CH661284A5 - Verfahren zur herstellung von cephalosporin c. - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren für die mikrobiologische Herstellung von Cephalosporin C. Dabei wird bei der Fermentation eines Cephalosporin C-pro-
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duzierenden Mikroorganismus, welcher ebenfalls das unerwünschte Desacetylcephalosporin C produziert; die Bildung dieses Nebenproduktes wird durch Zugabe von Phosphorverbindungen in hohem Masse verhindert. Damit wird die Gewinnung von Cephalosporin C aus der Fermentationsbrühe und ihre anschliessende Umwandlung zu 7-Aminoce-phalosporansäure (7-ACA) erleichtert.
Cephalosporin C (3-Acetoxymethyl-7ß-(D-5-amino-5-car-boxypentanamido)ceph-3-em-4-carbonsäure) ist eine Verbindung, welche gleichzeitig antibiotische Aktivität an sich aufweist und von besonderer Wichtigkeit als Ausgangsmaterial für die Herstellung von semi-synthetischen Cephalosporin-Antibiotika ist. Cephalosporin C kann daher durch bekannte Methoden zu 3-Acetoxymethyl-7ß-Aminoceph-3-em-4-car-bonsäure (7-ACA) übergeführt werden, welche dann als Schlüsselzwischenprodukt für die Herstellung einer Vielzahl von kommerziellen Cephalosporin-Antibiotika dient.
Es ist bekannt, dass Cephalosporin C durch Fermentation von verschiedenen Mikroorganismen, die insbesondere die Pilze der Gattung Emericellopsis-Cephalosporium umfassen, hergestellt werden kann. Die Cephalosporin C-produzieren-den Mikroorganismen werden durch den ursprünglichen Brotzu-Stamm von Cephalosporium veranschaulicht, d.h. Cephalosporium sp. I.M.I. 49137 (ATCC 11550) und Mutanten davon, wie der Mutantenstamm 8650 (ATCC 14553), beschrieben in U.K.-PS 1 109 362, Cephalosporium sp. I.B.I. 1131, beschrieben in U.K.-PS 1 503 851 und Cephalasporium sp. Stamm F. 12 (ATCC 20339), beschrieben in U.K.-PS 1 400 433. Andere Beispiele von Cephalosporin C-produzie-renden Organismen, die in der Literatur beschrieben sind, umfassen Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P Nr. 1160), beschrieben in U.K.-PS 1 488 822, Cephalosporium acermonium K-121 (ATCC 20427), und Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20428) beschrieben in U.K.-PS 1 488 821 und Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC
20359) und eine Mutante davon, bezeichnet mit Y-505 (ATCC
20360), beschrieben in U.K.-PS 1 389 714. Cephalosporin C wird im allgemeinen in industriellem Massstab unter Verwendung eines hochproduktiven Mutantenstamms von Cephalosporium acremonium (ebenfalls bekannt als Acremonium chysogenum), erzeugt. Beispiele solcher Mutanten und Methoden zu ihrer Herstellung sind ausführlich in der Literatur beschrieben.
Ungeachtet der intensiven Forschung während Jahren ist die Fermentation von Cephalosporin C in kommerziellem Massstab immer noch nicht vollumfänglich befriedigend. Die meisten Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismen, insbesondere diese hochproduktiven Stämme, die in der kommerziellen Produktion eingesetzt werden, erzeugen gleichzeitig in bedeutendem Anteil Desacetylcephalosporin C einer Verunreinigung, welche ausserordentlich schwierig vom gewünschten Cephalosporin C abzutrennen ist, wegen seinen ähnlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften. Die Gegenwart des Desacetylcephalosporin C, typischerweise in Anteilen von etwa 15% des gesamten Cephalosporinkerns, der während der Fermentation erhalten wurde, resultiert in der Gewinnung von Cephalosporin C (oder allgemeiner einem lösungsmittelextrahierbaren Derivat davon), das mit Desacetylcephalosporin C (oder einem Derivat davon) kontaminiert ist. Da in industriellem Massstab das Cephalosporin C (oder ein Derivat davon) üblicherweise vor der anschliessenden Überführung in die 7-ACA nicht gereinigt wird, wird überdies die Produktqualität der 7-ACA ebenfalls in ungünstiger Weise beeinträchtigt durch die gleichzeitige Produktion von Desacetylcephalosporin C in der ursprünglichen Fermentationsbrühe.
