino-(amido)N-[l,2-diphenyläthyl]-BLM

dMCLBZ-DPE

42

3-jN-methyl-N-[3-(p-chlorobenzyl)aminopropyl]

amino[propyIamino-( amido) N-[l,5-dimethylhexyl]-BLM

dMCLBZ-DHA

43

3-{N-methyl-N-[3-(2-(p-chIorophenyl)äthyl)aminopropyl]

amino}-propyIamino-(amido)N-[3-((S)-l'-phenyläthyl)aminopropyl]-BLM

dMCLPE-PEP

44

3-{N-methyl-N-[3-(2-(p-chlorophenyl)äthyl)aminopropyl]

aminof-propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM

dMCLPE-OCT

45

3-jN-methyl-N-[3-(2-(p-chlorophenyl)äthyl)aminopropyl] amino}-propylamino(amido)N-{3-[N-methyl-N-[3-(2-

(p-chlorophenyl)-äthyl)aminopropyl]amino]propyli-BLM

dMCLPE-MCLPE

46

3-j N-methyl- N-[3-( 2-( p-chlorophenyl )äthyl )

aminopropyl]aminoi-propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM

dMCLPE-BPA

47

3-{N-methyl-N-benzyI-N-[3-(dibenzylamino)propyl]aminof-

propylamino-(amido)N-[3-((S)-r-phenyläthyl)aminopropyl]-BLM

dMTBZ-PEP

48

3-{ N-methyl-N-benzyl-N-[3-( dibenzvlamino )propyI]amino[-

propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM

dMTBZ-OCT

49

3-{N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-propylamino-(amido)N-{3-{N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}

propyl}-BLM

dMTBZ-MTBZ

50

3-{N-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-[N-methyl-N-(3-n-butylaminopropyl)]-aminopropyI]-BLM

dMTBZ-BAPP

51

3-jN-methyl-N-benzyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[benzyl]-BLM

dMTBZ-BA

52

3-{N,N-dimethyI-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-((S)-r-phenyl)aminopropyl]-BLM

dMMDBZ-PEP

53

3-{N,N-dimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]aminoj-

propylamino-(amido)N-[n-octyl]-BLM

dMMDBZ-OCT

54

3-{N,N-dimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butyIamino)propyl]-BLM

dMMDBZ-BPA

55

3-{N,N-diäthyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-((S)-1 '-phenyläthyI)aminopropyl]-BLM

dEEDBZ-PEP

56

3-{N,N-diäthyl-N-[3-(dibenzyIamino)propyI]amino}propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM

dEEDBZ-OCT

57

3-{N,N-diäthyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]amino}

propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM

dEEDBZ-BPA

58

3-{N-methyl-N-[3-(cyclooctylmethylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM

dMCO-BPA

59

3-jN-methyl-N-[3-(cyclooctylmethylamino)propyl]amino}

propyl-amino-(amido)N-[octyl]-BLM

dMCO-OCT

60

3-{N-methyl-N-[3-(cyclooctylmethyl)aminopropyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-((S}-r-phenyläthylamino)propyl]-BLM

dMCO-PEP

61

3-{N-methyl-N-[3-(p-cyanobenzylamino)propyl]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-(di-n-butylamino)propyl]-BLM

dMCNBZ-BPA

62

3-{N-methyl-N-[3-(p-cyanobenzylamino(propyl]amino}propylamino-(amido)N-[octyl]-BLM

IdMCNBZ-OCT

63

3-{N-methyl-N-[3-(p-cyanobenzylamino)propyl]amino}

propylamino-(amido)N-[3-((S)-r-phenyläthylamino,)propyl]-BLM

dMCNBZ-PEP

64

3-{N-methyl-N-[3-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl)aminopropyI]amino}-

propylamino-(amido)N-[3-((S)-l'-phenyläthyl)aminopropyl]-BLM

dMDDBZOBZ-PEP

65

3-{N-methyI-N-[3-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl)aminopropyl]amino|-

propylamino-( amido)N-[n-octyl]-B LM

dMDDBZOBZ-OCT

9

657 140

Die durch Formel (I) dargestellten Verbindungen werden wie folgt hergestellt.

Eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (VI) oder reaktive Abkömmlinge der Carboxyl-Gruppe davon, wird mit einem Amin (nachher beschrieben) kondensiert,

CONH,

NH.

CH- NH .CH

\ / \ / \

CH CH- CO-X

4 o

(VI)

Nr

BM

X

o:

CO-R

H

worin BM einen Anteil des Bleomycin-Skeletts darstellt, R0 eine Hydroxyl-Gruppe oder ein End-Amino-Rest von Bleo-mycinen darstellt, X0 eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Gruppe der Formel -NH-X darstellt, wobei mindestens eine der R0 oder X0 eine Hydroxyl-Gruppe ist und X (1) ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatome, (2) ein Aminoalkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatome, (3) ein niederes Alkyl mit als Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatome, (b) 1 oder 2 Phenyl-Gruppen, (c) eine Indolyl-Gruppe oder (d) eine 5- oder ógliedrige heterozyklische Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefeloder Stickstoffatom darstellen und wobei unter den Substitu-enten-Gruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine niedere Alkoxygruppe substituiert sein kann, (4) X|-(niederes)Alkyl, [worin X|

X,

-N-X3 oder i'

-N-X

X,

w

X2 ein Wasserstoffatom, ein niederes Alkyl oder Benzyl, X3 (a) ein niederes Alkyl, (b) ein Phenyl(niederes)alkyl oder (c) ein Mono- oder Di-(niederes)alkylamino(niederes)alkyl ist, welches durch eine Phenyl oder Halophenyl-Gruppe substituiert sein kann, X4 ist (a) ein niederes Alkyl oder (b) ein Phe-nyl(niederes)alkyl], (5) Naphtyl, (6) Thiazolyl oder (7) ein N-Phenyl(niederes)alkylpiperazinyl. Wenn X0 in Formel (VI) die Hydroxyl-Gruppe ist, wird ein Amin der Formel (VII),

H,N-X

(VII)

(worin X die obige Bedeutung hat) bei der Kondensation benutzt, während, falls R0 in Formel (VI) die Hydroxyl-Gruppe und X0 -NH-X (worin X die obige Bedeutung hat) ist, ein Amin der Formel (VIII)

H-R

(VIII)

benutzt wird, wobei R die obige Bedeutung hat. Falls notwendig, wird aus dem Kondensationsprodukt das Kupfer entfernt, um ein (Amido)N-substituiertes Bleomycin der allgemeinen Formel (I) zu erhalten. Ferner wird, falls notwendig, ein Salz dieser Verbindung auf herkömmliche Weise hergestellt.

Die Kondensation einer Verbindung der Formel (VI) oder ein reaktiver Abkömmling ihrer Carboxyl-Gruppe mit einem Amin der Formel (VII) oder (VIII) wird nach einem bekannten Verfahren zur Bildung einer Säure-Amid-Verbindung durchgeführt, insbesondere ein solches Verfahren, das in der

Peptid-Chemie benutzt wird. Eine Verbindung der Formel (VI) wird mit einem Amin der Formel (VII) oder (VIII) in Gegenwart von solchen Aktivierungs-Reagenzien für die Carboxyl-Gruppe durchgeführt, die in der Peptid-Chemie 5 benutzt werden. Andererseits wird die Verbindung von Formel (I) durch die Reaktion eines Amins der Formel (VII) oder (VIII) mit einem reaktiven Abkömmling der Carboxyl-Gruppe einer Verbindung der Formel (VI) erhalten. Die Derivate sind beispielsweise solche, die durch die Reaktion eines io Aktivierungs-Reagenz für die Carboxyl-Gruppe und die Verbindung von Formel (VI) oder ein 3-Aminopropyl-Ester der Carboxyl-Gruppe der Verbindung von Formel (VI) erhalten werden. Als Beispiele von Aktivierungs-Reagenzien können erwähnt werden: 6-Chloro-l-p-Chlorobenzolsulfonyl-Oxy-15 benzotriazol, N-Äthyl-5-Phenylisooxazolium-3'-Sulfonat, N-tert-Butyl-5-Methyl-Isooxazolium-Perchlorat, N-Äthoxy-carbonyl-2-Äthoxy-l,2-Dihvdrochinon (FEDQ), Di-p-Nitro-phenyl-Sulphit, Tri-p-Nitrophenyl-Phosphit, P-Nitrophenyl-Trichloroacetat, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-Äthyl— 2o 3-(3-Di-Methylaminopropyl)carbodiimid, l-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoäthyl)carbodiimid, Diphenylcarbodiimid, Di-p-Tolylcarbodiimid, Di-isopropylcarbodiimid, Diphenyl-phosphorazidat (DPPA) und Diäthyl-Phosphorocyanidat (DEPC).

25 Als Beispiel für reaktive Derivate der Carboxyl-Gruppe der Verbindungen von Formel (VI) können solche erwähnt werden, die durch die Reaktion der obengenannten Aktivierungs-Reagenzien mit der Carboxyl-Gruppe erhalten wurden und reaktive Derivate der Carboxyl-Gruppe, die durch die 30 gemeinsame Benutzung der Aktivierungs-Reagenzien und der Kondensations-Additive, beispielsweise p-Nitrophenol, o,p-Dinitrophenol, Pentachlorophenol, 2,4,5-TrichlorophenoI, Pentafluorophenol, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxyben-zotriazol, N-Hydroxy-5-Norbornen-2,3-Dicarboximid; 35 3-Aminopropylester der Carboxyl-Gruppe von Formel (VI) und monosubstituierte 3-Aminopropylester, wie beispielsweise 3-Acetylaminopropylester, 3-Succinylaminopropylester, 3-Benzoylaminopropylester, 3-Benzylaminopropylester, 3-p-Toluolsulfonylaminopropylester, 3-(2,4-Dinitrophenyl)ami-40 nopropylester, 3-(3,5-Dimethyl-3-Oxocyclohexen-l-yl)amino-propylester, 3-(tert-Butoxycarbonyl)-aminopropylester und 3-(SaIizyliden)aminopropylester.

Die Kondensation wird im allgemeinen in einem Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel können sol-45 che verwendet werden, die die Reaktion nicht beeinflussen, doch wird es vorgezogen, ein polares Lösungsmittel zu verwenden, welches die Verbindung von Formel (VI), das als Anfangsmaterial verwendet wird, auflöst. Beispiele von solchen Lösungsmitteln sind Wasser, Dimethylformamid, Dime-5o thylacetamid, Acetonitril und Mischungen derselben. Das molare Verhältnis der Amine von Formel (VII) oder (VIII) zur Verbindung von Formel (VI) ist im allgemeinen um 0,5 zu 20, vorzugsweise um 1 zu 10. Obwohl die Reaktionstemperatur vom Typ des Lösungsmittels und anderen Bedingungen 35 abhängt, ist sie im allgemeinen zwischen - 15° bis 45 °C, vorzugsweise zwischen — 10° bis 30 °C. Die Reaktionszeit ist eine bis 70 Stunden. Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden im Detail beschrieben.

Die Kupfer-enthaltende Form der Verbindung von For-60 mei (VI) und, falls notwendig, das obenerwähnte Additiv werden in Wasser, Dimethylformaldehyd, Acetonitril oder einer Mischung derselben aufgelöst. Zu dieser Lösung wird das obenerwähnte Aktivierungs-Reagenz unter Rühren bei — 5° bis 15 °C beigegeben. Falls notwendig, wird die Mischung 65 auf einen pH-Wert eingestellt, der für die Aktivierung mit einer anorganischen Säure oder Base, wie Salzsäure oder Natriumhydroxyd, geeignet ist oder mit einer organischen Base, wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin. Dieser

657 140

10

Mischung wird dann die Amin-Komponente als solche oder in einer Lösung mit eingestelltem pH-Wert beigegeben. Die daraus entstehende Lösung wird gerührt und, falls notwendig, wird der pH-Wert in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, eingestellt. Das Rühren wird für eine bis 70 Stunden fortgesetzt, um die erwünschte Verbindung zu ergeben.

Die Isolierung des so gebildeten Derivats wird in der folgenden Weise durchgeführt. Ein organisches Lösungsmittel wie Azeton oder Äther wird dem Reaktionsgemisch beigegeben, um das erwünschte Produkt zu fällen. Die Fällung wird in destilliertem Wasser gelöst, dann auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und, zum Zwecke des Entsalzens, durch eine Kolonne, gepackt mit einem adsorbierenden Harz, wie beispielsweise Amberlite® XAD-2 (Rohm und Haas Co.) in destilliertem Waser durchgeleitet, um die Adsorption des gewünschten Produkts im Harz zu erzielen. Die Kolonne wird mit destilliertem Wasser gewaschen, um das Salz zu entfernen und die adsorbierten Teile werden mit einem angesäuerten wässrigen Methanol, wie eine Mischung von 1 /50 N Salzsäure und Methanol (1:4 V/V) herausgelöst, um die Fraktionen mit einem Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 290 nm zu erhalten. Die kombinierte Fraktion wird mit Dowex® 44 (ein OH-Typ Anionen-Austauscherharz von Dow Chemical Co.) neutralisiert, dann bei Unterdruck konzentriert und lyophilisiert, um ein rohes Pulver des Derivats zu erhalten. In manchen Fällen kann der Entsalzungsschritt weggelassen werden und die Lösung der Fällung in destilliertem Wasser kann direkt dem zweiten Behandlungsschritt unterworfen werden.

