CH664495A5

CH664495A5 - Pharmazeutische formulierung.

Info

Publication number: CH664495A5
Application number: CH2127/86A
Authority: CH
Inventors: Michael Denis Johnston; Henry Berger
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1988-03-15
Also published as: GR861365B; US5112609A; GB2176703B; DK163174C; DK163174B; IL78937A0; FR2593393B1; BE904831A; FI85334C; ATA141186A; IT8648064A0; DK246886D0; PT82647A; AU5796586A; PT82647B; FI85334B; ES8706443A1; FR2593393A1; GB8612781D0; DE3617753C2

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine wässrige, für die parenterale Applikation bestimmte Lösung, deren pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 liegt, enthaltend einen Gewebeplasmi-nogenaktivator, abgekürzt t-PA.

Es wird angenommen, dass ein dynamisches Gleichgewicht zwischen dem Enzymsystem, das fähig ist, Blutgerinsel zu bilden — das Koagulationssystem — und dem Enzymsystem, das fähig ist, Blutgerinselbildung aufzulösen — das fi-brinolytische System — besteht, das ein offenes Gefässbett intakt hält. Um den Blutverlust bei Verletzungen in Grenzen zu halten, werden Blutgerinsel in den verletzten Gefässen gebildet. Nach der natürlichen Reparatur der Verletzung werden die überflüssigen Blutgerinsel durch Einwirkung des fi-brinolytischen Systems aufgelöst. Gelegentlich werden Blutgerinsel gebildet, ohne dass eine traumatische Verletzung vorhanden ist, und können sich in den Hauptblutgefassen festsetzen, was eine teilweise oder sogar völlige Blutfussbehinderung zur Folge hat. Kommt dies im Herzen, der Lunge oder im Gehirn vor, kann dies zu einem Myokardinfarkt, einer Lungenembolie oder einem Schlaganfall führen. Diese Bedingungen zusammen sind die primären Ursachen für die Mortalität und Morbidität in den Industrienationen.

Blutgerinsel bestehen aus einem Gewebenetz, das durch das proteolytische Enzym, Plasmin, aufgelöst werden kann. Das Enzym wird dem inaktiven Proenzym, dem Plasminogen, einem Bestandteil des Blutplasmas, unter Mitwirkung eines Plasminogenaktivators entnommen. Es gibt zwei immunologisch unterschiedliche Plasminogenaktivatoren bei Säugetieren. Der intrinsische Plasminogenaktivator, auch als Urokinase bekannt, ist ein Enzym, das von der Niere erzeugt wird und aus dem Urin isoliert werden kann. Er kann ebenfalls aus verschiedenen Gewebekulturen hergestellt werden. Der extrinsische Plasminogenaktivator, auch als Gefässplas-minogenaktivator und als Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) bekannt, kann aus vielen Gewebehomogenaten (besonders dem menschlichen Uterus), aus den Gefasszellwänden und einigen Zellkulturen isoliert werden. Ausser diesen beiden Arten von Plasminogenaktivatoren gibt es noch ein bakterielles Produkt, die Streptokinase, die aus beta-hämolyti-schen Streptokokken hergestellt wird. Ein Hauptnachteil sowohl der Urokinase als auch der Streptokinase besteht darin, dass sie innerhalb des ganzen Blutkreislaufs und nicht nur an der Stelle des Blutgerinsels wirksam sind. Sie können zum Beispiel auch andere Blutproteine, wie zum Beispiel Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII, zerstören und dadurch die Fähigkeit der Blutgerinselbildung verringern und das Risiko der Hämorrhagie erhöhen. Dagegen hängt die biologische Aktivität des t-PA vom Vorhandensein des Fibrins ab, an das es sich bindet und wo es aktiviert wird. Die maximale Aktivität entwickelt sich daher nur an der Stelle eines Blutgerinsels, d.h. bei Vorhandensein eines Fibrinnetzes, das aufgelöst werden soll, und dies verhütet grösstenteils das Risiko von Hämorrhagien.

