JPS62215871A - ヒト癌細胞の免疫学的検出方法 - Google Patents
ヒト癌細胞の免疫学的検出方法Info
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- JPS62215871A JPS62215871A JP61297438A JP29743886A JPS62215871A JP S62215871 A JPS62215871 A JP S62215871A JP 61297438 A JP61297438 A JP 61297438A JP 29743886 A JP29743886 A JP 29743886A JP S62215871 A JPS62215871 A JP S62215871A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、ヒトの癌に広範に見られろが、非腫瘍組織に
は無い核小体抗原ｐｌ ４５、並びに該核小体抗原に特
異的な診断用の抗体および抗血清に関ずろ。
は無い核小体抗原ｐｌ ４５、並びに該核小体抗原に特
異的な診断用の抗体および抗血清に関ずろ。
［従来技術］
実験動物を用いた過去の研究により、ＩＩＩ瘍中には、
非腫瘍組織には見られない核抗原および核小体抗原が存
在ケることが示されている（アール・ケイ・ブツシュ（
ＩＬ Ｋ、 Ｂｕｓｃｈ）ら、カンザー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｃｓ、）３４．２３６２．１９７４年
、ヨウマン（Ｙ ｅｏｍａｎ）ら、プロシーディンゲス
・オブ・ナシジナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー
ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、）米国 ７３．３２５８．１９７６年；ブツシュおよ
びブツシュ、ツモリ（Ｔ ｕｍｏｒｉ） ６３．３４７
．１９７７年：ディヒス（１）ａｖｉｓ）ら、カンサー
・リサーチ３８．１９０６．１９７８年；マラシ（Ｍａ
ｒａｓｈｉ）ら、カンザー・リサーチ３９．５９．１９
７９年）。該研究者らによるこれらの先の研究において
は、兎を免疫感作することによって、ラットの正常およ
び新生物細胞の核小体に対する抗体を調製した（アール
・ケイ・ブツシュら、前記文献：プッシュおよびブツシ
ュ、ｉη記文献：ディビスら、首記文献）。間接免疫蛍
光法によって、アセトン固定腫瘍細胞中で、核小体が蛍
光を発することが示された。ラットのノビコツ（ＮＯＶ
ｉｋｏｆＤ肝癌核小体から抽出された抗原に対する抗血
清によってオフテルロニー・ゲル中に生じる免疫沈降線
は、叶核小体抗原およびそれに対する抗血清によって生
じる対応する免疫沈降線と異なることられかった（ブツ
シュおよびブツシュ、前記文献）。
非腫瘍組織には見られない核抗原および核小体抗原が存
在ケることが示されている（アール・ケイ・ブツシュ（
ＩＬ Ｋ、 Ｂｕｓｃｈ）ら、カンザー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｃｓ、）３４．２３６２．１９７４年
、ヨウマン（Ｙ ｅｏｍａｎ）ら、プロシーディンゲス
・オブ・ナシジナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー
ズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、）米国 ７３．３２５８．１９７６年；ブツシュおよ
びブツシュ、ツモリ（Ｔ ｕｍｏｒｉ） ６３．３４７
．１９７７年：ディヒス（１）ａｖｉｓ）ら、カンサー
・リサーチ３８．１９０６．１９７８年；マラシ（Ｍａ
ｒａｓｈｉ）ら、カンザー・リサーチ３９．５９．１９
７９年）。該研究者らによるこれらの先の研究において
は、兎を免疫感作することによって、ラットの正常およ
び新生物細胞の核小体に対する抗体を調製した（アール
・ケイ・ブツシュら、前記文献：プッシュおよびブツシ
ュ、ｉη記文献：ディビスら、首記文献）。間接免疫蛍
光法によって、アセトン固定腫瘍細胞中で、核小体が蛍
光を発することが示された。ラットのノビコツ（ＮＯＶ
ｉｋｏｆＤ肝癌核小体から抽出された抗原に対する抗血
清によってオフテルロニー・ゲル中に生じる免疫沈降線
は、叶核小体抗原およびそれに対する抗血清によって生
じる対応する免疫沈降線と異なることられかった（ブツ
シュおよびブツシュ、前記文献）。
腫瘍核小体に対する抗血清が肝核抽出物に吸収されると
、ノビコツ腹水肝癌細胞抽出物においては蛍光を発する
が、肝細胞抽出物においては発しないという性質ら更に
示された。逆に言うと、肝核小体に対する抗血清が腫瘍
核小体抽出物に吸収されると、検出可能な癌核小体蛍光
は発しないが、核小体抽出物においては蛍光が発する（
ディビスら、前記文献）。
、ノビコツ腹水肝癌細胞抽出物においては蛍光を発する
が、肝細胞抽出物においては発しないという性質ら更に
示された。逆に言うと、肝核小体に対する抗血清が腫瘍
核小体抽出物に吸収されると、検出可能な癌核小体蛍光
は発しないが、核小体抽出物においては蛍光が発する（
ディビスら、前記文献）。
免疫蛍光分析により（特に、正常な肝臓の核および核小
体に抗血清を吸収させることによって）、アセトン固定
腫搗塗抹漂本およびラット正常細胞塗抹標本に相違が見
られることがわかったので、対応するヒトの腫瘍の組織
試料の試験に、ラット腫瘍核小体抗原に対するこれらの
抗血清を利用する試みがなされた。嘔１“種類動物の腫
瘍の核小体に対する抗体を用いても、ヒト腫瘍核小体に
は免疫蛍光が見られないことがわかった。このことを考
慮して、本発明者らは、特異的なヒト核小体抗原を見つ
けるために新しい実験を開始した。そして、そのような
新しいヒト腫瘍核小体標本に対する抗血清よ３よび抗体
によって、ヒトの腫瘍組織に免疫蛍光か見られた。この
ような研究においては、抗体を胎盤核超音波処叩物およ
びウシ胎児面清に吸収させた（ブツシュら、カンサー・
リサーチ ３９．３０２４．１９７９年；ディビスら、
プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシーズ、米国 ７６．８９２．１９７９
年；スメタナ（Ｓ ｍｅｔａｎａ）ら、ライフ・サイエ
ンシーズ（Ｌ ｉｒｅ Ｓ ｃｉ、） ２５．２２７
．１９７９年）。
体に抗血清を吸収させることによって）、アセトン固定
腫搗塗抹漂本およびラット正常細胞塗抹標本に相違が見
られることがわかったので、対応するヒトの腫瘍の組織
試料の試験に、ラット腫瘍核小体抗原に対するこれらの
抗血清を利用する試みがなされた。嘔１“種類動物の腫
瘍の核小体に対する抗体を用いても、ヒト腫瘍核小体に
は免疫蛍光が見られないことがわかった。このことを考
慮して、本発明者らは、特異的なヒト核小体抗原を見つ
けるために新しい実験を開始した。そして、そのような
新しいヒト腫瘍核小体標本に対する抗血清よ３よび抗体
によって、ヒトの腫瘍組織に免疫蛍光か見られた。この
ような研究においては、抗体を胎盤核超音波処叩物およ
びウシ胎児面清に吸収させた（ブツシュら、カンサー・
リサーチ ３９．３０２４．１９７９年；ディビスら、
プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシーズ、米国 ７６．８９２．１９７９
年；スメタナ（Ｓ ｍｅｔａｎａ）ら、ライフ・サイエ
ンシーズ（Ｌ ｉｒｅ Ｓ ｃｉ、） ２５．２２７
．１９７９年）。
［発明の措成１
本発明は、ヒト腫瘍核小体抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体を製造することを目的とした研究にＪＪづく。モ
ノクローナル抗体は、特異性が高く、無制限に得られろ
という点で、ポリクローナル抗体よりも浸れている。ヒ
ト腫瘍核小体抗原（ｐ１４５）に対するこのようなモノ