Im zweiten Schritt wird die Lösung des rohen Pulvers in destilliertem Wasser durch eine Kolonne geleitet, die mit CM-Sephadex® C-25 gepackt ist (Na+-Typ; Pharmacia Fine Chemicals Co.), das mit einer 1/20 M Essigsäure-Natrium-azetat-Pufferlösung (pH 4,5) ausgeglichen wurde, um die Adsorption des gewünschten Produkts durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde dann durch ein lineares Konzentrationsgradientenverfahren herausgelöst, das durch kontinuierliches Zugeben von Natriumchlorid zu der obenerwähnten Pufferlösung durchgeführt wird, um die Natriumchloridkonzentration schrittweise auf 1,0 M zu erhöhen. In diesem Schritt haben die unreagierten Reaktionsmittel und die Nebenprodukte die Tendenz, in frühen Stufen herausgelöst zu werden und können mittels eines Ultraviolettabsorpitons-monitors getrennt werden. Falls gefunden wird, dass die Fraktion des gewünschten Produkts mit Verunreinigungen versehen ist, wird die Chromatographie wiederholt, um sämtliche Verunreinigungen zu entfernen.

Als Alternative, anstatt die oben beschriebene Chromatographie durchzuführen, kann ein anderes chroamtographi-sches Reinigungsverfahren durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines adsorbierenden Harzes Amberlite® XAD-2. Die wässrige Lösung des Rohproduktes wird in eine Pufferlösung, wie beispielsweise l%ige wässrige Ammoniumazetatlösung, durch die mit Harz gefüllte Kolonne geleitet, um die Adsorption des gewünschten Produktes zu erzielen. Die adsorbierte Phase wird durch das lineare Konzentrationsgradientenverfahren herausgelöst, in welchem Methanol stetig der Pufferlösung zugegeben wird, um schrittweise die Methanolkonzentration zu erhöhen. Da die unreagierten Reaktionsmittel die Tendenz haben, in einer frühen Stufe herausgelöst zu werden und die hauptsächlichen Nebenprodukte in einer späteren Stufe, können sie mit Hilfe eines Ultravio-lett-Monitors getrennt werden. Falls die gewünschten Fraktionen verunreinigt sind, können die Verunreinigungen vollständig durch wiederholte Chromatographie entfernt werden.

Die oben beschriebenen Arten von Chromatographie können alleine oder in Kombination durchgeführt werden. Die das gewünschte Produkt enthaltende gereinigte Fraktion wird mit Hilfe eines adsorbierenden Harzes, wie beispielsweise Amberlite® XAD-2 entsalzen und lyophilisiert, um ein blaues amorphes Pulver von kupferenthaltendem (Amido)N-substi-tuierten Belomycin zu erhalten. Die kupferfreie Form wird durch Entfernen des Kupfers von der kupferenthaltenden Form mittels eines bekannten Verfahrens, wie das Verfahren, das EDTA benutzt, durchgeführt gemäss der japanischen offengelegten Veröffentlichung Nr. 31 875/77. Ein Beispiel des Kupferentfernungsverfahrens wird weiter unten angegeben.

Das kupferenthaltende Produkt wird in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung durch eine Kolonne, gepackt mit Amberlite® XAD-2 in destilliertem Wasser durchgeleitet, um die Adsorption des kupferenthaltenden Produktes durchzuführen. Das Harz wird dann mit einer wässrigen Lösung ausgewaschen, die Natriumchlorid und 5% Dinatriumsalz von Äthylendiamintetra-Essigsäure (kurz EDTA.2Na) enthält, um das Kupferion durch das EDTA.2Na zu entfernen und kupferfreies (Amino)N-substituiertes Bleomycin zu hinterlassen, das am Harz adsorbiert ist. Das Harz wird dann mit einer Natriumchloridlösung zur Entfernung des EDTA.2Na gewaschen, dann mit destilliertem Wasser und schlussendlich mit einem angesäuerten wässrigen Methanol, wie beispielsweise eine '/so N wässrige Salzsäure-Methanolmischung (1:4 V/V) eluiert, um die Fraktionen, die ein Absorptionsmaximum bei ungefähr 290 nm zeigen, zu erhalten. Die kombinierte Fraktion wird mit Dowex® 44 (OH-Typ; Dow Chemical Co.) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, unter erniedrigtem Druck konzentriert und lyophilisiert, um ein weisses amorphes Pulver von kupferfreiem (Amido)N-substituierten Bleomycin-Hydrochlorid zu erhalten. Falls anstelle von Natriumchlorid und wässriger Salzsäure Natriumsulfat und wässrige Schwefelsäure benutzt werden, wird ein Sulfat erhalten. Auf diese Weise kann jedes gewünschte Salz durch Auswahl des Salzes und der Säure im Eluierungsschritt erhalten werden. Als Beispiele von derart erhaltenen Salzen kann Azetat, Tartrat, Zitrat, Maleat und Lactat, zusätzlich zum Hydrochlorid und Sulfat, genannt werden.

Falls das gemäss obigem Verfahren erhaltene (Amido)N-substitueirte Bleomycin einer Hydrolyse mit 6 N wässriger Salzsäure bei 105 °C während 20 Stunden unterworfen wird, werden neben den Aminen R-H und X-NH2 oder einem Zerfallprodukt dieser Amine in einigen Fällen Zersetzungsprodukte entdeckt, die bei Bleomycinen allgemein vorkommen und L-Threonin, ß-Amino-ß-(4-Amino-6-Carboxy-5-Methyl-Pyrimidin-2-yl)propionsäure, 4-Amino-3- Hydroxy-2-Methyl-n-Pentansäure, ß-Hydroxy-L-Histidin, ß-Amino-L-Alanin und 2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-Bithiazol-4-Carboxylsäure einschlies-sen. Diese Tatsache unterstützt die These, dass das (Amido) N-sustituierte Bleomycin die chemische Struktur von Formel (I) aufweist.

In der allgemeinen Formel (VI) der Verbindungen, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, wobei X0 eine Hydroxyl-Gruppe und R0 ein End-Amino-Rest von Bleomycinen ist, wird Deamidobleomycin (kupferenthaltende Form) der Formel (VI-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

657 140

erhalten, worin BM und R die obige Bedeutung haben. Es wird durch Hydrolysieren von kupferfreien Bleomycinen der allgemeinen Formel (11) mit einem Inaktivierungsenzym von Ratten oder aus Rinder- oder Schweineleber hergestellt.

Beispielsweise wird eine Rindsleber in einer Phosphatpufferlösung homogenisiert und bei 8000 U/min zentrifu-giert. Die obenliegende Flüssigkeit wird gegen einen Phosphatpuffer dialysiert, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten, der eine Lösung von Bleomycinen in einem Phosphatpuffer beigegeben wird. Der Lösung wird Gelegenheit gegeben, bei 37 °C während 5 bis 48 Stunden zu reagieren und das Reaktionsgemisch wird von den Proteinen durch entsprechende Massnahmen befreit. Das Protein kann beispielsweise entfernt werden durch Addition von Trichlores-sigsäure (kurz TCA) zu einer Konzentration von 5%, um das Protein zu fällen, dann Trennung der Fällung durch Zentrifu-gieren und dreimal Waschen der Fällung mit einer 5%igen TCA-Lösung, um dann die Waschlösung zu erhalten. Die proteinfreie Mischung wird neutralisiert, mit Kuperazetat im Überschuss gemischt, um das Produkt in ein Kupferchelat zu überführen. Um dieses Kupferchelat zu entsalzen, wird es in destilliertem Wasser durch eine mit einem adsorbierenden Harz, Dowex® HP 40, gefüllte Kolonne geleitet. Die Salze werden mit destilliertem Wasser abgewaschen und die adsorbierte Phase wird mit einer '/so N Salzsäure-Methanolmischung (1:4 V/V) herausgelöst, um Fraktionen zu erhalten, die ein Absorptionsmaximum bei ungefähr 290 nm aufweisen. Die gesammelte Fraktion wird mit einem Anionen-Aus-tauschharz. Dowex® 44 (OH-Typ, Dow Chemnical Co.), neutralisiert, unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert. Das entstandene Pulver wird in destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine Kolonne geleitet, die mit CM-Sephadex® C-25 (Na+-Typ; Pharmacia Fine Chemicals Co.) gepackt war, die mit einer '/20 M Essigsäure-Natriumazetat-pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5 ausgeglichen worden war, um die Adsorption durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mittels dem linearen Konzentrationsgradientenverfahren herausgelöst, in welchem Natriumchlorid kontinuierlich der Pufferlösung zugefügt wurde, um schrittweise die Natriumkonzentration auf 1,0 M zu erhöhen. Die herausgelösten Fraktionen, in blauer Farbe, mit dem gewünschten Produkt wurden gesammelt, und mittels dem Diaion® HP 40-Ent-salzungsverfahren, wie oben beschrieben, entsalzen und lyophilisiert, um ein blaues amorphes Pulver mit kupferenthaltenden Deamidobleomycinen zu erhalten.

Falls in der allgemeinen Formel (VI) der Verbindungen, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, X„ -NH-X (X mit obiger Bedeutung) und R„ OH ist, stellt die Formel (VI-2) eine (Amido)N-substituierte Bleomycinsäure dar.

conh-

nh.

ch-\

ch nh

/V

ch

/X

bleomycin wird mit einem Amin der Formel (VII) zur Reaktion gebracht, um ein (Amido)N-sustituiertes Bleomycin B:, in welchem R0 Agmantin ist, zu erhalten, woraufhin diese Verbindung unter Benutzung eines bekannten Pilz-Myzels (zum Beispiel IFO 8502, hinterlegt im Institute for Fermentation, Osaka) hydrolysiert wird, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Deamidobleomycinsäure der allgemeinen Formel (VI-3)

conh.

ch,

\

ch'

nh,

I 2

,nh ch

\ / \ xch2 \cooh n-

-cooh

(VI-3)

20

n-—n—\

BM—^Aa

• h co-nh-x

(vi-2)

n—n—'

JW^H

cooh worin BM die obige Bedeutung hat. Ein Beispiel des Verfahrens zu ihrer Synthetisierung ist weiter unten gegeben.

Unter Benutzung des oben erwähnten lnaktivierungsenzy-mes, wird Bleomycin B:, eine bekannte Verbindung, in ein Deamidobleomycin B2 umgewandelt, ein Deamidobleomycin der Formel (VI), in welche R(, Agmantin ist. Dieses Deamido-

ist ein Ausgangsmaterial der allgemeinen Formel (VI), in welcher sowohl Xo als auch R0 Hydroxyl-Gruppen sind. Es wird hergestellt durch Hydrolysieren einer bekannten Bleomycinsäure (siehe US-PS 3 886 133) mit den obenerwähnten Inakti-vierungsenzymen. Es kann auch erhalten werden durch Hydrolysieren von Deamidobleomycin B2 der allgemeinen Formel (VI-1 ), in welche R Agmantin ist, unter Benutzung des obenerwähnten Pilz-Myzels.

Als Beispiele von Aminen der allgemeinen Formel (VII ) können erwähnt werden Methylamin, Äthylamin, n-Propyl-amin, Isopropylamin, n-Butylamin, Isobutylamin, tert-Butyl-amin, n-Pentylamin, 3-Methylbutylamin, Neopentylamin, n-Heptylamin, 3-Methylpentvlamin, n-Hexylamin, 1,5-Dime-thylhexylamin, Isohexylamin, n-Octylamin, n-Decylamin, Laurylamin, Myristylamin, Cetylamin, Stearylamin, 2-Amino-äthylamin, 3-Aminopropylamin, 4-Aminobutylamin, 6-Ami-nohexylamin, 12-Aminododecylamin, 4-Amino-4-Methyl-

1-Dimethylpentylamin, 2,2,2-TrifIuoroäthylamin, 2,2,2-Tri-

, chloroäthylamin, 2,2-Difluoroäthylamin, 2,2-Dichloroäthyl-amin, Benzylamin, Diphenylmethylamin. 2-Phenyläthylamin.

