CH659328A5 - Verfahren zur isolierung von nukleolaren antigenen aus humanen krebszellen. - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Antigenen in Form von isolierten Nucleoli oder nuklearen Extrakten, die Nucleoli-Bestandteile enthalten. Die Antigene werden durch Extraktion aus Nuclei oder Nucleoli von humanen Krebszellen gewonnen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der entsprechenden Antikörper, auf ein Verfahren zum immunologischen Nachweis von Krebs und auf eine entsprechende diagnostische Ausrüstung.

Bei früheren experimentellen Untersuchungen bei Tieren wurde die Gegenwart von nuklearen oder nukleolaren Antigenen in Tumoren festgestellt, die nicht in nicht-tumorbefal-lenen Geweben gefunden wurden. (R.K. Busch et al, Cancer Res. 34,2362,1974; Yeoman et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 73,3258,1976; Busch and Busch, Tumori 63,347,1977; Davis et al, Cancer Res. 38, 1906, 1978: Marashi et al, Cancer Res. 39,59,1979). In diesen früheren Studien der Erfinder wurden Antikörper präpariert in Nucleoli von normalen und neoplastischen Zellen der Ratte durch Immunisierung von Kaninchen (R.K. Busch et al, supra; Busch and Busch, supra; Davis et al, supra). Durch die indirekte Immunofluoreszenz-methode wurde in Azeton fixierten Zellen eine helle nukleo-lare Fluoreszenz festgestellt. Es wurde gefunden, dass die Immunopräcipitinbanden in Ouchterlonygelen gebildet durch Antiseren zu Novikoff Hepatoma nuklearen Antigenen, extrahiert aus den Novikoff Hepatomaratten Nucleoli, unterschiedlich waren, gegenüber den entsprechenden Immunopräcipitinbanden hervorgebracht durch nukleolare Leberantigene und nukleolare Antileber Antiseren (Busch und Busch, supra).

Eine weitere spezifische Wirkung wurde erzielt als nukleo-lares antitumor Antiserum, absorbiert mit nuklearen Leberextrakten eine positive nukleolare Fluoreszenz gegenüber Novikoff Hepatoma aszite Zellen hervorbrachte, jedoch nicht gegenüber Leberzellen. Andererseits brachte nukleo-lares Antileber Antiserum, absorbiert mit nukleolaren Tumorextrakten, keine erkennbare nukleolare Tumorfluoreszenz hervor, ergab jedoch eine positive Fluoreszenz im Lebernucleoli (Davis et al, supra).

Wo mittels Immunofluoreszenzanalyse Unterschiede in acetonfixierten Tumorabstrichen und normalen Abstrichen von Rattenzellen (insbesondere nach Absorption der Antiseren mit normalem Lebernuclei und Nucleoli) zu beobachten waren, wurden Versuche gemacht, um diese Antiseren bei nuklearen Rattentumorantigenen zu verwenden, durch Prüfen der entsprechenden Gewebeproben, die von menschlichen Tumoren stammten. Studien mit Antikörpern von Nucleoli von Tumoren der Nagetiere ergaben, dass positive Immunofluoreszenz bei menschlichen Tumornucleoli nicht gefunden wurde.

Demzufolge wurde eine neue Serie von Experimenten durchgeführt, um menschliche nukleolare Antigene zu finden. Eine positive Immunofluoreszenz wurde dann bei menschlichen Tumorgeweben gefunden, mit Antiseren und Antikörpern zu diesen neuen menschlichen nukleolaren Tumorpräparaten. Bei diesen Studien wurden die Antikörper absorbiert mit placentalen nuklearen Sonicaten ebenso wie mit foetalem Kalbsserum (Busch et al, 39,3024,1979; Davis et al. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 76,892,1979 ; Smetana et al, Life Sci. 25,227,1979).

Die vorliegende Erfindung ergab sich aus Studien, die bestimmt waren zur Verwendung dieses neuen menschlichen nukleolaren Antigens eines weiten Bereichs von menschlichen Neoplasmen.

Die folgende Tabelle gibt eine Aufzählung der menschlichen Tumoren an, bei denen eine helle nukleolare Immu5

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nofluoreszenz gefunden wurde mit den Antikörpern gegenüber den menschlichen Tumornucleoli. Diese Studien unterstützten die überraschende und unerwartete Entdek-kung, dass viele menschliche Tumore ein gemeinsames nukleolares Antigen enthalten, das mit Antiseren oder Immunoglobulinfraktionen dieser Antiseren eine positive Immunofluoreszenz ergibt (Busch et al, supra).

Tabelle I

Helle nukleolare Immunofluoreszenz bei menschlichen Tumoren (aus Busch et al, 1979)

I. Carcinome

1. Blase, Übergangszelle

2. Hirn astrocytoma glioblastoma

3. Colon, adenocarcinoma (4)

Metastasen: Leber transplantable Carcinome (GW-39)

4. Eccrine Drüse, Carcinom

5. Esophagus, schuppiges Zellen Carcinom

6. Leber, primäres Carcinom

7. Lunge:

Adenocarcinom (2)

Haferzellen Schuppige Zellen (5)

8. Melanoma, malignant, cerebrale Metastasen

9. Prostata, Adenocarcinom (4)

10. Haut: basales Zellencarcinom (2)

Schuppiges Zellencarcinom Metastasen: Lymphknoten

11. Magen: Adenocarcinom

Metastasen: Leber Metastasen: Lymphkonten

12. Thyroides Carcinom (2)

II. Sarcome

1. Myoblastome malignent der Lippe

Metastasen zu cervicalen Lymphkonten

2. Osteogene Sarcome (3) Biopsy,

Gewebekultur

3. Synoviales Sarcom

4. Lymphomas (4), Nicht-Hodkins,

III. Hematologische Neoplasmen

1. Hodkins-Krankheit (Reed Sternberg, 5)

2. Leukämie: CCL (5), Haarzellen (Milz)

3. Lymphom, lymphocytisch, Milz

4. Multiple Myelomae (5)

5. Fungoide Mycosis

6. Akute myelocytische Leukämie (5)

7. Chronische myelocytische Leukämie (5)

8. Akute monocytische Leukämie (2)

IV. Kulturen

1. Brust Carcinom

2. Colon Adenocarcinom

3. HeLa

4. HEp-2

5. Prostata, Carcinom (3)

6. Schuppiges Zellencarcinom (3)

(Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Fälle an).