クローナル抗体が開発されたのである。
ル抗体を製造することを目的とした研究にＪＪづく。モ
ノクローナル抗体は、特異性が高く、無制限に得られろ
という点で、ポリクローナル抗体よりも浸れている。ヒ
ト腫瘍核小体抗原（ｐ１４５）に対するこのようなモノ
クローナル抗体が開発されたのである。
核小体抗原（ｐ１４’５）は、分子サイズが１４．５に
＋）であり、免疫電子顕微鏡法により、腫瘍細胞の核小
体の細繊維部分および顆粒域に存在することがわかって
いる。核小体抗原１）１４５に対ずろモノクローナル抗
体は、種々の病態および正常なヒトの組織において、該
抗原の存在を測定するために、免疫蛍光法および／また
は免疫パーオキシダーゼ法に用いられている。
＋）であり、免疫電子顕微鏡法により、腫瘍細胞の核小
体の細繊維部分および顆粒域に存在することがわかって
いる。核小体抗原１）１４５に対ずろモノクローナル抗
体は、種々の病態および正常なヒトの組織において、該
抗原の存在を測定するために、免疫蛍光法および／また
は免疫パーオキシダーゼ法に用いられている。
本発明は、共通の核小体抗１３９．（ｐ １４５ ）が
、ヒト癌細胞には広範に見られるが、ヒト正常細胞には
見られないという驚くべき発見に基づく。この抗原は、
遺伝子調節機能または他の機能を有し得るタンパク質で
あり、染色体周辺の位置において有糸分裂の間残存する
。本発明の重要な態様は、ヒト癌細胞に共通の核小体抗
原の発見、該核小体抗原の単離および精製、該抗原に特
異的なモノクローナル抗体の製造、並びに該抗原に特異
的なモノクローナル抗体を用いる、ヒト癌細胞検出のた
めの診断試験方法である。
、ヒト癌細胞には広範に見られるが、ヒト正常細胞には
見られないという驚くべき発見に基づく。この抗原は、
遺伝子調節機能または他の機能を有し得るタンパク質で
あり、染色体周辺の位置において有糸分裂の間残存する
。本発明の重要な態様は、ヒト癌細胞に共通の核小体抗
原の発見、該核小体抗原の単離および精製、該抗原に特
異的なモノクローナル抗体の製造、並びに該抗原に特異
的なモノクローナル抗体を用いる、ヒト癌細胞検出のた
めの診断試験方法である。
癌細胞中の抗原
抗原１）１４５は、胃腸管、性尿器管、肺、肝臓、筋肉
、軟骨、皮膚および血液の癌のようなヒトの癌に広範に
見られる。例えば、ヒトの悪性腫瘍細胞には、ヒーラ細
胞、前立腺癌腫、他の癌腫、肉腫および血液学的新生物
が含まれる。抗原ｐ１４５は、ヒト悪性腫瘍細胞の核ま
たは核小体がら抽出することができる。該抗原は、対応
する非腫瘍組織には見られない。
、軟骨、皮膚および血液の癌のようなヒトの癌に広範に
見られる。例えば、ヒトの悪性腫瘍細胞には、ヒーラ細
胞、前立腺癌腫、他の癌腫、肉腫および血液学的新生物
が含まれる。抗原ｐ１４５は、ヒト悪性腫瘍細胞の核ま
たは核小体がら抽出することができる。該抗原は、対応
する非腫瘍組織には見られない。
核小体抗原ｐ１４５は、特異的モノクローナル抗体で免
疫染色することによって、１次元のウェスタン法によっ
て、単一のベブヂド帯として同定される。５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル６〜８％を用いるウェスタン法（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ ｔｒａｎｓｆｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）
によると、ｐＩ ４５抗原の分子サイズは約１４５ＫＤ
である。免疫′４子顕微鏡法によると、抗原は、ｒＲＮ
Ａの転写が盛んに起こる細線細部分を含む癌細胞の核小
体全域、およびプレリポソーム粒子が集まっている顆粒
域に分散して位置している。
疫染色することによって、１次元のウェスタン法によっ
て、単一のベブヂド帯として同定される。５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル６〜８％を用いるウェスタン法（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ ｔｒａｎｓｆｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）
によると、ｐＩ ４５抗原の分子サイズは約１４５ＫＤ
である。免疫′４子顕微鏡法によると、抗原は、ｒＲＮ
Ａの転写が盛んに起こる細線細部分を含む癌細胞の核小
体全域、およびプレリポソーム粒子が集まっている顆粒
域に分散して位置している。
核小体抗原ｐｔ ４５は、デオキシコーレート０゜２％
含有０．０ＩＭトリス緩衝液中でホモジナイズすること
によって、ヒト腫瘍核小体から抽出し得る。この抽出物
を１００，０００ｇで遠心分離すると、抗原が核小体す
ボ核タンパク質（ＲＮＰ）フラクノヨンに会合して残る
。抗原ｐ１４５はこのような粒子と強く結合しているが
、４Ｍグアニジニウム塩酸塩またはりボヌクレアーゼで
処理することによって遊離し得る。ｐ１４５抗原は、イ
オン交換および免疫アフィニティクロマトグラフィーに
よって、または１次元もしくは２次元のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって、等質性に精製される。
含有０．０ＩＭトリス緩衝液中でホモジナイズすること
によって、ヒト腫瘍核小体から抽出し得る。この抽出物
を１００，０００ｇで遠心分離すると、抗原が核小体す
ボ核タンパク質（ＲＮＰ）フラクノヨンに会合して残る
。抗原ｐ１４５はこのような粒子と強く結合しているが
、４Ｍグアニジニウム塩酸塩またはりボヌクレアーゼで
処理することによって遊離し得る。ｐ１４５抗原は、イ
オン交換および免疫アフィニティクロマトグラフィーに
よって、または１次元もしくは２次元のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって、等質性に精製される。
抗原が、癌細胞中に高濃度で存在し、非癌細胞中には非
常に低い濃度でしか存在しない物質であるかどうか、ま
たはラットノビコツ肝癌およびラット正常肝細胞の核抗
原についての匹敵する研究において過去にわかっている
ような胎児性抗原であるかどうかを更に決定しなければ
ならない（ヨウマンら、１９７６年）。
常に低い濃度でしか存在しない物質であるかどうか、ま
たはラットノビコツ肝癌およびラット正常肝細胞の核抗
原についての匹敵する研究において過去にわかっている
ような胎児性抗原であるかどうかを更に決定しなければ
ならない（ヨウマンら、１９７６年）。
ヒトの腫瘍および他の組織
癌の疑いのある患者（ヒト）の組織、血液および血清の
試料を採り、分析するための全方法が、ザ・ヒユーマン
・リザーチ・コミソティ・アト・パイラー・カレッジ・
才ブ・メディソン、ヒユーストン、テキサス（ｔｂｃ
Ｉｌｕｍａｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ１ｔＬｅｅ
ａｔ Ｂａｙｌｏｒ ＣｏＣｏ１１ｅ ｏｒＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ、 １ｌｏｕｓｔｏｎ。
試料を採り、分析するための全方法が、ザ・ヒユーマン
・リザーチ・コミソティ・アト・パイラー・カレッジ・
才ブ・メディソン、ヒユーストン、テキサス（ｔｂｃ
Ｉｌｕｍａｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ１ｔＬｅｅ
ａｔ Ｂａｙｌｏｒ ＣｏＣｏ１１ｅ ｏｒＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ、 １ｌｏｕｓｔｏｎ。
Ｔｅｘａｓ）および付属病院により認められた。ヒトの
腫瘍切片は、主に、ザ・デパートメント・オブ・パソロ
ジーＱｈｅ Ｄ ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｒ Ｐ