2.2-Diphenyläthylamin, 1-Phenyläthylamin, 1,2-Diphenyl-äthylamin, 3-Phenylpropylamin, 2-Phenylisopropylamin,

1.3-Diphenylpropylamin, 3,3-Diphenylpropylamin, 4-Phenyl-, butylamin, 4,4-DiophenylbutyIamin, Chlorobenzylamin,

Dichlorobenzylamin, Bromobenzylamin, Methoxybenzyl-amin, Dimethoxybenzylamin, Äthoxybenzylamin. Methylen-dioxybenzylamin, Propoxybenzylamin, p-Chlorophenyläthyl-amin. p-Methoxyphenyläthylamin. p-Benzyloxybenzylamin. 1 Furylmethylamin, 2-Furyläthvlamin, 2-Thiazolylmethylamin,

2-Pyrazolylmethylamin, 2-Imidazolylmethylamin, 4-Imidazo-lylmethylamin, 2-Thienylmethylamin, 2-Pyridylmethylamin,

3-Pyridylmethylamin, 4-Pyridylmethylamin, Indolylmethyla-min, Indolyläthylamin, 4-Methoxyindolylmethylamin, 2-Pyri-

; rnidylmethylamin. 2-Pyrimidyläthylamin, 4-Pyrimidylmethy-lamin, 4-Pyrimidyläthylamin, 2-Piperidylmethylamin, 3-Pipe-ridylmethylamin, 4-Piperidylmethylamin, 2-(2-Piperidyl)äthy-lamin, 2-(3-Piperidyl)äthyIamin, 2-(4-Piperidyl)äthylamin, l-(2-Piperidyl)äthylamin, l-(3-Piperidyl)äthylamin, l-(4-Pipe-j ridyl)äthylamin, 2-(Piperidino)äthylamin, 2-Piperazylmethy-lamin, 2-(2-Piperazyläthyl)amin, 2-(Piperidino)äthylamin, 3-PiperidinopropyIamin, 2-(Morpholino)äthylamin, 3-(Morp-holinoipropylamin, 2-Morpholinvlmethylamin, 3-Morpholi-nylmethvlamin, 2-(Morpholinvl)äthylamin, 3-(Morpholinyl) s propvlamin. Dimethylaminoäthylamin, Diäthylaminoäthyla-min, Dipropylaminoäthylamin, Propylaminoäthylamin, Dimethylaminopropylamin, Diäthylaminopropylamin, Dipropylaminopropylamin, Propylaminopropylamin, Dibu-

657 140

tylaminpropylamin, Butylaminopropylamin, Benzylamino-propylamin, 2-PhenyIäthylaminopropylamin, I-Phenyläthyla-minopropylamin, 3-PhenylpropyIaminopropylamin, 4-Phe-nylbutylaminopropylamin, Methylaminoäthylaminopropyla-min, Äthylaminopropylaminopropylamin. Propylaminopro-pylaminopropylamin, Butylaminopropylaminopropylamin. N-(Butylaminopropyl)-N-Methylaminopropylamin, Dibutv-laminopropylaminopropylamin, Pentylaminopropylamino-propylamin, Äthylaminobutylaminopropylamin, Propylami-nobutylaminopropylamin, Äthylaminopropylaminobutyla-min, Butylaminopropylaminobutylamin. Benzylaminoäthyla-minoäthylamin, Benzylaminoäthylaminopropylamin, Benzy-laminopropylaminopropylamin, Benzylaminobutylaminopro-pylamin, Phenyläthylaminopropylaminopropylamin, N-(Phe-nyläthylaminopropyl)-N-methylaminopropyIamin, N-(Chlor-obenzyIaminopropyI)-N-MethyIaminopropylamin, N-(Brom-obenzylaminopropyl)-N-MethylaminopropyIamin, N-(Chlo-rophenyläthylaminopropyl)-N-MethyIaminopropyIamin, Dibenzylaminopropyl-N,N-Dimethylaminopropylamin, DibenzylaminopropyI-N,N-Diäthylaminopropylamin, Diben-zylaminopropyl-N-Methyl-N-Benzylaminopropylamin, a-Naphthylamin, ß-Naphthylamin, 2-Thiazolylamin, 3-Thia-zolylamin, 4-ThiazoIyIamin, N-Benzyl-4-PiperidyIamin, N-Phenyläthyl-4-Piperidylamin, N-BenzyI-3-Piperidylamin und N-Benzyl-2-PiperidyIamin.

Wünschenswerte Amine der Formel (VIII) sind solche aliphatische primäre Amine, die eine basische Gruppe zusätzlich zur Amino-Gruppe, die an der Reaktion teilnehmen, aufweisen. Als Beispiele solcher Amine können erwähnt werden

2-Aminoäthylamin, 3-Aminopropylamin, 2-Dimethylamino-äthylamin, 2-DiäthyIaminoäthylamin, 3-DimethyIaminopro-pylamin, 3-Diäthylaminopropylamin, 3-(3-Butylaminopropy-lamino)propylamin, 3-(2-Hydroxypropylamino)propylamin,

3-Piperidinopropylamin, 3-(l-PhenyläthyIamino)propylamin,

2-Aminopropylamin, 3-Methylaminopropylamin, 3-Butylami-nopropylamin, 3-(6-AminohexyIamino)propylamin, 3-Trime-thylaminopropylamin, 3-(3-DimethylaminopropyIamino)pro-pylamin, 3-(3-Aminopropylamino)propylamin, 3-[N-Methyl-N-(3-Aminopropyl)amino]propylamin, 3-Pyrrolidinylpropyla-min, 3-Piperidinylpropylamin, 3-Morpholinopropylamin,

3-Piperazinylpropylamin, 3-[4-(3-Aminopropyl)piperazinyI] propylamin-3- (3-Pyrrolidinylpropylamino)propylamin, 3-(3-Piperidinylpropylamino)-propylamin, 3-(3-MorphoIinyl-propylamino)propylamin, 3-(3-Hydroxypropylamino)propy-lamin, 3-(3-Methoxypropylamino)propylamin, 3-Benzylami-nopropylamin, m-Aminomethylbenzylamin, p-Aminomethyl-benzylamin, 2-Cyclopentylaminoäthylamin, 3-Cyclohexyla-minopropylamin, 4-Cyclohexylaminobutylamin, Cyclohepty-laminopropylamin, 3-Cyclooctylaminopropylamin, 3-[N-Methyl-3-N-(Cyclooctylmethylaminopropyl)amino]propyla-min, 3-CyclodecanyImethyIaminopropylamin, 3-{N-Methyl-N-[3-(2-p-ChIorophenyläthylamino)propyl]amino}propyla-min, 3-{N-Methyl-N-[3-(m,p-Dibenzyloxybenzyl)aminopro-pyl]amino jpropylamin, 3-{N-Methyl-N-[3-(p-Cyanobenzyla-mino)propyl]amino [propylamin, 3-{N-Methyl-N-[3-(Cycloun-decanylmethylamino)propyl]amino [-propylamin, 3-jN-Methyl-N-[bis(m,p-Dibenzyloxybenzyl)aminopropyl] amino}-propylamin, 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(Dibenzylamino)propyl] amino}-propylamin, 3-{N,N-Diäthyl-N-[3-(Dibenzylamino) propyl] aminoj-propylamin, 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(N,N-Dimethyl-N-(3-Dibenzylaminopropyl) amino)propyl]amino|-propylamin, 3-{N,N-DimethyI-N-[3-(N,N-Dimethyl-N— (3-Cyclooctylmethylaminopropyl) amino)propyl]amino}pro-pylamin, 3-[4-(3-DibenzylaminopropyIamino)piperidyl]pro-pylamin und 3-[4-(3-Cyclooctylmethylaminopropyl)piperidyl] propylamin.

Unter den Aminen der allgemeinen Formel (VIII) sind diejenigen, die durch die nachfolgende Formel (IX) dargestellt sind, neue Verbindungen, die als erste von den Erfindern synthetisiert wurden:

NHr(CH;)r A'-(CH;),-B'

(IX)

|10

worin A' . -n-

oder

-N

. I

R.

10 ©_

11

ist (worin Rji,' und Rn' jeder ein niederes Alkyl oder Benzyl und B' Di[Phenyl-(niederes)alkyl]Amino, Cyanophenyl(nie-deres)alkylamino. C\ ,rCycloalkyl-substituiertes niederes ,5 Alkylamino oder bis-[Di-benzyloxyphenyl(niederes)alkyl] amino ist.) Diese Verbindungen werden durch die Hydrolyse der durch die allgemeine Formel (X) dargestellten Verbindung synthetisiert.

2')

Y-(CH;),-AMCH2b-B'

(X)

(worin A' und B' die obige Bedeutung haben und Y eine geschützte Amino-Gruppe ist), um die schützende Gruppe zu entfernen. Obwohl die Hydrolyse in Anwesenheit entweder einer Säure oder einer Base stattfindet, wird im allgemeinen eine Säure, wie beispielsweise die Salzsäure, bevorzugt.

Von den Ausgangsmaterialien der allgemeinen Formel (X) werden die durch die Formel (XI)

flO fl2

1 (+) I

Y- (CH2) -N (CH )3-N

11 13

(XI)

[worin Rn/, Rn' und Y die obige Bedeutung haben und R|2" und R|3" je ein Phenyl(niederes)alkyl sind], in folgender Weise hergestellt.

Ein 3-AminopropyI-N,N-Dialkylamin der allgemeinen 40 Formel (XII)

110

NK2-<CH2)3-N-R1;li

(XII)

(worin Rn/ und R,,' die obige Bedeutung haben) wird einer reduzierenden Kondensation mit Benzaldehyd oder einem Phenyl(niederes)aldehyd unterworfen. Das Reaktionsgemisch wird alkalisch gemacht und mit einem organischen organi-5o sehen Lösungsmittel extrahiert, um ein N',N'-Dibenzylamino-propyI-N,N-DialkyIamin der allgemeinen Formel (XIII) zu erhalten,

ili

R.

12

55

R10'-N-(CH0),-N-R,,n

2 3

13

(XIII)

(worin R|0', Ru', R12" und Rt3" die obige Bedeutung haben). Das resultierende Amin wird mit einem 3-Halopropyl-N-60 (geschütztes)Amin zur Reaktion gebracht, um ein quaternäres Salz der Formel (XIV) zu bilden.

[10 J12

y-(CH ) -N ®- (CH_),-N 2 3 i 2 3 |

Rll' R13"

(XIV)

13

657 140

(worin Y, Rl0', Rn', R12" und R)3" die obige Bedeutung haben). Das quaternäre Salz wird in Anwesenheit einer Säure hydrolysiert, beispielsweise mit 6 N Salzsäure bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 200 °C, beispielsweise bei 110 °C während acht Stunden. Nach dem Entfernen 5 von Zwischenprodukten, z.B. eine Säure, wird das Reaktionsgemisch konzentriert, um ein Hydrochlorid einer Verbindung der Formel (XI) zu erhalten.

Ein Amin der allgemeinen Formel (XV)

niederes Alkyl 10

Y-(CH2)3-N-(CH2)3-B" (XV)

worin Y die obige Bedeutung hat und B" ein Di[phenyl(nie- 15 deres)alkyl]amino, p-Cyanophenyl(niederes)alkylamino, C5_n-Cycloalkyl-substituiertes niederes Alkylamino oder bis-

[Dibenzyloxyphenyl(niederes)alkyl]amino ist, wird durch Azylieren eines bis(3-Aminopropyl)(niederes)alkylamins mit einem Äquivalent oder wengier eines Azylierungsmittels hergestellt, wobei Azylierungsmittel, wie beispielsweise Benzoyl-chlorid, Azetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Carbobenzoxy-chlorid, S-tert-Butoxycarbonyl-4,6-Dimethyl-2-Mercaptopyri-midin oder N-Carbethoxyphthalimid verwendet, um ein monoacyliertes Derivat zu bilden. Dann wird dieses Derivat einer reduzierenden Kondensation mit einem Äquivalent eines Aldehyds unterworfen, falls B" eine monosubstituierte Amino-Gruppe ist oder mit zwei oder mehr, vorzugsweise 3 bis 6, Äquivalente eines Aldehyds, falls B" eine disubstitu-ierte Amino-Gruppe ist und dann wird die Acylgruppe mit Salzsäure hydrolisiert.

