CH664018A5

CH664018A5 - Immunologisches bestimmungsverfahren und reagens fuer immunologische bestimmungen.

Info

Publication number: CH664018A5
Application number: CH4161/83A
Authority: CH
Inventors: Takashi Kudo; Toshiyuku Sugawara; Hiroshi Sato; Ei Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-07-31
Filing date: 1983-07-29
Publication date: 1988-01-29
Also published as: FR2531223B1; SE8304190D0; SE8304190L; CA1235062A; DE3327496A1; FR2531223A1; GB2125547A; AT385601B; GB2125547B; ATA276883A; GB8319459D0; NL8302708A

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein immunologisches Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Gesamtmenge zweier oder mehrerer Substanzen in einer Probe und auf ein Reagens zur Ausführung dieses Verfahrens.

Infolge der grossen Fortschritte der klinischen Medizin in letzter Zeit sind genauere Diagnosen und Behandlungsarten verschiedenster Krankheiten dadurch möglich geworden, dass eine Anzahl klinischer Untersuchungsmerkmale gemessen und die Ergebnisse verständlich interpretiert werden können. Die zur Zeit ausführbaren immunochemi-schen Bestimmungen benötigen jedoch noch zur Untersuchungauf ein einzelnes Merkmal etwa 1 bis 4 Tage, und daher sind zur Untersuchung auf mehrere Merkmale noch sehr viele Tage nötig. Aus diesem Grunde muss man auf einige der an sich notwendigen Tests verzichten, wenn die Gefahr besteht, dass der Patient nicht mehr rechtzeitig behandelt werden kann. Unter solchen Umständen ergibt sich natürlich die Möglichkeit, dass die Behandlung des Patienten nicht immer die richtige ist.

Beispielsweise wird bei Krebs, der in der Rangliste der Sterbeursachen ganz oben steht, angenommen, dass die Bestimmung verschiedener Tumormerkmal-Stoffe für eine gute Frühdiagnose sehr wichtig ist und das Wissen von den Krankheitsbedingungen, die Beurteilung des therapeutischen Effekts, Feststellungeines Rückfalls usw. massgeblich beeinflusst. In solchen Fällen ist es eher angebracht und genauer, eine Anzahl von Tumormerkmal-Substanzen zu bestimmen und die Diagnose auf die kombinierte Beurteilung der Resultate abzustimmen, als nur von den Ergebnissen der Bestimmung einer einzigen Tumormerkmal-Sub-stanz zu urteilen. Wie aber schon oben angedeutet wurde, braucht es viele Tage, um mehrere Tumormerkmal-Substanzen zu bestimmen. Zur Bestimmung mehrerer Substanzen nacheinander müssen zudem mehrere bzw. grössere Proben genommen werden, z.B. Serum, Plasma usw., was die Schmerzen des Patienten vermehrt.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Gesamtmenge von zwei oder mehreren Substanzen zu entwickeln, die sich in einer Probe befinden, und zwar durch eine einzige Bestimmungsoperation.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Reagenzmittels zur gleichzeitigen Messung der in einer

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Probe anwesenden Gesamtmenge von zwei oder mehreren Substanzen durch eine einzige Bestimmungsoperation.

Demgemäss bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein immunologisches Verfahren und ein Reagens nach den Ansprüchen 1 und 11.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist der Zeitbedarf zur Bestimmung beträchtlich verkürzt, weil zwei oder mehr Substanzen gleichzeitig bestimmfwerden. Auch kann die Probengrösse verglichen mit bisher üblichen Methoden verkleinert werden, bei denen in jeder Probe nur jeweils eine Einzelmessung vorgenommen wurde.

In der Zeichnung sind Diagramme vorgestellt, die im Zusammenhang mit den nachstehenden Beispielen stehen. Es zeigen :

Fig. 1 bis 4: die Standardkurven gemäss Beispiel 6, dort erläutert;

Fig. 5 bis 8: die Standardkurven gemäss Beispiel 10;

Fig. 9; die Standardkurven gemäss Beispiel 12; und

Fig. 10; die Verdünnungskurven gemäss Beispiel 13.

Es wurde gefunden, dass zur Krebs-Frühdiagnose auf der Grundlage der Bestimmung von Tumormerkmal-Substanzen es bereits möglich ist, die Anwesenheit von Krebs mit Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, wenn man die Gesamtmenge der Merkmalsubstanzen bestimmt (vgl. nachstehende Beispiele 2,4,6 und 11 ), obwohl es natürlich besser wäre, wenn man Einzelbestimmungen ausführen würde, um zu erfahren, welche Tumormerkmal-Substanzen anwesend sind und in welchen Konzentrationen. Wie gesagt ist es aber wichtiger, sofort mit einer Therapie beginnen zu können. Auf der Grundlage der eben erwähnten Befunde wurde nach sehr eingehenden Forschungen und Studien gefunden, dass es möglich ist, die Gesamtmenge zweier oder mehrerer in einer Probe befindlichen Substanzen mit einer einzigen Bestimmungsoperation gleichzeitig zu bestimmen. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass die Gesamtmenge von zwei oder mehreren zu bestimmenden Substanzen in einer einzigen Bestimmungsoperation auf Grund eines immunologischen Bestimmungsprinzips bestimmt werden kann. Dabei wird die Bestimmung so ausgeführt, dass man zunächst zwei oder mehrere unterschiedliche Antikörper, die gegen zwei oder mehrere zu bestimmende Antigene gerichtet sind, an den gleichen unlöslichen Träger bindet oder indem man zwei oder mehrere insolubilisierte Antikörper vermischt und verwendet, die man durch Bindung von Antikörpern, die gegen zwei oder mehrere unterschiedliche zu bestimmende Antigene gerichtet sind, an getrennte unlösliche Träger erhält. Dabei ist eine Veränderung der Reaktivität zwischen den zu bestimmenden Antigenen und den entsprechenden Antikörpern zu vermeiden.

Die immunologischen Bestimmungsverfahren, die dem erfindungsgemässen Verfahren zugrunde liegen, werden bereits als Methoden zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen angewandt, die sich in ausserordentlich kleinen Konzentrationen in bestimmten Probenflüssigkeiten wie Serum, Urin usw. finden. Beispiele sind Peptidhormone, Steroide, Proteine, dem menschlichen Körper zugeführte Medikamente und Drogen usw. Insbesondere wendet man die Reaktionen der Hämagglutination und der Latexagglutination an, da sie den Vorteil einfacher Analysendurchführung und kurzer Analysenzeiten haben. Das gleiche gilt für Enzym-Immunoanalysen, Radio-Immunoanalysen und Fluoro-Immunoanalysen, die man oft auf Grund der Vorteile hoher Empfindlichkeit und ausgezeichneter Quantitativität benutzt.

Die Grundlagen dieser Bestimmungsmethoden sollen jetzt kurz beschrieben werden.

( 1 ) Agglutinations-Reaktionen. Setzt man eine unbekannte Menge eines zu bestimmenden Antigens mit einem entsprechenden Antikörper um, der an einen teilchenför-migen Träger gebunden ist (nachstehend als «feste Phase» bezeichnet), beispielsweise rote Blutkörperchen, Polymerlatex usw., bindet sich das Antigen an den Antikörper an der festen Phase proportional der anwesenden Menge, und die feste Phase agglutiniert dadurch. Man misst das Ausmass der Agglutination, und man bestimmt die Menge des zu messenden Antigens durch Vergleich der Agglutinationsraten, die man bei der Zugabe der gleichen Substanz, aber mit bekannten Konzentrationen nach analogen Arbeitsweisen erhält.

(2) Sandwich-Verfahren. Wird eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens, nämlich des zu bestimmenden Antigens, mit einem entsprechenden Antikörper umgesetzt, der an eine feste Phase gebunden ist (erste Reaktion), bindet sich das zu bestimmende Antigen an den Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Setzt man eine gegebene Menge des gleichen Antikörpers, der mit einem Markierungsmittel markiert ist, mit dem genannten Antigen-Antikörper-Komplex um (zweite Reaktion), so wird der markierte Antikörper an den genannten Komplex gebunden, wobei jedoch ein Anteil des Antikörpers, der die Bindungskapazität des Komplexes übersteigt, ungebunden bleibt und weiterhin in freier Form vorliegt. Dann wird die feste Phase von der flüssigen Phase abgetrennt, die Aktivität des Markierungsmittels in der festen oder der flüssigen Phase gemessen und die Menge des unmarkierten, zu bestimmenden Antigens mittels einer Standardkurve (Eichkurve) bestimmt. Diese Eichkurven hat man zuvor durch analoges Vorgehen mit bekannten Konzentrationen an unmarkiertem Antigen gewonnen.

(3) Verfahren der konkurrenzierenden Reaktion : Setzt man eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens (das zu bestimmende Antigen) und eine gegebene Menge eines markierten Antigens konkurrenzierend mit einem entsprechenden, an eine feste Phase gebundenen Antikörper um, so binden sich das unmarkierte und das markierte Antigen nach Massgabe ihrer Mengenverhältnisse an den Antikörper, derart, dass die Menge des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens derjenigen des unmarkierten Antigens umgekehrt proportional ist. Danach trennt man die feste Phase von der flüssigen Phase ab, und die Aktivität des Markierungsmittels wird entweder in der festen oder in der flüssigen Phase gemessen. Aus den Messungen wird die Menge des zu bestimmenden Antigens auf Grund einer Eichkurve gewonnen, die man zuvor durch ähnliche Methoden mit der unmarkierten Substanz bei bekannten Konzentrationen aufgestellt hat.