Der Stand der Technik, welcher sich mit der Cephalosporin C-Produktion beschäftigt, betrifft in erster Linie das
Suchen neuer Mikroorganismen mit höherer Cephalosporin C-Produktivität und das zur Verfügungstellen von Fermentationszusätzen, welche die Cephalosporin C-Produktion erhöhen. So wurden beispielsweise Mutantenstämme von Cepha-5 losporium acremonium gezüchtet, welche wesentlich höhere Ausbeuten von Cephalosporin C erzeugen. Es wurden verschiedene Additive vorgeschlagen für die Zugabe zum Nährmedium während der Fermentation eines Cephalosporin C-produzierenden Organismus, um die Ausbeute an Cephalo-10 sporin C zu erhöhen. So ist die Verwendung von Schwefelverbindungen, wie Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natri-umthiosulfat, Natriumhydrogensulfit, Natriumthiosulfat und Natriumsulfat in U.K.-PS 820 422 beschrieben, die Verwen- . dung von Methionin, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, 15 Ammoniumsulfat und gewisse Kohlenhydraten, Ölen und Fettsäuren ist in U.K.-PS 938 775 beschrieben, die Verwendung von Norvalin und Norleucin ist in U.K.-PS 975 393 beschrieben, die Verwendung von Phenylessigsäure ist in U.K.-PS 375 394 beschrieben und die Verwendung von e-Ca-20 prolactam, 2-Butanon, sekundärem Butylalkohol und 1,3-But-andiol ist in U.K.-PS 1 503 851 beschrieben. Das Problem der gleichzeitigen Herstellung von Desacetylcephalosporin C während der Cephalosporin C-Fermentation stellte sich nur bei Mikroorganismen, welche einen höheren Anteil an 25 Cephalosporin C-Kern als Cephalosporin C produzierten, oder bei Extraktions- bzw. Isolationsverfahren (z.B. US-PS 4 059 573).
Desacetylcephalosporin C wurde zuerst in Kulturfiltraten von Cephalosporium acremonium entdeckt. Abraham et al. 30 schlugen vor, dass die Bildung dieser Substanz wegen der enzymatischen Deacetylierung von Cephalosporin C auftrat (Biochem. J. 81, 591-596, 1961). Anschliessend sind Esteraseenzyme, die die Fähigkeit besitzen, Cephalosporin C zu deacetylieren, aus verschiedenen Quellen isoliert worden, z.B. 35 aus Zitrusfrüchten, Bakterien, Actinomycetes, Weizenkeimen, Säugetierleber und Niere und Rhodotorula. Pisano et al. in «Develop. Ind. Microbiol.», 8, 417-423, 1967, schildern, dass Esteraseaktivität im Genus Cephalosporium weitverbreitet ist. Die Mehrheit dieser Acetylesteraseenzyme scheint eine 40 breite Substrattoleranz zu haben, d.h. ß-Naphthylacetat und Triacetin sind aktive Substrate und ihre Aktivität gegen Cephalosporin C scheint nicht einzigartig zu sein.
Nuesch et al. in «Second International Symp. on Genetics of Industriai Microorganisms», Proc., 1975 ed. MacDonald, 45 KD., New York, Academic Press, S. 451-472 und Fujisawa et al. in «Agr. Biol. Chem.», 39 (6), 1303-1309 (1975) reinigten unabhängig voneinander Cephalosporin C-Esteraseaktivität aus extracellularem Brühenüberstand von Cephalosporium acremonium und schlössen, dass die Gegenwart der Enzym-50 aktivität teilweise für das Auftreten von Desacetylcephalosporin C in C.-Acremonium-Fermentationen verantwortlich sei. Ähnliche Esterase-Aktivität ist im Cephalosporin C-pro-duzierenden Streptomycetes Streptomyces clavuligerus entdeckt worden (Antimicrob. Agents Chemother. 1, 237-241, 55 1972). Huber in «Appi. Microbiol.», 16 (7), 1011-1014 (1968) hat jedoch bewiesen, dass die Bildung von Desacetylcephalosporin C während dem Fermentationsprozess wegen der nicht-enzymatischen Hydrolyse von Cephalosporin C auftritt. Nach Meinung der Erfinder tritt die Desacetylcephalosporin 60 C-Bildung sowohl wegen der enzymatischen wie auch der nicht-enzymatischen Hydrolyse auf, wobei die enzymatische Acetylesterase-Aktivität eine wichtige Rolle spielt.
Die Berichte von Liersch et al. in «Second International Symp. on Genetics of Industriai Microorganisms», Proc., 65 1976, ed. MacDonald, K.D., New York, Academic Press, S. 179-195 und Felix et al. in «FEMS Microbiol. Lett.», 8, 55-58, 1980 haben angegeben, dass Desacetylcephalosporin C ebenfalls ein ultracellulares Zwischenprodukt in der Bio-
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synthese von Cephalosporin C aus Desacetoxycephalosporin C ist.