Die physikochemischen Eigenschaften von typischen (Amido)N-substituierten Bleomycin-Derivaten gemäss dieser Erfindung sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Ver- Abkürzung UV-Absorptionsmaximum TLC*1 Electrophoresis*2 der bindung der Cu-freien Form, der Cu-enthaltenden Cu-enthaltenden Form, Rm

Nr. nm (E 1%/1 cm) Form Rf (Rm von Alanin = 1.0)

1

dH-MMA

291

111)

0.62*

0.92

2

dH-MEA

291

107)

0.75

0.83

3

dH-IPA

291

105)

0.56*

0.85

4

dH-BA

291

98)

0.70

0.75

5

dH-PEP

291

102)

0.68

0.96

6

dH-EDA

291

100)

0.45

1.04

7

dB2-IPA

291

89)

0.53*

0.93

8

dB2-DHA

291

94)

0.76

0.87

9

dB2-TFEA

291

93)

0.50*

0.85

10

dB2-OCT

291

85)

0.72

0.77

11

dB2-PEP

291

79)

0.87

1.03

12

dB2-BPA

292

79)

0.87

1.02

13

dB2-LAA

291

82)

0.43

0.70

14

dB2-BA

291

78)

0.39*

0.78

15

dB2-ADPM

291

89)

0.82

0.76

16

dB2-DPE

291

81)

0.77

0.76

17

dB2-NA

291

85)

0.84

0.83

18

dB2-FFA

292

115)

0.48*

0.82

19

dB2-AMPY

292

84)

0.47*

1.02

20

dB2-ATZ

292

137)

0.86

0.78

21

dPEP-IPA

291

94)

0.84

0.87

22

dPEP-PEP

291

89)

0.77

0.98

23

dPEP-BA

291

91)

0.78

0.87

24

dPEP-CBA

291

81)

0.74

0.79

25

dPEP-STE

291

68)

0.06

0.18

26

dPEP-LAA

291

83)

0.33

0.75

27

dPEP-OCT

291

83)

0.61

0.84

28

dPEP-MTA

285

100)

0.75

0.81

29

dPEP-DAD

291

94)

0.78

1.02

30

dPEP-DPE

291

88)

0.65

0.87

31

dPEP-ADPM

291

85)

0.69

0.87

32

dPEP-DHA

291

91)

0.63

0.84

33

dPEP-APZ

291

85)

0.78

1.26

34

dPEP-BPA

291

82)

0.73

1.00

35

dPEP-ABP

291

78)

0.72

1.10

36

dPEP-ADP

291

75)

0.80

1.06

37

dBAPP-IPA

291

91)

0.85

1.14

38

dBAPP-BAPP

291

83)

0.26

1.44

39

dMCLBZ-PEP

289

90)

0.53

1.16

40

dMCLBZ-OCT

290

88)

0.50

1.08

41

dMCLBZ-DPE

290

78)

0.55

1.01

42

dMCLBZ-DHA

290

80)

0.53

0.90

43

dMCLPE-PEP

290

79)

0.53

1.04

44

dMCLPE-OCT

290

85)

0.52

0.96

657 140

14

Ver- Abkürzung UV-Absorptionsmaximum TLC*1 Electrophoresis*2 der bindung der Cu-freien Form, der Cu-enthaltenden Cu-enthaltenden Form, Rm

Nr. nm (E 1%/1 cm) Form Rf (Rm von Alanin= 1.0)

45

dMCLPE-MCLPE

290

79)

0.25

1.20

46

dMCLPE-BPA

290

83)

0.60

1.11

47

dMTBZ-PEP

290

81)

0.38

1.06

48

dMTBZ-OCT

290

73)

0.24

0.92

49

dMTBZ-MTBA

290

69)

0.15

1.07

50

dMTBZ-BAPP

290

71)

0.47

0.79

51

dMTBZ-BA

290

81)

0.48

0.79

52

dMMDBZ-PEP

291

75)

0.50

1.15

53

dMMDBZ-OCT

291

76)

0.35

1.01

54

dMMDBZ-BPA

291

79)

0.49

1.13

55

dEEDBZ-PEP

291

76)

0.48

1.12

56

dEEDBZ-OCT

291

78)

0.33

1.00

57

, dEEDBZ-BPA

291

73)

0.48

1.14

58

dMCO-BPA

291

87)

0.54

1.08

59

dMCO-OCT

291

83)

0.42

0.96

60

dMCO-PEP

291

89)

0.53

1.06

61

dMCNBZ-BPA

290

81)

0.70

1.10

62

dMCNBZ-OCT

292

94)

0.59

0.95

63

dMCNBZ-PEP

291

93)

0.69

1.10

64

dMDDBZOBZ-PEP

285

74)

0.09

0.93

65

dMDDBZOBZ-OCT

285

76)

0.04

0.64

*1 : «Silica-Gel 60F 254 Silanised®» (Merck Co.); Methanol-6%-Ammonium-Acetat (60:40 V/V), ausgenommen für Rf-Werte mit einem Asterisk, die in einer anderen Mischung gemessen wurden (65:34 V/V).

*2: Avicel SF® (FMC Co.); Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75:900 V/V), 800 V, 15 Minuten.

Die biologischen Eigenschaften, die an den typischen Verbindungen dieser Erfindung bestimmt wurden, sind nachfolgend beschrieben.

1. Widerstandsfähigkeitstest gegen Inaktivierungsenzyme.

(1) Extraktion des Inaktivierungsenzyms.

Die Leber von männlichen Ratten der Donrvu-Rasse wurde mit dem doppelten Gewicht einer 'As M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7 gemischt und gemahlen, um eine Stoffemulsion herzustellen. Die resultierende Emulsion wurde bei 105 000 g (Gravitationskonstante) während 60 Minuten zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wurde dialysiert und die resultierende grosse Molekülfraktion wurde als Inaktivierungsenzymextrakt verwendet.

(2) Bestimmung der Inaktivierungsreaktion.

Zu einem ml des obigen Extraktes wurden 1 ml einer Substratlösung, enthaltend 800 u.g eines Bleomycin-Derivats gegeben. Die Mischung wurde bei 37 °C während 40 Minuten zur Reaktion gebracht. Ein Anteil (0,3 ml) des Reaktionsgemisches wurde von Proteinen befreit und auf Restaktivität gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607 getestet. Unter den gleichen Bedingungen zeigte Bleomycin B2, als Kontrolle benutzt, 50% Abnahme in der Aktivität. Die Testresultate waren wie in Tabelle 3 gezeigt. Wie daraus hervorgeht, sind die (Amido)N-substituierten Bleomycin-Derivate im Vegleich zu Bleomycinen im allgemeinen weniger durch die Belomycin-Inaktivierungsenzyme beeinflusst.

2. Antimikrobielle Aktivitäten gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607 und Bacillus subtilis.

45 Die antimikrobielle Aktivität wurde gegenüber diesen Testorganismen mittels der Methode des Agar-Plattenzylin-ders getestet. Die Aktivität wurde unter der Annahme aufgezeichnet, dass die Aktivität des Musterbeispiels von Bleomycin A2 (kupferfreie Form) 1000 ug Potenz/mg beträgt. Die 50 Testresultate sind in Tabelle 3 angegeben.

3. Wachstumshemmende Aktivität gegenüber gezüchteten HeLa S3-Zellen.

HeLa S3-Zellen wurden in ein Medium (MEM mit 10% Rinderserum) in einer Kunststoff-Petri-Schale gebracht. Zwei 55 Tage nachher wurde ein Bleomycin hinzugefügt. Nach drei Tagen brüten, wurde die Anzahl der Zellen gezählt. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde gemäss folgender Gleichung ausgerechnet: Prozentuale Hemmung (%)= 100 x (B-A)/(B-C), wobei A die endgültige Anzahl Zellen nach 60 drei Tagen nach dem Hinzufügen des Testmusters, B die endgültige Anzahl von Zellen in der Kontrolle ohne Beifügen des Testmusters und C die Anzahl von Zellen beim Zeitpunkt des Hinzufügens des Testmusters sind. ID50 (Konzentration von 50% Hemmung) wurde aus der Kurve geschätzt, die durch 65 Aufzeichnen der Konzentration des Testmusters in Abhängigkeit der prozentualen Hemmung gewonnen wurde. Die Resultate sind in Tabelle 3 aufgezeichnet.

Ver bind

Nr.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

15

657 140

Tabelle 3

Abkürzung

Antimikrobielle Potenz C'u-freier Verbindung (iig Potenz/mg) Gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607

50" o Wachstumshemmungs-Konzentration der Cu-freien Verbindung gegenüber Gegenüber gezüchteten HeLa S.rZellen (ID50) Bacillus subtilis ixg/ml

Widerstand der Cu-freien Verbindung gegenüber inaktivierendes Enzym*1

dH-MMA

1447

654

1.2

+ •+• + +

dH-MEA

1895

767

0.98

+ + +

dH-IPA

2778

593

0.95

H—1—l—h +

dH-BA

6595

579

1.10

+

dH-PEP

9846

3772

1.0

+ + + +

dH-EDA

2396

4453

1.0

H—1—1—H

dB2-IPA

6425

1950

0.56

+ + + +

dB2-DHA

24880

950

0.62

+ H—h dB2-TFEA

3990

730

1.03

+ +

dB2-OCT

33700

1500

0.34

+

dB2-PEP

15729

7036

0.71

+ + + + +

dB2-BPA

16438

4384

0.98

H—1—h H—h dB2-LAA

7650

660

0.39

+ + + +

dB2-BA

28140

1650

0.73

+

dB2-ADPM

42320

980

0.39

+ + + + +

dB2-DPE

24480

520

0.67

+ + + +

dB2-NA

33650

1295

1.1

+

dB2-FFA

19150

1285

0.58

+

dB2-AMPY

5160

1010

0.83

+ +

dB2-ATZ

4870

900

0.73

+ +

dPEP-IPA

11998

962

0.17

H—h H—f-

dPEP-PEP

28030

2800

0.80

+ + + + +

dPEP-BA

38348

1380

0.26

+

dPEP-CBA

56328

1184

0.28

+

dPEP-STE

210

0

4

*

dPEP-LAA

3920

384

0.40

+ + + +

dPEP-OCT

45100

886

0.36

+ +

dPEP-MTA

18650

586

0.60

+ + + +

dPEP-DAD

14200

5400

0.43

+ + + +

dPEP-DPE

33802

190

1.02

+ + + +

dPEP-ADPM

54645

430

0.56

+ + + + +

dPEP-DHA

39956

298

0.83

+ +

dPEP-APZ

6359

5009

1.50

+ + + +

dPEP-BPA

26023

2843

0.95

+ + + +

dPEP-ABP

18537

2159

0.90

+ + + +

dPEP-ADP

6061

3694

2.70

+ -f + +

dBAPP-IPA

13210

20048

0.90

+ + + +

dBAPP-BAPP

5100

6600

0.79

+ + +

dMCLBZ-PEP

14880

2590

0.53

+ + + + +

dMCLBZ-OCT

38200

1808

0.43

+ + +

dMCLBZ-DPE

23342

521

0.86

+ + + -t- +

dMCLBZ-DHA

31834

933

0.49

+ + + +

dMCLPE-PEP

15593

4267

0.37

+ + + + +

dMCLPE-OCT

38750

1898

0.23

+ +

dMCLPE-MCLPE

650

270

0.30

+ + + + +

dMCLPE-BPA

31690

3690

0.40

+ + + + +

dMTBZ-PEP

5900

180

2.15

+ + + + +

dMTBZ-OCT

2580

130

1.75

*

dMTBZ-MTBZ

230

1

11.0

*

dMTBZ-BAPP

1417

376

2 2

+ + + +

dMTBZ-BA

24461

410

0.77

+ + +

dMMDBZ-PEP

21371

2372

0.55

H—h + -I—h dMMDBZ-OCT

40703

595

0.23

*

dMMDBZ-BPA

32633

2663

0.80

+ + + +

dEEDBZ-PEP

20840

2150

1.00

+ + + + +

dEEDBZ-OCT

41380

520

0.60

dEEDBZ-BPA

25924

1831

1.5

_| 1 1 1_

dMCO-BPA

62418

5518

0.40

H—(—1—(-

657 140

16

Tabelle 3

Verbindung Nr.

Abkürzung

Antimikrobielle Potenz Cu-freier Verbindung (jig Potenz/mg) Gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607

50% Wachstumshemmungs- Widerstand der Cu-freien Konzentration der Cu-freien Verbindung gegenüber Verbindung gegenüber inaktivierendes Enzym*1

Gegenüber gezüchteten HeLa S3-Zellen (ID50)

Bacillus subtilis jig/ml

59

dMCO-OCT

65733

5473

0.23

+ + +

60

dMCO-PEP

54345

7273

0.33

+ + + + +

61

dMCNBZ-BPA

14730

4755

1.10

+ + + +

62

dMCNBZ-OCT

49270

381

0.28

+ + +

63

dMCNBZ-PEP

21877

11056

0.60

+ + + +

64

dMDDBZOBZ-PEP

115

23

0.058

*

65

dMDDBZOBZ-OCT

153

13

0.30

❖

*1 : Der Widerstand wurde als Inaktivierungsgrad unter den Bedingungen bewertet, unter welchen der Inaktivierungsgrad von Bleomycin B2 50% ist.

Mäuse während 5 Wochen unter Beobachtung gefüttert, dann getötet und bei einer Autopsie untersucht, um die Wirkung und den Grad der Lungen-Fibrosis zu ermitteln. Die Auswertung wurde durchgeführt durch Vergleichen der Anzahl von behandelten Mäusen, die unter Lungen-Fibrosis litten und dem Grad der Krankheit. Die Resultate sind in Tabelle 4 dargestellt.

Der Grad wurde numerisch wie folgt bewertet:

Anzahl Punkte 0: Keine Fibrosis

1 : Ansammlung von Exsudat in Alveolen und fibrosisähnli-

che Änderung im Alveolar-Septum 2: Fibrosis in verschiedenen Bereichen 3 : Zerstreute Fibrosis

4: Fibrosis in mehr als h des gesamten Bereichs

Das Verhältnis in Tabelle 4 wurde durch Vergleich mit «Bleomycin-Komplex» errechnet.

Wertung

Inaktivierungsgrad

+

45% oder mehr

+

35 bis 44%

+ +

25 bis 34" o

+ + +

15 bis 24%

H—1—1—b

5 bis 14%

+ + + + +

weniger als 5%

*

unbestimmbar wegen Adsorption zum

Enzyme-Protein

4. Lungentoxizität (Lugen-Fibrosis) bei Mäusen.

Mäuse der ICR-Rasse (männlich, 15 Wochen alt) in Gruppen von 9 wurden benutzt, jedes Testpräparat wurde durch intraperitonäale Injektion einmal pro Tag während 10 nach-einanderfolgenden Tagen mit einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht. Nach Beendigung der Verabreichung wurden die

Verbindung Abkürzung Nr.