(4) Immunometrische Verfahren : Setzt man eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens, nämlich des zu bestimmenden Antigens, mit einer bekannten Menge eines entsprechenden, markierten Antikörpers um und gibt dann das gleiche Antigen, aber an eine feste Phase gebunden, zu, so reagiert es mit unumgesetztem markiertem Antikörper, und der markierte Antikörper bindet sich an das Antigen an der festen Phase in einer Menge, die zur Menge des unmarkierten Antigens umgekehrt proportional ist. Danach trennt man die feste Phase von der flüssigen Phase, und nun wird die Aktivität des Markierungsmittels in der festen oder flüssigen Phase gemessen. Die Menge an unmarkiertem Antigen ergibt sich aus einer Eichkurve, die man mit den unmarkierten Substanzen unter bekannten Konzentrationen erhalten hat.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren und ein Reagens zur gleichzeitigen Messung der Gesamtmenge zweier oder mehrerer Substanzen, die zu bestimmen sind

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und in einer Probe vorliegen, unter Ausnutzung der vorstehend beschriebenen Grundlagen immunologischer Bestimmungsverfahren.

Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren kann mit Hilfe beliebiger üblicher immunologischer Analysenverfahren ausgeübt werden, bei denen eine Bindung eines Antikörpers oder Antigens an einen unlöslichen Träger im Spiele ist, beispielsweise die Blutagglutinierungsreaktion, die Ag-glutinations-Verhinderungs-Reaktion, die Verfahren konkurrenzierender Reaktionen, das Sandwich-Verfahren, die immunomelrische Methode usw.

Es soll nun das erfindungsgemässe Verfahren in den Grundzügen beschrieben werden, wobei zur Erläuterung die Agglutinationsreaktion und die Sandwich-Methode als Beispiele dienen sollen.

( 1 ) Agglutinationsreaktion : Soll eine Probe gemessen werden, in der die vier Substanzen A, B, C und D vermutet werden, so bindet man zunächst vier unterschiedliche Antikörper, die gegen die zu bestimmenden Substanzen gerichtet sind, nämlich den Anti-A-Antikörper, den Anti-B-Anti-körper, den Anti-C-Antikörper und den Anti-D-Antikörper, an den gleichen unlöslichen Träger, oder man bindet die Antikörper getrennt an unterschiedliche teilchenförmige unlösliche Träger. Dabei erhält man eine oder aber vier verschiedene Suspensionen unlöslicher teilchenförmigerTräger, die die vier Antikörper gebunden enthalten. Setzt man die Probe mit diesen Suspensionen um, binden sich die zu bestimmenden Substanzen A, B, C und D jeweils an ihre entsprechenden Antikörper an den Trägern, und es wird eine Agglutinierung der Trägerteilchen bewirkt. Durch Messung des Ausmasses der Agglutinierung kann man die Gesamtmenge der zwei oder mehreren zu bestimmenden Substanzen messen, die in der Untersuchungsprobe vorhanden waren.

(2) Sandwich-Methode: Soll eine Probe analysiert werden, in der die vier Substanzen A, B, C und D vermutet werden, so bindet man zunächst vier unterschiedliche Antikörper, die gegen die zu bestimmenden Substanzen gerichtet sind, nämlich den Anti-A-Antikörper, den Anti-B-Antikörper, den Anti-C-Antikörper und den Anti-D-Antikörper, an den gleichen unlöslichen Träger, oder man bindet sie getrennt an unterschiedliche unlösliche Träger. Man erhält einen oder aber vier verschiedene unlösliche Träger, die die vier Antikörper enthalten. Wird die Probe mit diesen unlöslichen Trägern umgesetzt, so binden sich die einzelnen zu bestimmenden Substanzen A, B, C und D jeweils an die entsprechenden Antikörper an den Trägern. Nach eventueller Abtrennung der festen Phase werden markierte Antikörper, die man durch Bindung eines Markierungsmittels an den Anti-A-Antikörper, Anti-B-Antikörper, Anti-C-Antikörper und Anti-D-Antikörper erhält, mit der festen Phase umgesetzt, wobei sich die jeweiligen markierten Antikörper mit den entsprechenden zu bestimmenden Substanzen verbinden. Dann wird die feste Phase abgetrennt und die Gesamtaktivität des an die feste Phase gebundenen Markierungsmittels gemessen. Auf diese Weise lässt sich die Gesamtmenge der zu bestimmenden vier Substanzen in einer einzigen Probe und zur gleichen Zeit bestimmen.

Ais unlöslicher teilchenförmigerTräger zur Ausführung der erfindungsgemässen Agglutinationsreaktion kann jeder der üblicherweise benutzten Träger verwendet werden. Es handelt sich beispielsweise um Bakterienzellen, rote Blutzellen usw., organische Polymerlatices wie Polystyrollatex, Latex von Polystyrolen mit eingebauten Carboxylgruppen, Latices von Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, Latices solcher Copolymere, die Hydroxyl oder Carboxylgruppen eingebaut enthalten, Poiyvinylalkohol-Latex, Polyacrylat-Latex, Vinylacetat-Acryl-Copolymer-Latex usw.;anorganische Substanzen wie Kieselerde, Russ, Tonerde usw. Diese Stoffe können für sich oder in Kombination verwendet werden.

Als unlösliche Träger für die Sandwich-Methode, das Verfahren mit konkurrenzierenden Reaktionen und die immu-nometrische Methode bei der Durchführung der Erfindung kommen die Träger in Frage, die üblicherweise schon verwendet werden, wie Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylharze, Polytetrafluorethylen, Papier, Glas, Agarose usw., und zwar für sich oder in Kombination. Die Form des Trägers kann der Methode angepasst sein, z.B. Kugeln, Stäbe, Scheiben oder aber Behälter wie optische Messzellen, Reagenzgläser usw. Andere Formen sind ebenfalls anwendbar.

Die in den erfindungsgemässen Bestimmungsverfahren verwendeten Antikörper können die normalen muliklonalen Antikörper sein. Die Verwendung monoklonaler Antikörper ergibt noch bessere Ergebnisse. Monoklonale Antikörper erhöhen beispielsweise die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmungen, verkürzen die Reaktionszeiten, verbessern die Spezifizität, vereinfachen die Analysenoperationen, gestatten den Ausschluss jeglicher unspezifischer Reaktionen und jeglicher Behinderungen von Reaktionen, die von anderen Komponenten der Probe wie Serum, Urin usw. herrühren können, u.a.m. Wenn monoklonale Antikörper bei der Agglutinierungsreaktion anzuwenden sind, so ist es erforderlich, in Kombination zwei oder mehrere monoklonale Antikörper entsprechend den unterschiedlichen Anti-genstellen einer der zu bestimmenden Substanzen einzusetzen, damit eine Agglutinierung eingeleitet wird.

Als Arbeitsverfahren zum Binden von einem oder mehreren Antikörpern oder Antigenen an unlöslicheTräger können beispielsweise die in Clinica Chimica Acta 48, 15 (1973); Journal of Immunology 116, 1554(1976) und Science 158, 1570 (1967) beschriebenen Methoden angewandt werden. Wenn zwei oder mehrere Antikörper an einen einzigen unlöslichen Träger zu binden sind, so bereitet man am besten zunächst eine Antikörper-Lösung durch Vermischen der zu bindenden Antikörper in den gewünschten Mengenverhältnissen. Als Beispiel sei eine Lösung genannt, die 0,5 mg/ml Anti-AFP-Antikörper, 0,1 mg/ml Anti-HCG-Antikörper und 0,25 mg/ml Anti-CEA-Antikörper in 0,05 M phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) vom pH 6,4 enthält. Diese Lösung wird dann in Berührung mit den unlöslichen Trägern gebracht, und man lässt die Reaktion bei 30 bis 56°C 2 bis 3 Stunden lang ablaufen. Nach der Umsetzung wäscht man die Träger mit physiologischer Salzlösung und erhält den gewünschten antikörpergebundenen Träger.

Will man einzeln den Anti-AFP-Antikörper, den Anti-HCG-Antikörper und den Anti-CEA-Antikörper an verschiedene unlösliche Träger binden, so löst man die einzelnen Antikörper getrennt in 0,05 M PBS vom pH 6,4 zu einer Konzentration von jeweils 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml, bringt die Lösungen dann einzeln in Berührung mit getrennten unlöslichen Trägern und lässt jedes Gemisch bei 30 bis 56°C 2 bis 3 Stunden lang reagieren. Nach der Reaktion werden die unlöslichen Träger dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen, und man erhält die einzelnen, mit Antikörper versehenen Träger.

Das M ischungsverhältnis der einzelnen so erhaltenen Antikörper wählt man in vorteilhafter Weise im Bereich ( 1 bis 10) : ( 1 bis 10) : ( 1 bis 10), obschonesje nach der Menge jedes Antikörpers, der an den unlöslichen Träger zu binden ist, und dem Titer des erhaltenen unlöslichen Antikörpers schwanken und auch andere Werte annehmen kann.

