IT8419892A1

IT8419892A1 - Procedimento microbiologico per produrre cefalosporina c

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Publication number: IT8419892A1
Application number: ITMI1984A019892A
Authority: IT
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-02
Publication date: 1985-09-02
Also published as: GB2136000B; GB2136000A; ZA841602B; NL194830C; PT78205B; FI840838A7; JPS59173097A; SE8401235D0; FR2545502B1; LU85240A1; SE461470B; PT78205A; FI78733C; AU567142B2; ATA74384A; CH661284A5; KR840008167A; KR910002861B1; DK139484A; SE8401235L

Description

W *?I f JJ/

Q

"PROCEDIMENTO MICROBIOLOGICO PER PRODURRE CEFALOSPORINA C"

* o BRISTOL-MYERS COMPANY,

a New York, N.Y. (U.S.A. )

Depositata il <? >Jfc 2 H4<p 1Q>8t <al H>?? 198924/84

RIASSUNTO

La produzione di desaoetilcefaloeporina C indesiderata durante la fomentazione di microorganismi ohe producono cefaloeporina C viene sostanzialmente ridotta aggiungendo certi oompoeti del fosforo al mezzo di coltura?

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un prooedimento migliorato per la produzione di cefaloeporina C. Pi? in particolare, la presente, invenzione riguarda l?aggiunta di oerti composti del fosforo organici e inorganici al mezzo di coltura durante la fomentazione di un microorganismo che produce cefaloeporina C, che produce anche desacetilcefalosporlna C indesiderata.

L'aggiunta dei composti del fosforo inibisce notevolmente la formazione dell'impurezza desacetilcefalosporlna C, facilitando cosi il ricupero della cefaloeporina C dal brodo di fomentazione e la sua successiva trasformazione in acido 7-amminoacefalosporanioo (7-ACA).

La cefaloeporina C / acido 3-acetossimetil?'7-beta-(l>-5-ammino-5? carboesipentanaeunido)cef-3-eiB-4-carbo8silioo_/ ? un oomposto che pur avendo, di per s?, una certa attivit? antibiotica, 6 di primaria importanza

come sostanza di partenza per la preparazione di antibiotici costituiti

da cefaloeporina semi?sintetiche? Cosi, la cefaloeporina C pu? venire trasformata, adottando metodi noti, nell'acido 3-acetossimetil-7 betaamminooef-3-e?-4-carbossilico (7-ACA) che viene quindi usato come prodotto intermedio-chiave per la preparazione di un'ampia variet? di antibiotici costituiti da cefalosporine commerciali?

E' noto che si pu? ottenere la cefalosporlna C mediante fermentazione di diversi microorganismi ivi compresi particolari funghi del genere Bnerioellopsis-Cephalosporium. Esempi illustrativi di microorganismi che producono cefalosporina C sono il oeppo Brotzu orginale di Cephalosporium, ossia, Cephalosporium sp? ?.?.?. 49137 (ATCC 11550), e suoi mutanti, per esempio il ceppo mutante 8650 (ATCC 14553)* descritto nel brevetto U?K? 1.109,362, Cephalosporium sp. I.B.I. 1131 descritto nel brevetto U.K.

1,503*851 e Cephalosporium sp. oeppo F.12 (ATCC 20339) descritto nel brevetto ?.?. 1.400.433? Tra gli altri esempi di organismi che producono cefalosporina C riportati in letteratura sono compresi Cephalosporium polyaleurun Y-505 (PERM-P No. 1160) descritto nel brevetto U.K. 1.488.822, Cepha1osporium acremonium N-75 (ATCC 20428) descritto nel brevetto U.K. 1.488.821 e Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) e un suo ceppo mutante identificato come Y-505 (ATCC 20360) descritto nel brevetto U.K. 1.389*714. La cefalosporina C viene prodotta in generale su scala industriale usando un ceppo mutante ad elevata produzione di Cephalosporium acremonium (noto anche come Acremonium chrysogenum). Esempi di tali mutanti e procedimenti per la loro preparazione sono stati ampiamente descritti in letteratura*

Nonostante un'esauriente ricerca nel corso degli anni, la fermentazione di cefalosporina C su scala commerciale ? ancora non completamente soddisfacente. La maggior parte dei microorganismi che producono cefalospori? o, <f >\??.? v>-zia Cf in particolare queiceppi ad elevata produzione usati nella produzione commerciale, danno come risultato la co-produzione di una notevole pro-porzione di desacetilcefalosporina C, un'impurezza che ? estremamente difficile da separare dal prodotto cefalosporina C desiderato a causa delle aue caratteristiche chimiche e fisiche simili. La presenza della desacetil? cefalosporina C, tipicamente in quantit? di circa 19$ rispetto al nucleo della cefalosporina totale prodotta durante la fermentazione, d? come risultato il ricupero di oefalosporina C (oppure pi? comunemente, un suo derivato estraibile con solventi) contaminata con desacetilcefalosporina C (oppure oon un suo derivato)?Inoltre, poich? su scala industriale la cefa^-losporlna C (oppure un suo derivato) usualmente non viene purificata prima della successiva trasformazione in 7^A.CA, la qualit? del prodotto 7-^A'PA viene anch'essa influenzata negativamente dalla contemporanea produzione di desacetilcefalosporina C nel brodo di fermentazione iniziale.