In den nicht-tumor Geweben, benignen Tumoren und entzündlichen Zuständen wurden im allgemeinen Ergebnisse erhalten, wie in der folgenden Tabelle II angegeben:

Tabelle II

Negative Immunofluoreszenz in menschlichen Geweben (Nach Busch et al, 1979)

I. Normales Gewebe

1. Blase

2. Knochenmark (hämoblstische Linien 5)*

3. Brust

4. Leukozyten-Blut (3)

5. Gallenblase

6. Intestin, klein, Krypta von Lieberkuhn

7. Intestin, gross

8. Niere

9. Leber (2)

10. Lunge (dem Tumor benachbart)

11. Lymphknoten

12. Lymphocyten, normal (2)

13. Pancreas

14. Epyphyse

15. Hypophyse

16. Placenta

17. Prostata

18. Haut

19. Magen

20. Schilddrüse

II.

1. Brust, adenoma

2. Parathyroid, adenoma (2)

3. Prostata, hyperlasia (3)

4. Schilddrüse, adenoma (3)

Knoten-Kropf

III. Entzündliche Erkrankungen

1. Chronische Ulcer Colitits

2. Glomerulonephitis

3. Granuloma und Fibrosis der Lunge

4. Leberzirrhose und Hepatitis

5. Lupus profundes (Brustdrüse und Haut)

6. Pemphigus - bullous

7. gastrischer Ulcer

8. Entzündliche Hyperplasia-Lymphknoten (4)

9. Infektiöse Mononucleosis (5)

IV. Kulturen

1. Brust Fibroblasten

2. Lymphocyten, PHA stimuliert

(Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Fälle an).

Diese Ergebnisse, ursprünglich erhalten durch Immunofluoreszenz, wurden durch ausgedehnte Verfahren mit Immunoperoxidase verifiziert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind das im Anspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von Antigenen, die so erhaltenen Antigene, das in Anspruch 8 definierte Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die so erhaltenen Antikörper, das im Anspruch 10 definierte diagnostische Verfahren und die im Anspruch 11 definierte diagnostische Ausrüstung.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden und unerwarteten Erkenntnis, dass allgemeine nukleolare Antigene in einem weiten Bereich von menschlichen Krebszellen gefunden werden, jedoch nicht in menschlichen normalen Zellen. Die Antigene und Proteine, die eine Genkontrolle oder andere Funktionen haben mögen, sind widerstandsfähig bei der Mitosis in einer perichromosalen Lage.

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Das Antigen in den Krebszellen Krebszellen und sehr niedrigen Konzentrationen in nicht

Die Antigene wurden in einem weiten Bereich des mensch- krebsartigen Zellen vorliegt oder ob sie foetale Antigene liehen Krebses, einschliesslich Krebs des zentralen Nerven- sind, wie früher in den Vergleichsstudien über nukleare Anti-

systems, des gastro-intestinalen Trakts, des genitalen Trakts, gene der Novikoff Heptoma bei der Ratte und normalen Rat-

der Lunge, Haut, der blutbildenden Gewebe und der endo- 5 tenleberzellen gefunden wurde (Yeoman et al, 1976).

krinen und exokrinen Drüsen gefunden. Die malignen menschlichen Zellen umfassen beispielsweise HeLa Zellen, Humane Tumore und andere Gewebe

Carcinome der Prostata, andere Carcinome, Sarcoma und Alle Stufen zur Herstellung und Analyse der Proben von hämatologische Neoplasmen. Die Antigene können aus den menschlichem Gewebe, Blut und Serum von krebsverdäch-

Nuclei oder Nucleoli der menschlichen malignen Zellen io tigen Patienten waren durch das «Human Research Com-

extrahiert werden. Die Antigene wurden nicht gefunden in mittee» des Baylor College of Medicine, Houston, Texas und entsprechenden nicht-tumorbefallenen Geweben. den angeschlossenen Spitälern erprobt. Proben von mensch-

Unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens liehen Tumoren wurden aus gefrorenen Schnitten von chir-

zum immunologischen Nachweis von Krebs und zum Nach- urgischen Proben, Biopsien oder konservierten cryostati-

weis der malignen Zellen wurden ungefähr 1% falsche nega- is sehen Proben erhalten, hauptsächlich von dem Departement ti ve und 3% falsche positive Ergebnisse festgestellt. Die fai- of Pathology des Houston Vétérans Administration Medicai sehen Negativen sind nekrotische Tumorgewebe oder aus Center und auch von der Michigan Cancer Foundation in unbekannten Gründen nicht reaktive Tumore. Die falschen Detroit, Michigan, und der Abteilung für interne Medizin

Positiven sind zwei Fälle von preneoplastischen Geweben der Karls-Universität in Prag, Tschechoslovakei. Diese und schwache Positive in gelegentlichen fokalen Regionen in 20 Schnitte wurden auf die Gegenwart von nuklearen Anti-

hyperplastischen Geweben. Zwei fokale positive Regionen genen durch indirekte Immunofluoreszenz und Immunope-

wurden identifiziert als preneoplastische Regionen oder roxidasetechnik untersucht.

fokale neoplastische Transformation bei gastro-intestinalen entzündeten Geweben. Reinigung des nukleolaren Antigens

Die Antigene aus humanen Krebszellen haben eine Haupt- 2s Die Antigene wurden durch 6-malige Extraktion der spezies und mindestens eine und wahrscheinlich mehrere Nuclei oder Nucleoli mit 10 mM Tris HCl/0,1 mM PMSF/

Nebenantigenspezies. Die Hauptspezies (a) hat einen dis- ph-Wert 8, gereinigt, wobei das Volumenverhältnis der kreten isoelektrischen Punkt im Bereich von 6,0-6,7 und in Waschlösung zu den Nuclei oder Nucleoli 20 :1 betrug. Der der Regel bei ungefähr 6,3, bestimmt durch isoelektrisches Extrakt wurde zuerst bei 27 000 x g während 10 min und