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Der Hauptverabreichungsweg für t-PA ist durch intravaskuläre Infusion, was vorraussetzt, dass das t-PA als parenterale Lösung formuliert wird. Es ist allgemein wünschen-wert, dass eine parenterale Lösung eine hohe Konzentration des Arzneimittels enthält, und zwar aus dem Grund, dass der Arzt oder Tierarzt dann die gewünschte Konzentration in jeder Situation einfach durch Verdünnen der Lösung mit einem zusätzlichen Lösungsmittel oder Medium erhalten kann. Ausserdem ist es nicht empfehlenswert, einem Patienten mit Herz- oder Nierenstörungen eine grosse Menge einer Lösung zu verabreichen, da diese das Herz oder die Nieren nur noch mehr belasten würde. Das Volumen sollte deshalb auf einem Minimum gehalten werden, indem man eine kon-zentriertere Formulierung verwendet. Gleichzeitig sollte eine solche parenterale Lösung stabil sein, indem das Arzneimittel nicht in bezeichnender Weise dazu neigt, weder bei Lagerung noch bei irgendeinem Verdünnungsprozess auszufällen.

Ein Anzahl von parenteralen Lösungen des t-PA sind ganz allgemein in EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 319, EP-A-123 304, der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 57-120523 (Anmeldung Nr. 56-6936) und der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 58-65218 (Anmeldung Nr. 56-163145) beschrieben worden. Die Formulierungen sind wässrige Salzlösungen des t-PA, deren pH-Wert ungefähr neutral ist, und die den Nachteil haben, dass die Löslichkeit des t-PA in solchen Lösungen niedrig ist, wenn kein Ansteigen der ionischen Konzentration vorhanden ist. Folglich enthalten diese Formulierungen entweder niedrige Konzentrationen an t-PA, die in einigen Fällen die Verabreichung an den Patienten von unwünschenswert grossen Volumen der Lösung verlangen, oder sie sind hypertonisch, was bedeutet, dass eine Verabreichung für die roten Blutzellen schädlich sein kann.

Es ist nun festgestellt worden, dass die Löslichkeit des t-PA in einer wässrigen, parenteralen Lösung verbessert werden kann, wenn der pH-Wert der Lösung innerhalb dem Säurebereich liegt, und dass der Säuregrad dieser Lösung bei der Verabreichung keine bedeutenden, physiologischen Probleme aufweist. Folglich sieht die vorliegende Erfindung eine wässrige, parenterale t-PA-Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 vor.

Ein Ergebnis der verbesserten Löslichkeit des t-PA besteht darin, dass die parenterale Lösung der vorliegenden Erfindung hohe Konzentrationen von t-PA erreichen kann, ohne dass im wesentlichen das Risiko besteht, dass das t-PA aus der Lösung ausfällt. Ausserdem ist festgestellt worden, dass die Konzentration des t-PA in einer solchen Lösung ohne weiteres durch Verdünnen mit Wasser mit einem neutralen pH-Wert oder ein wässriges Medium mit sauren pH-Wert verringert werden kann, und wiederum ohne jegliches, wesentliches Risiko, dass das t-PA ausfällt. Die vorliegende Erfindung sieht daher eine stabile, parenterale Lösung vor, die eine grössere Flexibilität bei der Verwendung und beim Gebrauch durch Ärzte und Tierärzte bietet.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete t-PA kann irgendein bioaktives Protein sein, das im wesentlichen t-PA von Säugetieren, und besonders,von Menschen, entspricht und Formen mit und ohne Glykosylierung umfasst. Es kann ein- oder zweikettiges t-PA oder eine Mischung der beiden sein, wie es in EP-A-112 122 beschrieben ist, und im Falle von vollständig glykosyliertem, menschlichen t-PA besitzt es ein scheinbares Molekulargewicht auf Polyacrylamiden Gels von ungefähr 70 000 und einen isoelektrischen Punkt zwischen 7,5 und 8,0. Vorzugsweise hat das t-PA eine spezifische Aktivität von ungefähr 500 000 IE/mg (Internationale Einheiten/mg, wobei die Internationale Einheit eine Aktivitätseinheit ist, die von der Weltgesundheitsorganisation WHO näher bestimmt ist und zwar von deren Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hamp-stead, London, NW3 6RB, Grossbritannien).