Tabelle 4

Vorkommen

Anzahl Mäuse mit

Lungen-Fibrosis (%)

Grad

Gesamttreffer von Verhältnis

Lugen-Fibrosis/Gesamtanzahl von Mustern {%)

21

dPEP-IPA

3/8 (38)

5/24

21)

0.27

22

dPEP-PEP

1/8(13)

1/21

4)

0.05

33

dPEP-APZ

5/9 (56)

11/27

41)

0.44

34

dPEP-BPA

0/8 ( 0)

0/24

0)

0

37

dBAPP-IPA

3/9 (33)

13/27

48)

0.46

38

dBAPP-BAPP

5/7(71)

7/21

33)

0.32

39

dMCLBZ-PEP

2/9 (20)

2/27

7)

0.07

43

dMCLPE-PEP

0/1 ( 0)

0/ 3

0)

0

45

dMCLPE-MCLPE

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

47

dMTBZ-PEP

0/8 ( 0)

0/24

0)

0

48

dMTBZ-OCT

0/8 ( 0)

0/24

0)

0

49

dMTBZ-MTBZ

0/3 ( 0)

0/ 9

0)

0

51

dMTBZ-BA

0/8 ( 0)

0/24

0)

0

52

dMMDBZ-PEP

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

53

dMMDBZ-OCT

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

54

dMMDBZ-BPA

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

55

dEEDBZ-PEP

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

56

dEEDBZ-OCT

0/9 ( 0)

0/27

0)

0

17

657 140

Verbindung Abkürzung Nr.

Tabelle 4

Vorkommen

Anzahl Mäuse mit

Lungen-Fibrosis (%)

Grad

Gesamttreffer von Verhältnis

Lugen-Fibrosis/Gesamtanzahl von Mustern (%)

57

dEEDBZ-BPA

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

58

dMCO-BPA

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

59

dMCO-OCT

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

60

dMCO-PEP

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

62

dMCNBZ-OCT

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

64

dMDDBZOBZ-PEP

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

7

65

dMDDBZOBZ-OCT

0/9 ( 0)

0/27 ( 0)

0

5. LD50 in Mäusen, bestimmt durch Verabreichen während 10 aufeinanderfolgenden Tagen.

Männliche Mäuse der CDF,/SLC-Rasse (6 Wochen alt, 7 Mitglieder pro Gruppe) wurden subkutan verschiedene Dosen Bleomycin-Derivate einmal pro Tag während 10 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Aus der Sterblichkeit während der Verabreichungsperiode wurde LD50 (tägliche Dosis) durch die Behrens-Kärber-Methode ermittelt. Die Resultate sind in Tabelle 5 aufgezeichnet.

Tabelle 5

Verbindungs-nummer

Abkürzung

LD50 während Verabreichungsperiode von 10 aufeinanderfolgenden Tagen

(mg/kg/Tag)

52

dMMDBZ-PEP

13.9

53

dMMDBZ-OCT

15.0

64

dMDDBZOBZ-PEP

> 81.4

65

dMDDBZOBZ-OCT

> 75.7

Wie aus obiger Beschreibung hervorgeht, waren die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegenüber einem Bleomycin-Inaktivierungsenzym widerstandsfähig und weisen sowohl eine hohe Wachstumshemmungsaktivität gegenüber gezüchteten HeLa S3-Zellen als auch eine bemerkenswerte antimikrobielle Aktivität auf und haben eine sehr niedrige Lungen-Toxizität, welches in positiver Weise ihre Nützlichkeit für den klinischen Bereich nahelegt.

Falls diese Verbindungen als Medikament benutzt werden, werden sie auf übliche Weise mit einem Arzneimittelträger gemischt und in Form von Injektionen, Tabletten, Salben, Suppositorien usw. hergestellt. Geeignete Arzneimittelträger schliessen Wasser, Zucker wie Mannitol und andere Materialien ein, die für medizinische Präparate verwendet werden. Obwohl die Dosis in Abhängigkeit von der Verabreichungsart variiert, wird eine Dosis von 2 bis 10 mg pro Person ein- bis viermal pro Woche verabreicht, wobei die Gesamtdosis 2 bis 200 mg pro Person und Woche beträgt.

Im nachfolgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dargestellt.

Beispiel 1 Schritt A

Frische Rinderleber mit einem Gewicht von 200 g wurde in 400 ml einer 0,05 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 homogenisiert und bei 8000 U/min während 30

Minuten zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit wurde 20 gegen 0,05 M Phosphatpuffer dialysiert, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Zu 10 g Bleomycin B2 wurden 400 ml dieser rohen Enzymlösung zugegeben und bei 37 °C während 24 Stunden zur Reaktion gebracht. Diesem Reaktionsgemisch wurden 40 ml einer 55%igen Trichloro-Essigsäure (kurz TCA) 25 beigegeben, um das Protein zu fällen. Die Fällung wurde durch Zentrifugieren getrennt und dreimal mit 5% TCA-Lösung gewaschen. Die obenstehende Lösung und die Waschlösungen wurden zusammengemischt, mit eienr 4 m Natriumhydroxid-Lösung neutralisiert und mit 3,2 g (2,4 30 Äquivalente zu Belomycin) KUpferazetat zugemischt, um ein Kupferchelat des gewünschten Produktes zu bilden. Zwecks Entsalzung wurde die Kupferchelat-Lösung durch eine Kolonne mit einem Volumen von einem Liter und gepackt mit einem adsorbierenden Harz Diaion® HP 40 (Mitsubishi 35 Chemical Co.) in destilleirtem Wasser durchgeleitet, um die Adsorption des gewünschten Produktes durchzuführen. Nach Abwaschen des Salzes mit 1,5 Liter destilliertem Wasser, wurde die adsorbierte Phase mit einer '/so N wässrigen Salz-säure-Methanol-Mischung (1:4 V/V) herausgelöst, um die 40 Fraktionen mit einem Absorpitonsmaximum bei ungefähr einer Wellenlänge von 290 nm zu erhalten. Die kombinierte Fraktion wurde mit Dowex® 44 (OH-Typ, Dow Chemical Co.) neutralisiert und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde durch eine Kolonne mit einem 45 Volumen von 1 Liter, gepackt mit CM-Sephadex® C-25 (Na+-Typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.) durchgeleitet, das mit einr V19 M Essigsäure-Natriumazetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5 ausgeglichen worden war, um eine Adsorption durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mit 50 dem linearen Konzentrationsgradienten-Verfahren herausgelöst, in welchem Natriumchlorid der obenerwähnten Pufferlösung stetig zugeführt wurde, um die Natrium-Konzentra-tion auf 1,0 M zu erhöhen. Die bei einer Natirum-Konzentra-tion von ungefähr 0,3 M herausgelöste blaue Fraktion wurde 35 gesammelt, dann unter Benutzung von Diaion® HP 40 wie oben beschrieben, entsalzen und lyophilisiert, um 8,5 g (83% Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von kupferenthaltendem Deamidobleomycin B2 zu erhalten.

Das blaue Pulver zeigte Absorptionsmaxima (E 1%/1 cm) 60 bei 242 nm (138) und 291 nm (115), die in destilliertem Wasser bestimmt wurden. Die Infrarot-Absorpitonsmaxima (in Wellenzahlen, cm-1), gemessen in KBr-Pastillen, waren 3425, 2975, 2940, 1720, 1640, 1575, 1460, 1420, 1400, 1375, 1280, 1260, 1240, 1190, 1140, 1100,1060, 1020, 760. Andere physiko-65 chemische Eigenschaften sind in Tabelle 6 gezeigt.

Auf ähnliche Art wie weiter oben beschrieben, unter Benutzung von Bleomycin A2'-C, 3-((S)-l'-Phenyläthyl) -Amino-Propylaminobleomycin und 3-(3-n-Butylaminopro-

657 140

18

pyl-Amino)propylaminobleomycin, wurde Deamidobleomycin A2'-C, 3-((S)-l'-Phenyläthylamino)propylamino-Deami-dobleomycin und 3-(3-n-Butylaminopropylamino)propylami-

nodeamidobleomycin erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in Tabelle 6 aufgezeigt.

Tabelle 6

Synthetisiertes Deamidobleomycin

UV-Absorptionsmaximum der Cu-enthaltenden Form nm (E 1%/1 cm)

TLC*1 der Cu-enthaltenden Form, Rf

Electrophorese*1 der Cu-enthaltenden Form, Rm (Rm von Alanin = 1.0)

Deamidobleomycin B2

242(138)

0.95

0.72

292(115)

0.64*

Deamidobleomycin A2'-C

242(132)

0.75

0.62

292(110)

0.46*

3-((S)-1 '-Phenyläthylamino)propyldeamido-

242(147)

0.87

0.67

bleomycin

292(124)

0.40*

3-(3-n-Butylaminopropylamino)propyIamino-

242(142)

0.83

deamidobleomycin

292(118)

0.55*

*1 : Silica-Gel 60F 254 Silanised®» (Merck Co.); gemessen in

Methanol-6%iger Ammonium-Azetat-Lösungsmischung

(60:40 V/V), ausgenommen für Rf-Werte mit einem Aste-

risk, das in einer anderen Mischung gemessen wurde

(65:34 V/V).

Schritt B

Einer Lösung von 1 g eines kupferenthaltenden Deamido-bleomycins B2, erhalten in Schritt A, und 1,77 g von 1-Hydro-xybenzotriazol (kurz HOBT) in 10 ml Dimethylformamid, wurde unter Kühlung bei 0 °C und Rühren 1,35 g (10 Äquivalente zu Bleomycin) von Dicyclohexylcarbodiimid (kurz DCC) beigefügt. 5 Minuten nachher wurden dieser Lösung 840 mg (5 Äquivalente zu Belomycin) von 3-((S)-l'-Phenyl-äthylamino)propylamin-Hydrochlorid und 0,72 ml N-Methy-lamorpholin hinzugefügt. Die entstehende Mischung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur während 16 Stunden zur Reaktion gebracht. Dem Reaktionsgemisch wurden das lOfache Volumen Azeton beigemischt, um das gewünschte Produkt zu fällen. Nach gründlichem Waschen mit Azeton, wurde die Fällung in destilliertem Waschen gelöst und durch eine Kolonne von 100 ml Volumen, gepackt mit CM-Sepha-dex® C-25 (Na+-Typ, Pharmacia Fine Chemicals Co), geleitet, welche mit einer 'Ao M Essigsäure-Natriumazetatpufferlö-sung mit einem pH-Wert von 4,5 ausgeglichen worden war, um eine Adsorption durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mittels dem linearen Konzentrationsgradienten-Verfahren herausgelöst, in welchem Natriumchlorid fortlaufend der obengenannten Pufferlösung hinzugefügt wurde, um die Natrium-Konzentration auf 1,0 M zu erhöhen. Die bei einer Natrium-Konzentration von ungefähr 0,6 M eluierte blaue Fraktion wurde gesammelt. Die kombinierte Fraktion wurde unter Benutzung von 100 ml Diaion® HP-40 entsalzen und lyophilisiert, um 880 mg (76% Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers aus kupferenthaltendem (Amido)N-[3-((S) -l'-PhenyläthyIamino)propyl]-Bleomycin B2 zu ergeben. Es zeigte Absorptionsmaxima (E I%/l cm) bei 243 nm (125) und 292 nm (96) in destilliertem Wasser gemessen. Die IR Absor-piton (in Wellenzahl, cm-'), in KBr-Pastillen gemessen, war 3425,2975,2930, 1720, 1640, 1580, 1575, 1550, 1455, 1430, 1400, 1370, 1290, 1240, 1190, 1130, 1095, 1060, 1005, 980, 875, 760. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 2 dargestellt.

In ähnlicher Manier wie oben beschrieben wurden kupferenthaltende Formen von ( Amido)N-substituierte Bleomycin B2 Nrn. 7 bis 20 gemäss Tabelle 2 synthetisiert durch die Reaktion von kupferenthaltenden Deamidobleomycin B2 mit Aminen, die den gewünschten Produkten entsprechen.

*2: Avicel SF® (FMC Co.); Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75:900 V/V); 800 V, 15 Minuten.

25

Auf ähnliche Weise wurden die Verbindungen Nrn. 1, 6, 21 bis 38, 64 und 65 gemäss Tabelle 2 synthetisiert durch die Reaktion von Deamidobleomycin A2'-C, 3-((S)-l'-Phenyl-30 äthyl Jaminopropylamino-Deamidobleomycin und 3-(3-n-Butylaminopropylamino)propylamino-Deamidobleomycin (jedes Deamidobleomycin in kupferenthaltender Form) mit Aminen, die den gewünschten Produkten entsprechen.