Die Menge jedes an unlösliche Träger zu bindenden Antikörpers beträgt bevorzugt jeweils 10 bis 0,05 mg/ml, insbesondere 5 bis 0,1 mg/ml, obschon sie je nach Art der zu

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bestimmenden Substanz, der Menge solcher Substanz in der Probe, dem Titer jedes Antikörpers usw. in praktisch beliebigen Grenzen schwanken kann.

Bei der Ausführung der Bestimmungen stellt man die optimalen Bedingungen durch einfachen Versuch fest, da die Menge der anzuwendenden Probe, die Menge jedes markierten Antikörpers oder markierten Antigens sowie die einzelnen Reaktionsbedingungen wie Reaktionszeit, Reaktionstemperatur usw. von der Art jeder zu bestimmenden Substanz, dem Titer jedes verwendeten Antikörpers, der Art des Markierungsmittels usw. abhängen.

Die Erzeugung des markierten Antikörpers und des markierten Antigens kann auf übliche Weise geschehen.

Wenn das erfindungsgemässe Verfahren nach der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen ausgeführt werden soll, so wird als markiertes Antigen ein solches verwendet, das sich an den insolubilisierten Antikörper in Konkurrenz mit der zu bestimmenden Substanz bindet, so dass im allgemeinen die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz als Antigen Verwendung findet. Es können jedoch die im menschlichen Körper vorkommenden physiologisch aktiven Substanzen an andere Körperkomponenten gebunden vorliegen oder einem partiellen Stoffwechsel unterliegen, und sie sind daher manchmal von analogen, ausserhalb des menschlichen Körpers vorliegenden Substanzen verschieden. In solchen Fällen kann demnach eine" Substanz, die praktisch die gleiche Reaktivität vom immunologischen Standpunkt aufweist, als mit der zu messenden Substanz identisch angesehen und eingesetzt werden.

Obschon es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, mindestens zwei Substanzen gleichzeitig zu bestimmen, ist es ebenfalls möglich, eine einzige Substanz mit Hilfe eines einzigen markierten Antikörpers zu bestimmen, auch wenn zwei oder mehrere insolubilisierte Antikörper verwendet werden, ausser wenn die zu bestimmenden Substanzen einander stören.

Als Markierungsmittel können Enzyme wie Peroxidase, ß-Galactosidase, Alkaliphosphatase, Glucoseoxidase usw., Radioisotope wie 125J,3H usw., Fluore wie Fluorescein-iso-thiocyanat, Tetramethylrhodamin-isothiocyanat usw. eingesetzt werden.

Bei der Agglutinierungsreaktion kann die Gesamtmenge der beiden oder mehreren zu bestimmenden Substanzen gleichzeitig gemessen werden, wenn man den Träger verwendet, der zwei oder mehrere Antikörper gebunden enthält und wie oben beschrieben erhältlich ist. Beim Sandwich-Verfahren und der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen kann die Gesamtmenge der beiden oder mehreren zu bestimmenden Substanzen gleichzeitig gemessen werden, wenn man zwei oder mehrere markierte Antigene oder Antikörper verwendet, die den zwei oder mehreren Antikörpern entsprechen, die wie oben beschrieben an unlösliche Träger gebunden wurden. Weiterhin ist sowohl nach der Sandwich-Methode als auch nach der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen die Bestimmung einer einzigen Substanz möglich, wenn man ein einziges markiertes Antigen oder einen einzigen markierten Antikörper verwendet. Beispielsweise gibt man eine geeignet verdünnte Probe in ein Reagenzglas, in dem ein Antikörper gebunden ist, und man lässt die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen. Nach deren Vervollständigung wird das Reagenzglas mit destilliertem Wasser gewaschen, ein markierter Antikörper wird zugegeben, und man lässt reagieren. Dann wird mit destilliertem Wasser gewaschen und die Aktivität des Markierungsmittels in der festen Phase, nämlich dem Reagenzglas, durch geeignete Mittel gemessen. Aus dem so erhaltenen Messwert kann man die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe berechnen, und zwar auf Grund der Eichkurve, die man durch analoge Arbeitsschritte mit Standardsubstanzen bekannter Konzentrationen erhalten hat. Im beschriebenen Fall kann die Standardsubstanz entweder ein einzelnes Antigen oder ein Gemisch mehrerer Antigene sein.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann man alle Substanzen bestimmen, die den üblichen immunologischen Bestimmungsmethoden zugänglich sind. Besonders wichtige Analysensubstanzen sind Tumormerkmal-Stoffe, die für die Früherkennung von Tumoren äusserst wichtig sind und auch die Beurteilung therapeutischer Wirkungen auf Tumoren gestatten.

Beispiele solcher Merkmalstoffe sind Carcinoembryo-Antigen (Abkürzung: CEA), a-Fetoprotein (AFP), Human-Chorio-Gonadotropin (HCG), ß2-Microglobulin (ß2m), basisches Fetoprotein (BFP), Alkaliphosphatase (ALP), y-Glut-amyltranspeptidase (y-GTP), schwangerschaftsassoziiertes ß2-Glycoprotein (SPi), schwangerschaftsassoziiertes cu-Gly-coprotein (SP3), immunosuppressives Säureprotein (IAP), immunosuppressives « 2-Macroglobulin, Säure-Isoferritin, Fibrinogen, Haptoglobin, Calcitonin, Steroidhormone, Polyamine, DNA-Bindungsproteine, ai-Antitrypsin, Pan-creas-Oncofetalantigen, Galactosyltransferase (GT-II) usw. sowie noch viele andere zurZeit untersuchte Substanzen. Weiterhin seien als Substanzen, die bei der Diagnose und Prophylaxe von Hepatitis bedeutsam sind, die durch Infektion mit Hepatitisviren nach Bluttransfusionen hervorgerufen wird, die Antigene von Hepatitis-B-Viren (HBs, HBc, HBe) und Antigene für Hepatitis-Viren ausser A- und B-Hepatitis zu nennen.

Beispiele für Kombinationen zweier oder mehrerer unterschiedlicher Substanzen, die zu bestimmen sind, umfassen ( 1 ) AFP, CEA, HCG ; (2) SP3, Fibrinogen ; (3) AFP, CEA, HCG, SP3, Fibrinogen;(4) Fibrinogen, Haptoglobin, Ferritin ; (5) Haptoglobin, ß2m, immunosuppressives ct2-Macro-globulin, ai-Antitrypsin ; (6) ALP, y-GTP, GT-1I;(7) Polyamine, Steroidhormone;(8) HBs, HBc, HBe usw.

Die Ausführung der vorliegenden Erfindung führt zu verkürzten Bestimmungszeiten. Bisher mussten, wenn eine Anzahl von Antigenen zu bestimmen war, auf übliche Weise die einzelnen Antigene getrennt und nacheinander bestimmt werden, wobei viel Zeit verbraucht wurde. Jetzt kann zudem die Probenmenge beträchtlich verringert werden.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht werden.

Beispiel I

Bestimmung der Gesamtmenge an Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin a) Herstellungeines Latex-Reagens mit gebundenem Antikörper

Man verdünnte Antifibrinogen-Antikörper (DAKO CO.), Antihaptoglobin-Antikörper (DAKO CO.) und Antiferritin-Antikörper(DAKO CO.) und mischte sie in 0.05 M phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung vom pH 6,4 (nachstehend als PBS abgekürzt). Die Mengen wurden so gewählt, dass sich Konzentrationen von 5 mg/ml, 1,8 mg/ml bzw. 0.7 mg/ml ergaben. Zu 2 ml der so erhaltenen Misch-Antikörper-Lösung wurde 0,5 ml einer 10%igen Polystyrol-latex-Suspension (gleichförmige Latexteilchen, Dow Chemical Co.) gegeben und das Ganze unter Rühren 2 Stunden lang bei 37°C umgesetzt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Gemisch abgekühlt (Eisbad), zentri-fugiert, mit PBS gewaschen und in PBS aufgeschlämmt, welches 1% Rinderserum-Albumin (Abkürzung: BSA) enthielt. Dies ist das Latex-Reagens mit gebundenen Antikörpern.

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b) Herstellung der Standardlösungen

Fibrinogen (Sigma Co.). Haptoglobin (Sigma Co.) und Ferritin (Sigma Co.) wurden einzeln mit PBS, enthaltend-1% BSA. auf eine Konzentrationsreihe von 120, 60, 30, 15 und 0 Lig/ml. 12. 6, 3, 1,5 und 0 |ig/ml bzw. 0,8, 0,4, 0,2, 0.1 und 0 Lig/ml verdünnt.

c) Bestimmungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin

Auf ein Glasplättchen brachte man 20 p.1 jeder der unter b) aufgeführten Lösungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin mit den angegebenen Konzentrationen. Dann wurden jeweils 50 (xl DER 1% BSA enthaltenden PBS sowie 20 ul des unter a) beschriebenen Reagens zugegeben. Man liess das Gemisch unter Rühren 3 Minuten reagieren, und dann wurde der Grad der Agglutination unter dem Mikroskop beobachtet. Eine Reaktion ohen Agglutination wurde als negativ (-) bewertet und Reaktionen mit Agglutination positiv( + , ++, + + +je nach Ausmass), dasergibt vier Stufen. Die Empfindlichkeit des Reagens gegenüber Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin betrug 15 ^g/ml, 1,5 H-g/ml bzw. 0.1 p.g/ml.