Die Enzymaktivität von partiell gereinigter Acetylesterase aus Cephalosporium acremonium wurde als hemmbar durch Diisopropylfluorphosphat, einem bekannten Esteraseinhibitor, geschildert (Agr. Biol. Chem., 39 (6), 1303-1309, 1975). Die extreme Toxizität und die hohen Kosten dieses Phos-phoracetylesteraseinhibitors verhindern jedoch seine Verwendung in der kommerziellen Produktion von Cephalosporin C.
Cephalosporin C wird wegen seiner amphoteren Natur normalerweise in ein Derivat übergeführt, damit es leichter aus der Fermentationsbrühe durch Flüssigextraktionsverfah-ren g. wonnen werden kann. Beispiele von solchen Derivater sind .i der U.K.-PA 2 021 640A beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist in der US-PS 3 573 296 beschrieben. Die durch ein solches bevorzugtes Verfahren erhaltenen Cephalosporin C-Derivate können als kristallines Bis-dicy-clohexylaminsalz gewonnen werden, wie in der US-PS 3 830 809 beschrieben. Das aus der Fermentationsbrühe gewonnene Cephalosporin C wird dann durch übliche Verfahren gespalten, beispielsweise durch das Verfahren der US-PS 3 932 392 zur Herstellung von 7-ACA.
Wie oben angegeben, hat die Desacetylcephalosporin C-Verunreinigung, die typischerweise während der Fermentation in Anteilen von etwa 15% erhalten wird, bezogen auf den gesamten Cephalosporinkern (Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C) chemische und physikalische Charakteristika, die denjenigen der gewünschten Cephalosporin C-Pro-dukt sehr ähnlich sind. Wenn somit das Cephalosporin C in ein lösungsmittelextrahierbares Derivat übergeführt wird, wird das Desacetylcephalosporin C ebenfalls in ein ähnliches Derivat übergeführt, und das Cephalosporin C-Derivat, das dann isoliert wird, ist durch das Desacetylcephalosporin C-Derivat verunreinigt. Es ist somit ersichtlich, dass die Reduktion des Anteiles des Cephalosporinkerns, erhalten als Desacetylcephalosporin C zu einem reineren Cephalosporin C-Derivatprodukt führt. Da überdies diese Derivate normalerweise vor der Überführung in die 7-ACA nicht gereinigt werden, führen die reduzierten Anteile von Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe zu einer besseren Qualität des 7-ACA-Produktes.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Cephalosporin C durch Fermentation, wobei die Desacetylcephalosporin C-Produktion während der Fermentation von Cephalosporin C möglichst stark gehemmt werden sollte. Dabei sollte ein ausgeprägt höherer Anteil von Cephalosporin C als Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe erhalten werden, mit dem Ziel, die Qualität des gewonnenen Cephalosporin C-Produktes zu erhöhen.
Es wurde nun gefunden, dass gewisse organische und anorganische Phosphorverbindungen, wenn sie zum Kulturmedium während der Kultivation eines Cephalosporin C-pro-duzierenden Mikroorganismus zugegeben werden, eine wesentlich reduzierte Produktion von Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe bewirken. Es wird angenommen, dass diese Reduktion der Desacetylcephalosporin C-Produktion von der Hemmung des Acetylesteraseenzyms herrührt, das typischerweise während der Kultivation eines Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismus erzeugt wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C. Es handelt sich dabei um ein mikrobiologisches Verfahren unter Verwendung einer submergen aeroben Kultur von Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismen. Im erfindungsgemässen Verfahren wird die Bildung von Desacetylcephalosporin C während der Fermentation eines
Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismus gehemmt. Diese Hemmung erfolgt durch die Zugabe der nachstehend definierten organischen und anorganischen Phosphorverbindungen in das Kulturmedium, das einen Mikroorganismus enthält, der ebenfalls das Desacetylcephalosporin C produziert.
Die erfmdungsgemäss eingesetzten Inhibitoren sind Phosphorverbindungen, die die folgenden Formeln aufweisen:
R10
^P-OR3 r2o7
R\/
r5O/P\6
II
III
r5O X>
y
Ra/ V
R10
oder
OR
IV
r2o7
^OR2
25
worin die Symbole die im Patentanspruch 1 angegebene Bedeutung haben. Sie hemmen im erfindungsgemässen Ver-30 fahren wirkungsvoll die Bildung von Desacetylcephalosporin C während der fermentativen Produktion von Cephalosporin C. Überdies sind die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Phosphorverbindungen wesentlich weniger toxisch als Diisopropylfluorphosphat und im allgemeinen verhältnis-35 mässig billig. Das Verfahren eignet sich somit für die praktische Anwendung bei der Produktion von Cephalosporin C in grossem Massstab ermöglicht.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann jeder Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismus verwendet wer-40 den, der ebenfalls Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe produziert. Es sind viele Beispiele von solchen Mikroorganismen in der Literatur beschrieben, beispielsweise in der U.K.-PA 2 060 610A. Andere Cephalosporin C-produ-zierende Mikroorganismen können leicht auf Desacetylce-45 phalosporin C-Produktion durch dem Fachmann bekannte Tests geprüft werden.