Fokussieren ; die isoelektrische Fokussierung kann in einem 30 dann bei 100 000 x g während 16 h zentrifugiert. Ammoni-

pH-Gradienten vom pH-Wert 3-10 in Polyacrylamidgel umsulfat mit 40%iger Sättigung wurde zur Entfernung der durchgeführt werden ; (b) besitzt ein Molekulargewicht, das Verunreinigungen verwendet. Die 40-100%ige Ammonium-

im Bereich von 50'000-60'000 u liegt, und die Bestimmung sulfatfraktion wurde abzentrifugiert und dialysiert gegen kann durch zweidimensionale Gelelektrophorese erfolgen, 20 mM Tris HCl/pH-Wert 7,6. Die Antigene wurden chro-

wobei die Elektrophorese in der zweiten Dimension in 35 matographiert in DE-52 Cellulosesäulen (1x10 cm). Die

Gegenwart von SDS (Natriumdodecylsulfat) durchgeführt Antigene wurden in der 0,15M NaCl/0,1 mM PMSF/pH-

wird; (c) sind löslich in 0,01 M Tris-HCl, pH-Wert 8, wenn sie Wert 7,6 Fraktion eluiert. Zur Identifizierung und Reinigung nicht fest an nukleare oder nukleolares Ribonukleoprotein der Antigene wurde eine isoelektrische Fokussierung unter gebunden sind ; (d) sind sowohl nuklear als auch extranu- Verwendung von Gelen durchgeführt. Diese enthielten 4%

kleolar, verbleiben jedoch intranuklear oder chromosomas- 40 Acrylamid/8M Harnstoff/2% Ampholine (pH-Wert 3,5-10).

soziiert während der Zellteilung. Die Antigene, pl 6,3, bzw. 6,0, wurden aus den Gelen

Als Nebenantigenspezies konnte eine zweite Antigenspe- geschnitten. In SDS (Natriumdodecylsulfat) Gelen wurde für zies ermittelt werden, welche einen pl-Wert von ungefähr 6,0 jedes dieser Antigene eine Hauptzone gefunden.

(ermittelt durch dasselbe Verfahren wie bei den Hauptantigenspezies) und ebenfalls ein Molekulargewicht, das im 45 Herstellung von HeLa-Zell-Nuclei oder -Nucleoli Bereich von 50'000-60'000 u liegt, besitzt. Es ist möglich, dass HeLa Zellen-Nuclei oder -Nucleoli wurden durch es ein modifiziertes Produkt des Hauptantigens ist, aber es Abtrennen von HeLa Zellen aus Spinner Kulturflaschen (7-8 wurde nicht festgestellt, ob es strukturell verwandt ist. Die Liter) hergestellt. Die Zellen sollten und waren in log phase Neben-Antigenspezies sind in relativ geringerer Konzentra- 7-8 x 105 Zellen/ml. Die Zellen wurden zentrifugiert bei tion vorhanden als die Hauptantigenspezies. so 800 x g während 8 min und bildeten Zellplättchen. Die Zell-Antigene sind auch in Partikeln von nukleolarem Ribonu- plättchen wurden in (PBS) Phosphat gepufferter Salzlösung kleoprotein (RNP) vorhanden, welche durch Ultrazentrifu- (0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat, pH-Wert 7,2) durch leichte gieren der Trisextrakte erhalten werden können. Sie werden Homogenisierung mit einem losen Teflonpistil suspendiert vorzugsweise wie nachstehend beschrieben erhalten. Das und bei 800 x g während 8 min zentrifugiert. Die Zellen Antigen, das in diesen Partikeln vorliegt, ist fester an Pro- 55 wurden ein zweites mal mit PBS gewaschen und die Zell-teine und Ribonukleinsäure RNA gebunden als das Antigen plättchen gewogen. Die Zellplättchen wurden durch leichte in den Tris löslichen Fraktionen. Es ist noch nicht klar, ob Homogenisierung in 20 Volumen Reticulocyten-Standard-die Antigene in den RNP Partikeln identisch sind mit denje- puffer (RSB) pH-Wert 7,4, suspendiert und 30 min auf Eis nigen in der überstehenden Fraktion, aber ihr isoelektrischer schwellen gelassen. Die Zellen wurden dann bei 1000 x g Punkt ist derselbe und sie absorbieren die Antikörper zu den 60 während 8 min zentrifugiert und wieder durch leichte HomoAntigenen. Nukleare Antigene, die in Fibrillen, wahr- genisierung in RSB Puffer plus 1/20 Volumen des Netzmit-scheinlich im nuklearen Ribonukleoproteinnetz vorliegen, tels Nonidet P40 ( 10% in RSB) suspendiert. Das Endvolumen können auch in den Krebszellen durch Immunlichtmikro- des Nonidet war 0,5%. Die Zellen wurden mit einem Dounce skopie festgestellt werden. Diese sind extranukleolare Struk- Homogenisator mit 20-60 Hüben homogenisiert bis die turen, die Elemente repräsentieren können von denen die 65 Zellen gebrochen waren und die Nuclei aus dem Cytoplasma RNP Partikel abgeleitet sind. befreit waren. Die Zellen wurden dann 1000 x g 8 min lang

Es verbleibt noch zu bestimmen, ob die Antigene eine Sub- zentrifugiert, wieder suspendiert durch leichte Homogenisie-

stanz repräsentieren, die in hohen Konzentrationen in den rung in 0,88 M Sucrose, 0,5 mM Mg Acetat (20 x Gewicht/

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Volumen) und zentrifugiert bei 1500 x g während 20 min. Die erhaltenen Plättchen enthielten den HeLa-Nuclei der verwendet wurde zur Herstellung des Antigenextrakts wie unten beschrieben. Nuclei aus anderen menschlichen malignen Zellen wurden in ähnlicher Weise erhalten. Für die Isolierung der Nucleoli wurde das nukleare Pellet, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, dann durch leichte Homogenisierung in 0,34 M Sucrose, 0,5 mM Mg Acetat unter Verwendung von 2 ml Sucrose für jedes Gramm der Originalzellen, suspendiert. Die Nuclei wurden dann in einem Branson Sonifier periodisch während 10 s (mit 10 s Intervallen) beschallt. Die Gesamtzeit betrug zwischen 60-110 s. Die freigesetzten Nucleoli wurden durch mikroskopische Prüfung untersucht. Zum Sichtbarmachen der Nucleoli wurden sie mit Azur C gebeizt (die Lösung bestand aus 1% Azur C in 0,25 M Sucrose). Nach der Beschallung mit dem Branson Sonifier sollte das Präparat frei sein von Nuclei. Die mit dem Branson Sonifier beschallte Fraktion wurde mit dem dreifachen Volumen von 0,88 M Sucrose (ohne Mg Acetat) unterschichtet und 1500 x g während 20 min zentrifugiert. Die erhaltenen Plättchen enthielten HeLa Nuclei, die als Immunogen verwendet werden können.

Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wurde im allgemeinen eine befriedigende Reinigung erreicht (Busch und Smetana, 1970) und die Lichtmikroskopie zeigte, dass die Qualität der Präparate im wesentlichen befriedigend war. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse die Gegenwart von Chromatin und nuklearen Verunreinigungen an. Das Schlüsselproblem bei der ausreichenden Reinigung dieser Präparate ist die begrenzte Menge der Original HeLa-Zellen in den Kulturen, die die Anzahl der Wiederrei-nigungsschritte begrenzt. Nucleoli, die aus 5-10 g HeLa Zellpräparaten erhalten wurden, ergaben im Gegensatz zu den 0,5-1 g Mengen die in früheren Versuchen verwendet wurden, genügend Material für eine ausreichende Reinigung. Die Bedingungen für das Wachstum der HeLa-Zellen und die Isolierung der placentalen Nuclei waren im wesentlichen dieselben, wie diejenigen, die schon früher beschrieben wurden (Davis et al, 1979).

Herstellung von HeLa-Tris-Extrakt

HeLa Tris Extrakt wurde hergestellt durch Suspendieren des HeLa Nuclei in Na C1-EDTÀ Puffer 10 x Gewicht/ Volumen, 1 g Nuclei/10 ml Puffer (Puffer : 0,075 M NaCl, 0,025 M Na EDTA/pH-Wert 8,1 mM PMSF). Phenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF) wurde in einer 100 mM Konzentration in Isopropylalkohol aufgelöst. Es wurde zu jeder Lösung vor der Extraktion zugefügt. Die Suspension wurde mit einem Dounce Homogenisator mit 20 Hüben homogenisiert und bei 3000 x g während 5 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt. Die vorstehenden Extraktionen wurden bei den nuklearen Pellets zwei weitere Male wiederholt. Der NaCl-EDTA Extrakt wurde nicht bei der vorliegenden Antigenarbeit verwendet, daher wurde er verworfen. Die Nuklearplättchen wurden suspendiert in 100 x Gewicht/Volumen 0,01 MTris-HCl;pH-Wert8,1 mM PMSF und mit einem Dounce Homogenisator mit 20 Hüben homogenisiert, obwohl 0,01 M Tris-HCl pH-Wert 7-9 befriedigend ist. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt und auf Eis aufbewahrt. Während der Trisextraktionen brach der Nuclei und Chromatin wurde freigesetzt. Das nukleare Aufbrechen wurde durch mikroskopische Prüfung verfolgt. Die Plättchen wurden wieder suspendiert in dem Trispuffer und das Nuclei wurde 15 min auf Eis schwellen gelassen. Es wurde dann mit einem Dounce Homogenisator mit 20 Hüben behandelt und bei 12 000 x g während 10 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde aufbewahrt. Die Pellets wurden wieder suspendiert und hatten ein weissliches flockiges Aussehen. Es wurde wieder homogenisiert (Dounce Homogenisator, 20 Hübe) und bei 27 000 x g während 30 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt und mit den vorhergehenden Überständen aus den s Tris Extrakten kombiniert.

Die Trisextrakte wurden dann durch Ultrafiltrationen mit einer Amicon-Um-10 oder PM-10 Diaflo Membrane konzentriert. Im allgemeinen ist das Volumen bei Beginn ungefähr 50 ml und wurde eingeengt auf 4-5 ml. Die Endkonzentra-10 tion des Proteins beträgt ungefähr 4-5 mg/ml. Das Kaninchen wurde mit diesem Trisextrakt immunisiert.

Durch das vorstehend beschriebene Verfahren können Extrakte auch aus HeLa Nucleoli und Nuclei oder Nucleoli von anderen menschlichen malignen Zellen hergestellt is werden.

Zur Herstellung des Trisimmunogens werden 250 |j.l Trisextrakt (4-5 mg/ml) wie oben hergestellt mit 250 (il PBS.

Dies wird dann wie unten beschrieben für das nukleolare Immunogen mit Freund's Adjuvans kombiniert.

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Immunisierung von Kaninchen mit HeLa-Zellen Nukleare Präparate zur Herstellung von Antikörpern

Es wurden Antikörper durch Immunisierung von Kaninchen mit nuklearen Zubereitungen von HeLa Zellen 25 wie folgt hergestellt:

Die HeLa Nuclei wurden gewogen (20-30 mg Feuchtgewicht) und gleichmässig in 0,5 ml 0,01 M Phosphat gepufferter Salzlösung, pH-Wert 7,2, suspendiert. Sie wurden dann folgendermassen mit 0,6 ml Freund's kompletten Adjuvans 30 (GIBCO)gemischt:

Die suspendierten Nucleoli wurden in eine 5 ml Spritze gegeben und das Freund's Adjuvans in eine zweite Spritze. Mit jeder Spritze wurde eine 18 Gauge-Nadel, deren Spitze entfernt war, verbunden. Die Nadeln wurden dann durch ein 35 Stück Polyethylenrohr I.D. 0,047 (Clay-Adams) verbunden. Der Inhalt der Spritzen wurde gemischt, bis das Präparat eindickte und es schwierig durch das Rohr zu befördern war.