Beispiel 2

Bestimmungen in Serumproben von Patienten Unter Verwendung von Serumproben, die man von folgenden Personengruppen erhalten hatte: 18 Leberkrebspatienten, 20 Magenkrebspatienten, 20 Dickdarmkrebspatienten, 8 Lungenkrebspatienten, 25 Patienten mit verschiedenen benignen Geschwulsten und 20 gesunden Personen, wurden Bestimmungen nach dem erfindungsgemässen Verfahren ausgeführt. Die Arbeitsweisen bei den Bestimmungen waren analog denjenigen des Beispiels lc). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Krankheit bzw. Anzahl Bewertung positive Be-

Zustand Patienten - + ++ + + + Wertungen,0/»

Leberkrebs

18

1

2

9

6

94

Magenkrebs

20

3

4

8

5

85

Dickdarmkrebs

20

2

3

7

8

90

Lungenkrebs

8

0

2

4

2

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Benigne

Krankheiten

25

19

5

1

0

24

Gesunde Personen

20

18

2

0

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Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurde bei Krebspatienten eine hohe prozentuale positive Bewertung gefunden, was die Nützlichkeit des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens bei der Überwachung und Diagnose von Krebspatienten bzw. krebsverdächtigen Personen beweist.

Beispiel 3

Bestimmung der Gesamtmenge von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin a) Herstellung eines Latex mit gebundenem Antikörper gegen Fibrinogen

Man verdünnte Antifibrinogen-Antikörper (DAKO CO.) mit PBS auf eine Konzentration von 5 mg/ml. Zu 2 ml dieser Verdünnung wurde 0,5 ml einer 10%igen Latexsuspension (Polystyrol-Latex, Dow Chemical Co., mittlerer Teilchendurchmesser 0,48 |im) gegeben, das Gemisch gerührt und bei 37°C 2 Stunden reagieren gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Eisgekühlt,

zentrifugiert, mit PBS gewaschen und schliesslich in PBS enthaltend 1% BSA suspendiert.

b) Herstellung eines Latex mit gebundenem Antikörper gegen Haptoglobin

5 Man verdünnte Antihaptoglobin-Antikörper (DAKO CO.) mit PBS auf eine Konzentration von 1,8 mg/ml, und diese Verdünnung wurde analog Teil a) mit einer 10%igen Latexsuspension von Polystyrollatex zur Reaktion gebracht, wobei man den an Latex gebundenen Antihaptoglobin-Anti-10 körper erhielt.

c) Herstellung von Latex mit gebundenem Antikörper gegen Ferritin

Man verdünnte Antiferritin-Antikörper (DAKO CO.) mit 15 PBS auf eine Konzentration von 1,2 mg/ml, und diese Verdünnung wurde mit einer Suspension eines 10%igen Poly-styrol-Latex mit eingebauten Carboxylgruppen (Dow Chemical Co., mittlerer Teilchendurchmesser 0,25 jx) nach Art des Teils a) zur Erzeugung des an Latex gebundenen 20 Antiferritin-Antikörpers zur Reaktion gebracht.

d) Herstellung des an Latex gebundenen Antikörper-Reagens

Im Mengenverhältnis 2:5:1 vermischte man die gemäss Teilen a), b) und c) erhaltenen Suspensionen, nämlich den Antifibrinogen-Antikörper-Latex, den Antihaptoglobin-Antikörper-Latex und den Antiferritin-Antikörper-Latex. Man erhielt das gewünschte kombinierte Reagens.

e) Bestimmung von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin 30 Jeweils 20 jil der nach Beispiel lb) erhaltenen Standardlösungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin brachte man auf einen Objektträger, und zur Standardlösung auf dem Objektträger wurden je 50 ^.1 der 1% BSA enthaltenden PBS sowie 20 p.1 der Latexsuspension mit gebundenen Anti-

35 körpern, erhalten nach Abschnitt d) dieses Beispiels,

gegeben. Dieses Gemisch liess man durch Stehenlassen während 3 Minuten unter Rühren reagieren, und dann wurde das Ausmass der Agglutination unter dem Mikroskop beobachtet. Die Reaktionen ohne Agglutination wurden als 40 negativ ( — ) klassifiziert, während die Reaktionen mit Agglutination je nach Ausmass einfach ( + ), doppel (+ + ) oder dreifach positiv (+ + + ) bewertet wurden. Man wendete also eine vierstufige Bewertung an. Die Empfindlichkeit (Titer) des Reagens betrug nach diesen Messungen 15 ji.g/ml für 45 Fibrinogen, 1,5 |ig/ml für Haptoglobin und 0,1 (ig/ml für Ferritin.

Beispiel 4

Bestimmungen an Serumproben von Patienten

Mit dem Reagens gemäss Beispiel 3 wurden Serumproben so von 15 Patienten mit Leberkrebs, 20 Patienten mit Magenkrebs, 17 Patienten mit Dickdarmkrebs, 12 Patienten mit Lungenkrebs, 25 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 20 gesunde Personen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Krankheit,

Anzahl

Bewertung

positive

Zustand

Personen

-

+

++

++ +

Bewertung, %

Leberkrebs

15

l

2

7

5

93

Magenkrebs

20

3

4

8

5

85

Dickdarmkrebs

17

2

6

7

88

Lungenkrebs

12

1

2

6

3

92

Benigne

Krankheiten

25

20

4

1

0

20

Gesunde Personen

20

19

1

0

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Wie aus derTabelle 2 hervorgeht, ist den Krebspatienten eine sehr hohe positive Bewertung insgesamt zuzuordnen. Dadurch wird die Nützlichkeit der Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung eindrücklich nachgewiesen.

Beispiel 5

Herstellung von gereinigtem AFP und Anti-AFP-Antikörper a) Herstellung von gereinigtem AFP

Aus 5 1 Bauchhöhlenflüssigkeit von Leberkrebspatienten wurden durch Aussalzen mit Ammuniumsulfat 16,2 g rohes AFP-Extrakt gewonnen. Der rohe Extrakt wurde durch Affi-nitäts-Chromatographie unter Verwendung von 50 ml Sepha-rose 4B, die Antikörper gegen Kaninchen-AFP gebunden enthielt (1 mg Antikörper/ml Sepharose), gereinigt, wobei man 924 mg gereinigtes AFP erhielt.

b) Herstellung von monoklonalem Anti-AFP-Antikörper

50 ng des nach Abschnitt a) erhaltenen gereinigten AFP

wurden zusammen mit Freunds Komplettzusatz (FCA) einer weiblichen Maus BALB/c subkutan injiziert. Die Gaben wurden viermal im Abstand von je einer Woche wiederholt, und vierTage nach der letzten Verabreichung wurde die Milz isoliert und die Milzzellen gesammelt. Die Milzzellen wurden mit modifiziertem MEM-Milieu nach Dulbecco (D-MEM) gewaschen. 1 x I08 Zellen wurden gezählt und mit 1 x 107Mausmyelom-Zellen(P3-NSI/l-Ag 4-1) vermischt. Dann wurde in I ml D-MEM, enthaltend 42,5% Polyethy-lenglycol 1540 und 7,5% Dimethylsulfoxid, bei 37°C während einer Minute eine Zellfusion durchgeführt. Zu diesen Zellen wurde HAT-Milieu (RPMI-1640-Milieu, enthaltend Hypo-xanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% Rinderfoetus-serum) bis auf 20 ml gegeben. Jeweils 0,2 ml der Mischung wurde in einem 96teiligen Mikroplatten-Kulturapparat 2 Wochen lang kultiviert, wonach man die Antikörperaktivität im Uberstehenden der sich ausgebreiteten gesammelten Kulturen bestimmte.

Dann wurden die Zellen der einzelnen Gefässe, die Aktivität zeigten, gesammelt und zu 40 ml Milieu RPM1-1640 gegeben, welches 10% Rinderfoetusserum undThymuszellen von BALB/c-Mäusen enthielt. Diese Zellsuspension wurde auf zwei 96gefässige Mikroplattenapparate verteilt und eine Woche lang kultiviert, wodurch man 9 Klone eines Anti-AFP-Antikörper-produzierenden Hybridoms erhielt. Diese wurden in Grosskulturen überführt, und 1 Liter des Überstehenden jeder erhaltenen Kultur wurde einer Affinitätschromatographie mit 50 ml einer Sephadose 4B, die gebundenes gereinigtes AFP enthielt (0,5 mg AFP/ml Sephadose), unterzogen, und man erhielt 4,2 bis 11,6 mg monoklonale Antikörper. Die Antikörper wurden mit den Chargen-Nummern 1 bis 9 versehen.

c) Identifizierung von Antigen-Erkennungsstellen

1 ) Herstellung von Reagenzgläsern mit gebundenem Anti-AFP-Antikörper

Jeweils 1 ml PSB, enthaltend 0,5 mg eines der neun Chargen der erhaltenen monoklonalen Anti-AFP-Anti-körper, wurden in jeweils ein Reagenzröhrchen aus Polystyrol gegeben, welche zuvor mit PBS gewaschen worden waren, und jedes Röhrchen wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert, um die Bindung des Antikörpers an die Innenwandung des Reagenzröhrchens zu erleichtern. Nach der Reaktion wurden die Teströhrchen mit PBS gewaschen.