ａｔｈｏｌｏｇｙ）、ザ・ヒユーストン・ヴエテラン
ズ・アドミニストレインヨン・メディカル・センター（
Ｌｈｅ ｌ１ｏｕｓｔｏｎＶｅｔｅｒａｎｓ Ａｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔ
ｅｒ）およびメソシスト・ホスピタル、ヒユーストン、
テキサス（Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ Ｈｏ５ｐｉｔａ１．
Ｈｏｕｓｔｏｎ。
腫瘍切片は、主に、ザ・デパートメント・オブ・パソロ
ジーＱｈｅ Ｄ ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｒ Ｐ
ａｔｈｏｌｏｇｙ）、ザ・ヒユーストン・ヴエテラン
ズ・アドミニストレインヨン・メディカル・センター（
Ｌｈｅ ｌ１ｏｕｓｔｏｎＶｅｔｅｒａｎｓ Ａｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔ
ｅｒ）およびメソシスト・ホスピタル、ヒユーストン、
テキサス（Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ Ｈｏ５ｐｉｔａ１．
Ｈｏｕｓｔｏｎ。
Ｔ ｅｘａｓ）からの、外科標本の凍結切片、生検また
は低温保存標本から得た。これらの切片を、間接免疫蛍
光法および免疫パーオキシダーゼ法によって核小体抗原
の存在を分析した。
は低温保存標本から得た。これらの切片を、間接免疫蛍
光法および免疫パーオキシダーゼ法によって核小体抗原
の存在を分析した。
ヒーラ細胞核小体の標本
スピンナー（Ｓ ｐｉｎｎｅｒ）培養ビン（７〜１Ｎり
からヒーラ細胞を集めた。この細胞の濃度は、対数期７
〜３ｘｌＯ’個／ｍＱであるべきであり、そのような値
であった。細胞を８００ｇで８分間遠心分離して、細胞
ベレットを形成した。荒いテフロンの乳棒で臣やかにホ
モジナイズすることによって、細胞ペレットをリン酸緩
衝生理食塩液（Ｐ １３ Ｓ ）Ｃ０．１５Ｍ ＮａＣ
Ｑ、０．０１Ｍリン酸塩、ｐＨ７゜２）に懸濁し、８０
０ｇで８分間遠心分離した。細胞をＰＢＳで２回洗い、
細胞ペレットの重１を測定した。ｔ＝やかにホモジナイ
ズすることによって、細胞ペレットを、２０倍容量の網
状赤血球標準緩衝液（Ｒ９Ｉ３． ｐ＋（７，４）に懸
濁し、水上で３０分間膨潤さ０゛た。次いで１０００ｇ
で８分間遠心し、［２やかにホモジナイズすることによ
って、ＲＳｒ３緩衝液＋１／２０容量の洗剤ノニデート
（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ４０（ＲＳＢ中１中形０％再度懸
濁した。ノニデートの最終容量は０．５％であった。ド
ウンス（Ｄ ｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（２０〜６０
ストローク）で細胞をホモジナイズすることによって細
胞を破壊し、核を細胞質から離した。次いで、細胞を１
０００ｇで８分間遠心分離し、穏やかにホモジナイズす
ることによって、０．８８Ｍシュクロース、０ 、５
ｍＭ酢酸マグネシウム（２０×重量−容量）に再度＠濁
し、１５００ｇで２０分間遠心分離した。
からヒーラ細胞を集めた。この細胞の濃度は、対数期７
〜３ｘｌＯ’個／ｍＱであるべきであり、そのような値
であった。細胞を８００ｇで８分間遠心分離して、細胞
ベレットを形成した。荒いテフロンの乳棒で臣やかにホ
モジナイズすることによって、細胞ペレットをリン酸緩
衝生理食塩液（Ｐ １３ Ｓ ）Ｃ０．１５Ｍ ＮａＣ
Ｑ、０．０１Ｍリン酸塩、ｐＨ７゜２）に懸濁し、８０
０ｇで８分間遠心分離した。細胞をＰＢＳで２回洗い、
細胞ペレットの重１を測定した。ｔ＝やかにホモジナイ
ズすることによって、細胞ペレットを、２０倍容量の網
状赤血球標準緩衝液（Ｒ９Ｉ３． ｐ＋（７，４）に懸
濁し、水上で３０分間膨潤さ０゛た。次いで１０００ｇ
で８分間遠心し、［２やかにホモジナイズすることによ
って、ＲＳｒ３緩衝液＋１／２０容量の洗剤ノニデート
（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ４０（ＲＳＢ中１中形０％再度懸
濁した。ノニデートの最終容量は０．５％であった。ド
ウンス（Ｄ ｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（２０〜６０
ストローク）で細胞をホモジナイズすることによって細
胞を破壊し、核を細胞質から離した。次いで、細胞を１
０００ｇで８分間遠心分離し、穏やかにホモジナイズす
ることによって、０．８８Ｍシュクロース、０ 、５
ｍＭ酢酸マグネシウム（２０×重量−容量）に再度＠濁
し、１５００ｇで２０分間遠心分離した。
得られたペレットは、ヒーラ細胞核を含有しており、核
小体の調製に使用した。
小体の調製に使用した。
核小体を単離するために、前記のように調製した核ペレ
ットを、穏やかにホモジナイズすることににッて、０．
３４Ｍンユクロース、０ 、５ ｍＭ酢酸マグネンウノ
・に、元の細胞１ｇ当たりシュクロース２ｍｇを使用し
て’ＷＥした。核を、１０秒ずつ（１０秒の休止をはさ
んで）超音波処理した（ブランソン振動器（Ｂ ｒａｎ
ｓｏｎ ５ｏｎｉｆｅｒ）を用いた）。全時間は、６
０〜ｌｌＯ秒であった。遊離した核小体を、鏡検した。
ットを、穏やかにホモジナイズすることににッて、０．
３４Ｍンユクロース、０ 、５ ｍＭ酢酸マグネンウノ
・に、元の細胞１ｇ当たりシュクロース２ｍｇを使用し
て’ＷＥした。核を、１０秒ずつ（１０秒の休止をはさ
んで）超音波処理した（ブランソン振動器（Ｂ ｒａｎ
ｓｏｎ ５ｏｎｉｆｅｒ）を用いた）。全時間は、６
０〜ｌｌＯ秒であった。遊離した核小体を、鏡検した。
核小体を可視化するために、アズール（Ａｚｕｒｅ）Ｃ
（溶液は、０．２５Ｍシュクロース中のアズールＣ１％
から成る）で染色した。超音波処理後には、標本に核が
含まれないようにすべきである。超音波処理フラクショ
ンを３倍容量の０．８８Ｍシュクロース（酢酸マグネシ
ウムを含まない）に懸濁し、１５００ｇで２０分間分離
遠心した。得られたペレットは、免疫原として使用し得
るヒーラ細胞核小体を含有していた。
（溶液は、０．２５Ｍシュクロース中のアズールＣ１％
から成る）で染色した。超音波処理後には、標本に核が
含まれないようにすべきである。超音波処理フラクショ
ンを３倍容量の０．８８Ｍシュクロース（酢酸マグネシ
ウムを含まない）に懸濁し、１５００ｇで２０分間分離
遠心した。得られたペレットは、免疫原として使用し得
るヒーラ細胞核小体を含有していた。
通例、前記方法（ブツシュおよびスメタナ、１９７０年
）によって十分な精製を行うことができ、光学顕微鏡に
よってこの標本の質は実質的に十分であることが示され
た。このような標本の十分な精製に重要な点は、培養液
中の元のヒーラ細胞の景を制限し、それによって再精製
工程数を減らすことである。核小体を十分に精製するの
に適当なヒーラ細胞量は、５〜ｌＯｇ、好ましくは０．
５〜１ｇである。ヒーラ細胞の生育条件および胎盤細胞
核の単離は、過去に報告されているもの（ディビスら、
１９７９年）と実質的に同様である。
）によって十分な精製を行うことができ、光学顕微鏡に
よってこの標本の質は実質的に十分であることが示され
た。このような標本の十分な精製に重要な点は、培養液
中の元のヒーラ細胞の景を制限し、それによって再精製
工程数を減らすことである。核小体を十分に精製するの
に適当なヒーラ細胞量は、５〜ｌＯｇ、好ましくは０．
５〜１ｇである。ヒーラ細胞の生育条件および胎盤細胞
核の単離は、過去に報告されているもの（ディビスら、
１９７９年）と実質的に同様である。
免疫感作のためのヒーラ細胞核小体抽出物の調製
場合によっては、無傷ヒーラ核小体から核小体タンパク
質を抽出し、次いで、正常組織および腫瘍組織に共通の
免疫優性抗原を選択的に除去するために、塩分側に付し
た。この目的のために、ヒーラ核小体をＮａＣＱ−ＥＤ