35 Schritt C

In 20 ml destilliertes Wasser wurden 880 mg der in Schritt B erhaltenen kupferenthaltenden Verbindungen aufgelöst. Zwecks Entsalzen wurde die Lösung durch eine Kolonne von 100 ml Volumen, gepackt mit Amberlite® XAD-2, in destil-40 liertem Wasser geleitet, um die Adsorption der kupferenthaltenden Verbindung durchzuführen. Das Harz wurde hintereinander mit 300 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend Natriumchlorid und 5% EDTA. 2 Na, 100 ml einer 2%wässri-gen Natriumchlorid-Lösung und 250 ml destilliertem Wasser 45 gewaschen. Die adsorbierte Phase wurde dann mit einer1 so N Salzsäure-Methanol-Mischung (1:4 V/V) herausgelöst, um die Fraktionen zu erhalten, die ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von ungefähr 290 nm zeigten. Die kombinierte Fraktion wurde mit Dowex® 44 (OH-Typ, Dow Chemi-30 cal Co.) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, dann unter erniedrigtem Druck konzentriert und lyophilisiert, um 790 mg (93% Ausbeute) eines weissen amorphen Pulvers von kupferfreiem (Amido)-N-[3-((S)-r-Phenyläthylamino)propyl]-Bleo-mycin B2-Hydrochlorid zu ergeben. Das UV-Absorptionsma-55 ximum und (E l%/\ cm) war 291 nm und (79) respektive. IR-Absorptionsmaxima (in Wellenzahl, cm - '), gemessen in KBr-Pastillen, waren 3425, 2950, 1720, 1640, 1555, 1450, 1400, 1360, 1320, 1260, 1190, 1060, 880, 910, 805, 770 und 700. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 2 60 gezeigt.

Beispiel 2 Schritt A

Pilz-Myzels mit einem Gewicht von 400 g, erhalten durch 65 Züchtung von Fusarium roseum IFO 7189, niedergelegt im Institute for Fermentation, Osaka, wurde in 4 ml einer Im M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 homogenisiert. Dieser homogenisierten Mischung wurde eine Lösung

19

657 140

von 10 g kupferenthaltendem (Amido)N-[3-((S)-l'-Phenyl-äthylamino)propyl]-Bleomycin B2 in einem Liter der gleichen Phosphat-Pufferlösung beigefügt. Die Mischung wurde bei 37 °C während 20 Stunden zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde mit Hilfe eines Saugfilters gemischt und der Rest wurde mit der gleichen Pufferlösung wie oben erwähnt gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden miteinander gemischt und durch eine Kolonne, gepackt mit einem Liter eines adsorbierenden Harzes Amberlite® XAD-2, in destilliertem Wasser geleitet, um die Adsorption des gewünschten Produkte durchzuführen. Nach dem Abwaschen der Salze mit 2 Liter destilliertem Wasser wurde die adsorbierte Phase mit 50%igem wässrigen Methanol herausgelöst, um 5 Liter von blauen oder blau-grünen Fraktionen zu erhalten. Die kombineirte Fraktion wurde bei Unterdruck konzentriert, dann in 350 ml von 80%igem Methanol aufgelöst und durch eine Kolonne, gepackt mit 70 ml Aluminiumoxyd in 80%igem Methanol geleitet. Die Kolonne wurde mit 100 ml 80%igem Methanol gewaschen und mit 40% Methanol entwickelt, um 350 ml der blauen eluierten Fraktionen zu erhalten. Die kombinierte Fraktion wurde bei Unterdruck konzentriert, dann in destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine Kolonne mit einem Volumen von 600 ml geleitet, die mit CM-Sephadex® C-25 (Na+-Typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.) gepackt war und die mit einer V20 M Essigsäure-

Natriumazetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5 ausgeglichen worden war, um die Adsorption des gewünschten Produktes durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mittels des linearen Konzentrationsgradienten-Verfahrens her-5 ausgelöst, in welchem Natriumchlorid stetig der obigen Pufferlösung zugefügt wurde, um die Natrium-Konzentration auf 1,0 M zu erhöhen. Die bei einer Natrium-Konzentration von ungefähr 0,2 M herausgelösten blauen Fraktionen wurden gesammelt, dann unter Benutzung von Diaion® HP 40 entsal-10 zen und lyophilisiert, um 7,1 g (79% Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von kupferenthaltenden (Amido)N-[3-((S)--l'-Phenyläthylamino)propyl]-Bleomycinsäure zu ergeben. Die UV-Absorptionsmaxima und (E 1%/1 cm), gemessen in destilliertem Wasser, waren 245 nm (121) und 293 nm (119). 15 Die IR-Absorpitionsmaxima (in Wellenzahl, cm-1), gemessen in KBr-Pastillen, waren 3450, 2975, 2940, 1720, 1645, 1580, 1555, 1460, 1370, 1300, 1190, 1140, 1095, 1060, 1005,980, 880, 765 und 700. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 7 dargestellt.

20 In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wurde (Amido) N-n-Octyl-Bleomycinsäure und (Amido)N-(3-Dibutylamino-propyl)-Bleomycinsäure aus (Amido)N-n-Octylbleomycin B2 und (Amido)N-(3-Dibutylaminopropyl)bleomycin B2 erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Säuren sind 25 in Tabelle 7 dargetellt.

Tabelle 7

Synthetisierte (Amido)N-substituierte UV-Absorptionsmaximum der TLC*'der Electrophorese*2 der

Bleomycinsäure Cu-enthaltenden Form, Cu-enthaltenden Cu-enthaltenden Form,

nm (E IVI cm) Form, Rf Rm (Rm von Alanin = 1.0)

(Amido)N-[3-((S)-l'-Phenyiäthylamino)- 245(121) 0.93 0.84

propyl]Bleomycinsäure 293 (119) 0.62*

(Amido)N-(3-Dibutylaminopropyl) 247(123) 0.93 0.88

Bleomycinsäure 294(123) 0.62*

(Amido)N-(Octyl)Bleomycinsäure 245 (130) 0.79 0.59

293 (128) 0.20*

*1: «Silica-Gel 60F 254 Silanised®» (Merck Co.): gemessen 4n in Methanol-6%iger Ammonium-Azetat-Lösungsmischung (60:40 V/V), ausgenommen für Rf-Werte mit einem Asterisk, das in einer anderen Mischung gemessen wurde (65:34 V/V).

43

Schritt B

In 10 ml DM F wurden 1,0 g von kupferenthaltender ( Amido )N-[3-(( S)-r-Phenyläthylamino)propyl]-Bleomycin-säure von Schritt A und 1,71 g HOBT gelöst. Auf ähnliche Weise wie in Schritt B von Beispiel 1, unter Benutzung von ^ 1,31 g DCC, wurde die Lösung mit 340 mg 3-[N-(3'-Cyclooc-tylmethylamino)propyl-N-Methylamino]propylamin während drei Stunden zur Reaktion gebracht, um ein Kondensationsprodukt zu bilden. Wie in Beispiel 1 wurde das Reaktionsgemisch mit Azeton behandelt, dann mittels der CM-Sephadex® Chromatographie gereinigt und durch eine 100 ml Amberlite® CAD-2 Kolonne geführt, um die Adsorption durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mit dem linearen Konzentrationsgradienten-Verfahren herausgelöst, wobei 500 ml Methanol fortwährend 500 ml einer Azetatpufferlösung mit einem M) pH-Wert von 4,5 zugegeben wurden, um die Methanol-Konzentration linear zu erhöhen.

Das vorgesehene Produkt wurde bei einer Methanol-Kon-zentration von 40 bis 50% herausgelöst. Diese Lösung wurde unter Benutzung einer 100-ml-Diaion- HP 40 Kolonne entsal-zen und lyophilisiert, um 980 mg (83"" Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von 3-[N-3'-(Cyclooctylamino)propyl-N-Methvlamino]propylamino-( Amido)N-[3- ((S)-l'-Phenyläthyl-

*2: Avicel SF®(FMC Co.); Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (27:75:900 V/V); 800 V, 15 Minuten.

amino)propyl]-Bleomycin (kupferenthaltende Form) zu ergeben.

Schritt C

In 22 ml destilliertes Wasser wurden 980 mg kupferenthaltendes 3-[N-(3'-Cyclooctylmethylamino)propyl-N-Methyl-amino] propylamino-(Amido)N-[3-((S)-!'-Phenyläthyl)amino-propvl]-Bleomycin von Schritt B gegeben. Die Lösung wurde einer kupferentfernenden Behandlung, wie in Beispiel 1, unterworfen unter Benutzung von Amberlite® XAD-2 und einer 5"n wässrigen EDTA-2Na-Lösung. Die gereinigte Lösung aus der Kolonne wurde lyophilisiert, um 870 mg (92% Ausbeute) eines farblosen amorphen Pulvers von kupferfreiem 3-[N-(3'-Cyclooctylmethylamino)propyl-N-Methvl-amino]propylamino-(Amido) N-[3-((S)-l'-Phenyläthylamino) propyl]-Bleomycin-Hydrochlorid zu ergeben. Das UV-Absorptionsmaximum und (E IV1 cm), gemessen in destilliertem Wasser, waren 291 nm und (89). Die IR-Absorptions-maxima (in Wellenzahl, cm"'), in KBr-Pastillen gemessen, waren 3400. 29256, 1720, 1650, 1550, 1520. 1480. 1460, 1450, 1405. 1385, 1360, 1320, 1255, 1190, 1130, 1100, 1055, 1020, 980, 960, 880, 805. 760, 725 und 695. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 2 angegeben.

657 140

20

In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wurden die kupferfreien Verbindungen Nr. 20 bis Nr. 63 von Tabelle 2 aus entsprechenden Ausgangsmaterialien hergestellt.

Beispiel 3 Schritt A

Auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 wurden 1,5 g eines kupferenthaltenden Deamidobleomycins B:, hergestellt in Beispiel 1, mit einer homogenisierten Mischung von 60 g von gezüchteten Myzels der Fusarium roseum und 750 ml einer Vio M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 gemischt. Die Mischung wurde bei 37 während 21 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Beispiel 2 behandelt und durch eine 500-ml-Kolonne Amberlite® XAD-2 geführt, um die Adsorption der vorgesehenen Substanz durchzuführen. Die Kolonne wurde mit 750 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit einer Wasser-Methanol (4:1)-Mischung eluiert, um die grünen Fraktionen (750 ml insgesamt) zu erhalten, die bei Unterdruck konzentriert wurden. Das Konzentrat wurde durch eine 60-ml-Kolonne geleitet, gepackt mit CM-Sephadex® C-25 (Na+-Typ, Pharmacia Fine Chemicals Co.), die mit einer !'2« M Essigsäure-Natriumazetat-Pufferlösung mit pH-Wert von 4,5 ausgeglichen worden war. Die Kolonne wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und die blauen Fraktionen (80 ml insgesamt) wurden gesammelt. Nach Wiederholung der CM-Sephadex® Chromatographie wurde die gereinigte blaue Fraktion konzentriert und durch eine 1 Liter-Kolonne, gepackt mit Sephadex® LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) in einer Wasser-Methanol ( 1:4)-Mischung geleitet. Die kombinierte blaue Fraktion wurde bei Unterdruck konzentriert und lyophilisiert, um 890 mg (87% Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von kupferenthaltenden Deamido-bleomycinsäure zu ergeben. UV-Absorptionsmaximum und (E 1%/1 cm), in destilliertem Wasser gemessen, waren 254 nm (143) und 292 nm (144). IR-Absorptionsmaxima (in Wellenzahl, cm-1), gemessen in KBr-Pastillen, waren 3450, 2975, 2940, 1720, 1640, 1560, 1465, 1420, 1380, 1280. 1190, 1140, 1100, 1060, 1020,990, 880, 810 und 775. Unter den Bedingungen von Tabelle 7 waren die Rf-Werte in der Dünnschicht-Chromatographie 0,91 * und der Rm-Wert der Elektrophorese war 0,49.

Schritt B

In 5 ml Dimethylformamid wurden 500 mg einer in Schritt A erhaltenen kupferenthaltenden Verbindung aufgelöst sowie 2,010 mg HOBT. Die Lösung und 3-((S)-l'-Phenyläthylami-no)propylamin wurden während 21 Stunden einer Kondensation unterworfen, wie in Beispiel 1, unter Benutzung von 770 mg DCC. Wie in Beispiel 2 wurde das Reaktionsgemisch mit Azeton behandelt und mittels der CM-Sephadex® und Amberlite® CAD-2 Chromatographie gereinigt, unter Benutzung von Diaion ®HP-40 entsalzen und lyophilisiert, um 280 mg (42% Ausbeute) eines blauen amorphen Pulvers von kupferenthaltenden 3-((S)-l'-Phenyläthylamino)propyl-amino-(Amido) N-[3-((S)-1 '-Phenyläthylamino)propyl]-Bleo-mycin zu ergeben.

In gleicher Weise wie oben beschrieben, wurden 3-(3-n-Butylaminopropylamino)propylamino-( Amido)N-[3-(3-n-Butylaminopropylamino) propyl]-Bieomycin und 3-jN-3-[2-(p-Chlorophenyl)äthyIamino]propyl-N- Methylamino}-propylamino-(Amido)N-[3-(2-(p-Chlorophenyl) äthylamino) propyl-N-MethylaminopropyI]-Bleomycin erhalten, wobei 3-(3-n-Butylaminopropylamino)propylamin und N-[N-(3-Aminopropyl)-N-Methylaminopropyl]-N- [2-(p-Chloro-phenyl)äthyl]amin benutzt wurden.