Die Aminosäuresequenz des t-PA entspricht vorzugsweise im wesentlichen dem in Figur 1 dargestellten. Die Sequenz s ist daher mit jener von Figur 1 identisch oder enthält eine oder mehrere Aminosäureauslöschungen, -ersetzungen, -ein-fügungen, umkehrungen oder -zusätze von allelischem oder anderen Ursprungs, wobei die daraus resultierende Sequenz mindestens 80% und vorzugsweise 90% Homologie mit der io Sequenz von Figur 1 aufweist und im wesentlichen dieselben biologischen und immunologischen Eigenschaften des Proteins umfasst. Die t-PA-Sequenz ist im besonderen mit der aus Figur 1 identisch oder hat dieselbe Sequenz, wobei jedoch die Aminosäure in der 245ten Position ausgehend von 15 dem Serin-N-Terminus, Valin anstelle von Methionin ist, wobei jede Sequenz wahlweise ohne irgendeine der drei ersten Aminosäuren oder wahlweise einen zusätzlichen Poly-peptid-N-Terminus, eine Vorsequenz des Gly-Ala-Arg, aufweist.

20 Die in Figur 1 dargestellte Aminosäurensequenz hat fünfunddreissig Cysteinreste und daher ein Potential zur Bildung von siebzehn Disulfidbrücken. Basierend auf der Analogie mit anderen Proteinen, deren Struktur ausführlicher dargelegt worden ist, ist die angenommene Sequenzstruktur 25 (die sich aus der Bildung der Disulfidbindung ergibt) zwischen der Aminosäure in der 90sten Position und dem Pro-Iin-C-Terminus in Figur 2 dargestellt. Die Struktur der N-Terminus-Gegend ist weniger sicher, obwohl einige Vorschläge ausgearbeitet worden sind (Progress in Fibrinolysis, 30 1983, 6,269—273; und Proc. Nati. Acad. Sei., 1984, 81, 5355 — 5359). Die wichtigsten Merkmale der t-PA-Struktur sind zwei Kringel-Bereiche (zwischen der 92sten und der 173sten Aminosäure und der 180sten und der 261sten Aminosäure), die für die Bindung des Proteins an das Fibrin ver-35 antwortlich sind, und der Serinproteasebereich, der den Hauptteil der B-Kette umfasst, und die für die Aktivierung des Plasminogen verantwortlich ist. Die Aminosäuren, die von besonderer Bedeutung für die Serinprotease sind, ist das katalytische Trias, His/Asp/Ser. Im t-PA treten diese drei in 40 der 322sten, der 371 sten und der 463sten Position auf. Die Disulfidbrücke zwischen den 264sten und den 395sten Cy-stein-Aminosäureresten ist ebenfalls wichtig, da sie die A-und B-Ketten bei der zweikettigen Form des t-PA zusammenhält.

45 In Figur I und 2 sind die üblichen ein und dreistelligen Buchstabenkodes für die Aminosäurereste wie folgt verwendet:

Asp D Asparaginsäure Ile I Isoleucin Thr T Threonin Leu L Leucin

50 SerSSerin TyrYTyrosin

Glu E Glutaminsäure Phe F Phenylalanin

Pro P Prolin His H Histidin

Gly G Glycin Lys K Lysin

Ala A Alanin Arg R Arginin

55 Cys C Cystein Trp W Tryptophan

Val V Valin Gin Q Glutamin

Met M Methionin Asn N Asparagin

Man erhält das t-PA durch irgendein beschriebenes oder in der Technik bekanntes Verfahren. Es kann zum Beispiel 60 aus einer normalen oder neoplastischen Zellinie erhalten werden, wie in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41 766 oder EP-A-113 319 beschrieben. Vorzugsweise jedoch sollte das t-PA aus einer kulivierten, transformierten oder transfizierten (transfected) Zellinie er-65 halten werden, die unter Verwendung der rekombinierten DNS-Technologie erhalten wird, so wie es zum Beispiel in EP-A-93 619, EP-A-117 059 oder in EP-A-117 060 beschrieben worden ist. Es ist vor allem vorzuziehen, dass die Zellen

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der Eierstöcke von chinesischen Hamstern (CHO) zur Herstellung von t-PA verwendet und derart entnommen werden wie es in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750 — 1759 beschrieben ist. Auf diese Art und Weise wird das klonierte Gen mit dem Gen kotransfiziert, indem das Gen die Dihydrofolatreduktase (dhfr) in dhfr—CHO-Zellen aufschlüsselt. Transformaten, die das dhfr exprimieren, werden auf nukleosidenlosen Medien ausgewählt und einer steigenden Konzentration von Methotrexaten ausgesetzt. Die dhfr und die t-PA-Gene werden so koamplifiziert und führen zu einer stabilen Zellinie, die in der Lage ist, die hohen Niveaus des t-PA zu exprimieren.