Le tecniche precedenti riguardanti la produzione di cefalosporina C riguardano principalmente la scoperta di nuovi microorganismi aventi una produttivit? in cefalosporina C pi? elevata e riguardano la realizzazione di additivi di fermentazione che fanno aumentare la produzione di cefalospo? rina C. Cos?, per esempio, sono stati sviluppati ceppi mutanti di Cephalo? sporium acremonium che producono rese di cefalosporina C sostanzialmente pi? elevate. E' stato suggerito di aggiungere diversi additivi al mez.:o nutritivo durante la fermentazione di un organismo che produce cefalosporina C in modo da fare aumentare la resa in oefalosporina C. Cos?, l'impiego di composti dello zolfo come solfito di sodio, metabisolfito di sodio, tiosol? fato di sodio, idrosolfito di sodio, tiOBOlfato di sodio e solfato di sodio ? VO.\ ? descritto nel brevetto U.K. 820.422, l'uso di metionina, oloruro di oal- xjfr ci?, cloruro di magnesio, solfato di ammonio e certi carboidrati, oli e acidi grassi ? descritto nel brevetto U.K. 936*755? l'uso di norvalina e di norleuoina ? descritto nel brevetto U.K. 975*393? l'uso di acido fenilacetico ? descritto nel brevetto U.K. 975*394 e l'uso di -caprolattaree, 2-butanone, alool butilico secondario e 1,3-butandiolo ? descritto nel brevetto U.K. 1*503*651* Il problema della co?produzione di desacetllcefalosporina C durante la fermentazione di cefalosporina C ? stato affrontato soltanto in termini di realizzare microorganieoi che producono quantit? maggiori di nucleo di cefalosporina C sotto forma di cefalosporina C oppure in termini di procedimenti di estrazione/isolamento (per esempio il brevetto U.K. 4*059*573).

La desacetilcefalosporina C i stata messa in evidenza la prima volta in filtrati di colture di Ceuhalosporium aoremonium. Abraham e altri haano proposto che la formazione di questa sostanza fosse dovuta alla deacetilazione enzimatica della cefalosporina C (Biochem. J, 811591-596, 1961)? Successivamente, gli enzimi esteraei capaci di deacet?lare la cefalosporina C sono stati idolati da una variet? d? sorgenti, per esempio, agrumi, batteri, act?onoceti, germogli di frumento, fegato e rene di mammiferi e Hhodotorala. Pisano e altri in Develop. Ind.Microbiol. 8*417-423, 1967?iddicano che l'attivit? di esteraei ? diffusa nel genere Cephalosporium. La maggior parte di questi enzimi acetilesterasi manifestano ampie tolleranze per il substrato, ossia, il beta?naft?lacetato e la triacetina sono substrati attivi e la loro attivit? nei confronti della cefalosporina C non risulta essere unica.

Neuesch et al* in Second International Symp* on Genetica of o Industriai Mioroorganisma, Proc*. 1975? ed* MacDonald, K*D., New York, Academio PressT pg* 451-472 e Fojisawa et al. in Agr* Biol? Chem* 39(6)? 1303?1309 (1975) indipendentemente hanno purificato parzialmente l'attivit? di cefalosporina C esterasi da "brodo extracellulare sumatante di Ce? phalosporium acremonium e hanno concluso ohe la presenza dell'attivit? enzimatica era parzialmente responsabile per la presenza di desacetilcefalo? sporina C in fermentazioni di C* acremonium* Un'attivit? di esterasi simile ? stata messa in evidenza negli Streptomiceti che producono oefa? losporina C Streptomyces clavuligerus (Antimicrob. Agents Chemother, 1_: 237-241, 1972)? Huber in Appi, microbiol. 16 (7): 1011-1014 (1968), tuttavia, ha messo in evidenza che la formazione di desacetilcefalosporina C durante il processo di fermentazione ? dovuta all'idrolisi non-enzimatica della cefalosporina C* Opinione della Richiedente ? che la formazione di desacetilcefalosporina C s?a dovuta ad un idrolisi enzimatica e ad una idrolisi non-enzimatica, l'attivit? enzimatica della acetilesterasi avendo un ruolo significativo*

Relazione di Liersch e altri in Second International S.ymp* on Oenetics of Industriai Microorgan?sms, Proc., 1976? sd. MacDonald, K*D., New York, Academio presa, pg. 179-1950 Felix e altri in FBMS Microbiol* Lett.

8* 55-58, 1980 hanno indicato che la desacetilcefalosporina C ? anche un prodotto intermedio intracellulare nella biosintesi della cefalosporina C dalla desacetossicefalosporina C

E' stato descritto che l'attivit? enzimatica della acetilesterasi ??' rV* parzialmente purificata ottenuta da Cephalosporium acremonium ? inibita dal diisopropilfluorofosfato, un noto inibitore di esterasi (Agr? BioI.

Chem. 39 (6): 1303-1309, 1975). L'estrema tossicit? e l'elevato costo di questo inibitore della fosforoacetilesterasi, tuttavia, impedisce il suo impiego nella produzione commerciale di cefalosporina C.