ＴＡｍ衝液（！０×０Ｍ／容量、０．０７５Ｍ ＮａＣ
Ｑ、０．０２５ＭＮ ａ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ／ ｐＨ８
，１ｍＭＰＭｓＦ）に懸濁しりＣ核１ ｇ／ Ｉ Ｏｍ
（ｌｔＪ街液）。イソプロピルアルコール中、フェニル
メヂルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の濃度がｌ０
０ｍＭとなるようにした。これを、抽出の前に各溶液に
加えた。懸濁液を、ドウンスホモジナイザ−（２０スト
ローク）で、３０００ｇで５分間均質化した。上澄を集
めた。この核小体ペレットについて、前記抽出を２回行
った。
質を抽出し、次いで、正常組織および腫瘍組織に共通の
免疫優性抗原を選択的に除去するために、塩分側に付し
た。この目的のために、ヒーラ核小体をＮａＣＱ−ＥＤ
ＴＡｍ衝液（！０×０Ｍ／容量、０．０７５Ｍ ＮａＣ
Ｑ、０．０２５ＭＮ ａ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ／ ｐＨ８
，１ｍＭＰＭｓＦ）に懸濁しりＣ核１ ｇ／ Ｉ Ｏｍ
（ｌｔＪ街液）。イソプロピルアルコール中、フェニル
メヂルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の濃度がｌ０
０ｍＭとなるようにした。これを、抽出の前に各溶液に
加えた。懸濁液を、ドウンスホモジナイザ−（２０スト
ローク）で、３０００ｇで５分間均質化した。上澄を集
めた。この核小体ペレットについて、前記抽出を２回行
った。
ＮａＣＱ ＥＤＴＡ抽出物は、この抗原研究には使用
しなかった（それ故、廃棄した）。核小体ペレットを、
１０×重量／容遣の０．ＯＩＭ）リス−１−Ｉ ＣＱ７
２０ ｍＭジヂオトレイトール１０．２％デオキシコー
レート／ｐｔＩ８／１ｍＭ ＰＭＳＦに懸濁し、ドウン
スホモジナイザー（２０ストローク）でホモジナイズし
、水浴中で１時間放置した。懸濁液を３０００ｇで１５
分間遠心した。可溶化抗原を含有する上澄を取って置き
、ペレットを前記のように更に２回抽出した。次いで、
上澄を合し、固体（ＮＨ，）２ＳＯ，を加え、最終的な
濃度を３０％飽和とした。混合物を４℃で３時間沈澱さ
せ、次いで３０００ｇで２０分間遠心分離した。免疫漫
性核小体タンパク質Ｃ２３を含有する上澄を捨て、タン
パク質Ｃ２３を含まない沈澱した核小体タンパク質を、
１Ｍ ＮａＧＱ−１Ｍ尿素中で再び可溶化し、注射に使
用した。
しなかった（それ故、廃棄した）。核小体ペレットを、
１０×重量／容遣の０．ＯＩＭ）リス−１−Ｉ ＣＱ７
２０ ｍＭジヂオトレイトール１０．２％デオキシコー
レート／ｐｔＩ８／１ｍＭ ＰＭＳＦに懸濁し、ドウン
スホモジナイザー（２０ストローク）でホモジナイズし
、水浴中で１時間放置した。懸濁液を３０００ｇで１５
分間遠心した。可溶化抗原を含有する上澄を取って置き
、ペレットを前記のように更に２回抽出した。次いで、
上澄を合し、固体（ＮＨ，）２ＳＯ，を加え、最終的な
濃度を３０％飽和とした。混合物を４℃で３時間沈澱さ
せ、次いで３０００ｇで２０分間遠心分離した。免疫漫
性核小体タンパク質Ｃ２３を含有する上澄を捨て、タン
パク質Ｃ２３を含まない沈澱した核小体タンパク質を、
１Ｍ ＮａＧＱ−１Ｍ尿素中で再び可溶化し、注射に使
用した。
抗原調製の第２のアプローチは、腫瘍核小体における非
腫瘍抗原の抗体マスキングである。この方法において、
ヒーラ細胞から精製した核小体を、低イオン強度緩衝液
中でホモジナイズし、２価陽イオンをキレート化するこ
とによってのばした。
腫瘍抗原の抗体マスキングである。この方法において、
ヒーラ細胞から精製した核小体を、低イオン強度緩衝液
中でホモジナイズし、２価陽イオンをキレート化するこ
とによってのばした。
１回の注射につき、ヒーラ細胞５ｇから単離した核小体
を、０．０１Ｍトリス−ＩＩ Ｃｌ２（１）Ｈ７，２，
５ｍＭＥＤＴＡ含有）に＠濁し、水浴中に１時装置いた
。２匹の兎から採ったヒトの正常肝に対する抗血清（各
ｌＯμσ）を、処理したヒーラ核小体に加え、４℃で一
晩振盪した。得られた免疫複合体を、５匹のマウスの注
射に用いた。
を、０．０１Ｍトリス−ＩＩ Ｃｌ２（１）Ｈ７，２，
５ｍＭＥＤＴＡ含有）に＠濁し、水浴中に１時装置いた
。２匹の兎から採ったヒトの正常肝に対する抗血清（各
ｌＯμσ）を、処理したヒーラ核小体に加え、４℃で一
晩振盪した。得られた免疫複合体を、５匹のマウスの注
射に用いた。
免疫感作およびモノクローナル抗体の発生雌のＢａ１ｂ
／ｃマウスに、Ｃ２３を含まない抽出核小体抗原または
前記免疫複合体２００μｇで、腹腔内に４〜６回前期注
射を行った。最初の注射は、不完全フロインドアジュバ
ントを用いて行った。最後の前期注射からｌ箇月後、４
日間連続してマウスを後期注射に付した。マウスに、１
日に核小体抽出物または生理食塩液中の免疫複合体を４
００ｇｇ注射した。注射は、５０％は静脈に、５０％は
腹腔に行った。５日目にマウスを殺し、融合のために肺
臓細胞を集めた。
／ｃマウスに、Ｃ２３を含まない抽出核小体抗原または
前記免疫複合体２００μｇで、腹腔内に４〜６回前期注
射を行った。最初の注射は、不完全フロインドアジュバ
ントを用いて行った。最後の前期注射からｌ箇月後、４
日間連続してマウスを後期注射に付した。マウスに、１
日に核小体抽出物または生理食塩液中の免疫複合体を４
００ｇｇ注射した。注射は、５０％は静脈に、５０％は
腹腔に行った。５日目にマウスを殺し、融合のために肺
臓細胞を集めた。
細胞融合およびクローニング
フィコルーヒパーク（Ｆ １ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ
）勾配（エム−エイ・バイオプロダクツソ（Ｍ、八、
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウォーカーズヴイラ（Ｗａ
ｌｋｅｒｓｖｉ １ｌｅ）、メリーランド）によって、
マウス肺臓のリンパ球を集め、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３骨髄腫細胞（ソーク・インスティテユート（Ｓ
ａｌｋ ｌ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、サン・ディエゴ（
Ｓ ａｎ Ｄ ｉｅｇｏ）、カリフォルニア）と融合
した。各融合のために、胛臓すッパ球約５×１０７個を
、骨髄腫細胞１ｘ１０７ｇ含む５０ｍＣ滅菌円錐管に加
えた。細胞を混合し、而？？ｒを含まないダルベラ：ｌ
（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ）改良イーグル（Ｅａｇｌｅ）
培地（ＤＭＥＭ、エム・エイ・バイオプロダクツ）中で
１回洗った。培地を除去し、ＤＭＥＭ中の５０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）ｌ ５００（エム・エイ・
バイオプロダクツ）１．０＋ｎ＋２に代えた。
）勾配（エム−エイ・バイオプロダクツソ（Ｍ、八、
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウォーカーズヴイラ（Ｗａ
ｌｋｅｒｓｖｉ １ｌｅ）、メリーランド）によって、
マウス肺臓のリンパ球を集め、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３骨髄腫細胞（ソーク・インスティテユート（Ｓ
ａｌｋ ｌ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、サン・ディエゴ（
Ｓ ａｎ Ｄ ｉｅｇｏ）、カリフォルニア）と融合
した。各融合のために、胛臓すッパ球約５×１０７個を
、骨髄腫細胞１ｘ１０７ｇ含む５０ｍＣ滅菌円錐管に加
えた。細胞を混合し、而？？ｒを含まないダルベラ：ｌ