Das t-PA wird vorzugsweise gereinigt, indem man irgendeines der beschriebenen oder in der Technik bekannten Verfahren verwendet, wie zum Beispiel die Verfahren, die in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140—153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid 1981, 256(13), 7053-7041; Eur. J. Biochem., 1983,132,681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 oder GB-A-2 122 219 beschrieben sind.

Es gibt anscheinend keine Grenze nach oben für die Löslichkeit des t-PA in der parenteralen Lösung. Bei sehr hohen Konzentrationen, wie beispielsweise grösser als 150 000 000 IE/ml (Internationale Einheiten/ml), wird die Lösung lediglich viskos, ohne jedoch irgendwelche bedeutenden Ausfalle von t-PA. Die Konzentration des t-PA in der parenteralen Lösung kann daher innerhalb weiter gesteckten Grenzen variieren, zum Beispiel zwischen 50 000 und 50 000 000 IE/ml. Um den grösstmöglichen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu sichern, wird eine t-PA-Konzentrati-on von mehr als 100 000 IE/ml vorgezogen, ganz besonders grösser als 500 000 IE/ml und am meisten bevorzugt grösser als 1 000 000 IE/ml. Es wird eine t-PA-Konzentration von ungefähr 5 000 000 IE/ml am meisten bevorzugt.

Die oberste Grenze des pH-Werts der parenteralen Lösung ist vorzugsweise 4,5. Vorzugsweise liegt der pH-Wert in einem Bereich von 2,5 bis 4,0, noch bevorzugter wird ein Bereich von 2,8 bis 3,5 und meisten bevorzugt wird ein Wert von ungefähr 3,0. Der gewünschte pH-Wert der parenteralen Lösung wird vorteilhafterweise erhalten, indem man eine physiologisch akzeptable, anorganische oder organische Säure verwendet. Beispiele solcher Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, Zitronensäure, Weinsteinsäure und Benzolsulfonsäure. Von diesen Beispielen wird die Salzsäure bevorzugt.

Obwohl einige physiologisch akzeptable Ko-Lösungsmit-tel wahlweise zusätzlich zum Wasser vorhanden sein können, ist es vorzuziehen, dass das Medium für die parenterale Lösung vollständig oder im wesentlichen wässrig ist.

Die parenterale Lösung kann mit dem Blutserum des Patienten hypertonisch, hypotonisch oder isotonisch sein. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden, soll die parenterale Lösung vorzugsweise isotonisch sein, obwohl geringe Abweichungen nicht von grosser, physiologischer Bedeutung sind. Eine im wesentlichen isotonische, parenterale Lösung kann durch Einschluss eines physiologisch akzeptable Mittels erhalten werden, das in der Lage ist, der Tonus der Lösung auf das gewünschte Niveau zu bringen. Beispiele eines solchen Mittels sind allgemein in der Technik bekannt und enthalten Dextrose (in wasserfreier oder monohydrati-scher Form) und Natriumchlorid und Mischungen davon. Die Konzentration des Mittels in der parenteralen Lösung wird natürlich von Mittel zu Mittel variieren. Im Fall von Natriumchlorid liegt die Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 7 bis 10 mg/ml und am meisten bevorzugt ist eine Konzentration von ungefähr 8,5 mg/ml, wobei man diese Konzentration oft als physiologische Kochsalzlösung bezeichnet. Im Falle der wasserfreien Dextrose liegt die Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 30 bis 70 mg/ ml und am meisten bevorzugt ist ein Wert von ungefähr 50 mg/ml. Falls die Konzentration von t-PA in einer im wesentlichen isotonischen, parenteralen Lösung verringert werden soll, ist es vorzuziehen, die Verdünnung mit einer wässrigen Lösung des selben Mittels bei gleicher Konzentration durchzuführen, um eine im wesentlichen isotonische Lösung beibehalten zu können.