La cefalosporina C, a causa del suo carattere anfotero, viene normalmente trasformata in un derivato, in modo che essa pu? venire pi? facilmente ricuperata dal brodo di fermentazione mediante procedimenti di estrazione con solventi. Esempi di tali derivati sono indicati nella domanda di brevetto U.K. 2.021.640A. Un procedimento particolarmente pre ferito ? descritto nel brevetto U.S.A. 3.573.296. Il derivato della cefalosporina C ottenuto mediante tale procedimento preferito pu? venire ricuperato sotto forma di un sale di bis-dicicloesilammina cristallino come descritto nel brevetto U.S.A. 3.830.809. La cefalosporina C oppure un suo derivato isolato dal brodo di fermentazione viene quindi scissa mediante un procedimento tradizionale, per esempio il procedimento del brevetto U.S.A. 3.932.392 ottenendo cos? il 7-ACA.

come indicato sopra, l'impurezza desacetilcefalosporina C ottenuta tipicamente durante la fermentazione in quantit? di circa 15%

del nucleo della cefalosporina totale (cefalosporina C e desacetilce falosporina C) ha caratteristiche chimiche e fisiche abbastanza simili a quelle del prodotto desiderato costituito dalla cefalosporina C. Cos?, quando la cefalosporina C viene trasformata in un derivato estraibile con solvente, la desacetilcefalosporina C viene anch'essa trasformata in un derivato simile e il derivato della cefalosporina C, successivamente iso-?<v>-<> lato, viene contaminato con il derivato della desacetilcefalosporina C. Pertanto, si pu? rilevare che, facendo diminuire la proporzione del nucleo cefalosporina ottenuto come desacetilcefalosporina C si otterr? co me risultato un prodotto derivato della cefalosporina C pi? puro. Inoltre, poich? questo derivato non viene normalmente purificato prima della trasformazione in 7-ACA, quantit? ridotte di desacetilcefalosporina C nel brodo di fermentazione daranno come risultato anche una migliore qua-lit? del prodotto 7-ACA.

La presente invenzione riguarda la realizzazione di certi composti del fosforo che agiscono come inibitori della produzione di desacetilcefalosporina C durante la fermentazione della cefalosporina C.

Il brodo di fermentazione cosi ottenuto contiene una proporzione notevolmente pi? elevata di cefalosporina C rispetto alla desacetilcefalosporina C, realizzando cos? un miglioramento della qualit? del prodotto cefalosporina C ricuperato e, anche, della qualit? dell'ultimo intermedio del 7?ACA preparato da tale prodotto cefalospirlna C.

La presente invenzione riguarda un perfezionamento nella produzione di cefalosporina C mediante coltura aerobica sommersa di microorganismi che producono cefalosporina C. Pi? in particolare, la presente invenzione riguarda un procedimento per inibire la formazione di desacetilcefalosporina C durante la fermentazione di un microorganismo che produce cefalosporina C, detto microorganismo essendo un microorganismo che produce anche desacetilcefalosporina C, mediante aggiunta di certi compo

#v * \> sti del fosforo organici ed inorganici al mezzo di coltura.

Gli inibitori costituiti da composti del fosforo realizzati dalla presente invenzione hanno le formule generali

R?

^ P-OR<3 >i R<2>?^ v O

RVY II

R 0 O R<1>Q ? ?1

<N>Y v 0 OR

^p/ \p/

R<8 >^ V 2 / \ 2

R O OR

III IV

1 2 3

in cui R , R e R sono ciascuno indipendentemente alchile, arile oppure

4

arilalchile eventualmente sostituiti, R ? alchile eventualmente sostilo 10

tuito oppure -OR in cui R ? idrogeno oppure alchile, arile oppure

5

arilalchile eventualmente sostituiti, R ? idrogeno oppure alchile, ari-6

le oppure arilalchile eventualmente sostituiti, R ? idrogeno, ossidri-8

le, alchenile, alcanoile oppure alchile eventualmente sostituito e R e

9

R sono entrambi idrogeno oppure sono entrambi cloro.

Tali composti fanno diminuire efficacemente la formazione di desacetilcefalosponna C durante la produzione mediante fermentazione d? cefalosporina C. Inoltre, questi composti sono sostanzialmente meno tossici rispetto al diisopropilfluorofosfato e, in generale, sono realitamente poco costosi, consentendo cos? il loro impiego pratico nella produzione di cefalosporina C in grande scala.

Il procedimento della presente invenzione ? applicabile a qualsia si procedimento di fermentazione tradizionale per la preparazione di cefalosporina C, purch? in tale procedimento si impieghi un microorganismo che produce cefalosporina C che produce anche desacetilcefalosporina C nel brodo di fermentazione. Molti esempi di tali microorganismi sono descritti in letteratura, per esempio, nella domanda di brevetto U.K. 2.060.610A. Altri microorganismi che producono cefalosporina C possono venire facilmente esaminati per ci? che riguarda la produzione di desacetilcefalospo rina C mediante prove tradizionali ben note a coloro che sono esperti nel settore.

Il microorganismo che produce cefalosporina C pi? preferito per venire impiegato nella presente invenzione ? un ceppo di Cephalosporium acremonium (noto anche come Acremonium chrysogenum), che produce cefalo sporina C e desacetilcefalosporina C. Tipici ceppi di produzione di Cephalosponum acremonium danno come risultato la formazione di circa 15% del nucleo di cefalosporina C totale (cefalosporina C e desacetilcefalo sporina C) sotto forma di desacetilcefalosporina C.