（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ）改良イーグル（Ｅａｇｌｅ）
培地（ＤＭＥＭ、エム・エイ・バイオプロダクツ）中で
１回洗った。培地を除去し、ＤＭＥＭ中の５０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）ｌ ５００（エム・エイ・
バイオプロダクツ）１．０＋ｎ＋２に代えた。
大孔ピペット（１０ｍｆ２）を用いて、ＰＥＧを細胞と
１分間混合し、Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ ７ ｍＱを加え、５分
間放置した。培地２０ｍＱを更に加え、２５０ｇで１５
分間遠心分離した。洗った細胞を、ウソ胎児血清２０％
（エイ・エム・エフ・バイオロジカル・アンド・ダイア
グノスティック・プロダクツ（Ａ Ｍ ＦＢ ｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｄ ｔａｇｏｎｏｓｔｔｃ
Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓＧｏ、 ）、セギン（Ｓｅｇｕｉ
ｎ）、ＴＸ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸塩１
ｍＭ、Ｌ−アルギニン０゜５５ｍＭ、Ｌ−アスパラギン
０．２７ｍＭおよびチミジン１４ｍＭを加えたＤＭＥＭ
３０ｍｆ２に分散した。細胞懸濁液を、ピペットで９６
穴（ｗｅｔ ｌ） ミクロウェル培養プレートに１００
μρずつ入れ、００２５％存在下に３７℃でインキュベ
ートした。
１分間混合し、Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ ７ ｍＱを加え、５分
間放置した。培地２０ｍＱを更に加え、２５０ｇで１５
分間遠心分離した。洗った細胞を、ウソ胎児血清２０％
（エイ・エム・エフ・バイオロジカル・アンド・ダイア
グノスティック・プロダクツ（Ａ Ｍ ＦＢ ｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｄ ｔａｇｏｎｏｓｔｔｃ
Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓＧｏ、 ）、セギン（Ｓｅｇｕｉ
ｎ）、ＴＸ）、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸塩１
ｍＭ、Ｌ−アルギニン０゜５５ｍＭ、Ｌ−アスパラギン
０．２７ｍＭおよびチミジン１４ｍＭを加えたＤＭＥＭ
３０ｍｆ２に分散した。細胞懸濁液を、ピペットで９６
穴（ｗｅｔ ｌ） ミクロウェル培養プレートに１００
μρずつ入れ、００２５％存在下に３７℃でインキュベ
ートした。
１週間後、アミノプテリンを含まない培地を各ウェルに
更に１００μＱ加えた。２〜４週間培徨後、生育細胞ク
ローンを含有する上澄を、ヒーラ細胞によｊける核小体
免疫蛍光について試験した。免疫蛍光が陽性であったウ
ェルを、供給細胞として同−系肺臓細胞を約１０５個／
ウェル含む９６ウエルプレート中で、希釈を制限するこ
とによって再度クローン化した。単一のコロニーを形成
するウェルについて免疫蛍光を再度試験し、希釈を制限
することによって更に１回再クローン化した。再クロー
ン化ハイブリドーマを、供給細胞層を含有ずろ２４ウエ
ルプレートに入れ、次いで、供給細胞を含まないフラス
コに移した。
更に１００μＱ加えた。２〜４週間培徨後、生育細胞ク
ローンを含有する上澄を、ヒーラ細胞によｊける核小体
免疫蛍光について試験した。免疫蛍光が陽性であったウ
ェルを、供給細胞として同−系肺臓細胞を約１０５個／
ウェル含む９６ウエルプレート中で、希釈を制限するこ
とによって再度クローン化した。単一のコロニーを形成
するウェルについて免疫蛍光を再度試験し、希釈を制限
することによって更に１回再クローン化した。再クロー
ン化ハイブリドーマを、供給細胞層を含有ずろ２４ウエ
ルプレートに入れ、次いで、供給細胞を含まないフラス
コに移した。
ハイブリドーマの生育およびモノクローナル抗体の精製
大量の抗体を製造するために、核小体抗原ｐｔ４５に対
して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを
、腹水癌に関して以下のように生育した。細胞培養液か
ら集めたハイプリドーマ細胞層５ｘ１０５ｆ１１’ｌを
、ブリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）で前処理したマウス
に腹腔内注射した。癌の生育から約１週間後、毎日穿刺
してマウスから腹水を採り、遠心分離して細胞を除去し
た。プルツク（Ｂ ｒｕｃｋ）らの方法（１９８２年）
に従って、ＤＥＡＥアフィニティゲルブルー（ＡＩ’ｆ
ｉ−Ｇｅｔ ［３１ｕｅ）り０１トゲラフイーによっ
て、腹水から抗体を精製した。
して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマクローンを
、腹水癌に関して以下のように生育した。細胞培養液か
ら集めたハイプリドーマ細胞層５ｘ１０５ｆ１１’ｌを
、ブリスチン（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）で前処理したマウス
に腹腔内注射した。癌の生育から約１週間後、毎日穿刺
してマウスから腹水を採り、遠心分離して細胞を除去し
た。プルツク（Ｂ ｒｕｃｋ）らの方法（１９８２年）
に従って、ＤＥＡＥアフィニティゲルブルー（ＡＩ’ｆ
ｉ−Ｇｅｔ ［３１ｕｅ）り０１トゲラフイーによっ
て、腹水から抗体を精製した。
精製したモノクローナル抗体を、対照ヒーラスライドの
抗原の免疫蛍光検出が最適となるように滴定した。精製
モノクローナル抗体をＰＢＳに入れ、使用まで一７０°
Ｃで貯蔵した。
抗原の免疫蛍光検出が最適となるように滴定した。精製
モノクローナル抗体をＰＢＳに入れ、使用まで一７０°
Ｃで貯蔵した。
免疫蛍光法
本研究には、第２の抗体をブリツノとして導入するとい
う点を改良して、従来の免疫蛍光法（アール・ケイ・ブ
ツシュら、！９７４年：ヒルガーズ（１−（ｔｉｇｅｒ
ｓ）ら、１９７２年）を使用した。
う点を改良して、従来の免疫蛍光法（アール・ケイ・ブ
ツシュら、！９７４年：ヒルガーズ（１−（ｔｉｇｅｒ
ｓ）ら、１９７２年）を使用した。
間接免疫蛍光法：
抗ｐ１４５モノクローナル抗体作用溶液５０μＱを、ア
セトン固定ヒーラ細胞または固定組織標本上に置いた（
ヒルガーズら、１９７２年；アール・ケイ・ブツシュら
、１９７４年）。組織標本がスライドを広く）°σっで
いる場合には、５０μｅ以上使用しなければならないこ
とらある。抗体の希釈は、抗体濃度に依存する。既知の
陽性細胞（例えばヒーラ細胞）が陽性に反応しないほど
希釈しすぎるのでなければ、他の希釈を用いてもよい。
セトン固定ヒーラ細胞または固定組織標本上に置いた（
ヒルガーズら、１９７２年；アール・ケイ・ブツシュら
、１９７４年）。組織標本がスライドを広く）°σっで
いる場合には、５０μｅ以上使用しなければならないこ
とらある。抗体の希釈は、抗体濃度に依存する。既知の
陽性細胞（例えばヒーラ細胞）が陽性に反応しないほど
希釈しすぎるのでなければ、他の希釈を用いてもよい。
加湿器内で、３７℃で４５〜５０分間スライドをインキ
ュベートした。加湿器は、湿ったベーパータオルを入れ
た大きなペトリ皿であってよい。インキュベーション後
、ＰＢＳをほやかに加えることによって、抗体溶液をス
ライドから洗い流し、スライドをスライドホルダーに入
れ、ＰＢＳで１時間洗った。ＰＢＳを３回換えた（１５
分後、３０分後および４５分後）。スライドをＰＢＳか
ら取り出し、蒸留水または脱イオン水中に素早く上下さ
せて１０回浸漬した。次いで、第２の非標識抗体（兎抗
マウス抗体ｌ：５０希釈、カベル（Ｃａｐｐｅｌ））を
ブリッジとして加え、３７℃で３０分間インキュベート