Die parenterale Lösung kann wahlweise Zusätze enthalten, die normalerweise in Formulierungen dieser Art vorhanden sind. Beispiele umfassen das Albumin des menschlichen Serums. Zusätzlich hat das t-PA die Neigung, an Glas und Plastikoberflächen zu adsorbieren, und es kann daher wünschenswert sein, einen oberflächenaktiven Stoff in der parenteralen Lösung zu haben, um ein solches Adsorbieren zu verhindern oder auf das Mindestmass zu verringern. Beispiele eines solchen Mittels sind Polyoxyethylen-Derivate von Fettsäureteilestern der SorbitAnhydriden, die im Handel unter dem Handelsnamen «Tween 80» erhältlich sind.

Einer der überraschenden Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, neben der im wesentlichen erhöhten Löslichkeit des t-PA, dass die Verwendung einer sauren, parenteralen Lösung mit einem pH-Wert innerhalb der hierin festgelegten Grenzen keine bedeutende, gegenteilige, physiologische Wirkung bei der Verabreichung an den Patienten zu zeigen scheint. Es scheint, dass die Blutbahn allgemein in der Lage ist, den pH-Wert einer Lösung auf beinahe neutral zu erhöhen, sobald sie damit in Verbindung kommt und dadurch das t-PA schnell innerhalb der Blutbahn verteilt wird. Es wird jedoch vorgezogen, dass dieser Vorgang nicht wesentlich auf irgendeine Art und Weise behindert wird, und dass die parenterale Lösung kein starkes Puffermittel enthält. Ein schwaches Puffermittel, das diesen Vorgang nicht wesentlich hemmt, kann jedoch enthalten sein, und das t-PA handelt bei einem sauren pH-Wert tatsächlich als sein eigenes schwaches Puffermittel. Zusätzlich kann das menschliche Serum Albumin als schwaches Puffermittel wirken.

Aufgrund der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA in der parenteralen Lösung der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, Zusatzstoffe, wie Lysin oder Ornithin oder ein Salz davon, hinzuzufügen, um die Löslichkeit des t-PA zu erhöhen.

Die parenterale Lösung kann in Übereinstimmung mit den gewöhnlichen, pharmazeutischen Formulierungsverfahren und -techniken hergestellt werden, indem t-PA in Form einer gereinigten Lösung oder eines Feststoffs verwendet wird. Die vorliegende Erfindung sieht daher ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, parenteralen t-PA-Lösung vor, die hierin näher bestimmt wird und folgendes umfasst:

(i) Erhalten einer gereinigten t-PA-Lösung und Ersatz des

Mediums durch ein wässriges Medium mit einem pH-

Wert von 2 bis 5; oder

(ii) Verdünnen des t-PA in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 und

Sterilisieren der erhaltenen Lösung.

Die Reinigung des t-PA kann in einem Endstadium die Eluierung des Proteins von einer chromatographischen Säule wie zum Beispiel einer iSosung, die ein starkes Puffermittel enthält, umfassen. Wie schon zuvor erwähnt, ist es vorzuziehen, dass die parenterale Lösung kein starkes Puffermittel enthält, und daher ist als vernünftiges Mittel zur Durchführung dessen Entfernung und während dem Auswechseln des Mediums, die Dialyse zu verwenden. Dies kann durchgeführt werden, indem man eine Dialyseröhre oder eine künstliche Niere verwendet, in der eine gereinigte Lösung gegen eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 dialysiert wird. Es kann wünschenswert sein, zuerst den pH-Wert der Lösung auf einen Wert in einem Bereich von 2

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bis 5 anzugleichen, besonders wenn die t-PA-Konzentration in der gereinigten Lösung hoch ist. Ein anderes Mittel zur Durchführung des Entfernens eines starken Puffermittels während dem Auswechseln des Mediums besteht darin, die gereinigte Lösung einer Gelfiltrierung zu unterwerfen und eine Säule mit einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 zu entwickeln.

t-PA in Form eines festen Niederschlags kann vorzugsweise aus einer gereinigten Lösung erhalten werden, indem man den pH-Wert auf ungefähr 5,5 angleicht, die Lösung abkühlt, um sie gerade über ihrem Gefrierpunkt zu halten, und das Protein, z. B. durch Zentrifugierung wieder zu erhalten. Der feste Niederschlag kann dann in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 auf die übliche Art und Weise aufgelöst werden.