Il procedimento della presente invenzione verr? effettuato desiderabilmente sottoponendo a coltura un microorganismo che produce cefalosporina C (un microorganismo capace di produrre sia cefalosporina C che desacetilcefalosporina C) in condizioni aerobiche, preferibilmente in coltura sommersa, in un mezzo nutritivo tradizionaley per la cefalospo rina C, secondo procedimenti di fermentazione della cefalosporina C tradizionali? La presente invenzione consiste nella scoperta che 1'aggiunta di certi composti del fosforo al mezzo nutritivo ridurr? sostanzialmente la produzione di desacetilcefalosporina C durante la fermenta zione e dar? come risultato un brodo finale contenente una proporzione sostanzialmente pi? elevata di cefalosporina C desiderata rispetto alla desacetilcefalosporina C indesiderata.

li mezzo nutritivo impiegato dovr? contenere sorgenti assimilabili di carbonio e azoto e, se si desidera, sostanze che favoriscono la crescita e anche sali inorganici.

Tra le sorgenti di carbonio adatte sono comprese, per esempio, glucosio, saccarosio, amido, amido solubile, oli vegetali e animali, destrina e maltosio.

Tra le adatte sorgenti di azoto sono comprese, per esempio, sostanze naturali contenenti azoto o sostanze preparate da esse come estrat ti di carne, peptone, caseina, liquido di macerazione del mais, estratti di lievito, farina di semi di soia, triptone, farina di semi di cotone e crusca di frumento. Si possono anche usare composti organici o inorganici contenenti azoto, per esempio, urea, nitrati e sali di ammonio come acetato di ammonio, cloruro di ammonio oppure solfato di ammonio.

Tra i sali inorganici che possono venire usati nel mezzo di fermentazione sono compresi solfati, nitrati, cloruri, carbonati, eccetera che sono stati impiegati nella produzione di cefalosporina C.

Tra le sostanze che favoriscono la crescita, che possono venire usate, sono comprese, per esempio, cisteina, cistina, tiosolfato,metti o? leato e, in particolare, metionina e anche elementi in tracce come ferro, zinco, rame e manganese.

Le condizioni di coltura come temperatura, pH e tempo di fermenta ?*v* zione,vengono scelte in modo che il microorganismo impiegato possa accumulare una quantit? massima della cefalosporina C desiderata. Normalmente, si mantiene la temperatura a circa 15-45?, preferibilmente a circa 25?C e si effettua la fermentazione per un periodo di tempo compreso circa tra

1 giorno e 20 giorni, preferibilmente tra 4 giorni e 10 giorni e, nel modo pi? preferibile, per un periodo di tempo di circa<* >6 giorni.

Si ? ora trovato che certi composti del fosforo organici e inorganici, quando vengono aggiunti al mezzo di coltura durante la coltura

di un microorganismo che produce cefalosporina C danno come risultato una produzione sostanzialmente ridotta di desacetilcefalosporina C nel brodo di fermentazione. Si ritiene che questa diminuzione di produzione di desa cetilcefalosporina C sia il risultato di una inibizione dell'enzima acetilesterasi prodotto tipicamente durante la coltura di microorganismi

che producono cefalosporina C.

I composti del fosforo che possono venire usati nel procedimento della presente invenzione possono venire rappresentati dalle formule

?^? o

.//

P-OR<'>

R<2>0 RSQ^ V

II

R 0v O

\ // <R1>?\ <\ OR<1>

> E>/

2 / N 2

R<8 >\ <9 >R 0 OR

III IV

in cui R , R e R sono ciascuno indipendentemente alchile, arile op- '\P 9i\i v 4

pure arilalchile eventualmente sostituiti, R ? alchile eventualmente

10 . 10 .

sostituito oppure e -OR in cui R e idrogeno oppure alchile, arile op?

pure arilalchile eventualmente sostituiti, R ? idrogeno oppure alchile,

arile oppure arilalchile eventualmente sostituiti R ? idrogeno, ossi?

drile, alchenile, alcanoile oppure alchile eventualmente sostituito e

8 9

R e R sono entrambi idrogeno oppure sono entrambi cloro.

Composti del fosforo preferiti sono quei composti di formule

1 2 3

I, II, III e IV in cui R , R e R rappresentano ciascuno indipendente?

mente alchile C^?<1>C a catena lineare o a catena ramificata, fenile op?

pure fenil(C^-C^)alchile, detto gruppo alchilico oppure la porzione al-

chilica del fenilalchile essendo eventualmente sostituita con uno o pi?f

preferibilmente 1-3^sostituenti come alo (cloro, bromo, fluoro, iodio)

oppure carbossile e detto gruppo fenile della porzione fenilica del fe?

nilalchile essendo eventualmente sostituito con uno o pi?(preferibil-

mente uno-tre,sostituenti, scelti indipendentemente da gruppi come C -C

1 6

4

alchile, C -C alcossile e alogeno: R ? C -C alchile eventualmente so-1 6 <& >1 6

stituito con uno o pi?, preferibilmente l-3jgruppi alo oppure -OR<1>*<?>* in

10

cui R ? idrogeno, C -C alchile, fenile oppure fenil(C -C )alchile,

1 10 1 4

detti radicali alchile, fenile e fenilalchile essendo eventualmente so?

1 5 ..

stituiti come definito sopra per R J R e idrogeno, C^-C alchile, fe?

nile oppure fenil(C -C )alchile, detti radicali alchile, fenile e fenilal-1 4

1 6

chile essendo eventualmente sostituiti come definito sopra per R * R ?

idrogeno, ossidrile, C -C alchenile, C -C alcanoile oppure C -C alchile,

2 6 2 6 1 6

detto gruppo alchile essendo eventualmente sostituito con uno o pi?(preferibilmente l-3fsostituenti come il gruppo ciano, <C>2<-C>g alcanoile oppure 8 9

carbo(C -C )alcossile*e R e R sono entrambi idrogeno oppure entrambi 1 6 '

cloro.