Der am meisten bevorzugte Cephalosporin C-produzie-rende Mikroorganismus für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist der Stamm Cephalosporium acremonium so (ebenfalls als Acremonium chrysogenum bekannt), welcher Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C produziert. Typische Produktionsstämme von Cephalosporium acremonium bilden ungefähr 15% Desacetylcephalosporin, bezogen auf den gesamten Cephalosporin C-Kern (Cephalosporin C 55 und Desacetylcephalosporin C).
Im erfindungsgemässen Verfahren wird in der Regel ein Cephalosporin C-produzierender Mikroorganismus (einer der befähigt ist, Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C zu produzieren) unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in 60 submergen Kulturen in einem üblichen Cephalosporin
C-Nährmedium, gemäss der bekannten Cephalosporin C-Fer-mentationsverfahren, kultiviert. Die Zugabe der genannten Phosphorverbindungen zum Nährmedium reduziert die Herstellung von Desacetylcephalosporin C während der Fermen-65 tation in einem wesentlichen Ausmass, womit in der Brühe ein wesentlich höherer Anteil des gewünschten Cephalosporin C erhalten wird, wobei der Anteil bezüglich des unerwünschten Desacetylcephalosporin C minimal gehalten wird.
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Das verwendete Nährmedium sollte assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten und gewünschten-falls wachstumsfördernde Substanzen, wie anorganische Salze.
Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen z.B. Glukose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, pflanzliche und tierische Öle, Dextin und Maltose.
Geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. natürliche stickstoffhaltige Substanzen oder Materialien, hergestellt aus solchen, wie Fleischextrakte, Pepton, Kasein, Maiswasser, Hefeextrakte, Sojamehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Stickstoffhaltige organische oder anorganische Verbindungen können ebenfalls verwendet werden, z.B. Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumace-tat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat.
Im Fermentationsmedium verwendbare anorganische Salze umfassen Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate usw., welche aus der Cephalosporin C-Produktion bekannt sind.
Wachstumsfördernde Substanzen, welche verwendet werden können, umfassen beispielsweise Cystein, Cystin, Thio-sulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin und Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.
Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit werden so ausgewählt, dass die verwendeten Mikroorganismen einen maximalen Anteil des gewünschten Cephalosporin C erzeugen. Die Temperatur wird normalerweise bei 15-45 °C, vorzugsweise bei etwa 25 °C, gehalten, und die Fermentation wird während einer Zeit von 1-20 Tagen, vorzugsweise 4-10 Tagen und besonders bevorzugt während Tagen durchgeführt.
In den Phosphorverbindungen der Formel I, II, III und IV sind die Substituenten RJ, R2, R3, R4, R5 und R6, die weiter substituiert sein können, vorzugsweise solche, die 1-3 Substituenten aufweisen. Halogen bedeutet Chlor, Brom, Fluor oder Jod.
Beispiele der Phosphitverbindungen der Formel I sind Trimethylphosphit, Triethylphosphit, Triisopropylphosphit, Tributylphosphit, Triphenylphosphit und Tris(2-chlorethyl)--phosphit. Phosphite mit gemischten Funktionen, wie Benzyl-diethylphosphit und Diphenylisodecylphosphit können ebenfalls verwendet werden.
Die Phosphorverbindungen der Formel II sind beispielsweise Phosphorsäure, Dibenzylphosphit, Dibutylphosphit, •Diethylphosphit, Diisopropylphosphit, Dimethylphosphit, Diphenylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethyl-phosphonsäure, Diethyl-cyanomethyl-phosphonat, Dimethyl-methyl-phosphonat, Dimethylphosphat, Trimethylphos-phonoacetat, Diethylethyl-phosphonat, Diethyl-carbome-thoxymethyl-phosphonat, Diethyl-acetyl-phosphonat, Di-methyl-acetylmethyl-phosphonat, Dimethyl-cyanomethyl-phosphonat, Diethyl-allyl-phosphonat und 2-Carboxyethyl-phosphonsäure.
Die Verbindungen der Formel III können beispielsweise Hypophosphorsäure, Monomethylphosphonat, Monoethyl-phosphonat und 2,2,2-Trichlorethylphosphorodichloridit sein.
Pyrophosphitverbindungen der Formel IV sind beispielsweise Tetramethylpyrophosphit und Tetraethylpyrophosphit.