2) Herstellung von enzym-markiertem Anti-AFP-Anti-körper

5 mg Meerrettich-Peroxydase (Boehringer Mannheim AG), Nr. 1 (nachstehend als HRPO abgekürzt) wurden in 1 ml 0,3 M Natriumbicarbonatpuffer gelöst, und zu dieser Lösung wurde 0,1 ml einer l%igen Lösung von l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in Ethanol gegeben und die Mischung eine

Stunde lang reagieren gelassen. Dann wurde zum Gemisch 1,0 ml einer 0,06 M Natriumperjodatlösung gegeben, die Reaktion 30 Minuten lang ausgeführt, dann 1,0 ml einer 0,16 M Ethylenglykollösung zugegeben und die Reaktion 5 eine Stunde lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen eine 0,01 M Sosalösung vom pH 9,5 dialysiert. Zum Dialysat wurden je 5 mg der neun Chargen der monoklonalen Antikörper gemäss Abschnitt b) gegeben, und jedes Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang io umgesetzt. Dann wurden je 5 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Mischungen über Nacht stehen gelassen. Dann wurden die Reaktionsgemische gegen 0,01 M PBS vom pH 7,2 dialysiert. Man erhielt nun HRPO-markierte monoklonale Anti-AFP-Antikörper.

15 3) Identifizierung der Antigen-Erkennungsstellen

In jedes der mit Anti-AFP-Antikörper gebundenen Reagenzröhrchen, hergestellt nach Absatz 1), wurden 0.1 ml der mit PBS verdünnten Standardlösung gegeben, derart, dass jedes Röhrchen 100 ng/ml des nach Abschnitt a) erzeugten 20 AFP und 0,4 ml einer lOOfachen Verdünnung der mit HRPO markierten Anti-AFP-Antikörper, erhalten nach Absatz 2), enthielt. Dann wurde die Reaktion 30 Minuten lang ausgeführt. Nach deren Vervollständigung wurde jedes Röhrchen ausgewaschen und mit 0,5 ml einer Enzymsubstratlösung 25 befüllt, enthaltend 20 mg/dl o-Phenylendiamin und 6 mM Wasserstoffperoxid. Man liess 30 Minuten lang reagieren. Zum Stoppen der Enzymreaktion wurden 2 ml 1 N Salzsäure zugegeben, und es wurde die optische Absorption des Reak-tionsgemischs bei 492 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3o Tabelle 3 aufgeführt, wobei das Pluszeichen eine farberzeu-gende Kombination und das Minuszeichen eine Kombination ohne Farbbildung anzeigt.

35

Tabelle 3

HRPO-markierte Antikörper

3 4 5 6 7

40

1

—

+

—

+

—

+

ö

D-

V-

;Q

2

—

+

—

+

—

+

3

—

_

—

+

—

+

—

+

e

45

<

4

+

—

+

—

5

-

+

-

+

-

+

w

6

+

—

+

-

50

7

-

+

-

+

-

+■

+

o

C/2 g

8

+

-

+

-

9

+

55

60 Auf Grund der Differenz der Antigen-Erkennungsstellen wurden die 9 Chargen der monoklonalen Antikörper in drei Gruppen eingeteilt, nämlich eine erste Gruppe mit den Chargen 1,2,3, 5 und 7, eine zweite Gruppe mit der Charge 6, und die dritte Gruppe mit den Chargen 4,8 und 9. Diese 65 Gruppen wurden als Anti-AFP-Antikörper (A), (B) und (C) bezeichnet. Davon wird (A) als insolubilisierter Antikörper und (C) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet werden.

664 018

8

Beispiel 6

Herstellung von gereinigtem CEA und von Anti-CEA-Antikörper a) Herstellung von gereinigtem CEA

40 g Dickdarmkrebsgewebe wurden zerkleinert und nach Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser in einem Homogenisator homogenisiert. Zu dieser Suspension gab man ein gleiches Volumen 1,2 M Perchlorsäure, und das Gemisch wurde unter Rühren 30 Minuten lang extrahiert. Dann wurde zentrifugiert und die erhaltene Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei man einen rohen CEA-Extrakt erhielt.

Dieser rohe Extrakt wurde zu 10 ml aufkonzentriert und das Konzentrat an Sephadose 4B gelfiltriert, die mit PBS equilibriert war. Es wurde die erste Proteinfraktion gesammelt. Diese Fraktion wurde an Sephadex 200 auf ähnliche Weise equilibriert, erneut gelfiltriert, und es wurde die zweite Proteinfraktion gesammelt, die dann zu 2 ml eingeengt wurde, welche 135 mg gereinigtes CEA enthielten.

b) Herstellung von monoklonalem Anti-CEA-Antikörper

Aus dem in Abschnitt a) erhaltenen gereinigten CEA

wurden nach Verfahrensweisen analog Beispiel 5b) acht Klone eines Anti-CEA-Antikörper erzeugenden Hybridoms erhalten. Zur Immunisierung der Mäuse wurden bei jeder Verabreichung 30 (ig des gereinigten CEA verwendet.

Einer weiblichen Maus BALB/c wurden 1 x 106 Hybridom-Zellen intraperitoneal injiziert. Die Maus hatte 0,5 ml Pri-stan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Wako Pure Chemicals Co. Ltd) intraperitoneal erhalten. Nach zwei Wochen wurde die Bauchhöhlenflüssigkeit abgezogen und an DEAE-Cellulose Chromatographien, die mit 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht war, und man erhielt in der nichtadsorbierten Fraktion einen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper. Nach dem Ergebnis des Identifizierungsversuchs der Antigen-Erkennungsstellen gemäss der Methode des Beispiels 5b) wurden die Antikörper in 3 Gruppen (5 Chargen, 2 Chargen, 1 Charge) eingeteilt, nämlich Anti-CEA-Antikörper (A), (B) und (C). Davon wird Antikörper (A) als insolubilisierter Antikörper und Antikörper (B) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet.

Beispiel 7

Herstellung von HCG-ß und Anti-HCG-ß-Antikörper a) Herstellung der HCG-ß-Untereinheit

Diese Untereinheit wird im folgenden als HCG-b bezeichnet.

In 2 ml 0,025 M Phosphatpuffer pH 5,6 wurde 1 g HCG (2000 IE/mg)gelöst und an 3 g DEAE-Sephadex A-50, ausgeglichen mit dem gleichen Puffer, Chromatographien. Die mit 0,05 M Phosphatpuffer pH 5,6 eluierte Fraktion wurde gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Man erhielt 308 mg gereinigtes HCG, das dann gefriergetrocknet wurde. 300 mg dieser Substanz wurden in 10 ml 10 M Harnstoff (pH 4,5) gelöst und bei 40°C eine Stunde lang umgesetzt, wonach an 2 g DEAE-Sephadex A-50, ausgeglichen mit einer Lösung enthaltend 0,03 M Glycin und 10 M Harnstoff, Chromatographien wurde. Die mit einer Lösung, enthaltend 0,2 M Glycin, 1 M NaCl und 8 M Harnstoff, eluierte Fraktion wurde gegen PBS dialysiert, und man erhielt 147 mg der Beta-Untereinheit (HCG-b).

b) Herstellung des Anti-HCG-b-Antikörpers

Elf Chargen eines Anti-HCG-b-Antikörper produzierenden Hybridoms wurden aus der HCG-b-Untereinheit, erhalten nach obenstehendem Abschnitt a), nach Arbeitsweisen analog Beispiel 5b) gewonnen. An den Antikörpern, die man aus diesen Chargen erhielt, wurde die Identifizierung von Antigen-Erkennungsstellen nach der Verfahrensweise des Beispiels 5c) vorgenommen, und man konnte in zwei Gruppen (A) (8 Chargen) und (B) (2 Chargen) einteilen. Davon wird der Anti-HCG-b-Antikörper (A) als insolubilisierter Antikörper und die Gruppe (B) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet werden. Bei der Prüfung dieser Antikörper auf Gegenreaktion mit Lutei-nisierungshormon (LH) unter Anwendung der obigen Kombination wurde die Reaktionsfähigkeit zu weniger als 1% bestimmt, wenn die Reaktionsfähigkeit des HCG mit 100% angesetzt wird.