Composti costituiti da fosfiti di formula I possono essere esem plificati da :trimetil fosfito, trietilfosfito, triisopropilfosfito, tri. butilfosfito, trifenilfosfito e tns(2-cloroetil)fosfito. Si possono anche usare fosfiti a funzione mista come benzildietilfosfito e difeniliso decilfosfito.

Composti del fosforo di formula li possono venire esemplificati da acido fosforoso,dibenzil fosfito, dibutilfosfito, dietilfosfito, diiso propilfosfito, dimetilfosfito, difenilfosfito, trietilfosfonoacetato, acido 2-cloroetilfosfonico, dietilcianometilfosfonato, dimetilmetilfosfonato, dimetilfosfato, trimetilfosfonoacetato, dietiletilfosfonato, dietilcarbometossimetilfosfonato, dietilacetilfosfonato, dimetilacetilmetilfosfonato, dimetilcianometilfosfonato, dietilallilfosfonato e acido 2-carbossietilfosfonico.

Composti di formula generale III possono essere illustrati da acido ipofosforoso, monometilfosfonato, monoetilfosfonato e 2,2,2-tricloroetilfosforodicloridito.

Composti costituiti da pirofosfiti di formula IV possono essere illustrati da tetrametilpirofosfito e da tetraetilpirofosfito.

Tra gli inibitori costituiti da composti del fosforo preferiti so no compresi acido fosforoso, acido ipofosforoso, diisopropilfosfito, triisopropilfosfito, dibenzilfosfito, dimetilfosfito, tributilfosfito, trietilfosfonoacetato, acido 2-cloroetilfosfonico, tetraetilpirofosfito, dietilcianometilfosfonatof dimetilmetilfosfonato, 2,2f2-tricloroetilfoeforo e**<v >dicloridito, dimetilfosfato, difenilfosfito, trifenilfosfito, trimetilfosfi? to, dibutilfosfito, tris(2-cloroetil)foefito, trimetilfosfonoacetato, distiletilfosfonato, dietilcarbomet08simetilfosfonatO| dietilacetilfosfonato, diraetilacetilmetilfosfonato, diraetiloianometilfosfonato e dietilallilfosfonato

Tra i composti particolarmente preferiti sono compresi acido fosforoso, acido ipofosforoso, diisopropilfosfito, triisopropilfosfito, dibenzilfosfito, dimetilfosfito e tributilfosfito.

L*inibitore costituito da un composto di fosforo pi? preferito ? l'acido fosforoso.

Si impiegano preferibilmente composti fosforosi in modo da ottenere concentrazioni finali del brodo comprese tra circa 10Q e 3000 parti per milione (riferito al peso) e, per lo pi?, preferibilmente comprese circa tra 200 e 1000 parti per milione. Si pu? aggiungere H composto inibitore in una sola volta, oppure ad intervalli periodici nel corso della fermentazione.

Nel modo pi? vantaggioso, i composti del fosforo organici vengono aggiunti a fermentazioni in corso tra circa 70 e 140 ore sotto forma di una carica singola o di cariche multiple. I composti del fosforo inorganici possono venire aggiunti vantaggiosamente a fermentazioni in corso,im mediatamente dopo l'inoculazione fino a circa 140 ore dopo l'inoculazione. Come alternativa, essi possono venire introdotti, nel mezzo di fermentazione prima della sterilizzazione?

Si ? trovato che l'impiego dei composti del fosforo citati sopra

condo il procedimento della presente invenzione fa diminuire sostanzial%rse . mente la percentuale di desacetilcefalosporina C (riferito al nucleo totale di cefaloeporina che ? cefalosporina C e desacetilcefalosporina C) nel brodo di fermentazione? Quandi si effettua l'impiego in fermentazioni di cefalosporine C tipiche, le concentrazioni d? desacetilcefalosporina C vengono ridotte a circa 4$ del nucleo totale della cefalosporina, in confronto a circa 15$ che si ha nel caso d? fermentazioni non trattate.

In fermentazioni effettuate in matracci trattati sottoposti a sbattimento, la quantit? totale di nucleo d? cefalosporina prodotto sembra rimanere inalterata e, cosi, i titoli di cefalosporina C in generale vengono aumentati di un'adeguata quantit?. In fermentazioni in scala maggiore, non ? stato stabilito che l'impiego dei composti inibitori costituiti da composti del fosforo d?a oome risultato concentrazioni elevate di cefalosporina C. Tuttavia, anche se le concentrazioni di cefaloeporina C rimangono costanti, la quantit? ridotta di desacetilcefalosporina C nelle fermentazioni trattate facilita notevolmente il ricupero del prodotto cefalosporina C desiderato con un grado di purezza pi? elevato.

S? ? messo in evidenza che i composti del fosforo della presente invenzione hanno la loro attivit? di Inibizione al livello di enzima. Cosi, si ? parzialmente purificata l'attivit? di cefalosporina C esterasi ottenuta dal surnatante di brodo di Cephalosporlum acremonlum mediante cromatograf?a in colonna DEAE Sephadez A50 e si ? trovato che l'attivit? idrolitica di questo preparato (misurata mediante HPLC dopo la trasformazione di cefalosporina C in desacetilcefalosporina C) ? inibita dai composti del fosforo di formule I, II, III e IV?