Schritt C

In 8 ml destilliertes Wasser wurden 280 mg kupferenthaltendes 3-((S)-r-PhenyläthyIamino)propylamino-(Amido)N-[3-((S)-l'-Phenyläthyl)aminopropyl]-Bleomycin, erhalten in Schritt B, aufgelöst. Die Lösung wurde wie in Beispiel 1 einer kupferentfernenden Behandlung unterworfen, unter Benutzung von Amberlite® XAD-2 und 5"oige wässrige EDTA.2Na-Lösung. Die geklärte Lösung aus der Kolonne wurde lyophilisiert, um 250 mg (92% Ausbeute) eines weissen amorphen Pulvers von kupferfreiem 3-((S)-l'-Phenyläthylamino)pheny-lamino-(Amido)N-[3-((S) -1 '-Phenyläthylamino)propyl]-BIeo-mycin zu ergeben. Die IR-Absorptionsmaxima (Wellenzahl, cm-'), in KBr-Pastillen gemessen, waren 3370,2975,2940, 1715, 1660, 1565, 1500, 1455, 1385, 1320, 1255, 1190, 1140, 1100. 1060, 1020,970,920,880, 805,760,730 und 695. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 2 gezeigt.

Auf gleiche Art wurden die in Schritt B aufgezeichneten Verbindungen in eine kupferfreie Form überführt, deren physikochemische Eigenschaften in Tabelle 2 dargestellt sind.

Beispiel 4

Eine Lösung von 10,22 g 3-Aminopropyldimethylamin in 100 ml Methanol wurde mit 12 ml Eisessig neutralisiert und mit 100 g Benzaldehyd gemischt. Der gerührten Lösung wurden portionenweise 8,38 g Natriumcyanoborohydrid beigegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 16 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 1 gebracht und durch Destillation bei Unterdruck vom Methanol befreit. Der Rest wurde mit 200 ml Wasser und 200 ml Chloroform behandelt. Die wässrige Schicht wurde getrennt und mit 200 ml Chloroform extrahiert, um das Benzaldehyd zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde mit Natrium-Hydroxid auf einen pH-Wert von 12 eingestellt und zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Das Chloroformextrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und durch Destillation bei Unterdruck vom Lösungsmittel befreit, um 26 g (92% Ausbeute) [3-(N,N-Dimethylamino)propyl]-Dibenzylamin zu ergeben.

Das oben erhaltene Amin wurde in 100 ml Azetonitril gelöst. Der gerührten Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von 22,25 g N-(3-Bromopropyl)-Phthalimid in 100 ml Azetronitril beigegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 18 Stunden gerührt bis das Halid verschwunden war, was durch Dünnschicht-Chromatographie bestätigt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch Destillation bei Unterdruck vom Azetonitril befreit. Der Rest wurde in 200 ml 6 N Salzsäure aufgelöst und durch Erhitzen bei 110 °C während 8 Stunden hydrolisiert. Die hydrolisierte Lösung wurde gekühlt, von der gefällten Phthalsäure durch Filtration befreit, zur Trockne eingedampft, in destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine Kolonne mit einem Ionenaustauscherharz Dowex® -1 (Cl-Typ, 279 ml Volumen) durchgeleitet. Die durchgeleitete Lösung wurde bei Unterdruck zur Trockne eingedampft, um 43,7 g N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N, N-Dimethylamino]propyl}dibenzylamin-Trihydrochlorid zu ergeben. Das in schwerem Wasser ermittelte PMR-Spektrum dieser Verbindung zeigte die folgenden Signale:

S (ppm) = 2.0 - 2.7,4H (m); 2.9 - 3.8, 8H (m); 3.3, 6H (s); 4.6,4H (m); 7.7, 10H (s), (worin die in Klammer gesetzten m und s für Multiplett und Singulett stehen ). Diese Signale sind für die oben angegebene chemische Struktur hinweisend. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 8 dargestellt.

Auf ähnliche Weise wie oben wurde N-{3-[N-(3-Amino-propyl)-N,N-Diäthylamino]propyl| dibenzylamin-Trihydro-chlorid aus 3-AminopropyIdiäthylamin als Ausgangsmaterial

5

Ii.)

1-5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

21

657 140

i erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften sind in Tabelle 8 dargestellt.

Beispiel 5

In 180 ml Wasser wurden 150 g bis(3-Aminopropyl) methylamin, gefolgt von 53 g Triäthylamin, aufgelöst. Diese Lösung wurde, bei Eiskühlung und Rühren, portionenweise einer Lösung von 83 g (W Äquivalent) 4,6-Dimethyl-2-tert-Butoxycarbonylthiopyrimidin in 200 ml Dioxan beigegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Destillation bei Unterdruck von Dioxan und Triäthylamin befreit. Der Rest wurde mit 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit Chloroform gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 13,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und durch Destillation bei Unterdruck vom Lösungsmittel befreit, um 60 g (24% Ausbeute) von (3-tert-Butoxycarbonylamino-propyl)-(3-Aminopropyl)methylamin (BOC-APMP) zu ergeben.

In 130 ml Methanol wurde das oben erhaltene BOC-APMP aufgelöst. Dieser Lösung, bei Eiskühlung und unter Rühren, wurden 69 g (2 Äquivalente) Cyclooctancarboxylal-dehyd und eine Lösung von 10 g Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN) in 20 ml Methanol beigegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 30 ml 6 N Salzsäure hinzugefügt, um das überschüssige Reduzierungsmittel abzubauen und die tert-Butoxy-Gruppe zu entfernen. Die Mischung wurde durch Destillation bei Unterdruck vom Methanol befreit, mit 400 ml destilliertem Wasser gemischt und mit 300 ml Chloroform extrahiert, um das Rest-Aldehyd zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 13,5 eingestellt und zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die das gewünschte Produkt enthaltende Chloroformschicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und durch Destillation bei Unterdruck vom Chloroform befreit. Der Rest wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und mit 50 ml konzentrierter Salzsäure gemischt und zur Trockne eingedampft, um 66 g (71% Ausbeute) N-{3-[N-(3-Aminopropyl-N-Methylamino]propyl [cyclooctylamin-Trihydrochlorid zu ergeben.

Das in schwerem Wasser bestimmte PMR-Spektrum dieser Verbindung zeigte die folgenden Signale: S(ppm) = 1.2 -2.3, 15H (m); 2.0 - 2.8,4H (m); 3.0 - 3.9, 10H (m); 3.25, 3H (s), (worin m und s die obige Bedeutung haben).

Diese Signale sind für die oben angegebene chemische Struktur hinweisend. Andere physikochemische Eigenschaften sind in Tabelle 8 dargestellt.

In gleicher Weise wie oben beschrieben wurden N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N-Methylamino]propyl [-p-Cyanobenzyl-amin-Trihydrochlorid (81% Ausbeute) und N-{2-[N-(3-Ami-nopropyl)-N-Methylamino]propyl}-2-(p- Chlorophenyl)äthy-lamin-Trihydrochlorid (51% Ausbeute) aus p-Cyanobenzal-dehyd und p-Chlorophenylazetaldehyd erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in Tabelle 8 dargestellt.

Beispiel 6

Eine im ersten Schritt von Beispiel 5 erhaltene Lösung von 14,90 g BOC-APMP in 300 ml Methanol wurde mit Eisessig auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt. Dieser eisgekühlten Lösung wurden 77,30 g (4 Äquivalente) von 3,4-Dibenzyloxy-benzaldehyd, gefolgt von 5,0 g NaBH3CN, beigegeben. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gebracht, dann während 96 Stunden gerührt und durch Destillation bei Unterdruck vom Methanol befreit. Der Rest wurde mit 200 ml destilliertem Wasser verdünnt und zweimal mit je 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, auf 100 ml konzentriert und durch eine Silikagel-Kolonne mit einem Volumen von 1200 ml durchgeleitet, die vorgehend mit Chloroform ausgewaschen worden war, um die Adsorption der gewünschten Verbindung in der Kolonne durchzuführen. Die adsorbierte Phase wurde mit einer Chloroform-Methanol-Mischung herausgelöst, während die Methanol-Konzentration schrittweise erhöht wurde. Das gewünschte Produkt wurde in dem Stadium herausgelöst, in welchem das Chloroform-zu-Methanol-Verhältnis 97:3 erreichte. Die herausgelösten Fraktionen mit dem gewünschten Produkt wurden vereinigt und bei Unterdruck konzentriert, um 31,43 g l-[N-(3-tert-Butoxycarbonyl-aminopropyl)-N-Methylamino]-3- [bis(3,4-Dibenzyloxyben-zyl)amino]propan in öliger Form zu erhalten. Einer Lösung dieses Öls in 78,6 ml Dichloromethan wurde, unter Eiskühlung und Rühren, 78,6 ml Trifluoroessigsäure (TFA) tropfenweise während einer Dauer von 30 Minuten zugegeben. Die Mischung wurde während 1,5 Stunden bei 0 °C zur Reaktion gebracht. Die Badtemperatur wurde dann auf 25 °C erhöht und das Lösungsmittel wurde bei Unterdruck abdestilliert. Der Rest wurde mit 200 ml destilliertem Wasser und 50 ml einer 5 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung gemischt und mit 500 ml Chloroform extrahiert, um 3-{N-{N-Methyl-N-[3'-bis(m,p-Dibenzyloxybenzyl)aminopropyl]amino}}propyla-min (kurz MDD-Amin) zu erhalten. Die wässrige Schicht wurde nochmals mit 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten wurden vereint, über Natriumsulfat getrocknet und bei Unterdruck von Chloroform befreit, um 26,30 g rohes Öl von MDD-Amin zu ergeben. Zwecks Reinigung wurde das rohe Öl einer Amberlite® XAD-2 (2000 ml Volumen) Kolonnen-Chromatographie unterworfen, die auf folgende Weise durchgeführt wurde. Das rohe Öl wurd ein 75 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde mit 750 ml einer 4%igen wässrigen Kaliumazetat-Lösung und 2%igen wässrigen Essigsäure (1:1)-Pufferlösung gemischt. Die resultierende Suspension wurde durch die genannte Kolonne durchgeleitet, um das gewünschte Produkt daran zu adsorbieren. Die genannte Pufferlösung wurde durch die Kolonne geleitet und Methanol hinzugefügt, um schrittweise die Methanol-Konzentration zu erhöhen. Das gewünschte Produkt (MDD-Amin) wurde bei einem Puffer-zu-Methanol-Verhältnis von 15:85 eluiert. Die Fraktion mit dem gewünschten Produkt wurde durch Destillation bei Unterdruck vom Methanol befreit, dann mit einer 5 N wässrigen Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 13 eingestellt, dann dreimal mit je 300 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten wurden vereint, über Natriumsulfat getrocknet und durch Destillation bei Unterdruck vom Chloroform befreit, dann über Phosphorpentoxid getrocknet, um 21,08 g (46,2% Ausbeute) MDD-Amin (freie Base) in Form von Öl zu ergeben. Die physikochemsichen Eigenschaften sind in Tabelle 8 dargestellt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

657140 22

Tabelle 8

Synthetisiertes Amin IR (cm ') PMR*1 (ppm) Rm*2 Rf*3

(KBr-Tablette) (60 MHz, D20)

N-{3-[N-(3-AminopropyI)-N,N-Dimethylamino] 3425,2975,2750,2600,2000, 1640,

propylJ-dibenzylamin-Trihydrochlorid

N-{3-[N-(3-AminoporpyI)-N,N-

Diäthylamino]propyl}-dibenzylamin-

Trihydrochlorid

N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N-

Methylamino]propyl}-Cyclooctylmethylamin-

Trihydrochlorid

N-{3-[N-(3-Aminopropyl)-N-

Methylamino]propyl}-(p-Cyanobenzyl)amin-

Trihydrochlorid

N-{3-yEN-(3-AminopropyI)-N-

Methylamino]propyl}-2-(p-

Chlorophenyl)äthylamin-Trihydrochlorid

3-{N-{N-Methyl-N-[3-bis(m,p-

Dibenzyloxybenzyl)amino-

propyl]amino}}propylamin

1600,1480,1460,1420,1350, 1300, 1220, 1190, 1160, 1120, 1060, 1030, 960, 920, 850, 700

3425,2975, 2750, 2600,2000, 1600, 1480, 1450, 1400, 1200, 1180, 1160, 1120,1080,1050,1020, 990, 960, 900, 800, 740, 680

3425, 2950, 2875, 2775, 2700, 2050, 1600, 1480, 1300, 1200, 1170, 1140, 1070, 990, 970, 950, 850, 770

3425, 2975, 2800, 2750, 2675, 2250, 2000, 1960, 1840, 1700, 1600, 1520, 1300, 1220, 1170, 1120,1060, 1030, 990, 970, 900, 860, 830, 760

3425, 2975, 2800, 2650, 2500, 2000, 1600, 1500, 1460, 1410, 1310, 1200, 1160,1100,1070,1027, 960, 860, 810, 760, 720, 650

690, 730, 790, 805, 850, 905, 1020, 1085, 1130, 1160, 1195, 1220, 1265, 1380, 1425, 1455, 1510, 1590, 1610, 1650, 1760, 1815, 1880, 1960, 2800, 2870, 2940, 3040, 3075, 3375, 3660

2.0-2.7 4H(m) 1.32 0.72 2.9-3.8 8H (m)

3.3 6H (s)

4.6 4H (m)

7.7 10H (s)

1.4 6H(t) 1.64 0.81 1.9-2.6 4H (m)

4.7 4H (s)

7.7 10 H (s)

1.2-2.3 15H (m) 1.77 0.30 2.0-2.8 4H (m)

3.0-3.9 ÎOH (m)

3.25 3H (m)

2.0-2.7 4H (m) 1.86 0.38

3.0-3.8 8H (m)

3.1 3H (s)

4.5 2H (s)

7.7-8.1 4H (m)

2.1-2.8 4H (m) 1.78 0.27 2.9-3.9 12H (m)

3.2 3H (s)

7.4-7.8 4H (m)

1.2-1.9 6H (m) 0.78 0.24*4 2.0-2.9 11H (m)

3.43 4H (s)

5.16 8 H (s)

6.6-7.7 26H (m)

*1 : s, t und m in Klammern steht für Singulett, Triplett und Multiplett.