Beispiel 8

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG

a) Herstellung von Reagenzröhrchen mit gebundenem Antikörper

In Reagenzröhrchen aus Polystyrol gab man 1 ml der Lösung, enthaltend 0,1 mg/ml an monoklonalem Anti-AFP-Antikörper, 0,5 mg/ml monoklonalen Anti-CEA-Antikörper und 0,25 mg/ml monoklonalen Anti-HCG-Antikörper, hergestellt in den Beispielen 3,6 bzw. 7, und jedes Röhrchen wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Vervollständigung der Inkubation wurde jedes Röhrchen mit PBS gewaschen, und auf diese Weise stellte man die Reagenzröhrchen her, die Antikörper gebunden enthalten.

b) Herstellung der Standardlösungen

Das AFP nach Beispiel 5a), das CEA nach Beispiel 6a) und HCG (HCG Mochida; Mochida Pharmaceutical) wurden mit PBS enthaltend 1% BSA zu Lösungen mit den Konzentrationen 80,40,20, 10, 5 und 0 ng/ml; 80,40,20, 10,5 und 0 ng/ml und 80,40, 20, 10, 5 und 0 miu/ml verdünnt.

c) Bestimmung von AFP, CEA und HCG In die Reagenzröhrchen gemäss obenstehendem Absatz a) wurden Anteile von 0,1 ml der Standardlösungen von AFP, CEA und HCG mit den einzelnen Konzentrationen gegeben, wonach noch 0,4 ml PBS, enthaltend 1% BSA, zugegeben wurde. Jede Reaktion wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ausgeführt. Nach Vervollständigung wurden die Röhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die enzym-markierten Antikörper, hergestellt nach Beispielen 5, 6 und 7, wurden für sich verdünnt und in PBS enthaltend 1% BSA unter Bildung einer Lösung mit 2000facher Verdünnung des enzym-markierten Anti-AFP-Antikörpers, 800facher Verdünnung des enzym-markierten Anti-CEA-Antikörpers und 500facher Verdünnung des enzym-mar-kierten Anti-HCG-Antikörpers vermischt. Anteile von je 0,5 ml dieser Mischung wurden in die oben beschriebenen Röhrchen gegeben, und jede Reaktion liess man bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ablaufen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Röhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen, Anteile von 0,5 ml einer Substratlösung (6 mM/1 Wasserstoffperoxid und 20 mM/1 o-Phenylen-diamin in PBS) zugefügt und jede Reaktion bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang unter Lichtausschluss durchgeführt. Zum Abbruch der Reaktion wurden dann 2 ml 1 N Salzsäure zugegeben und die Lichtabsorption der Proben bei 492 nm gemessen. Zu Vergleichszwecken wurden dieselben Bestimmungen mit getrennten Antikörpern ausgeführt, die markiert waren. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 1 bis 4 dargestellt. Die Kombinationen von insolubilisierten Antikörpern und den markierten Antikörpern, deren Resultate in den Figuren dargestellt sind, finden sich in Tabelle 4 zusammengestellt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabelle 4

9

664018

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Insolubilisierter Antikörper Markierter Antikörper

Fig. 1 Anti-AFP-Antikörper,

Anti-CEA-Antikörper und

Anti-HCG-Antikörper im Gemisch

Fig. 2 Anti-AFP-Antikörper, Anti-AFP-Antikörper Anti-CEA-Antikörper und allein Anti-HCG-Antikörper im Gemisch

Fig. 3 Anti-CEA-Antikörper allein

Fig. 4 Anti-HCG-Antikörper allein

Aus den Ergebnissen, die in den Figuren dargestellt sind, geht hervor, dass AFP, CEA und HCG einzeln gemessen werden können, da sie nicht miteinander reagieren, wenn man die entsprechenden, markierten Antikörper einsetzt, auch wenn diese Substanzen in Mischung vorliegen, und dass nur die einzelnen einander entsprechenden Antigene und Antikörper miteinander reagieren, auch wenn man die markierten Antikörper als Gemisch anwendet, und dass die Reaktionsfähigkeiten durch die Anwesenheit von Fremd-. Stoffen nicht beeinflusst werden.

Beispiel 9

Bestimmungen an Senunproben von Patienten Serumproben, entnommen von 10 Leberkrebs-Patienten, 10 Magenkrebs-Patienten, 10 Dickdarmkrebs-Patienten, 10 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 10 gesunden Personen, wurden nach vorliegendem Verfahren auf die Gesamtmengen an AFP, CEA und HCG untersucht. Jede Bestimmung wurde entweder mit 0.1 ml Standardlösung oder 0,1 ml Serum nach der Arbeitsweise des Beispiels 8c) ausgeführt. Die Ergebnisse sind durch die Werte der direkten Absorption bei 492 nm und ausserdem durch einen auf CEA bezogenen Wert ausgedrückt, den man durch versuchsmäs-sige Übertragung des Absorptionswertes auf die CEA-Eich-kurve erhält. Zum weiteren Vergleich wurden AFP, CEA und HCG einzeln an den gleichen Proben bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 5.

Tabelle 5

Krankheit

Erfindung

Vergleich

Absorption

CEA-bezo-

AFP

CEA

HCG

492 nm gener Wert ng/ml ng/ml miu/ml

ng/ml

Leberkrebs

0,570

20,0

20,1

2,1

2,0

0,392

10,7

10,5

5,8

1,8

1,608

85,2

101,8

1,1

3,1

0,231

4,0

2,3

2,2

2,0

3,205

147,5

158,7

0,8

2,0

0,261

5,3

0,2

0,3

4,4

1,758

99,7

60,1

51,1

3,5

0,431

10,2

12,3

1,2

2,7

0,818

32,0

33,9

0,8

1,3

0,211

57,1

63,2

0,5

1,5

Magen

0,473

15,0

4,0

8,8

4,1

krebs

0,915

27,5

1,7

0,7

30,1

0,731

28,8

1,5

1,3

30,8

Krankheit

Erfindung

Vergleich

Absorption

CEA-bezo-

AFP

CEA

HCG

492 nm gener Wert ng/ml ng/ml miu/ml

ng/ml

0,321

7,1

3,1

4,1

0,9

0,492

19,8

1,1

1,7

21,1

0,501

16,8

1,0

17,2

0,8

0,481

18,1

16,3

0,3

4,1

0,336

8,1

4,4

1,1

3,1

0,270

5,1

1,0

2,2

3,7

0,260

4,7

2,0

1,0

4,0

Dickdarm

0,788

4,4

3,2

0,8

2,1

krebs

3,109

138,5

1,5

152,1

2,1

1,121

50,3

4,0

50,5

3,3

0,228

3,8

1,0

2,8

0,9

0,388

10,1

1,5

11,1

0,8

0,470

14,8

1,2

13,0

3,2

0,323

6,9

8,8

0,7

1,4

0,450

13,9

10,3

6,1

1,5

2,712

119,3

138,1

1,5

1,8

0,620

20,9

2,5

21,8

2,0

Benigne

0,231

4,0

1,3

0,3

3,0

Syndrome

0,219

3,8

1,3

0,2

1,9

0,320

6,9

3,1

3,2

2,2

0,301

6,0

2,1

3,1

2,5

0,371

9,8

2,2

6,1

1,1

0,333

8,5

2,5

1,8

3,5

0,261

4,9

0,8

2,1

3,3

0,321

7,1

2,9

2,2

0,271

5,1

0,8

3,1

2,8

0,270

5,1

4,1

0,9

1,0

Gesundes

0,230

4,0

1,1

1,2

2,2

Indi

0,241

4,2

1,2

1,3

2,2

viduum

0,281

5,3

3,1

1,5

3,2

0,267

4,8

0,7

1,5

3,8

0,259

4,7

0,7

2,8

3,3

0,268

4,8

2,0

2,1

2,0

0,221

3,7

1,1

1,5

1,8

0,260

4,7

0,8

3,1

1,7

0,253

4,5

0,7

2,1

0,231

4,0

0,7

0,9

2,1

Die untenstehende Tabelle 6 zeigt die prozentuale positive Beurteilung von Patienten mit den jeweiligen Krankheiten, die man durch Bestimmung von Einzelmerkmalen erhält unter der Annahme, dass die diagnostischen Standardwerte für ein vermutetes Auftreten von Krebs 10 ng/ml oder darüber für AFP, 5 ng/ml oder darüber für CEA und mindestens 5 miu/ml für HCG betragen. Tabelle 6 gibt ebenfalls die prozentualen positiven Ergebnisse an, die man an den gleichen Proben der gleichen Patienten erhält, wenn man in Tabelle 5 eine Absorption von 0,350 und darüber bzw. einen CEA-bezogenen Wert von 8,5 ng/ml und darüber als krebsanzeigend ansieht.

Tabelle 6

Krankheit Erfin- AFP CEA HCG Eine oder mehrere bzw. Zustand dung Merkmalsubstanzen

% % % % %

Leberkrebs 80 80 20 0 80 Magenkrebs 60 10 20 30 60

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

664 018

10

Tabelle 6 (Fortsetzung)

Krankheit

Erfin

AFP

CEA

HCG

Eine oder mehrere bzw. Zustand dung

Merkmalsubstanzen

%

Dickdarmkrebs 60

10

60

0

60

Benigne

10

0

10

0

10

Krankheiten

Gesunde

0

Personen

Wenn man weiterhin die prozentualen positiven Befunde bei den Patienten mit den genannten Krankheiten unter der Annahme berechnet, dass ein Patient krebspositiv ist, wenn mindestens eine der drei separat bestimmten Tumormerkmal-Substanzen für sich den minimalen Standardwert übersteigt, sind die prozentualen positiven Befunde gemäss der letzten Spalte obiger Tabelle 6 identisch mit den Werten, die man bei gemeinsamer Bestimmung erhält (zweite Spalte in Tabelle 6). Dies bedeutet, dass man bei der Krebsdiagnose nicht notwendigerweise die Tumormerkmalsubstanzen einzeln messen muss, sondern dass eine verlässliche Diagnose von der Gesamtbestimmung abgeleitet werden kann.