した。スライドを前記と同様に洗い、フルオレッセイン
標識したヤギ抗兎抗血清（ハイランド（Ｉ（ｙｌａｎｄ
）またはカペル；１：２０希釈）５０ｔ１１２をスライ
ド上に置き、加湿器内で室温で３０〜３５分間インキュ
ベートした。穏やかにＰＢＳで洗うことによって、第２
の抗体をスライドから除いた。次いで、スライドを、Ｐ
ＢＳを１５分後、３０分後および４５分後に換えて１時
間洗うか、または１５分間洗浄後に新しいＰＢＳに入れ
て冷蔵庫内で一晩放置した。ＰＢＳによる最終洗浄後、
スライドを脱イオン水または蒸留水に素早＜１０回上下
させて浸漬し、乾燥した。グリセロール９０％、ＰＢＳ
Ｉ ０％、没食子酸ｎ−プロピル４％、ｐｔ１８の溶
液を、細胞または組織標本に加え、カバースリップで覆
った。カバースリップをシーラント（例えば透明マニキ
ュア液）でシールし、低温に保てば、標本を数箇月間保
存するごとが可能である。次いで、スライドを蛍光顕微
鏡で観察した。萌免疫（ｐｒｅ ｉｍｍｕｎｅ）イムノ
グロブリンまたは前免疫１ｇＧフラクションには、核小
体蛍光は見られなかった。使用した他の免疫学的方法は
、従来の研究（ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）、■９３８
年；ロウリー（Ｌ ｏｗｒｙ）ら、■９５１年；ディル
（Ｄａｌｅ）およびラトナー（Ｌａｔｎｅｒ）、１９６
９年；ローレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）、１９７２年、ワレ
イス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、■９７４年；マラシ（Ｍａ
ｒａｓｈｉ）ら、１９７９年）において使用したものと
同様であった。免疫蛍光法の核小体位置の分析のために
、蛍先ｌｉＵダ【の聞ｌご 七Ｃ文１名−／ｉ’ｒ
創１）タロ召叩ｎ１ノ ・ノ十 と−？−ドアウドに切
り替えた。
ュベートした。加湿器は、湿ったベーパータオルを入れ
た大きなペトリ皿であってよい。インキュベーション後
、ＰＢＳをほやかに加えることによって、抗体溶液をス
ライドから洗い流し、スライドをスライドホルダーに入
れ、ＰＢＳで１時間洗った。ＰＢＳを３回換えた（１５
分後、３０分後および４５分後）。スライドをＰＢＳか
ら取り出し、蒸留水または脱イオン水中に素早く上下さ
せて１０回浸漬した。次いで、第２の非標識抗体（兎抗
マウス抗体ｌ：５０希釈、カベル（Ｃａｐｐｅｌ））を
ブリッジとして加え、３７℃で３０分間インキュベート
した。スライドを前記と同様に洗い、フルオレッセイン
標識したヤギ抗兎抗血清（ハイランド（Ｉ（ｙｌａｎｄ
）またはカペル；１：２０希釈）５０ｔ１１２をスライ
ド上に置き、加湿器内で室温で３０〜３５分間インキュ
ベートした。穏やかにＰＢＳで洗うことによって、第２
の抗体をスライドから除いた。次いで、スライドを、Ｐ
ＢＳを１５分後、３０分後および４５分後に換えて１時
間洗うか、または１５分間洗浄後に新しいＰＢＳに入れ
て冷蔵庫内で一晩放置した。ＰＢＳによる最終洗浄後、
スライドを脱イオン水または蒸留水に素早＜１０回上下
させて浸漬し、乾燥した。グリセロール９０％、ＰＢＳ
Ｉ ０％、没食子酸ｎ−プロピル４％、ｐｔ１８の溶
液を、細胞または組織標本に加え、カバースリップで覆
った。カバースリップをシーラント（例えば透明マニキ
ュア液）でシールし、低温に保てば、標本を数箇月間保
存するごとが可能である。次いで、スライドを蛍光顕微
鏡で観察した。萌免疫（ｐｒｅ ｉｍｍｕｎｅ）イムノ
グロブリンまたは前免疫１ｇＧフラクションには、核小
体蛍光は見られなかった。使用した他の免疫学的方法は
、従来の研究（ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）、■９３８
年；ロウリー（Ｌ ｏｗｒｙ）ら、■９５１年；ディル
（Ｄａｌｅ）およびラトナー（Ｌａｔｎｅｒ）、１９６
９年；ローレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）、１９７２年、ワレ
イス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、■９７４年；マラシ（Ｍａ
ｒａｓｈｉ）ら、１９７９年）において使用したものと
同様であった。免疫蛍光法の核小体位置の分析のために
、蛍先ｌｉＵダ【の聞ｌご 七Ｃ文１名−／ｉ’ｒ
創１）タロ召叩ｎ１ノ ・ノ十 と−？−ドアウドに切
り替えた。
免疫パーオキシダーゼ法
ヤギのフルオレッセイン標識抗マウス抗体の代わりに、
ヤギのパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体（１：１０ま
たは１．２０希釈）を加えた。光学顕微鏡または電子顕
微鏡で観察するために、種々のレドックス色素系によっ
てベルオキンダーゼ活性の位置を示した。間接法には他
の酵素をラベルとして使用し得、ペルオキシダーゼおよ
び他の酵素を、第１の抗体を標識することによって直接
使用し得る。
ヤギのパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体（１：１０ま
たは１．２０希釈）を加えた。光学顕微鏡または電子顕
微鏡で観察するために、種々のレドックス色素系によっ
てベルオキンダーゼ活性の位置を示した。間接法には他
の酵素をラベルとして使用し得、ペルオキシダーゼおよ
び他の酵素を、第１の抗体を標識することによって直接
使用し得る。
カルノフスキー（Ｋ ａｒｎｏｆｓｋｙ）のインキュベ
ーション培地を以下のように調製するニ ジアミノベンジジン（シグマ（Ｓ ｉｇｍａ））を計量
し、０．０５Ｍ）リス−１１Ｃρ（ｐａｒ ７ 、６
）に懸濁し、濃度を０．５ｍｇ／ｍＱとする。０．０２
％過酸化水素溶液を調製する（０．０５Ｍ）リス−１−
ＩＯＣ緩衝液中）。
ーション培地を以下のように調製するニ ジアミノベンジジン（シグマ（Ｓ ｉｇｍａ））を計量
し、０．０５Ｍ）リス−１１Ｃρ（ｐａｒ ７ 、６
）に懸濁し、濃度を０．５ｍｇ／ｍＱとする。０．０２
％過酸化水素溶液を調製する（０．０５Ｍ）リス−１−
ＩＯＣ緩衝液中）。
０．５ｍｇ／ｍＱＤΔＢおよび０．０２％ｏｚｏｔを等
量（！；１の比で）混合する（溶液はそれぞれ用時に新
しく調製し、調製時には低温に保った）。ＤＡ［３およ
びｒ−１２０を混合物２００〜３００μｇをスライドに
載せ、加湿器内で室温で３０分間インキュベートする。
量（！；１の比で）混合する（溶液はそれぞれ用時に新
しく調製し、調製時には低温に保った）。ＤＡ［３およ
びｒ−１２０を混合物２００〜３００μｇをスライドに
載せ、加湿器内で室温で３０分間インキュベートする。
インキュベーション後、０．ＩＭＮａＣＪ！を加えた０
、０５Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液（ｒ）Ｈ７，６）でスラ
イドを洗うことによって、ＤＡＩ３およびＨｔ Ｏｘ混
合物を除去する。スライドを、０．０５Ｍトリス−ＨＣ
＆（ＰＩ（７、６； ０ 、 Ｉ Ｍ ＮａＣＱ含有）
中で１０分間ずつ２回洗浄する。その後、スライドを光
学顕微鏡で観察する。
、０５Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液（ｒ）Ｈ７，６）でスラ
イドを洗うことによって、ＤＡＩ３およびＨｔ Ｏｘ混
合物を除去する。スライドを、０．０５Ｍトリス−ＨＣ
＆（ＰＩ（７、６； ０ 、 Ｉ Ｍ ＮａＣＱ含有）
中で１０分間ずつ２回洗浄する。その後、スライドを光
学顕微鏡で観察する。
免疫蛍光法用ヒーラ細胞スライドの調製保存用固定ヒー
ラ細胞を以下のように調製した；ヒーラ細胞培養器の活
性生育細胞を採り、ＰＩ３５（ｐｌ（７，２）で１回洗
った。細胞を懸濁し、細胞数か少なくとも１．５ＸＩｏ
ｌ″個／ｍ（！となるようにした。ヒーラ細胞懸濁液１
滴を、洗浄した（洗剤で洗い、蒸留水または脱イオン水