J.O 2 i <? \ )? & Dopo che la fermentazione ? terminata, il prodotto cefalosporina C desiderato viene preferibilmente trasformato, adottando procedimenti no ti, come quelli descritti nel brevetto U.S.A. 3.573.296,in un derivato che pu? venire pi? facilmente ricuperato dal brodo mediante procedimenti di estrazione con solventi. La cefalosporina oppure un suo derivato,ottenuti.dalla fermentazionepossonoquindiveniretraefoA>ati|adottando metodi noti, in 7-ACA, un prodotto intermedio chiave nella preparazione di molte cefalosporine semi-sintetiche. Impiegando i composti del fosforo inibitori secondo la presente invenzione, si ottengono la cefalosporina C oppure i suoi derivati e si ottiene il prodotto intermedio ultimo 7-ACA in modo pi? efficace e con un grado di purezza superiore in confronto al procedimento con brodo non trattato delle tecniche precedenti.

Gli esempi che seguono hanno lo scopo di illustrare la presente invenzione senza limitare in alcun modo l'ambito della presente invenzione alle forme di realizzazione specificamente descritte. Il termine "ppm" usato negli esempi si riferisce a una base peso/peso.

Esempio 1

Si sono messe in opera fermentazionistandard) in matracci sottoposti a sbattimentodi Cephalosporium acremonium (un ceppo mutante che produce cef-C in elevata concentrazione,che produce anche desacetil cef-C) se condo il seguente procedimento. Si ? iniziata una coltura di semi con la inoculazione di un mezzo di semina a base di glucosio-liquido di macerazione del mais, proveniente da una coltura di conservazione congelata. S? sono sottoposti a coltura matracci inseminati per tre giorni a 28?C ef? 4 ? ?J fettuando lo sbattimento a 260 giri/m?nuto e si ? usato un volume di inocu-feN^^Oi -lo 10% per fare iniziare le fermentazioni nello stadio di produzione.

Il mezzo di produzione era basato su una composizione equilibrata di liquido di macerazione del mais, PHARMAMEDIA (farina di semi di cotone posta in commercio dalla Traders Oil Mill Company, Forth Worth, Texas), destrina, olio di soia, metionina e solfato di ammonio. Si sono sottoposti a sbattimento i palloni a 25?C a 260 giriVminuto per un periodo totale di 6 giorni, dopo di che le porzioni del brodo sono state dilui-te, filtrate e saggiate per stabilirne il contenuto in cefalosporina C e in desacetilcefalosporina C, mediante HPLC. Le sostanze inibitrici

sono state aggiunte,nelle quantit? indicate,in corrispondenza del quarto giorno (96 ore). I risultati sono riassunti qui di seguito.

Dee C/Sxtr Inibitore M&Hfra dell'ag Cef C Dee?Cef C eleo di C?te aggiunte giunta ppa 52 B?t totale* ) di-isopropil 1600 9750 495 4,83 fosfito 600 9850 520 5,01 trl-lsopropll 1600 11 .000 575 4,96 fosfito 600 8995 530 5,56 dibenzil 600 9380 485 4,92 fosfito 100 9220 660 6,68 dimetll fosfito 600 9400 350 3,60 soldo(della Mobil 100 10.615 520 4,67 Cheta* Co*)

dinetil fosfito 600 9380 340 3,49 soldo(dellaAlfa 100 9360 415 4,23 Chea* Co*)

dietil aoetil 1000 9285 440 4,52 fosfonato 600 9665 445 4,40 oontrollo nessuna 8760 705 7,45 aggiunta

* Cef C -i-Dea Cef C

IO '\?' >?

Esempio 2

Adottando le condizioni di fermentazione standard in matracci sotto-posti a sbattimento, e usando la medesima coltura di produzione descritta nell'Esempio 1, si sono aggiunti composti del fosforo inorganici ed organici a fermentazioni in corso in corrispondenza di 0,48 ore e in corrispondenza di 96 ore dopo 1'inoculazione ottenendo cos? nel brodo concentrazionediinibitore finali comprese tra 100 ppm e 800 ppm. I risultati sono riassunti nella seguente tabella di dati.

Composto inibitore 6? giorno 7? giorno

Cef C/ ?D Cef C/ *D Ora di aggiunta/oonoen Dea Caf C C D Dee Cef C C D trazione finale in ppm <in >?og/g _ in mcg/g _ fosforo acido

O/ore/l00 11.810/730 5*8 10,300/925 8,2 200 10,540/460 4,2 11 ,585/935 7,4 400 9,940/350 3,4 10,240/500 4,6 800 10,600/390 3,5 10,335/425 3,9 48 ore/100 10,300/710 6,4 9,370/820 8,0

200 9,895/535 5,1 9,950/710 6,6 400 10,030/405 3,8 9,305/480 4,9 800 9,200/355 3,7 9,180/470 4,8 96 ore/100 8,355/755 8,3 10,240/1 ,430 12,2

200 7,670/670 8,0 9,605/975 9,2 400 7,830/640 7,5 8,645/705 7,5 800 10,140/780 7,1 8,225/770 8,5 difenilfoefito

96/ore/lOO 10,565/1,145 9,7 9,705/1,220 11,2

200 10,345/935 8,2 10,000/1,410 12,3 400 9,985/690 6,4 9,250/945 9,2 800 9,615/780 7,5 8,800/720 7,5 Controllo

(nessuna aggiunta di ini 8,055/1,145 12,5 8,784/1,562 15,1 bitore)

* cono, di dea?cef C

cono, cef C dee cef C x 100

Esempio 3

Adottando condizioni di fermentazione standard in palloni sottoposti a sbattimento, ? usando la medesima coltura di produzione descritta nell'Esempio 1, si sono aggiunti composti del fosforo inorganici, come inibitori, al mezzo prima della sterilizzazione sottoponendo a trattamento in autoclave a 121?C per 20 minuti. I risultati sono riassun ti nella tabella dei dati che segue.