Beispiel 10

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA lind HCG

a) Herstellung des Reagens: an Polystyrolperlen gebundener Antikörper

Die nach den Beispielen 5, 6 und 7 erzeugten monoklonalen Anti-AFP-Antikörper, Anti-CEA-Antikörper und Anti-HCG-Antikörper wurden auf Konzentrationen von 1,0, 0,8 und 0,5 mg/ml verdünnt. In jede Lösung wurden Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 2,5 mm eingetaucht, und man beliess die Perlen 3 Stunden bei 37°C in jeder Lösung. Nach der Reaktion wurden die Perlen mit PBS gewaschen. Jede Reagenziengruppe bestand aus 3 Perlen, deren jede einen anderen Antikörper gebunden enthielt.

b) Bestimmung von AFP, CEA und HCG

In Reagenzgläser 10x60 mm gab man Anteile von je 0,1 ml der Standardlösungen von AFP, CEA und HCG, mit den einzelnen Konzentrationen, die man gemäss Beispiel 8b) erhalten hatte, dann jeweils 0,4 ml PBS enthaltend 1 % BSA, und eine Gruppe des Reagens, bestehend aus drei Polystyrolperlen mit den daran gebundenen unterschiedlichen Antikörpern. Nach Rühren liess man die Umsetzung bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ablaufen. Danach wurden die Polystyrolperlen mit destilliertem Wasser abgewaschen.

Die enzym-markierten Antikörper, hergestellt nach Beispielen 5, 6 und 7, wurden separat verdünnt und in PBS, enthaltend 1% BSA, vermischt, derart, dass man eine Mischlösung mit folgenden Verdünnungen erhielt: 2500fache Verdünnung des enzym-markierten Anti-AFP-Antikörpers; lOOOfache Verdünnung des markierten Anti-CEA-Antikör-pers und 650fache Verdünnung des markierten Anti-HCG-Antikörpers. Zu den oben beschriebenen Polystyrolperlen wurden Anteile von 0,5 ml der Mischlösung gegeben und jede Reaktion bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ausgeführt. Danach wurden die Polystyrolperlen mit destilliertem Wasser abgewaschen, Anteile von 0,5 ml der Substratlösung (6 mM/1 Wasserstoffperoxid und 20 mM/1 o-Phenylen-diamin in PBS) zugegeben und jede Mischung bei Zimmertemperatur unter Lichtabschluss 30 Minuten lang stehen gelassen. Zum Reaktionsabbruch wurden 2 ml 1 N-HC1 zugefügt. Dann wurde die Absorption bei einer Lichtwellenlänge von 492 nm gemessen. Zu Vergleichszwecken wurden die gleichen Reaktionen mit den einzelnen markierten Antikörpern separat, also unvermischt, ausgeführt. Die Ergebnisse finden sich graphisch dargestellt in Fig. 5 bis 8. Die verwendeten Kombinationen aus insolubilisiertem Antikörper und markiertem Antikörper sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Insolubilis. Antikörper

Markierter Antikörper

Fig. 5

Drei Perlen gemeinsam (Perle mit Anti-AFP-AK, Perle mit Anti-CEA-AK und

Perle mit Anti-HCG-AK)

Anti-AFP-Antikörper, Anti-CEA-Antikörper und

Anti-HCG-Antikörper (Gemisch)

Fig. 6

Anti-AFP-Antikörper

Fig. 7

Anti-CEA-Antikörper

Fig. 8

Anti-HCG-Antikörper

Aus diesen Ergebnissen kann man ähnlich wie in Beispiel 8 entnehmen, dass AFP, CEA und HCG wegen des Fehlens gegenseitiger Reaktivitäten separat bestimmt werden können, wenn man die entsprechenden, markierten Antikörper verwendet, auch wenn diese Substanzen in Mischung vorliegen, und dass nur die sich entsprechenden Antigene und Antikörper miteinander reagieren, auch wenn die markierten Antikörper im Gemisch eingesetzt werden;auch wird die Reaktionsfähigkeit durch die Anwesenheit von Fremdsubstanzen nicht beeinflusst.

Beispiel 11

Bestimmungen an Serumproben von Patienten Serumproben von 10 Leberkrebs-Patienten, 10 Magenkrebs-Patienten, 10 Dickdarmkrebs-Patienten, 10 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 10 gesunden Personen wurden auf die Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG untersucht. Für jede Bestimmung wurde 0,1 ml der Standardlösung oder des Serums angewendet, die Arbeitsweise war diejenige des Beispiels 8c). Die Ergebnisse sind als unmittelbare Ablesungen der Absorptionswerte bei 492 nm und ausserdem als CEA-bezogene Werte ausgedrückt, die man durch versuchsweise Übertragung der Messwerte auf die CEA-Eichkurve erhält. Zum Vergleich wurden AFP, CEA und HCG an den gleichen Proben separat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst.

Tabelle 8

Krankheit Erfindung

Vergleich

Absorption

CEA-bezo-

AFP

CEA

HCG

492 nm gener Wert ng/ml ng/ml miu/ml

ng/ml

Leberkrebs 1,55<

80 <

320,5

9,6

1,2

1,55<

80<

173,6

3,0

1,4

0,221

5,6

4,0

0,6

1,4

0,186

58,1

57,3

0,3

3,0

0,518

21,6

13,8

7,2

1,6

0,197

4,3

1,4

0,3

2,3

1,547

79,8

82,1

1,1

1,2

0,374

13,9

11,8

0,3

2,6

0,473

19,2

20,5

0,5

1,5

1,368

68,8

73,0

2,3

1,2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

664018

Tabelle 8 (Fortsetzung)

Krankheit

Erfindung

Vergleich

Absorption

CEA-bezo-

AFP

CEA

HCG

492 nm gener Wert ng/ml ng/ml miu/ml

ng/ml

Magen

0,175

3,1

1,6

0,3

1,6

krebs

0,582

25,0

4,9

0,6

20,3

0,207

4,8

2,7

1,4

1,2

0,313

10,6

3,3

7,2

1,8

0,481

19,6

5,2

0,3

15,9

0,475

19,3

17,1

0,7

2,2

0,238

6,5

1,1

2,4

1,3

0,207

4,8

2,3

1,1

1,6

0,322

11,1

4,9

5,2

1,5

0,339

12,0

3,5

0,2

8,1

Dickdarm

0,582

25,0

13,0

12,2

1,4

krebs

0,245

6,9

4,5

0,6

1,6

0,864

40,2

8,0

32,2

3,0

0,785

35,9

1,6

35,0

1,1

0,516

21,5

4,6

17,7

1,2

0,249

7,1

1,2

4,0

2,0

0,192

4,0

1,5

1,3

1,7

0,269

8,2

7,0

0,4

1,1

0,339

12,0

2,6

5,9

4,2

1,110

53,8

3,3

54,1

1,6

Benigne

0,232

6,2

5,2

0,2

1,0

Syndrome

0,265

8,0

7,3

0,4

1,1

0,230

6,1

2,3

0,8

3,0

0,249

7,1

3,4

1,4

2,5

0,177

3,2

1,7

0,3

1,9

0,247

7,0

1,9

4,0

1,2

0,484

19,8

4,2

12,4

3,8

0,245

6,9

2,2

0,7

4,0

0,216

5,3

3,8

1,4

1,1

0,203

4,6

2,8

1,8

1,2

Gesundes

0,155

2,0

1,2

0,2

1,0

Indi

0,165

2,5

2,0

0,2

1,0

viduum

0,168

2,7

1,8

0,3

1,2

0,157

2,1

1,4

0,5

0,7

0,161

2,3

1,0

0,3

1,0

0,192

4,0

2,1

0,2

2,0

0,181

3,4

1,0

1,6

1,3

0,155

2,0

0,8

0,3

1,0

0,157

2,1

0,8

0,4

1,4

0,155

2,0

0,6

0,3

1,4

Die nachstehende Tabelle 9 zeigt die prozentuale positive Beurteilung von Patienten mit den jeweiligen Krankheiten bzw. Zuständen, die man durch Bestimmung von Einzelmerkmalen erhält, unter der Annahme, dass die diagnostischen Standardwerte für ein vermutetes Auftreten von Krebs mindestens 10 ng/ml für AFP, mindestens 5 ng/ml für CEA und mindestens 5 miu/11 für HCG betragen. Tabelle 9 gibt ebenfalls die prozentualen positiven Befunde an, die man erhält, wenn man in Tabelle 8 bei der Bestimmung der Gesamtmenge der drei Substanzen nach der Erfindung eine Absorption von 0,350 bei 492 nm oder einen auf CEA bezogenen Wert von 8,5 ng/ml und darüber als krebsanzeigend ansieht.