で雇ぎ、アルコールで洗浄し、澗ぎ、ヘアドライヤーの
温風で乾燥した）各スライド上に載せ、少し広げ、室温
で（または低温で一晩）乾燥させた。スライドを４℃で
アセトン中に１２分間置くことによって、乾燥細胞を固
定した。先がダイヤモンドのガラス製マーカーでスライ
ドに番号を付けた。スライドを、陽性の対照として免疫
蛍光法に使用した。
ラ細胞を以下のように調製した；ヒーラ細胞培養器の活
性生育細胞を採り、ＰＩ３５（ｐｌ（７，２）で１回洗
った。細胞を懸濁し、細胞数か少なくとも１．５ＸＩｏ
ｌ″個／ｍ（！となるようにした。ヒーラ細胞懸濁液１
滴を、洗浄した（洗剤で洗い、蒸留水または脱イオン水
で雇ぎ、アルコールで洗浄し、澗ぎ、ヘアドライヤーの
温風で乾燥した）各スライド上に載せ、少し広げ、室温
で（または低温で一晩）乾燥させた。スライドを４℃で
アセトン中に１２分間置くことによって、乾燥細胞を固
定した。先がダイヤモンドのガラス製マーカーでスライ
ドに番号を付けた。スライドを、陽性の対照として免疫
蛍光法に使用した。
試験抗体によって検出される悪性腫瘍
本研究により、核小体抗原が腫瘍細胞中に存在し、非腫
瘍組織中には存在しないことが確証された。最初の研究
により、ヒト腫瘍細胞の培養液にも、剖検または生検資
料の標本にも、三重抗体法（間接免疫蛍光法）によって
核小体蛍光が発し、このような結果は、非腫瘍組織の場
合には見られないことが示された。外胚葉、内胚葉およ
び中胚葉の悪性腫瘍に広範に共通の核小体抗原が存在す
ることが示された点が非常に興味深い。
瘍組織中には存在しないことが確証された。最初の研究
により、ヒト腫瘍細胞の培養液にも、剖検または生検資
料の標本にも、三重抗体法（間接免疫蛍光法）によって
核小体蛍光が発し、このような結果は、非腫瘍組織の場
合には見られないことが示された。外胚葉、内胚葉およ
び中胚葉の悪性腫瘍に広範に共通の核小体抗原が存在す
ることが示された点が非常に興味深い。
［実施例］
実施例１
正常組織・・・・・・４２の非腫瘍組織においては、Ｐ
Ｉ４５に対するモノクローナル抗体と種々の固定細胞標
本とのインキュベーション後に、核小体蛍光は発しなか
った。この方法によって、皮膚のマルビギ一層ら、骨髄
細胞も、ジーベルキューン腺も陽性の免疫蛍光を示さな
かったことが特に興味深い。その上、種々の組織を含ん
で、新生物に隣接する種々の非腫瘍組織ら陰性であった
。試験した良性腫瘍の１群（甲状腺および乳腺の線維腺
腫を含む）も陰性であった。
Ｉ４５に対するモノクローナル抗体と種々の固定細胞標
本とのインキュベーション後に、核小体蛍光は発しなか
った。この方法によって、皮膚のマルビギ一層ら、骨髄
細胞も、ジーベルキューン腺も陽性の免疫蛍光を示さな
かったことが特に興味深い。その上、種々の組織を含ん
で、新生物に隣接する種々の非腫瘍組織ら陰性であった
。試験した良性腫瘍の１群（甲状腺および乳腺の線維腺
腫を含む）も陰性であった。
実施例２
アーチファクト・・・・・・前立腺の管部分の各細胞中
の核小体でない部分に蛍光を発する域が存在し、これは
、蛍光抗体が凝固物に非特異的に付着するためであると
考えられる。肝組織において、抗体の非特異的分布は、
凝集体の形態で、おそらく抗体がグリコーゲン粒子に非
特異的に結合することによって起こると考えられる。核
小体蛍光陰性のいくつかの組織においては、通例、細胞
の形にかかわらず、非特異的蛍光小斑点が分散している
。
の核小体でない部分に蛍光を発する域が存在し、これは
、蛍光抗体が凝固物に非特異的に付着するためであると
考えられる。肝組織において、抗体の非特異的分布は、
凝集体の形態で、おそらく抗体がグリコーゲン粒子に非
特異的に結合することによって起こると考えられる。核
小体蛍光陰性のいくつかの組織においては、通例、細胞
の形にかかわらず、非特異的蛍光小斑点が分散している
。
このような非常に小さい非特異的沈澱の直径は、懐中の
核小体直径が４〜６μであるのに対して、０．５〜０．
１μであった。
核小体直径が４〜６μであるのに対して、０．５〜０．
１μであった。
実施例３
細胞周期における蛍光・・・・・・間期の核小体におい
て、核小体蛍光は容易に観察できた。分裂中期において
は、核小体蛍光ははっきりとは見られなかったが、染色
体間および「核」と細胞質の間の接合域には見られた。
て、核小体蛍光は容易に観察できた。分裂中期において
は、核小体蛍光ははっきりとは見られなかったが、染色
体間および「核」と細胞質の間の接合域には見られた。
分裂中期に主に核小体が消失し、後の０１１期にはｒｒ
ｔＮＡ合成が停止するので、そのような細胞においては
はっきりとは見られなかった（タン（Ｔａｎ）およびレ
ーナー（Ｌ ｅｒｎｅｒ）、１９７２年）。しかし、免
疫蛍光生成物がいくらかは有糸分裂を通じて持続すると
いう知見により、（核小体生成物よりらむしろ）核小体
の基礎となるものが発生機構学的に持続する抗原を含ａ
すると行えられる。
ｔＮＡ合成が停止するので、そのような細胞においては
はっきりとは見られなかった（タン（Ｔａｎ）およびレ
ーナー（Ｌ ｅｒｎｅｒ）、１９７２年）。しかし、免
疫蛍光生成物がいくらかは有糸分裂を通じて持続すると
いう知見により、（核小体生成物よりらむしろ）核小体
の基礎となるものが発生機構学的に持続する抗原を含ａ
すると行えられる。
実施例４
悪性腫瘍の陰性部分・・・・・・一連の悪性腫瘍におい
て、スライドから種々の程度に陰性の域が見られた。通
例、これらは新生物の壊死または膿瘍部分と関連してい
る。腫瘍切片において、隣接して見える正常組織は、免
疫蛍光染色に対して陰性であった。
て、スライドから種々の程度に陰性の域が見られた。通
例、これらは新生物の壊死または膿瘍部分と関連してい
る。腫瘍切片において、隣接して見える正常組織は、免
疫蛍光染色に対して陰性であった。
実施例５
標識・・・・抗体を示すための直接免疫化学法は、第１
の抗体を１種ま７二はそれ以上の下記ラベルで標識ずろ
ことを含んで成るニオ−トラジオグラフィー用放射性同
位元素（例えば１２６■、＋３１１、＋４０または３Ｎ
） ：蛍光顕微鏡法用蛍光色素（例えばフルオレッセ
インまたはテトラメヂルローダミン）、蛍光または光学
顕微鏡法用の、蛍光または有色生成物を生成する酵素、
または電子顕微鏡法用の、電子高密度生成物を生成する
酵素：または直接または間接電子顕微鏡法用電子高密度
分子（例えばフェリチン、パーオキシダーゼまたは金ビ
ーズ）。
の抗体を１種ま７二はそれ以上の下記ラベルで標識ずろ
ことを含んで成るニオ−トラジオグラフィー用放射性同
位元素（例えば１２６■、＋３１１、＋４０または３Ｎ
） ：蛍光顕微鏡法用蛍光色素（例えばフルオレッセ
インまたはテトラメヂルローダミン）、蛍光または光学
顕微鏡法用の、蛍光または有色生成物を生成する酵素、
または電子顕微鏡法用の、電子高密度生成物を生成する
酵素：または直接または間接電子顕微鏡法用電子高密度
分子（例えばフェリチン、パーオキシダーゼまたは金ビ
ーズ）。
間接免疫化学法は、第１の抗体に対して特異的な第２の
抗体または他の結合タンパク質を、蛍光色素、電子高密
度化合物、光学、蛍光らしくは電子顕微鏡によって検出
し得る生成物を生成する酵素、またはオートラジオグラ
フィーによって検出し得る放射性同位元素で標識するこ
とを含んで成る。
抗体または他の結合タンパク質を、蛍光色素、電子高密
度化合物、光学、蛍光らしくは電子顕微鏡によって検出
し得る生成物を生成する酵素、またはオートラジオグラ
フィーによって検出し得る放射性同位元素で標識するこ
とを含んで成る。
抗体を可視化する間接免疫化学法は、ハイブリッド第１
抗体らしくは第２抗体または抗体フラグメント（Ｆ （
ａｂ’ ）２）の適用を含んで成る。ハイブリット抗体
は、核小体抗原（ハイブリッド第１抗体）または第１抗
体（ハイブリッド第２抗体）に特異的であり、前記のよ
うなラベルに特異的である。
抗体らしくは第２抗体または抗体フラグメント（Ｆ （