Die Kaninchen wurden auf dem Rücken rasiert und mit 6 Einstichen, 0,1 ml/pro Einstich, intradermal injiziert. Die 40 verbleibenden 0,4-0,5 ml wurden, halb subcutan (unter die lose Haut am oberen Rücken) und halb intramuskulär (in den weichen Muskel) injiziert. Die Injektionen wurden 3 Wochen lang mit ähnlichen Mengen des Nucleis ein Mal pro Woche verabreicht. Der erste Aderlass wurde 7-10 d nach der 45 dritten Woche der Immunisierung durchgeführt. Zum Sammeln des Blutes wurde eine Kaninchen-Ohrenschale (Bellco) und eine Vakuumpumpe verwendet. Das Blut wurde (ungefähr 45-50 ml) 3-4 h bei Zimmertemperatur gerinnen gelassen. Das Serum wurde aus dem Rohr entfernt und bei so 1000 g 30 min zentrifugiert (dieses sedimentiert frei von roten Blutzellen). Das klare Serum wurde abgetrennt und absorbiert, oder im Kühlschrank bis zur Durchführung des Absorptionsverfahrens aufbewahrt. Das Blutgerinnsel kann über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt werden. Es setzt 55 wenige weitere ml Serum frei. Das Serum aus jedem Aderlass wurde auf die Anwesenheit von nukleolaren Antikörpern durch ein indirektes Immunofluoreszenzverfahren geprüft.

Andere, nicht-humane Wirte (z.B. Ziegen, Schafe, Pferde, Kücken etc.) können mit Präparaten von menschlichen 60 malignen Zellnucleoli immunisiert werden, um die Antiseren oder Antikörper der nukleolaren Antigene hervorzubringen. Antiseren können auch hergestellt werden, indem nicht-humane Wirte mit Extrakten (z.B. Tris Extrakt) von humanen malignen Zellnuclei oder Nucleoli, immunisiert 65 werden.

Absorption von antinuclearem Antiserum

Die Absorption von antinukleolaren Antiseren wurde

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durchgeführt durch Absorbieren des Kaninchenantiserums mit 20%igem normalem menschlichem Serum und 20%igem foetalem Kalbsserum (GIBCO). 20%iges normales menschliches Serum wurde zugefügt zu dem Kaninchenantiserum (4 ml/20 ml) und 1 h bei 37°C in einem Wasserbad unter Schütteln inkubiert. Der Behälter wurde entfernt, 20% foetales Kalbsserum (4,8 ml/24 ml) zugefügt und die Inkubation 1 h bei 37°C unter Schütteln in einem Wasserbad durchgeführt. Der Behälter wurde entfernt und 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert, wobei durch leichtes Quirlen alle 15 min gemischt wird. Dann wurde bei 15 000 x g während 30 min zentrifugiert und die überstehende Lösung (absorbiertes Serum) entfernt und aufbewahrt. Das absorbierte Serum wurde in die Immunoglobulin(Ig)form umgewandelt, indem das nachstehend beschriebene Verfahren für die (NHU^SOt-Ausfällung von Serum durchgeführt wird. Das Ig-Präparat aus dem nukleolaren Antiserum, das mit normalem menschlichem Serum und foetalem Kalbserum absorbiert worden ist, wurde nun mit normalem menschlichem Gewebe (Placenta oder Leber) absorbiert. Ein gleiches Volumen von beschalltem placentalem Nuklearpräparat in PBS 7,2 (10-15 mg Protein/ml) wurde zu dem absorbierten nuklearen Immunoglobulin (10 ml Ig plus 10 ml beschalltes nukleares Präparat) und 1 h bei 37°C unter Schütteln in einem Wasserbad bebrütet. Es wurde dann 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert, wobei unter leichtem Quirlen der Flasche alle 15 min gemischt wurde und anschliessend wurde 30 min bei 15000 x g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt und das absorbierte Ig wie beschrieben wieder mit (NHO2SO4 ausgefällt. Dieses Ig kann als endgültiges Antikörperprodukt verwendet werden oder es kann durch Chromatographie mit Diethylaminoethyl-Cellulose (DEAE-Cellulose) folgendermassen weitergereinigt werden :

Das Ig, das in der 0,01 M Phosphatpuffersalzlösung, pH-Wert 7,2, enthalten ist, wird gegen 0,0175 M Phosphatpuffer, pH-Wert 6,3 (ohne Salzlösung), dialysiert. Nach der Dialyse wird es bei 2500 x g 20 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird auf eine DEAE-Säule (20 mg Protein pro Gramm der Cellulose, Whatman DE52) gegeben. Das IgG wird mit dem 0,0175 M Phosphatpuffer aus der Säule eluiert. Nach dem Eluieren wird die IgG Fraktion gegen eine 0,01 M Phosphat gepufferte Salzlösung, pH-Wert 7,2, dialysiert.

Dasselbe Verfahren wurde mit Kontrollserum durchgeführt, welches aus präimmunem Serum besteht, das durch Aderlass von Kaninchen (oder anderen nicht-humanen Wirten) vor Beginn der Immunisierung erhalten wurde.

Herstellung von Kaninchen-Immunoglobulin Ig

Es wurde eine gesättigte (NH4)2S04-Lösung (760 g/1) hergestellt und ein gleiches Volumen kalter gesättigter (NHO2SO4 tropfenweise unter Rühren zu dem Antiserum zugefügt. Es bildete sich eine weisse Ausfällung, die zur Aggregation 1 Yi-2 h stehengelassen wurde, wobei mit einem magnetischen Rührer in der Kälte gerührt wurde. Das ausgefällte Antiserum wurde bei 3000 x g 20 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt und das Sediment wieder suspendiert in PBS, pH-Wert 7,2 (ungefähr die Hälfte des Volumens des ursprünglichen Serums). Das solubilisierte Sediment wurde in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen 100 Volumen PBS über Nacht in der Kälte unter magnetischem Rühren dialysiert. Der Dialysebehälter wurde in frisches PBS (100 x Volumen) am folgenden Morgen gegeben und die Dialyse 6 h fortgesetzt. Das Immunoglobulin wurde sorgfältig aus dem Dialysebehälter entfernt und bei 2500 x g 20 min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt.

Nachstehend sind einige bevorzugte immunologische Nachweismethoden beschrieben.