Tabelle 9

%

Leberkrebs

80

20

0

80

Magenkrebs

60

10

20

30

60

Dickdarmkrebs

60

10

60

0

60

Benigne

10

0

10

0

10

Krankheiten

Gesundie

0

Personen

Wenn man weiterhin die prozentualen positiven Befunde bei den Patienten mit den genannten Krankheiten unter der Annahme berechnet, dass ein Patient krebspositiv ist, wenn mindestens eine der drei separat bestimmten Tumor-merkmal-Substanzen für sich den minimalen Standardwert übersteigt, so sind die prozentualen positiven Befunde gemäss der letzten Spalte der Tabelle 9 den Werten gleich, die man bei gemeinsamer Bestimmung erhält (zweite Spalte in Tabelle 9). Dies bedeutet, dass man bei der Krebsdiagnose die Tumormerkmal-Substanzen nicht separat zu messen braucht, sondern dass eine verlässliche Diagnose von der Gesamtbestimmung abgeleitet werden kann.

Beispiel 12

Bestimmung der Gesamtmenge an Fibrinogen und SPs a) Herstellung des Reagens: An Sepharose 4B gebundener Antikörper

Antifibrinogen-Antikörper und Anti-SP3-Antikörper (beide DAKO CO.) wurden jeweils mit 0,1 M Natriumbicar-bonatpuffer pH 8,3 auf Konzentrationen von 5 bzw. 3 mg/ml verdünnt. Zu Anteilen von je 0,5 ml dieser Verdünnungen wurden Anteile von 5 ml Sepharose 4B gegeben, die mit CNBr aktiviert war (Pharmacia Co.), und man liess bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang reagieren. Danach wurde mit 0,1 M Acetatpuffer, enthaltend 0,5 M NaCl, und dann mit PBS gewaschen. Man erhält an Sepharose 4B gebundenen Antifibrinogen-Antikörper und Anti-SP3-Antikörper. Die beiden Stoffe vermischte man im Verhältnis 1:1:

b) Herstellung von Fibrinogen-Standardlösungen

Fibrinogen (Sigma Co.) wurde mit PBS, enthaltend 1%

BSA, zu Standardlösungen mit 80,40,20, 10,5 und 0 ug/ml verdünnt.

c) Herstellung von SP3-Standardlösungen

Nach der Methode von Hans Bohn u. Mitarb. (Blut Band 33,377-378, 1976) wurden 5 kg Placenta mit PBS extrahiert, unter Verwendung von Rivanol und Ammoniumsulfat fraktioniert und mit 50 ml Sepharose 4B mit daran gebundenem Anti-SP3-Antikörper(l mg Antikörper/ml Sepharose) durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Man erhielt 3,7 mg gereinigtes SP3. Diese Substanz wurde mit PBS, enthaltend 1% BSA, zu Standardlösungen mit 80,40,20, 10, 5 und 0 ug/ml verdünnt.

d) Herstellung von enzym-markiertem Antifibrinogen-Antikörper und enzym-markiertem Anti-SP3-Antikörper

Derenzym-markierte Antifibrinogen-Antikörper und der enzym-markierte Anti-SP3-Antikörper wurde, ausgehend von den unmarkierten Antikörpern, nach der Vorschrift des Beispiels 5c) 2) hergestellt.

e) Bestimmung von Fibrinogen und SP3

In separate Reagenzröhrchen wurden 0,1 ml der Fibrinogen- oder SP3-Standardlösung mit den jeweiligen Konzen5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

664 018

12

trationen (erhalten nach Abschnitt b) bzw. c) dieses Beispiels) sowie 0,4 ml PBS, enthaltend 1% BSA, und 0,2 ml des nach Abschnitt a) dieses Beispiels hergestellten Reagens gegeben. Nach Umrühren liess man bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen. Dann wurde der Inhalt jedes Röhr- s chens zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die nach Abschnitt d) hergestellten enzym-markierten Antikörper wurden nach Verdünnung so vermischt, dass die Mischlösung eine 1500fache Verdünnung des enzym-markierten Antifibrinogen-Antikörpers und eine lOOOfache Ver- io dünnung des markierten Anti-SP3-Antikörpers darstellte. Anteile von 0,5 ml der Lösung wurden in die oben genannten Röhrchen gegeben, und man liess bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen. Danach wurde der Inhalt der Röhrchen zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewa- is sehen. Nach Zugabe von 0,5 ml der Substratlösung (6 mM/1 H:0: und 20 mM/1 o-Phenylendiamin in PBS) wurde jedes Gemisch bei Zimmertemperatur unter Lichtabschluss umgesetzt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml 1 N HCl abgebrochen. Die Absorption der Proben 20 wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt.

Beispiel 13

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG 25 a) Herstellung der Standardlösungen Das in Beispiel 5a) hergestellte AFP, das in Beispiel 6a) erhaltene CEA und das HCG (Mochida) wurden mit PBS, enthaltend l°/o BSA, zu Lösungen mit 80 ng/ml, 80 ng/mi bzw. 80 miu/ml verarbeitet, und diese Lösungen wurden in 30

verschiedenen Verhältnissen vermischt (Tabelle 10), wobei man 5 verschiedene Mischlösungen erhielt.

Tabelle 10

Nr. Mischlösung

AFP

CEA

HCG

1

l l

2

5

1

3

1

5

1

4

1

5

3

2

1

Jede der fünf Lösungen der Tabelle 10 wurde dann zweifach, vierfach und achtfach mit PBS, enthaltend 1% BSA, zu Standardlösungen verdünnt.

b) Bestimmung von AFP, CEA und HCG Unter Anwendung von Anteilen von je 0,1 ml der gemäss Abschnitt a) erhaltenen Standardlösungen und der Mischungen der drei unterschiedlichen markierten Antikörper wurden die Bestimmungen nach der Vorschrift des Beispiels 8c) durchgeführt. Die diesbezüglichen Eichkurven sind in Fig. 10 dargestellt. Selbst wenn man die Standardlösungen des AFP, CEA und HCG in Mischung einsetzt, erhält man Eichkurven ähnlich Fig. 1. Dies weist darauf hin, dass AFP, CEA und HCG einzeln bestimmt werden können, auch wenn sie miteinander vermischt vorliegen. Daher kann die Gesamtmenge als Messwert des erfindungsgemässen Verfahrens bestimmt werden.

B

5 Blatt Zeichnungen

Claims

664 018

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Immunologisches Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Gesamtmenge zweier oder mehrer Substanzen in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe, die zwei oder mehrere zu bestimmende Substanzen enthält, gleichzeitig mit zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörpern oder Antigenen umsetzt und die genannten Substanzen auf Grund einer immunologischen Reaktion misst, die zwischen den genannten Substanzen und den zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörpern oder Antigenen auftritt.
2. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörper oder Antigene gemeinsam an einen unlöslichen Träger gebunden sind.
3. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörper oder Antigene jeweils für sich an getrennte unlöslicheTrägergebunden sind.
4. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der unlöslicheTräger rote Blutkörperchen, ein Polymerlatex, Russ oder die Innenwandung eines Reaktionsgefässes ist.
5. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der unlöslicheTräger rote Blutkörperchen, ein Polymerlatex oder Russ ist.
6. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte immunologische Reaktion eine Agglutinationsreaktion oder eine Ag-glutinationsverhinderungs-Reaktion ist.
7. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren eine enzy-matische Immunoanalyse, eine Radio-lmmunoanalyseoder eine Fluoro-Immunoanalyse ist.
8. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es im übrigen ein Sandwich-Verfahren, ein Konkurrenzreaktions-Verfahren oder ein immunometri-sches Verfahren ist.
9. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Antikörper solche sind, die gegen Tumormerkmal-Sub-stanzen gerichtet sind.
10. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper monoklonale Antikörper sind.
11. Reagens zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens nach Anspruch l, das zur Umsetzung mit einer Probe befähigt ist, die zwei oder mehrere durch eine immunologische Reaktion zu bestimmende Substanzen enthält,

dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gemisch aus mindestens zwei insolubilisierten Antikörpern oder insolubilisierten Antigenen enthält oder daraus besteht.
12. Reagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörper oder insolubilisierten Antigene zusammen an einen gemeinsamen unlöslichen Träger gebunden sind.
13. Reagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten zwei oder mehreren insolubilisierten Antikörper oder insolubilisierten Antigene jeweils an getrennte unlöslicheTräger gebunden sind.
14. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als unlöslicherTräger rote Blutkörperchen, hochmolekularer Latex, Russ oder die Innenwandung eines Reaktionsgefässes vorliegt.
15. Reagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als unlöslicherTräger rote Blutkörperchen, ein Polymerlatex oder Russ vorliegt.
16. Reagens nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Lage ist, an einer Agglutina-tions-Reaktion oder einer Agglutinationsverhinderungs-Reaktion teilzunehmen.
17. Reagens nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Verwendung in einem immunologischen Bestimmungsverfahren ausgebildet ist, nämlich Enzym-Immunoanalyse, Radio-lmmunoanalyse oder Fluor-Immunoanalyse.
18. Reagens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Bestimmungsverfahren im übrigen ein Sandwich-Verfahren, ein Konkurrenzreaktions-Verfahren oder ein immunometrisches Verfahren ist.
19. Reagens nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Antikörper solche sind, die gegen Tumormerkmalsubstanzen gerichtet sind.
20. Reagens nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Antikörper monoklonale Antikörper sind.