Die Sterilisierung der so erhaltenen Lösung kann dann auf übliche Art und Weise durchgeführt werden, z.B. durch Filtersterilisierung.

Die parenterale Lösung wird normalerweise in versiegelten, sterilen Plastik- oder Glasbehältern abgefüllt. Sie wird aber auch in Einzeldosierungsformen, wie Ampullen, Injektionsflaschen oder Einwegspritzen oder in Mehrfachdosie-rungsformen, wie Infusionsbeuteln oder -flaschen abgefüllt. Die Menge der Lösung, die in solchen Behältern abgefüllt ist, kann stark variieren, liegt aber üblicherweise in einem Bereich von 0,5 bis 20 ml.

Um den t-PA zu stabilisieren, wird die parenterale Lösung vorzugsweise gefroren und bei —10 bis —30 °C aufbewahrt.

Die biologische Aktivität des t-PA zur Auflösung des Fibrinnetzes bei Blutgerinseln hat dazu geführt, dass es zur Behandlung von thrombotischen Störungen verwendet wird (The Lancet, 7. November 1981,1018 — 1020; ibid., 13. April 1985,842—847; The New England Journal of Medicine, 1984,310(10), 609-613; and ibid., 1985,312(14), 932-936). Die vorliegende Erfindung sieht daher eine Methode zur Behandlung einer thrombotischen Störung bei Säugetieren vor, die aus der Verabreichung einer wässrigen, parenteralen t-PA-Lösung wie hierin beschrieben an ein Säugetier besteht. Als Alternative ist auch eine wässrige, parenterale t-PA-Lösung wie hierin beschrieben zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, besonders zur Verwendung bei der Behandlung einer thrombotischen Störung vorgesehen.

Spezielle Beispiele einer thrombotische Störung sind in der Technik bekannt und umfassen Myokardinfarkt, Thrombose in tiefliegenden Venen, Lungenembolien und Schlaganfall.

Der Hauptverabreichungsweg der parenteralen Lösung ist mittels einer intravaskulären, besonders intravenösen Infusion, obwohl auch andere Verabreichungswege wie intramuskuläre Verabreichung verwendet werden können. Intravaskuläre Infusionen werden normalerweise mit einer parenteralen Lösung in einem Infusionsbeutel oder einer Infusionsflasche oder in einer elektrisch betriebenen Spritze durchgeführt. Die Lösung kann von dem Infusionsbeutel oder der Infusionsflasche mit Hilfe der Schwerkraft oder unter Verwendung einer Infusionspumpe dem Patienten verabreicht werden. Die Verwendung eines mit Schwerkraft betriebenen Infusionssystems bietet nicht genügend Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit der parenteralen Lösung, und die Verwendung einer Infusionspumpe wird daher vorgezogen, besonders wenn es sich um Lösungen mit relativ hoher t-PA-Konzentration handelt. Es wird jedoch eine elektrisch betriebene Infusionsspritze eher vorgezogen, da dies sogar noch grössere Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit bietet.

Eine wirksame Menge an t-PA, um Säugetiere mit thrombotischen Störungen zu behandeln, hängt natürlich

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von mehreren Faktoren ab, zum Beispiel vom Alter und Gewicht des Säugetieres, des genauen Zustands, der einer Behandlung bedarf, und seiner Schwere, dem Verabreichungsweg und letztendlich vom Ermessen des jeweiligen behandelnden Arztes oder Tierarztes ab. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass eine wirksame Menge zur Auflösung beispielsweise eines Herzarterienthrombus allgemein sich auf 150 000 bis 450 000 IE/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde beläuft. Daher liegt für einen 70 kg schweren, erwachsenen Menschen die wirksame Menge pro Stunde allgemein in einem Bereich von 10 000 000 bis 30 000 000 IE und insbesondere ung. bei 20 000 000 IE, und diese Menge kann entweder mit oder ohne Vorbereitungsdosierung verabreicht werden. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, dass die Dosierung bei einigen thrombotischen Zuständen niedriger ist, zum Beispiel bei Thrombose in tiefliegenden Venen und akutem Schlaganfall oder um einfach nur die Durchgängigkeit einer bereits wieder durchbluteten Koronararterie zu erhalten. In diesen Fällen liegt die wirksame Menge allgemein zwischen 7000 und 36 000 IE/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung und sollen auf keinen Fall als Begrenzung derselben aufgefasst werden.