Immunofluoreszenz 5 Das früher beschriebene Verfahren (RK Busch et al, 1974 ; Hilgers et al, 1972) für Immunofluoreszenz wurde bei dieser Studie wie folgt verwendet:

Indirektes Immunofluoreszenz-Verfahren 10 150 (il eines antinukleolaren Antiserums (verdünnt 1 :50) wurde auf azetonfixierte HeLa Zellen oder eine fixierte Gewebeprobe gebracht (gemäss Hilgers et al, 1972; RK Busch et al, 1974). Es kann notwendig sein, mehr als 150 |il zu verwenden, wenn die Gewebeprobe einen grossen Teil des 15 Objektträgers bedeckt. Die Verdünnung des Antiserums (As) ist abhängig von dem Antikörper (Ab) Titer. Andere Verdünnungen können angewandt werden bis zu dem Punkt, wo As-oder Ab-Verdünnungen zu verdünnt sind, um eine positive Antwort auf bekannte positive Zellen (z.B. HeLa) zuzugeben. 20 Die Objektträger werden in einer feuchten Kammer bei 37°C während 45-50 min inkubiert. Die feuchte Kammer kann aus einer grossen Petrischale bestehen, in die feuchtes Papier gegeben wurde. Nach der Inkubation wurde das Antiserum durch vorsichtige PBS-Zugabe vom Objektträger abgewa-25 sehen und die Objektträger wurden in einen Halter gebracht und 1 h in PBS gewaschen. Das PBS wurde dreimal bei 15,30 und 45 min gewechselt. Die Objektträger wurden aus dem PBS entfernt und in destilliertes oder deionisiertes Wasser 10 mal unter schnellem Auf- und Abbewegen eingetaucht. Die 30 Objetträger wurden mit einem Haartrockner mit kalter Luft 2-3 min getrocknet, wobei darauf geachtet wurde, dass nicht zu stark getrocknet wurde. 150 jxl fluoreseeinmarkiertes Ziegen-Antikaninchenantiserum (Hyland oder Cappel), das im Verhältnis 1 :10 verdünnt war, wurde auf die Objekt-3S träger gebracht und in der feuchten Kammer 30-35 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wurde von dem Streifen durch ein leichtes Waschen mit PBS entfernt. Die Objektträger wurden dann 1 h mit PBS gewaschen, wobei die Waschlösung dreimal, nämlich bei 15,30 und 40 45 min, gewechselt wurde; oder nach den ersten 15 min Wäsche können sie in frisches PBS gebracht werden und im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt werden. Nach der letzten Wäsche mit PBS wurden die Objektträger 10 mal in deionisiertes oder destilliertes Wasser getaucht, mit schnellen 4s Auf- und Abbewegungen und mit kalter Luft aus einem Haartrockner getrocknet (2-3 min). Eine Lösung Glycerin und PBS im Verhältnis 1 :1 wurde zu den Zellen oder Gewebeproben zugegeben und mit einem Deckglas bedeckt. Die Proben können mehrere Monate aufbewahrt werden, wenn so das Deckglas mit einem Versiegelungsmittel, wie klarem Nagellack, versiegelt ist und in der Kälte aufbewahrt wird. Die Objektträger wurden dann mit einem Fluoreszenzmikroskop geprüft. Eine nukleolare Fluoreszenz wurde bei präimmunem Immunoglobulin oder präimmunen Ig-Fraktionen ss nicht beobachtet. Die anderen angewandten immunologischen Techniken waren dieselben wie diejenigen, die in früheren Studien angewandt wurden (Kendali, 1938; Lowry et al, 195 l;Dale und Lautner, 1969;Laurell, 1972; Wallace et al, 1974; Marashi et al, 1979). Für die Analyse der nukleo-60 laren Lokalisation der Immunofluoreszenz wurde bei den Proben während der Fluoreszenzbeobachtung eine Phasen-kontraktbeleuchtung an- und ausgeschaltet.

Immunoperoxidase-Verfahren 65 Anstelle des fluoreseeinmarkierten Ziegen-Antikanin-chenantiserums kann das Immunooxidaseverfahren angewandt werden. Beispielsweise wurden 150 jxl peroxidasemar-kiertes Ziegen-Antikaninchen 1 :10 oder 1 :20 Verdünnung

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zugefügt. Die lokalisierte Peroxidaseaktivität kann durch eine Anzahl von Redox-Farbsystemen für licht- oder elektronenmikroskopische Untersuchungen gezeigt werden. Andere Enzyme können als Markierungen für die indirekte Methode dienen und Peroxidase und andere Enzyme können direkt verwendet werden, indem der primäre Antikörper markiert wird.

Das Karnofskysche Inkubationsmedium wird wie folgt hergestellt:

Auswiegen von genug Diaminobenzidin (Sigma) und Suspendieren in 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 7,6, so dass die Konzentration 0,5 mg/ml beträgt. Herstellen einer Wasserstoffperoxidlösung von 0,02% (in dem 0,05 M Tris-HCl Puffer). Mischen von 0,5 mg/ml DAB und 0,02% H2O2 in gleichen Teilen in einem Verhältnis von 1:1. (Diese Lösung wurde jedesmal zum Gebrauch frisch zubereitet und wurde während der Herstellung kaltgehalten).

200-300 jil DAB und H2O2 Mischung werden auf den Objektträger gegeben und 30 min in einer feuchten Kammer bei Zimmertemperatur inkubiert.

Nach dieser Inkubation wird die DAB und H2O2 Mischung durch Waschen mit 0,05 M Tris HCl, pH-Wert 7,6, Puffer, zu welchem 0,01 M NaCl zugefügt wurden, entfernt. Die Objektträger werden zweimal 10 min in 0,05 M Tris HCl, pH-Wert 7,6,0,1 M NaCl gewaschen. Die Entbehandlung der Objektträger wird wie in den Stufen 11-14 angegeben durchgeführt mit der Ausnahme, dass PBS durch Tris-HCl ersetzt wird. Die fertiggestellten Objektträger werden mittels Lichtmikroskopie geprüft.

Herstellung der Objektträger mit den HeLa-Zellpräparaten für die Immunofluoreszenz

Eine Vorratsmenge von fixierten HeLa Zellen wurde fol-gendermassen hergestellt:

Aktiv wachsende Zellen aus der HeLa Kulturflasche wurden entfernt und mit PBS, pH-Wert 7,2, gewaschen. Die Zellen wurden so suspendiert, dass mindestens 1,5 x 106 Zellen/ml vorhanden waren. Ein Tropfen der HeLa Zellensuspension wurde auf einen gewaschenen Objektträger aufgebracht (gewaschen mit einem Reinigungsmittel, gespült mit destilliertem oder deionisiertem Wasser, gereinigt mit Alkohol, gespült und getrocknet mit erwärmter Luft) und leicht verteilt und bei Zimmertemperatur oder in der Kälte über Nacht trocknen gelassen. Die getrockneten Zellen wurden fixiert, indem die Objektträger bei 4°C 12 h in Aceton gegeben wurden. Die Objektträger wurden mit einem Markierungsstift mit Diamantspitze numeriert. Die Objektträger wurden als positive Kontrollen für die Immunofluoreszenz verwendet.