Bevorzugte solche Inhibitoren sind die Phosphorverbindungen Phosphorsäure, Hypophosphorsäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Tetraethylparophosphit, Diethyl-cyanomethyl-phosphonat, Dimethyl-methyl-phospho-nat, 2,2,2-Trichlorethylphosphorodichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphit, Triphenylphosphit, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris(2-chlorethyl)phosphit, Trimethyl-phosphonoacetat, Diethyl-carbomethoxymethyl-phosphonat,
Diethyl-acetyl-phosphonat, Dimethyl-acetylmethyl-phospho-nat, Dimethyl-cyanomethyl-phosphonat und Diethyl-allyl-phosphonat.
Besonders bevorzugte Verbindungen umfassen Phosphor-5 säure, Hypophosphorsäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit und Tributylphosphit.
Der am meisten bevorzugte phosphorhaltige Inhibitor ist die Phosphorsäure.
io Die Phosphorverbindungen werden vorzugsweise so eingesetzt, dass die Endkonzentrationen in der Brühe von 100-3000 ppm (auf Gewichtsbasis) betragen und besonders bevorzugt 200-1000 ppm betragen. Die Inhibitorverbindung kann auf einmal zugefügt werden oder in periodischen Inter-i5 vallen während dem Verlauf der Fermentation.
Besonders bevorzugt werden die organischen Phosphorverbindungen während der fortlaufenden Fermentation nach 70-140 h als einzelne oder mehrere Portionen zugegeben. Die anorganischen Phosphorverbindungen werden vorteilhafter-20 weise bei der fortlaufenden Fermentation unmittelbar nach der Inokulation bis etwa 140 h nach der Inokulation zugegeben. Sie können aber auch zum Fermentationsmedium vor der Sterilisation zugegeben werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren führt zu wesentlich 25 kleineren Prozentsätzen von Desacetylcephalosporin C (auf Basis des gesamten Cephalosporinkerns, welcher Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C umfasst), in der Fermentationsbrühe, als entsprechende Verfahren ohne Zusatz von Phosphorverbindungen.
3o In typischen Cephalosporin C-Fermentationen konnte der Anteil an Desacetylcephalosporin C auf etwa 4% des gesamten Cephalosporinkerns reduziert werden, verglichen mit einem Anteil von etwa 15% in unbehandelten Fermentationen.
35 In behandelten Schüttelflaschen-Fermentationen erscheint der erzeugte Cephalosporinkern unverändert und folglich werden die Cephalosporin C-Titer in angemessenem Anteil erhöht. Bei Fermentationen in grösserem Massstab konnte noch nicht nachgewiesen werden, dass die Verwen-40 dung der Phosphorinhibitorverbindungen zu einem erhöhten Spiegel von Cephalosporin C führt. Sogar wenn die Cephalosporin C-Spiegel konstant bleiben, erleichtert die reduzierte Menge von Desacetylcephalosporin C in behandelten Fermentationen die Gewinnung des gewünschten Cephalosporin 45 C-Produktes in einem höheren Reinheitgrad.
Es wurde gezeigt, dass die genannten Phosphorverbindungen eine inhibitorische Aktivität auf der Enzymstufe aufweisen. Daher wurde die Cephalosporin C-Esteraseaktivität partiell gereinigt aus Cephalosporium acremonium-Brühenüber-5o stand durch DEAE Sephadex A50-Säulenchromatographie partiell gereinigt und es wurde festgestellt, dass die hydrolytisch eAktivität dieses Präparates (gemessen durch HPLC, indem die Umwandlungsrate von Cephalosporin C zu Desacetylcephalosporin C bestimmt wurde) durch die Phosphor-55 Verbindungen der Formeln I, II, III und IV gehemmt wurde.
Nach Beendigung der Fermentation wird das gewünschte Cephalosporin C-Produkt vorzugsweise durch bekannte Methoden wie in der US-PS 3 573 296 beschrieben, in ein Derivat übergeführt, welches leichter durch Lösungsmittelex-60 traktionsverfahren aus der Brühe gewonnen werden kann. Das durch die Fermentation erhaltene Cephalosporin C oder das Derivat davon kann anschliessend durch bekannte Methoden in die 7-ACA, einem Schlüssenzwischenprodukt für die Herstellung von vielen semisynthetischen Cephalospo-65 rinen, übergeführt werden. Unter Verwendung des gemäss der vorliegenden Erfindung erhaltenen Cephalosporins C oder von Derivaten davon kann das letzte 7-ACA-Zwischenprodukt wirkungsvoller und in höherem Reinheitsgrad erhalten
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werden, als dies bei früheren Verfahren mit unbehandelter Brühe der Fall war.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Der Ausdruck «ppm», der in den Beispielen verwendet wird, bezieht sich auf die Gewichts/Gewichts-Basis.