Gii orno 6

Composto Inibitore/ Cef C/ * D cono, finale in ppm Des Cef C C D in mcg/g % acido fosforoso/ 200 9.740/600 5,8

400 8.050/340 4,0 800 7.111/285 3,8

a?ido ipofosforoso/ 150 8.110/1.130 12,2

300 8.600/1* 000 10,4 450 9.080/940 9,4

Controllo (nessuna aggiunta di 7.840/1.060 H ,<9 >inibitore )

* oono? di dee-ce& C

cono? cef. C dea? cef. C x 100

Esempio 4

Si ? fatto fermentare Cephalosporium acremonium in fermentatori costituiti da serbatoi sottoposti ad agitazione da 30 litri, secondo pr? cedimenti standard, per far procedere coltura e fermentazione. Si so no inoculati i serbatoi di fermentazione al 10% del volume medio con una coltura di semina ottenuta su un mezzo glucosio-PHARMAMEDIA-liquido di ma-cerazione del mais. Il mezzo di fermentazione era costituito da liquido di macerazione del mais, farina di soia e olio di soia come carbonio organico e azoto organico. Durante la fermentazione si sono introdotti sciroppo di glucosio e olio di soia. Al fermentatore in esame si ? aggiun to tributilfosfito in corrispondenza di 96 ore fino ad ottenere una concentrazione finale del brodo di 300 ppm. Si registra l'effetto dell'ag-giunta, qui di seguito, in termini di variazioni nelle concentrazioni di cefalosporina C e di desacetilcefalosporina C.

Tributilfosfito-300 ppm a 96 h.

<?>D

C D

<? >Tempo (ore) %

74 4,2

<' >85 3,7

98 4,3

109 4,0

122 4,6

133 5,8

146 6,9

157 7,9

170 9,1

<?>conc. des cef C_

cono, cef C + des cef C x 100

<?1 [Z(

Prova di controllo - non era necessario alcun inibitore.

<?>D

C D

Tempo (ore) %

74 4,8

85 4,5

98 5,1

109 6,9

122 8,9

133 12,6

146 13,0

157 13,2

170 15,0

*

L'aggiunta di tributilfosfito ha fatto diminuire la quantit? di desacetilcefalosporina C prodotta fino a 9,1% del nucleo totale di cef in confronto a 15,0% nella prova di controllo.

Esempio 5

Si ? fatto fermentare Cephalosporium acremonium in un fermentato re costituito da un serbatoio dotato di agitatore da 3000 litri, usando mezzi di cefalosporina C tradizionali e adottando procedimenti tradizionali. Si ? aggiunto dimetilfosfito acido in corrispondenza di 100 ore fi no ad una concentrazione finale del brodo di 600 ppm. I risultati dell'aggiunta dell'inibitore sono riassunti nelle tabelle che seguono.

t/QO*

Dimetti fosfito acido a 100 ore

*D

Tempo C D lore)

78 5.8

91 7,4

102 8.8

115 7.7

126 6.9

139 7.9

150 7,4

163 ?.3

168 9,0

* cono? dee oef C

cono? oef C des oef C x 100

Controllo ? non era neoeesario alcun inibitore *D

Tempo C D iorei

83 5*8

96 8,2

107 10.7

120 11.9

131 13.8

144 16.9 155 18.9

168 20.9

170 22,5

* cono? des cef C

oono, oef C dee cef C x 100

?? * ?T? Esempio 6

Si sono inoltre esaminati i seguenti ulteriori composti del fosforo in fermentazioni effettuate in matracci sottoposti a sbattimento e detti composti presentavano un'attivit? di inibizione rispetto alla produzione di desacetilcefalosporina C:

trietilfosfonoacetato

acido 2-cloroetilfosfonico

tetraetilpirofosfito

dietil cianometilfosfonato

2 ,2,2-tricloroetilfosforodicloridito

dimetilfosfato

tnmetilfosfito

trietilfosfito

dibutilfosfito

tris(2-cloroetil}fosfito

trimetilfosfonoacetato

dietiletilfosfonato

tributilfosfito

tnfenilfosfito

d?etilcarbometossimet?lfosfonato

dimetilacet?lmetilfosfonato

dimetilcianometilfosfonato

d?etilallilfosfonato

Esempio 7

Si sono inoltre esaminati 1 seguenti ulteriori composti del fosforo

Claims

RIVENDICAZIONI

1 Procedimento per produrre oefalosporina C sottoponendo a coltura in un mezzo nutritivo microorganismi che producono cefalosporina Cf e che produoono inoltre desacatilcefalosporina C, caratterizzato dal fatto che si aggiunge a detto mezzo un composto del fosforo di formula.

R^-O R<4 >0

^ P-OR<3>

R<2>0<// >?=,?II ?