*2: Relative Mobilität, wenn diejenige von Alanin 1.0 ist de Dünnschichtelectrophorese (Avicel SF®; FMC Co.; Ameisensäure- Essigsäure- Wasser (27:75:900 V/V), 800 V, 6 Minuten).

*3: Dünnschicht- Chromatographie; Silica- Gel 60F 254 (Merck Co.), Methanol- 10%ig wässrige Ammonium- Azetat- Lösung-

10%ig wässriges Ammonium (1:1:1 V/V), Ninhydrin- Farbreaktion.

*4 Methanol- 10%ig wässrige Ammonium- Azetat- Lösung- 10%ig wässriges Ammonium (10:1:1 V/V).

G

Claims (18)

1. 657 140

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. (Amido)N-substituierte Bleomycine, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (I) oder ein Salz davon:

   CONH,

   NH,

   CH

   NH .CH.

   /\ / \

   CH XCH-, CO-NH-X

   (I)

   N'

   BM"

   N il—

   -CO-R H

   H

   worin BM einen Anteil des Bleomycin-Skeletts darstellt; X (A) ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatome, (B) ein Amino-alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatome, (C) ein niederes Alkyl mit als Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatome, (b) 1 oder 2 Phenyl-Gruppen, (c) eine Indolyl-Gruppe oder (d) eine 5-oder ógliedrige heterozyklische Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom und wobei unter den Substituenten-Gruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine niedere Alkoxygruppe substituiert sein kann, (D) X,-(niederes)Alkyl, worin X,

   ein Mono- oder Di-(niederes)Alkylamino(niederes)alkyl ist, welches durch eine Phenyl- oder Halophenyl-Gruppe substituiert sein kann, X4 (a) ein niederes Alkyl oder (b) ein Phe-nyl(niederes)alkyl ist, oder X ein Thiazolyl oder ein N-Phe-5 nyl(niederes)alkylpiperazinyl ist.
2. 4. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin das Xr(niederes)Alkyl ein Mono-oder Di-(niederes)Alkylamino(niederes)alkylamino(niederes) alkyl, ein Phenyl(niederes)alkylamino(niederes)alkyl. ein io Di(niederes)alkylamino(niederes)alkyl, ein N-[Halophe-nyl(niederesjalkylamino(niederes)alkyl]-N-(niederes)Alkyl-amino(niederes)alkyl, oder ein N-(niederes)Alkyl-N-Phe-nyl(niederes)alkyI-N-[DiphenyI(niederes)alkylamino (niede-res)alkyl]ammonio(niederes)alkyl ist. 15 5. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin R eine aliphatische primäre Amino-Gruppe ist, deren N-ständiger Substituent eine oder mehrere basische Gruppen enthält.
3. 6. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon 20 nach Anspruch 5, worin die eine basische Gruppe enthaltende aliphatische primäre Amino-Gruppe eine 1 -Phenyl-äthylaminopropylamino-Gruppe, Butylaminopropylamino-Gruppe oder eine Gruppe der Formel -NH(CH2)3-A'-(CH,)3-B' ist, worin A'

   X-

   -N-X3 Oder

   -N-X

   1

   X-

   fio'

   -N-

   oder

   30

   ,10

   -ÌGL

   I

   Rn'

   X2 ein Wasserstoffatom, ein niederes Alkyl oder Benzyl, X3 (a) ein niederes Alkyl, (b) ein Phenyl(niederes)alkyl oder (c) ein Mono- oder Di-(niederes)Alkylamino(niederes)alkyl ist, welches durch eine Phenyl oder Halophenyl-Gruppe substituiert sein kann, X4 (a) ein niederes Alkyl oder (b) ein Phenyl-(niederes)alkyl ist, (E) Naphthyl, (F) Thiazolyl oder (G) ein N-Phenyl(niederes)alkylpiperazinyl ist; und R ein von einem substituierten oder unsubstituierten aliphatischen Amin abgeleiteter Amidorest ist.
4. 2. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X der allgemeinen Formel (I) ein Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatome oder ein niederes Alkyl mit als Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatome, (b) 1 oder 2 Phenyl-Gruppen, (c) eine Indolyl-Gruppe oder (d) eine 5-oder ógliedrige heterozyklische Gruppe enthaltend ein Schwefel- oder Stickstoffatom ist und wobei unter den Substi-tuenten-Gruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine niedere Alkoxygruppe substituiert sein kann.
5. 3. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X in der allgemeinen Formel I ein Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatome, ein Trihalo-(niederes) Alkyl, ein Aminoalkyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatome, ein Phenyl(niederes)alkyl, ein Halophenyl(niederes)alkyl, ein Di-Phenyl(niederes)alkyl, ein Methoxyindolyl, ein Pyridyl(niede-res)alkyl, ein Piperazinyl(niederes)alkyl, ein Xr(niederes) Alkyl, worin X,

   X X,

   |2 I2©

   -N-X. oder -N-X-,

   X2 ein Wasserstoffatom, ein niederes Alkyl oder Benzyl, X3 (a) ein niederes Alkyl, (b) ein Phenyl(niederes)alkyl oder (c)

   ist, worin R|0' ein niederes Alkyl und Rn' ein niederes Alkyl oder Benzyl ist und B'

   V

   ist, worin RI2' ein Phenyl(niederes)alkyl ist, das auf seiner Phenyl-Gruppe ein oder mehrere (a) Halogenatome, (b) 40 Cyano-Gruppen oder (c) Benzyloxy-Gruppen oder ein niederes Alkyl substituiert durch eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 13 Kohlenstoffatome aufweisen kann; und R13' ein Wasserstoffatom oder Benzyl-Gruppe ist, die durch ein oder zwei Benzyloxy-Gruppen substituiert sein kann. 45 7. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X ein Isopropyl, 1-Phenyläthylami-nopropyl, 4-Diäthylamino-l-methylbutyl oder Dibutylamino-propyl und R 1-Phenyläthylaminopropylamino, ein N-(niede-res)Alkyl-N-(halobenzylaminopropyl)aminopropylamino 50 oder n-Butylaminopropylaminopropylamino ist.
6. 8. (Amido)N-substituiertes Bleomycin oder ein Salz davon nach Anspruch 1, worin X ein Alkyl mit drei bis zehn Kohlenstoffatome, Benzyl, 1-Phenyläthylaminopropyl, Di-n-Butylaminopropyl, n-Butylaminopropylaminopropyl, N-

   55 Methyl-N-Benzyl-N-(Dibenzylaminopropyl)ammoniopropyl oder N-Methyl-N-(Halophenyläthylaminopropyl)aminopro-pyl und R N-Methyl-N-(Halophenyläthylaminopropyl)ami-nopropylamino, N-Methyl-N-Benzyl-N(Dibenzylaminopro-pyl)ammoniopropylamino, N-Methyl-N-[bis(m,p-Dibenzyl-60 oxybenzyl)aminopropyl]aminopropylamino, N,N-Dimethyl-N-(Dibenzylaminopropyl)ammoniopropylamino, N,N-Diäthyl-N-(DibenzylaminopropyI)ammoniopropylamino, N-Methyl-N-(cyclooctylmethylaminopropyl)aminopropyla-mino oder N-Methyl-N-(Cyanobenzylaminopropyl)amino-65 propylamino ist.
7. 9. 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(dibenzylamino)propyl]ammo-nio }propylamino-(Amido)N-[3-((S)-l'-phenyläthyl)aminopro-pyl] bleomycin-Salz als Verbindung nach Anspruch 6.

   3

   657 140
8. 10. 3-{N-Methyl-N-[3'-bis(m,p-dibenzyloxybenzyl) amino-propyl]-Amino}propylamino-(Amido)-N-[3-((s)- l'-phenyl-äthyl)aminopropyl]bleomycin oder ein Salz davon als Verbindung nach Anspruch 1.
9. 11. 3-{N,N-Dimethyl-N-[3-(Dibenzylamino)propyl] ammonio}propylamino-(Amido)N-Octylbleomycin-Salz als Verbindung nach Anspruch 1.
10. 12. 3-{N-Methyl-N-[3'-bis(m,p-Dibenzyloxybenzyl) ami-nopropyl]-amino[propylamino-( Amido) N-Octylbleomycin als Verbindung nach Anspruch 1.
11. 13. Verfahren zur Herstellung von (Amido)N-substituier-tem Bleomycin nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der allgemeinen Formel (VI) oder deren Kupferkomplex conh-

    conh.

    nh,
12. nh.

    ch- nh ch

    \ / \ / N

    ch %ch2

    n

    ■co-x.

    (vi)

    bm n 77—

    A.X

    -co-r

    S'^MÎ

    h worin BM die obige Bedeutung hat, R0 eine Hydroxyl-Gruppe oder die im Anspruch 1 für R angegebene Bedeutung hat, eine End-Amino-Restgruppe von Bleomycin und X0 eine Hydroxyl-Gruppe oder eine Gruppe der Formel -NH-X bedeuten, X die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, vorausgesetzt, dass eine der Gruppen R0 oder X0 eine Hydroxyl-Gruppe ist oder ein reaktives Derivat der Carboxyl Gruppe kondensiert wird mit (a) einem Amin der Formel (VII)

    HiN-X

    (VII)

    worin X die obige Bedeutung hat, falls X0 der obigen Formel eine Hydroxyl-Gruppe ist oder mit (b) einem Amin der Formel (VIII)

    ch_ nh .ch

    \ / \ s ch ch.

    cooh cooh

    (VI-3)

    worin BM die obige Bedeutung hat oder ein Salz davon mit einem Amin der Formel H-R umsetzt.
13. 15. (Amido)N-substituierte Bleomycinsäure, dargestellt durch die folgende Formel (VI-2) oder ein Salz davon als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 13

    conh.
14. nh.

    \ _/

    25

    (vi-2)

    cooh worin BM einen Anteil des Bleomycin-Skeletts darstellt; X (A) ein Alkyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatome, (B) ein Aminoal-kyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatome, (C) ein niederes Alkyl mit als Substituenten (a) 1 bis 3 Halogenatome, (b) 1 oder 2 Phenyl-Gruppen, (c) eine Indolyl-Gruppe oder (d) eine 5- oder ógliedrige heterozyklische Gruppe enthaltend ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom und wobei unter den Substitu-enten-Gruppen die Phenyl- oder Indolylgruppe weiter durch ein Halogenatom oder eine niedere Alkoxygruppe substituiert sein kann, (D) Xr(niederes)Alkyl, worin X:

    H-R

    (VIII)

    worin R die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, falls R0 der obigen Formel eine Hydroxyl-Gruppe und X0 -NH-X ist, worin X die obige Bedeutung hat und zutreffendenfalls. Entfernen des Kupfers vom resultierenden Kondensationsprodukt.
15. 14. Verfahren zur Herstellung von (Amido)N-substituier-ten Bleomycinen nach Anspruch 1 der Formel (1)

    conh.

    nh-,

    i i2 r2

    ch- nh .ch_

    ch nch- co-nh-x

    (I)

    . n s h co-r h

    worin der Rest -NH-X identisch ist mit dem Rest R und letzterer die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, dadurch gekennzeichnet, dass man Deamidobleomvcinsäure der Formel (VI-3)

    X2 I2

    -n-x-

    oder -I? X3

    x

    4

    X; ein Wasserstoffatom, ein niederes Alkyl oder Benzyl, X5 (a) ein niederes Alkyl, (b) ein Phenyl(niederes)alkyl oder (c) ein Mono- oder Di-(niederes)Alkylamino(niederes)alkyl ist, welches durch eine Phenyl- oder Halophenyl-Gruppe substituiert sein kann, X4 (a) ein niederes Alkyl oder (b) ein Phe-nvl(niederes)alkyl ist. (E) Naphthyl, (F) Thiazolyl oder(G) ein N-Phenyl(niederes)alkylpiperazinyl ist.
16. 16. Deamidobleomvcinsäure oder ein Salz davon, dargestellt durch die Formel (VI-3) als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 14

    conh.
17. ch.

    nh nh.

    .ch

    N*/ V

    cooh

    (vi-3)

    cooh

    657 140

    4

    worin BM die obige Bedeutung hat.
18. 17. Amin, dargestellt durch die allgemeine Formel (IX) als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 13 oder 14

    NH2-(CH;),-A'-(CH;)3-B' (IX)

    darstellt, wobei Ri„' und Rh'je ein niederes Alkyl oder Benzyl und B' ein Di-[Phenyl(niederes)alkyl]amino, ein Cvano-phenyI(niederes)alkylamino, ein C5 u-Cycloalkyl-substituier-tes(niederes)Alkylamino oder ein DibenzyIoxyphenyl(niede-res)alkylamino darstellt.