Beispiel 1
Die Standard-Schüttelflaschenfermentationen von Cephalosporium acremonium (1 Mutantenstamm, der eine hohe Ceph-C-Produktion aufweist und ebenfalls Desacetylceph C produziert) wurden gemäss dem folgenden Protokoll angesetzt. Die Keimkultur wurde durch Impfung mit einem Keimmedium auf Basis von Maiswasser-Glukose aus einer gefroren aufbewahrten Kultur gestartet. Die Keimflaschen wurden während 3 Tagen bei 28 °C kultiviert, während sie bei 260 Umdrehungen/min geschüttelt wurden, und 10% des Inoku-lumvolumens wurde zum Start der Produktionsstufenfermentationen verwendet. Das Produktionsmedium beruhte auf 5 einer ausgewogenen Zusammensetzung von Maiswasser, «Pharmamedia» (Baumwollsamenmehl, von Traders Oil Mill Company, Förth Worth, Texas), Dextrin, Sojaöl, Methionin und Ammoniumsulfat. Die Flaschen wurden bei 25 °C geschüttelt bei 260 Umdrehungen/min, während einer Peri-io ode von 6 Tagen, wonach Portionen der Brühe verdünnt, gefiltert und auf Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C durch HPLC getestet wurden. Die Inhibitoren wurden in den aufgezeichneten Mengen am Tag 4 (96 h) zugegeben. Die Resultate sind nachstehend zusammengefasst.
15
Ceph C Des Ceph C Des C/Total Ceph iig/g jig/g Nucleus* (%)
Zugegebener Inhibitor Zugabemenge ppm
Di-isopropylphosphit
1600
9750
495
4,83
600
9850
520
5,01
Tri-isopropylphosphit
1600
11,000
575
4,96
600
8995
530
5,56
Dibenzylphosphit
600
9380
485
4,92
100
9220
660
6,68
Dimethyl-hydrogenphosphit (von Mobil Chem. Co.) 600
9400
350
3,60
100
10,615
520
4,67
Dimethyl-hydrogenphosphit (von Alfa Chem. Co.)
600
9380
340
3,49
100
9360
415
4,23
Diethyl-acetylphosphonat
1000
9285
440
4,52
600
9665
445
4,40
Kontrolle keine Zugabe
8760
705
7,45
*Ceph C + Des Ceph C Beispiel 2
Unter Verwendung der Standard-Schüttelflaschenfermen-tationsbedingungen und der gleichen Produktionskultur, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, wurden anorganische und organische Phosphorverbindungen zu fortlaufenden Fermentationen nach 0,48 und 96 h nach der Inokulation zugegeben, wobei Inhibitorbrühen-Endkonzentrationen von 100-800 pm 40 erhalten wurden. Die Resultate sind in der folgenden Datentabelle zusammengefasst.
Inhibitor-Verbindung Tag 6 Tag 7
Stunde der Zugabe/ Ceph C/Des Ceph C *D/C + D Ceph C/Des Ceph C *D/C + D
Endkonz, in ppm in ug/g % in |ig/g %
Phosphorsäure
0/h/100
11,810/730
200
10,540/460
400
9,940/350
800
10,600/390
48/h/100
10,300/710
200
9,895/535
400
10,030/405
800
9,200/355
96/h/100
8,355/755
200
7,670/670
400
7,830/640
800
10,140/780
Diphenylphosphit
96/h/100
10,565/1,145
200
10,345/935
400
9,985/690
800
9,615/780
Kontrolle (keine
Inhibitor-Zugabe)
8,055/1,145
5,8
10,300/925
8,2
4,2
11,585/935
7,4
3,4
10,240/500
4,6
3,5
10,335/425
3,9
6,4
9,370/820
8,0
5,1
9,950/710
6,6
3,8
9,305/480
4,9
3,7
9,180/470
4,8
8,3
10,240/1,430
12,2
8,0
9,605/975
9,2
7,5
8,645/705
7,5
7,1
8,225/700
8,5
9,7
9,705/1,220
11,2
8,2
10,000/1,410
12,3
6,4
9,250/945
9,2
7,5
8,800/720
7,5
12,5
8,784/1,562
15,1
* Konz, des Ceph C/Konz. Ceph C + des Ceph C x 100
Beispiel 3
Unter Verwendung der Standard-Schüttelflaschenfermen-tationsbedingungen und der gleichen Produktionskultur, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden anorganische Phosphor-Inhibitor-Verbindungen zum Medium gegeben, vor 5 der Sterilisation durch Autoklavierung bei 121 °C während 20 min. Die Resultate sind in der folgenden Datentabelle zusammengefasst.