Nachweis des bösartigen Tumors mit Testantikörper

Die vorliegenden Studien bestätigen, dass nukleolare Antigene in Tumorzellen anwesend sind, aber in Geweben ohne Tumor nicht gefunden werden. Einleitende Studien zeigten, dass sowohl in Zellkulturen mit humanen Tumoren als auch in Proben von Autopsie- oder Biopsieproben durch die Doppel-Antikörpertechnik (indirekte Immunofluoreszenz) eine helle nucleolare Fluoreszenz erzeugt wurde, und dass mit einer Serie von nicht-Tumorgeweben keine entsprechenden Ergebnisse erhalten wurden (Davis et al, 1979). In späteren Studien wurden mehr als 60 maligne Tumore studiert und eine Vielzahl von Gewebekontrollen ausgewertet. Es ist von grossem Interesse, dass diese breite Versuchsreihe von malignen Tumoren von ektodermalem, endodermalem, und mesodermalem Ursprung die Gegenwart von einem oder mehreren allgemeinen nuklearen Antigenen zeigt (Tabelle I).

Beispiel I

Normale Gewebe - In 17 nicht-Tumorgeweben wurde nach der Bebrütung der Antiseren oder Antikörper mit den verschiedenen fixierten Zellpräparaten keine nukleolare Fluoreszenz beobachtet. Es war von besonderem Interesse, dass weder die Malpighianschicht der Haut noch die Zellen des Knochenmarks noch die Krypten von Lieberkuhn eine positive Immunofluoreszenz bei diesem Verfahren zeigten. Darüber hinaus war die Vielzahl der nicht-Tumorgewebe im Anschluss an die Neoplasmen ebenfalls negativ, diese schliessen viele Gewebe von verschiedenen Typen ein. Eine Gruppe von benignen Tumoren, die ausgewertet wurden, einschliesslich verschiedene Typen von thyroidem Adenoma war ebenfalls negativ (Tabelle II).

Beispiel 2

Entzündliche Affektionen - Um festzustellen ob eine «ent-zündungs»-Reaktion mit dem Auftreten dieser Antigene verbunden war, wurden Studien durchgeführt, mit 8 Typen von entzündeten Geweben. In den meisten Fällen wurde keine bemerkenswerte Fluoreszenz in den Nucleoli der Zellen beobachtet. Es wurden jedoch Abschnitte gefunden, bei Proben von ulcerativer Colitis und gastrischem Ulcer, die eine positive nukleolare Fluoreszenz zeigten. Insbesondere zwei von drei Abschnitten der ulcerativen Colitis waren negativ und einer zeigte eine definitive positive nukleolare Fluoreszenz. Beim gastrischen Ulcer zeigte eine von zwei Abschnitten eine positive nukleolare Fluoreszenz. Diese Ergebnisse sind besonders interessant im Hinblick auf die bekannte Neigung dieser Affektionen, eine maligne Änderung durchzumachen. Es war von besonderem Interesse, sowohl die fokalpositiven und negativen Regionen dieser Streifen in den häm toxilineosingebeizten Abschnitten zu beobachten. Diese zeigten, dass bei diesen Affektionen in der Tat Regionen vorliegen, die nicht nur mitotische Figuren zeigen, sondern auch eine Anhäufung von epithelialer Auskleidung. Dieses Ergebnis legte es nahe, dass diese Zellen prä-neoplastische Affektionen oder Carcinome in situ darstellen. Es ist möglich, dass diese Entdeckung der fluoreszenten Regionen behilflich sein kann bei Entscheidungen über das chirurgische Vorgehen durch entweder lokale oder mehr allgemeine Resektion der befallenen Schäden.

Beispiel 3

Gegentatsachen - Bei dem gastrischen Epithelium wurde eine Fluoreszenzregion in jeder Zelle festgestellt, die nicht nukleolar war, was eine nicht spezifische Lokalisation des fluoreszierenden Antikörpers darzustellen schien. In einer Krypte des kleinen Intestinums schien eine nicht spezifische Lokalisation des Antikörpers aufzutreten in Form von Aggregaten. In den meisten Fällen eliminierte die Präfiltration der Antikörper durch ein 0,34 (im Milliporfilters diese Aggregate. In einer Probe des Brustgewebes, das negativ war gegenüber nukleolarer Fluoreszenz, waren kleine nicht spezifische immunofluoreszente Partikel allgemein verteilt ohne eine spezielle Lokalisierung hinsichtlich der Zellenmorphologie. Die Durchmesser dieser sehr kleinen nicht spezifischen Präzipitate waren 0,5 bis 0,1 |im im Vergleich zu den nukleolaren Durchmessern in den Nuclei und Nucleoli, die 4 bis 6 p.m betrugen.

Beispiel 4

Fluoreszenz während der Phasen des Zellcyclus - Die nukleolare Fluoreszenz wurde gut sichtbar gemacht in den Interphasennucleoli. In der Metaphase war die nukleolare Fluoreszenz nicht sichtbar als eine deutliche Gesamtheit, sondern war sichtbar zwischen den Chromosomen und in den verbindenden Bereichen zwischen dem Nucleus aus dem

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Kryptoplasma. Insofern als der Nucleus im allgemeinen während der Metaphase und der RNA verschwindet, hört die Synthese in der späten Prophase auf, es war daher nicht überraschend, dass die nukleolare Fluoreszenz nicht sichtbar war als deutliche Gesamtheit in diesen Zellen (Tan und Lerner, 1972). Die Feststellung, dass Überreste der immunofluores-zenten Produkte während der Mitosis bestehen bleiben, legte jedoch nahe, dass die nukleolaren Substrukturen (im Gegensatz zu den nukleolaren Produkten) Antigene enthalten, die epigenetisch beständig sind.