ａｂ’ ）２）の適用を含んで成る。ハイブリット抗体
は、核小体抗原（ハイブリッド第１抗体）または第１抗
体（ハイブリッド第２抗体）に特異的であり、前記のよ
うなラベルに特異的である。
診断用キット
標識した複合および非複合抗体を、リン酸緩衝生理食塩
液（ＰＩ３Ｓ）または他の緩衝懸濁剤中で個々に包装し
て供し得る。適当な懸濁剤には、グリセリン、ヘパリン
またはシュクロースがある。適当な緩衝液には、バルビ
タール緩衝液、モルホリン緩衝液、ＭＯＰＳ−３−（Ｎ
−モルホリノ）プロパンスルホン酸、へペスーＮ−２−
ヒドロキンエヂルピペラジンーＮ−２−エタンスルポン
酸、トリスカーボネートなどがある。
液（ＰＩ３Ｓ）または他の緩衝懸濁剤中で個々に包装し
て供し得る。適当な懸濁剤には、グリセリン、ヘパリン
またはシュクロースがある。適当な緩衝液には、バルビ
タール緩衝液、モルホリン緩衝液、ＭＯＰＳ−３−（Ｎ
−モルホリノ）プロパンスルホン酸、へペスーＮ−２−
ヒドロキンエヂルピペラジンーＮ−２−エタンスルポン
酸、トリスカーボネートなどがある。
開示の目的で、本発明の好ましい態様を挙げたが、本発
明の範囲内で改良を行い得る。
明の範囲内で改良を行い得る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、癌細胞から抽出される核小体タンパク質のうち、ウ
ェスタン法による分子サイズが約１４５ＫＤであること
を特徴とする核小体抗原ｐ１４５。 ２、主にヒト癌細胞の核小体に存在する核小体抗原ｐ１
４５に対して特異性を有し、検出可能なラベルを有し、
緩衝された懸濁剤または溶液に入れることを特徴とする
モノクローナル抗体。 ３、抗原ｐ１４５に対して特異性を有する抗体であって
、該抗原は、分子量が約１４０〜１５０ＫＤで、０．０
１Ｍトリス−ＨＣｌ／０．２％デオキシコーレート（ｐ
Ｈ８．０）に可溶であり、主にヒト癌細胞の核小体に存
在することを特徴とする抗体。 ４、ヒトの組織切片、塗抹標本または脱落細胞標本の癌
の免疫学的検出方法であって、標本を第２項または第３
項記載の抗体と接触させ、正常細胞ではなく悪性腫瘍細
胞中の核小体内に該抗体の存在を示すことを特徴とする
方法。 ５、ヒーラ細胞、癌腫、肉腫および血液学的新生物から
成るヒト悪性腫瘍細胞群のうちの１種から単離された核
小体に抗体が誘導される第４項記載の方法。 ６、ヒト前立腺癌細胞から単離された核小体に抗体が誘
導される第４項記載の方法。 ７、ヒーラ細胞由来のヒト悪性腫瘍細胞の核小体抽出物
に抗体が誘導される第４項記載の方法。 ８、核小体抗原の精製方法であって、硫酸アンモニウム
沈澱、ＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィー、セファデ
ックスゲル溶出、陽イオン交換およびリン酸カルシウム
ゲルクロマトグラフィー並びに等電点フォーカシングに
よって連続的に精製することを特徴とする方法。 ９、ヒト癌細胞の核小体から核小体抗原を抽出する第８
項記載の方法。 １０、ヒト癌細胞の核小体に存在する抗原に対して特異
性を有する抗体の調製方法であって、ヒト以外の宿主動
物を、第１項記載の抗原で免疫感作し、免疫感作動物の
抗体を採ることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/808,913 US4794077A (en) | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Detection of human cancer cells with anitbodies to human cancer nucleolar antigen p145 |
| US808913 | 1991-12-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62215871A true JPS62215871A (ja) | 1987-09-22 |
Family
ID=25200100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61297438A Pending JPS62215871A (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-13 | ヒト癌細胞の免疫学的検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4794077A (ja) |
| EP (1) | EP0226468A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62215871A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962316A (en) * | 1992-10-16 | 1999-10-05 | Cold Spring Harbor Laboratory | Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto |
| US7691632B2 (en) * | 1993-11-18 | 2010-04-06 | Cold Spring Harbor Laboratory | Kit for detecting the level of cyclin-dependent kinase inhibitor P16 gene expression |
| US6828157B1 (en) * | 1999-05-04 | 2004-12-07 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6682940B2 (en) * | 1999-05-04 | 2004-01-27 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US20060073095A1 (en) * | 2001-08-22 | 2006-04-06 | Steven Kessler | Methods for screening antibody-producing cells on heterogeneous antigen substrates |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4448890A (en) * | 1980-09-29 | 1984-05-15 | Baylor College Of Medicine | Detection of human cancer cells with antibodies to human cancer nucleolar antigens |
| US4725669A (en) * | 1984-11-09 | 1988-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III |
-
1985
- 1985-12-13 US US06/808,913 patent/US4794077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-12-12 EP EP86309701A patent/EP0226468A3/en not_active Withdrawn
- 1986-12-13 JP JP61297438A patent/JPS62215871A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0226468A2 (en) | 1987-06-24 |
| EP0226468A3 (en) | 1989-11-29 |
| US4794077A (en) | 1988-12-27 |
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