Tag 6
Inhibitor-Verbindung/ Ceph C/ * D/
Endkonzentration in ppm Des Ceph C C + D
in jig/g %
661 284
Kontrollversuch - ohne Inhibitor Zeit (h) *D/C + D
74
4,8
85
4,5
98
5,1
109
6,9
122
8,9
133
12,6
146
13,0
157
13,2
170
15,0
Phosphorsäure/200
9,740/600
5,8
400
8,050/340
4,0
800
7,111/285
3,8
Hypophosphorsäure/150
8,110/1,130
12,2
300
8,600/1,000
10,4
450
9,080/940
9,4
Kontrolle (keine
Inhibitzorzugabe)
7,840/1,060
11,9
* Konz, des Ceph C/Konz. Ceph C + des Ceph C x 100
Die Zugabe von Tributylphosphit senkte die Menge des produzierten Desacetylcephalosporin C auf 9,1% des gesam-20 ten ceph Nukleus, verglichen mit 15% im Kontrollversuch.
Beispiel 5
Cephalosporium acremonium wurde in einem gerührten 3000-1-Tank-Fermentor unter Verwendung von üblichen 25 Cephalosporin C-Medien und üblichen Verfahren fermentiert. Nach 100 h wurde Dimethylhydrogenphosphit zugegeben bis zu einer finalen Brühenkonzentration von 600 ppm. Die Resultate der Inhibitorzugabe sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst.
Beispiel 4
Cephalosporium acremonium wurde in gerührten 30-1-Tankfermentatoren für den Kulturaufbau und die Fermentation vermentiert. Die Gefässe wurden mit 10% des Mediumvolumens einer Keimkultur, die in Maiswasser-«Pharmame-dia»-Glukosemedium gezüchtet wurde, inokuliert. Das Fermentationsmedium war zusammengesetzt aus Maiswasser, Sojamehl und Sojaöl aus organischem Kohlenstoff und Stickstoff zusammengesetzt. Zum Testfermentor wurde nach 96 h Tributylphosphit zugegeben zu einer Endkonzentration von 300 ppm. Die Wirkung der Zugabe ist nachstehend angegeben in Form von Änderungen des Spiegels von Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C.
Dimethylhydrogenphosphit nach 100 h Zeit (h) *D/C + D
33
78
5,8
91
7,4
102
8,8
115
7,7
126
6,9
139
7,9
150
7,4
163
8,3
168
9,0
Tributylphosphit-300 ppm nach 96 h
Zeit (h)
*D/C + D %
* Konz, des Ceph C/Konz. Ceph C + des Ceph C x 100 Kontrolle - ohne Inhibitor
Zeit (h)
«D/C + D
74
4,2
85
3,7
98
4,3
109
4,0
122
4,6
133
5,8
146
6,9
157
7,9
170
9,1
83
5,8
96
8,2
107
10,7
120
11,9
131
13,8
144
16,9
155
18,9
168
20,9
170
22,5
* Konz, des Ceph C/Konz. Ceph C + des Ceph C x 100
* Konz, des Ceph C/Konz. Ceph C + des Ceph C x 100
661284
Beispiel 6
Die folgenden zusätzlichen Phosphorverbindungen wurden ebenfalls in Schüttelflaschenfermentationen getestet und zeigten Inhibitoraktivität in bezug auf die Desacetylcephalosporin C-Herstellung.
Triethylphosphonoacetat 2-Chlorethylphosphonsäure Tetraethylpyrophosphit Diethyl-cyanomethyl-phosphonat 2,2,2-Trichloroethyl-phosphorodichloridit Dimethylphosphat Trimethylphosphit Trier lylphosphit Dibutylphosphit Trist 2-Chlorethyl)phosphit Trimethylphosphonoacetat Diethyl-ethyl-phosphonat Tributylphosphit Triphenylphosphit
Diethyl-carbomethoxymethyl-phosphonat Dimethyl-acetylmethyl-phosphonat
Dimethyl-cyanomethyl-phosphonat Diethyl-allyl-phosphonat
Beispiel 7
5 Die folgenden zusätzlichen Phosphorverbindungen wurden ebenfalls in Fermentoren getestet und zeigten eine Inhibitoraktivität in bezug auf die Desacetylcephalosporin C-Produktion.
Triethylphosphonoacetat 10 2-Chlorethylphosphonsäure Tetraethylpyrophosphit Diethyl-cyanomethyl-phosphonat Dimethyl-methyl-phosp.ionat 2,2,2-Trichlorethyl-phosphorodichloridit i5 Dimethylphosphat Triethylphosphit Diphenylphosphit Triphenylphosphit Diisopropylphosphit 20 Triisopropylphosphit
Claims (15)
- 661284
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Cephalosporin C-produzieren-der Stamm des Genus Cephalosporium ist.2PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Kultivierung eines Cephalosporin C-produzierenden Mikroorganismus, welcher auch Desacetylcephalosporin C produziert, in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nährmedium eine Phosphorverbindung der FormelIIIRX0^P-OR3 r2o//R5OV OV
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ein Cephalosporin C-produzieren-der Stamm von Cephalosporium acremonium ist.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorverbindung die FormelRX0\P-OR-R2(/hat, worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander Ci-Cio-Alkyl, Halogen substituiertes Ci-Cio-Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeuten.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Butyl, Phenyl, Benzyl, Isodecyl oder 2-Chlorethyl darstellen.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorverbindung die FormelR4 OvR5^ V253035404550hat, worin R5 Wasserstoff, Ci-Cio-Alkyl, Halogen substituiertes Ci-Cio-Alkyl, Phenyl oder Benzyl ist; und R8 und R® entweder beide Wasserstoff oder beide Chlor bedeuten.