Beispiel 1

Ein geklärter Ertrag an t-PA, der aus einer kultivierten, transformierten CHO-Zellinie erhalten wurde, die wiederum unter Verwendung des Verfahrens aus der Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750—1759, abgeleitet war, wurde chromatographisch gereinigt und das t-PA als wässrige Lösung mit 0,1 M Natriumeitrat und 0,01% (g/v) Tween 80 mit einem pH-Wert von 5,5 gesammelt wird. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,0 mit Salzsäure angeglichen, und die so erhaltene Lösung wurde unter Verwendung einer H-10-Patrone (Amicön Ltd., Upper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, England) durch Ultrafiltrierung konzentriert. Man erhielt so eine konzentrierte, gereinigte, wässrige t-PA-Lösung (2 500 000 IE/ml), die 0,1 M Natriumeitrat, 0,23 M Natriumchlorid (die sich aus dem Zusatz mit Salzsäure ergibt) und 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt mit einem pH-Wert von 3,0. Diese Lösung wurde in eine Dialyseröhre mit einer Molekulargewichtssperrung bei etwa 14 000 gefüllt und bei 4 °C dialysiert bei viermaligem Auswechseln von 50 Volumen von durch Filter sterilisierter, physiologischer Salzlösung (0,85% (g/v) Natriumchlorid), die 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt und auf einen pH-Wert von 3,0 mittels konzentrierter Salzsäure angeglichen wurde. Man liess jede Dialysestufe während 12 Stunden laufen. Nachdem man die wässrige Lösung aus der Dialysetasche erhalten hatte, wurde sie durch einen Filter sterilisiert und mit einer physiologischen Salzlösung verdünnt, bis sie die 500 000 IE/ml t-PA enthielt, verdünnt. Die so erhaltenen parenterale Lösung wurde dann in Ampullen gefüllt, die gefroren und bei —20° aufbewahrt wurden.

Beispiel 2

Ein geklärter Ertrag an t-PA, der aus einer kultivierten, transformierten CHO-Zellinie erhalten wurde, die wiederum unter Verwendung des Verfahrens aus Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750—1759, war, wurde chromatographisch gereinigt und das t-PA wurde als wässrige Lösung, die 0,17 M Natriumeitrat und 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt und einen pH-Wert von 5,5 aufwies, gesammelt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Salzsäure auf 3,0 angeglichen und die so erhaltene Lösung durch Ultrafiltrierung unter Verwendung einer H-10-Patrone (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England) konzentriert. Die konzentrierte, wässrige Lösung wurde weiter gereinigt, in5

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dem es auf eine Gelfiltrierungssäule (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Schweden) anwendet und mit 0,85%iger Salzlösung, die 0,01 % (g/v) Tween 80 enthält und einen pH-Wert von 3,0 aufweist, eluiert. Man erhielt so eine stark gereinigte, wässrige t-PA-Lösung, die nochmals unter Verwendung einer künstlichen Einwegniere konzentriert wurde. Das t-PA wurde aus der Lösung ausgefällt, indem man den pH-Wert auf 5,5 mit Natriumhydroxid erhöhte und die Suspension bei 4 °C während 2 Stunden aufbewahrte. Das t-PA wurde durch Zentrifugierung bei 4000 x g während 30 min. bei 4° wiedergewonnen. Die t-PA-Kugel wurde wieder in einer wässrigen Natriumchloridlösung (0,85% (g/v)) verdünnt, die 0,01 % (g/v) Tween 80 enthielt und deren pH-Wert mit Salzsäure auf 3,0 angeglichen wurde. Man benötigte ein Salzlösungsvolumen, dass erforderlich war, um eine t-PA-Konzentration zwischen 7 500 000 IE/ml und 10 000 000 IE/ml zu erhalten. Diese t-PA-Lösung wurde dann mit einer weiteren wässrigen Natriumchloridlösung (0,85% (g/v)), die 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angeglichen wurde, verdünnt und ebenfalls mit einer ausreichenden Menge einer 10%igen (g/v) Mannitlösung in derselben sauren Salzlösung verdünnt, um endgültige Konzentrationen von 5 000 000 IE/ ml für t-PA und 25 mg/ml für Mannit zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde durch einen Filter sterilisiert und in Volumen von 1 ml in Ampullen abgefüllt, die dann gefroren und bei — 20° aufbewahrt wurden.