Beispiel 5

Negativ maligne Tumore - Bei der Serie der malignen Tumoren wurden negative Regionen in verschiedenem Umfang auf den Objektträgern gefunden. Im allgemeinen können diese in Verbindung gebracht werden mit entweder nekrotischen oder Abszessteilen des Neoplasmas. In einer Probe eines Gehirntumors war die Masse die keine positive Fluoreszenz zeigte, nekrotisches waren viele Leukozyten anwesend, aber es bestand keine definierte Struktur. Ein Adenocarcinom, das in das Gehirn metastasierte, zeigte keine positive Fluoreszenz, die Gründe waren nicht klar. 61 von 63 untersuchten Tumoren zeigten eine positive nukleolare Fluoreszenz, 97% der untersuchten Serie war positiv. Diese Studien wurden nun in weitem Umfang ausgedehnt auf über 300 menschliche Krebsproben, einschliesslich einer Serie von Krebs der Brust, Prostata, Lunge und hämatologi-schen Tumoren mit sehr ähnlichen Ergebnissen.

Beispiel 6

Markierung - Direkte immunochemische Verfahren zur Demonstration der Antikörper schliesst die Markierung des primären Antikörpers mit einem oder mehreren der folgenden Labels ein: ein Radioisotop für Autoradiographie wie beispielsweise 12SI, mI, l4C oder 3H, ein fluoreszierender Farbstoff wie Fluoreszein oder Tetramethylrhodamin für

Fluoreszenzmikroskopie, ein Enzym das ein fluoreszierendes oder gefärbtes Produkt hervorbringt zur Feststellung der Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie, oder das ein elektronendichtes Produkt hervorbringt, für die Demonstration mit-5 tels Elektronenmikroskopie, oder ein elektronendichtes Molekül, wie Ferritin, für direkte elektronenmikroskopische Sichtbarmachung.

Indirekte immunochemische Verfahren umfassen die Markierung des zweiten Antikörpers oder andere Binde-Pro-io teine, die spezifisch sind für den ersten Antikörper mit einem fluoreszierenden Farbstoff, eine elektronendichte Verbindung, ein Enzym, das ein Produkt hervorbringt, das mittels Licht feststellbar ist, fluoreszenz- oder elektronenmikroskopische Untersuchung oder ein Radioisotop, das durch Auto-15 radiographie feststellbar ist.

Die indirekten immunochemischen Verfahren für die Sichtbarmachung der Antikörper sind: Anwendung von hybriden, primären oder sekundären Antikörpern oder Antikörperfragmenten (F(ab')j) worin ein Teil des hybriden 20 Antikörperpräparats spezifisch ist für die nukleolaren Antigene (hybride primäre Antikörper) oder für den primären Antikörper (hybrider zweiter Antikörper) und ein Teil spezifisch ist für einen Label, wie diejenigen die im vorangehenden Absatz erwähnt wurden.

Diagnostik-Ausrüstungen

Markierte konjugierte und nichtkonjugierte Antikörper können für die Vermarktung getrennt in phosphorgepufferte 30 Salzlösung (PBS) oder anderen gepufferten Suspensionsmittel verpackt werden. Geeignete Suspensionsmittel sind Glycerin, Heparin oder Sucrose. Geeignete Puffer sind Puffer auf der Basis von Barbituraten, Morpholinpuffer, MOPS-3-(N-morpholino)propansulfonsäure, Hepes-N-2-35 hydroxyethylpiperazine-N-2-äthansulfonsäure oder Triscar-bonate.

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Claims (11)

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1. Verfahren zur Isolierung von Antigenen in Form von isolierten Nucleoli oder nuklearen Extrakten, die Nucleoli-Bestandteile enthalten, und welche Antigene eine Hauptspezies und mindestens eine Nebenspezies haben, wobei die Hauptspezies der Antigene folgende Charakteristika aufweist:

Isoelektrischer Punkt pl 6,0-6,7, ermittelt durch isoelektrisches Fokussieren,

Molekulargewicht = 50'000-60'000 u,

löslich in 0,01 M Tris HCL ph 8, und die Antigene primär in Nucleoli von humanen Krebszellen lokalisiert werden,

dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene aus Nuclei oder Nucleoli von humanen Krebszellen durch Extraktion mit 0,01 M Tris HCl mit einem pH-Wert von 7-9 gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene zur Reinigung zusätzlich nacheinander einer Ammoniumsulfatfällung, einer DEAE-Säulenchroma-tographie, einem Dextran-Gelausschluss, einer Kationenaustausch- und Calciumphosphat-Gelchromatographie und einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen werden.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Antigene Nucleoli aus malignen humanen Zellen aus der Familie HeLa-Zellen, Carcinomen, Sarcomen und hämatologischen Neoplasmen extrahiert werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Antigene Nucleoli aus HeLa-Zellen oder humanen prostatischen Carcinom-Zellen extrahiert werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Antigene Extrakte von Nuclei oder Nucleoli von malignen humanen Zellen aus der Familie, bestehend aus HeLa-Zellen, Carcinomen, Sarcomen und hematologischen Neoplasmen gewonnen werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Antigene Extrakte von Nuclei oder Nucleoli von HeLa-Zellen oder humanen prostatischen Carcinom-Zellen gewonnen werden.

7. Antigene, erhalten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6.

8. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch sind gegen die Antigene aus Nuclei oder Nucleoli von humanen Krebszellen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wirtstier mit einem Antigen gemäss Anspruch 7 immunisiert wird und die Antikörper aus dem immunisierten Tier gewonnen werden.

9. Antikörper, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 8.

10. Verfahren zum immunologischen Nachweis von Krebs in humanen Gewebesektionen, Abstrichen und abgeschuppten cytologischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, dass Proben hiervon mit Antikörpern nach Anspruch 9 in Kontakt gebracht werden.

11. Diagnostische Ausrüstung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie Antikörper gemäss Anspruch 9 enthält, die in einem gepufferten Suspensionsmittel oder in Lösung vorliegen und die durch ein Label markiert sind, das durch eine oder mehrere der nachstehend erwähnten Methoden einen Nachweis erlaubt: Licht-Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie, indirekte immunchemische Testmethoden und Autoradiographie.