R 0 0 R<1>0 0 OR

\ # \ / \ /

<N>P P P

?8 / V 9 2 /

R R R O ^ OR<2>

III IV

V*V J$? 1 2 3 <N>?LON f in cui R , R e R ciascuno indipendentemente rappresentano C^-C alchile <y>

a catena lineare o a catena ramificata, fenile oppure fenil(C^-C^J-alchile, detto gruppo alchile oppure la porzione alchilica del fenilalchile essendo eventualmente sostituita con uno pi? sostituenti alo oppure carbossile e detto gruppo fenile oppure la porzione fenilica del fenilalchile essendo eventualmente sostituito con uno o pi? sostituenti C -C alchile, C -C 1 6 1 6 4 _

alcossile oppure alo; R e C -C alchile eventualmente sostituito con uno

1 6

10 10 ?

o pi? gruppi alo,oppure e -OR in cui R e idrogeno oppure ha il signi-

1 5 .

ficato definito sopra per R ; R e idrogeno oppure ha il significato de-1 6

finito sopra per R ; R ? idrogeno, ossidrile, C -C alchenile, C -C al-2 6 2 6 canoile oppure C -C alchile, detto gruppo alchile essendo eventualmente 1 6

sostituito con uno o pi? radicali ciano, C -C alcanoile oppure carbo(C -C )-2 6 1 6 8 9

alcossile; e R e R sono entrambi idrogeno oppure sono entrambi cloro, in una concentrazione compresa tra circa 100 e 3000 parti per milione.

2 - Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui il microorganismo e un ceppo del genere Cephalosporium che produce cefalosporina

3 - Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui il microorganismo ? un ceppo di Cephalosporitun acreraonium, che produce cafalospo? rina C.

4 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui il composto del fosforo ha la formula

R^O

^ P-OR<3>

R<2>0</>

1 2 3

in cui R , R e R sono ciascuno indipendentemente C -C alchile, C -C

1 10 1 10 alchile aio-sostituito , fenile oppure benzile .

(-( );) 5 - Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui R , R e R

sono ciascuno indipendentemente metile, etile, isopropile, n-butile, fe?

nile, benzile isodecile oppure 2-cloroetile.

6 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui

il composto del fosforo ha la formula

R? o

R<5>O^ <N>R<6>

4 10 in cui R ? C -C alchile, C TC alchile aio-sostituito oppure e -OR in 1 6 1? 6

10

cui R ? idrogeno, C -C alchile, C -C alchile aio-sostituito, fenile <s >1 10 1 10

5

oppure benzile: R ? idrogeno, C -C alchile, C -C alchile alo-sostitui 1 10 1 10

6 _

to, fenile oppure benzile; e R e idrogeno, ossidrile, C -C alchenile,

2 6

C -C alchile, C -C alcanoile oppure C -C alchile sostituito con C -C 1 6 2 6 1 6 2 6 alcanoile, carbo(C -C )alcossile oppure ciano.

1 -6

4

7 - Procedimento secondo la rivendicazione 6 in cui R e 2-cloroe 10 10 ?

tile oppure e -OR in cui R e idrogeno, benzile, n-butile, etile, ?so-5

propile, metile, fenile oppure 2,2,2-tricloroetile; R ? idrogeno, etile,

6 metile, 2-cloroetile, n-butile, fenile, isopropile oppure benzile; e R ?

idrogeno, ossidrile, allile, cianometile, carboetossimetile, metile, car-

bometossimet?le , etile, acetile oppure acetilmetile.

8 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui

il composto del fosforo ha la formula

R<5>O

<X>P</7>

V

di to < in cui R ? idrogeno, C -C alchile, C -C alchile aio-sostituito, fe?

1 10 1 10

a 9

nile oppure benzile; e R e R sono entrambi idrogeno oppure sono entram bi cloro.

9 - Procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui R ? idrogeno, metile, etile oppure 2,2,2-tricloroetile.

10 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, oppure 3 in cui il composto del fosforo ? tetrametilpirofosfito oppure tetraetilpirofo sfito.

11 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui il composto del fosforo ? scelto dal gruppo costituito da acido fosforoso, acido ipofosforoso,diisopropil fosfito, triisopropilfosfito, dibenzilfosfito, dimetilfosfito, tributilfosfito, trietilfosfonoacetato, acido 2-cloroetilfosfonico, tetraetilpirofosfito, dietilcianometilfosfonato, dimetilmetilfosfonato, 2,2,2-tricloroetil fosforodidoriditof dimetilfosfato, difenilfosfito, trifenilfosfito, trimetilfosfito, dibutilfosfito, tris(2-cloroetil)fosfito, trimetilfosfonoacetato, dietiletilfosfonato, dietilcarbometossimetilfosfonato, dietilacetilfosfonato, dimetilacetilme tilfosfonato, dimetilcianometilfosfonato e dietilallilfosfonato.

12 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui il composto del fosforo ? scelto dal gruppo costituito da acido fosforoso, acido ipofosforoso, diisopropilfosfito, triisopropilfosfito, dibenzilfosfito, dimetilfosfito e tributilfosfito.

13 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui il composto del fosforo ? acido fosforoso.

14 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 in cui ? si aggiunge un composto organo del fosforoalla fermentazione in corso tra circa 70 ore e 140 ore dopo l'inoculazione.

15 - Procedimento secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 m cui si aggiunge un composto inorganico del fosforoal mezzo di coltura prima della sterilizzazione oppure da 0 ore a 140 ore dopo l'inoculazione.

Il Mandatario!

o MODIANO -

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