Beispiel 3

Die Wirksamkeit der parenteralen Lösung aus Beispiel 1 auf Thrombosen wurde in einem in vivo-Modell von jugula-rer Venenthrombose ausgewertet.

(a) Verfahren:

Das Testverfahren wurde im wesentlichen gemäss jenem, das bei Collen et al. (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368—376) beschrieben wird durchgeführt.

Man liess die parenterale Lösung aus Beispiel 1 auftauen und verdünnte sie mit einer sterilen, isotonischen Salzlösung, die auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht wurde und 0,01% Tween 80 enthielt, um eine ausreichende Menge der Lösung für eine zweistündige Infusion von 500 000 IE/kg t-PA bereitzustellen. Die Infusion wurde durch eine Kanüle in die rechte Oberschenkelvene durchgeführt. Drei weisse, neuseeländische Kaninchen wurden für den Test verwendet. Nach der Infusion wurde der Grad des Thrombuszerfalls ausgewertet.

(b) Ergebnisse:

Der Prozentsatz des Thrombuszerfalls betrug 22,3 ± 4,2 und stellt so die thrombolytische Wirkung der parenteralen Lösung aus Beispiel 1 dar. Zusätzlich konnten keine gegenteiligen Wirkungen bei der Infusion dieser Lösung festgestellt werden.

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2 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Eine wässrige, pharmazeutisch anwendbare, für die parenterale Applikation bestimmte Lösung, deren pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 liegt, enthaltend einen Gewebeplasmi-nogenaktivator, abgekürzt t-PA.
2. Eine Lösung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA entweder in ein- oder in zweikettiger Form vorhanden ist.
3. Eine Lösung gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA über eine Aminosäurensequenz verfügt, die in Figur 1 dargestellt ist, oder dieselbe Aminosäurensequenz hat, wobei jedoch die Aminosäure in der 245ten Position vom Serin-N-Terminus aus gerechnet, Valin anstelle von Methionin ist, wobei die eine oder andere Sequenz wahlweise ohne irgendeine der drei ersten Aminosäuren ist, oder aber wahlweise eine zusätzliche Polypeptid-N-Terminus-Vorsequenz aus Gly-Ala-Arg aufweist.
4. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA t-PA einer kultivierten, transformierten oder transfizierten Zellinie ist, die mittels der rekombinierten DNS-Technologie hergestellt wurde.
5. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA grösser als 100 000 IE/ml ist.
6. Eine Lösung gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA grösser als 500 000 IE/ml ist.
7. Eine Lösung gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA grösser als

1 000 000 IE/ml ist.
8. Eine Lösung gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA bei etwa

5 000 000 IE/ml liegt.
9. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 2 bis 4,5 liegt.
10. Eine Lösung gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,0 liegt.
11. Eine Lösung gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 2,8 bis 3,5 liegt.
12. Eine Lösung gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert ungefähr bei 3,0 liegt.
13. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium vollständig oder im wesentlichen wässrig ist.
14. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein physiologisch akzeptables Mittel enthält, das die Lösung im wesentlichen isotonisch mit menschlichem Blutserum macht.
15. Eine Lösung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch akzeptable Mittel Natriumchlorid ist.
16. Eine Lösung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch akzeptable Mittel Dextrose ist.
17. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oberflächenaktives Mittel enthält.
18. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie im wesentlichen ungepuffert ist.
19. Eine Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie im wesentlichen frei von Lysin oder Ornithin oder einem Salz davon ist.
20. Eine wässrige Lösung gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, die Natriumchlorid enthält.
21. Ein Verfahren zur Herstellung einer parenteralen Lösung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgendes umfasst:

(i) Erhalten einer gereinigten t-PA-Lösung und Auswechseln des Mediums mit einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5; oder

(ii) Verdünnen des t-PA in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5; und

Sterilisieren der so erhaltenen Lösung.
22. Ein versiegelter Behälter mit einer parenteralen Lösung gemäss einem der Ansprüche von 1 bis 20.