- 7. Verfahren gemäss Anspruch 6, worin R4 2-Chlorethyl ist oder -OR10 bedeutet, worin R10 Wasserstoff, Benzyl, n-Bu-io tyl, Ethyl, Isopropyl, Methyl, Phenyl oder 2,2,2-Trichlorethyl II ist; R5 Wasserstoff, Ethyl, Methyl, 2-Chlorethyl, n-Butyl, Phenyl, Isopropyl oder Benzyl ist; und R6 Wasserstoff, Hydroxy, Allyl, Cyanomethyl, Carboethoxymethyl, Methyl, Carbome-thoxymethyl, Ethyl, Acetyl oder Acetylmethyl ist. 15 8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, worin die Phosphorverbindung die Formel r5O ,0IV x/"R8^ V20zugegeben wird, worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander gerad- oder verzweigtkettiges Ci-Cio-Alkyl, Phenyl oder Phenyl-(Ci-Gt)-alkyl, darstellt, wobei die Alkylgruppe oder der Alkylteil des Phenylalkyls gegebenenfalls durch einen oder mehrere Halogen- oder Carboxysubstituenten substituiert ist und die Phenylgruppe oder der Phenylteil des Phenylalkyls gegebenenfalls durch einen oder mehrere Ci-C56-Alkyl-, Ci-Cä-Alkoxy- oder Halogensubstituenten substituiert ist; R4 gegebenenfalls durch Halogen substituiertes Ci-Cs-Alkyl oder -OR10 bedeutet, worin R10 Wasserstoff ist oder die Bedeutung R1 hat; R5 Wasserstoff ist oder die Bedeutung R1 hat; R6 Wasserstoff, Hydroxy, C2-C6-Alkenyl, C2-Ce-Alkanoyl oder Ci-Cs-Alkyl bedeutet, wobei die Alkylgruppe gegebenenfalls durch eine oder mehrere Cyano-, C2-C6-Alkanoyl- oder Carbo(Ci-C«)-alkoxyreste substituiert ist; und R8 und R9 entweder beide Wasserstoff oder beide Chlor bedeuten, in einer Konzentration von 100-3000 ppm, bezogen auf das Gewicht.
- 8^ \ 9R RoderR\/° Vr1woe1hat, worin R4 Ci-Cö-Alkyl, Halogen substituiertes Ci-Có-Alkyl darstellt, oder -OR10 ist, worin R10 Wasserstoff, Ci-Cio-Alkyl, Halogen substituiertes Ci-Cio-Alkyl, Phenyl oder Benzyl ist; R5 Wasserstoff, Ci-Cio-Alkyl, Halogen substituiertes Ci-Cio-Alkyl, Phenyl oder Benzyl ist; und R6 Wasserstoff, Hydroxy, C2-Cä-Alkenyl, Ci-Ce-Alkyl, substituiert durch Cî-Cs-Alkanoyl, Carbo(Ci-Cs)-alkoxy oder Cyano, ist.
- 9. Verfahren gemäss Anspruch 8, worin R5 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder 2,2,2-Trichlorethyl bedeuten.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, worin die Phosphorverbindung Tetramethylpyrophosphit oder Tetra-ethylpyrophosphit ist.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, worin die Phosphorverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphorsäure, Hypophosphorsäure, Diisopropyl-phosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethyl-phosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Tetraethylpyrophosphit, Di-ethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, 2,2,2-Trichlorethylphosphorodichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphit, Triphenylphosphit, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris(2-chlorethyl)-phosphit, Trimethylphos-phonoacetat, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxy-methylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dimethyl-acetylmethylphosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat und Diethylallylphosphonat.
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphorsäure, Hypophosphorsäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit und Tributylphosphit.
- 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphorverbindung Phosphorsäure ist.
- 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass eine organische Phosphorverbindung zur fortschreitenden Fermentation zwischen 70-140 h nach der Inokulation zugegeben wird.
- 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass eine anorganische Phosphorverbindung vor der Sterilisierung oder von 0-140 h nach der Inokulation zum Kulturmedium zugegeben wird.
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