CH666048A5 - Composition-supplement pour un milieu de croissance de cellules, procede de sa preparation, composition-finale et utilisation. - Google Patents
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Description
DESCRIPTION
Les sérums animaux, et particulièrement le sérum fœtal de veau, sont connus comme suppléments pour les milieux courants de culture de tissus. Ainsi, il est connu que l'on peut ajouter jusqu'à 20% en volume et fréquemment 10% de sérum de bovin aux cultures de tissus de cellules animales dans de tels milieux de croissance de tissus standards tels que le F12 de Ham, l'Eagle modifié de Dulbecco et autres. Ce sérum apparaît propre à fournir certaines matières essentielles pour la culture des tissus qui ne sont pas fournies facilement, si même elles le sont par les substituts connus. L'utilisation de sérum animal comme supplément aux milieux de croissance aide fréquemment les cellules à remplir une fonction différenciée, à s'accroître aux concentrations voulues et à maintenir la croissance et la viabilité pendant de longues durées.
Toutefois, l'utilisation du sérum animal peut soulever certains problèmes dans la culture des tissus. Le principal de ces problèmes est la variabilité de la composition du sérum. Par suite, l'aptitude à promouvoir la croissance de lots de sérum différents peut varier dans de larges limites. Les fournisseurs de sérum animal s'efforcent de réduire au minimum cette variation en rassemblant le sérum de nombreux animaux et en maintenant les troupeaux d'animaux donneurs d'une quantité connue, et/ou en triant ou essayant les taux d'hormones de croissance et autres composants du sérum. Toutefois, ces efforts peuvent être onéreux et ne sont pas toujours efficaces pour réduire les problèmes de variabilité. Ces problèmes peuvent restreindre l'usage par les utilisateurs et peuvent causer des variations dans les résultats des recherches. Fréquemment, les utilisateurs doivent procéder à de vastes investigations sur le sérum avant de l'utiliser, ce qui peut être coûteux en temps de même qu'en argent. La possibilité de se procurer du sérum de bovin en quantités importantes peut constituer un problème du fait qu'elle varie suivant les hauts et les bas de l'industrie du bœuf. Et le sérum fœtal de veau de même que les autres sérums de bovin peuvent être obtenus comme sous-produit, et l'obtention est liée aux dimensions du troupeau, qui varient cycliquement.
On a constaté que l'utilisation de sérum animal çomme supplément aux milieux de croissance normaux présente des inconvénients. D'autres personnes ont essayé de réduire la proportion de sérum utilisé dans les cultures de tissus ou même de supprimer complètement l'utilisation du sérum. On a établi des milieux de croissance exempts de sérum qui sont spécifiques pour des types particuliers de cellules. De même, on a fait appel à une diminution de la quantité de sérum normalement ajoutée, en même temps qu'on utilisait des facteurs de croissance fournis par d'autres suplléments destinés à des séries spécifiques de cellules. Et aussi, quand les proportions de sérum ont été réduites ou supprimées dans la croissance normale de tissus dans le passé, elles l'ont été en connexion avec des types particuliers de cellules. La technique antérieure n'a pas réalisé un supplément sensiblement universel pour la croissance des tissus qui ait été
accepté par l'industrie pour être utilisé avec une large variété de cellules de différents types, y compris les cellules primaires transformées et non transformées d'origine aussi bien fibroblastoïde qu'épi-thélioïde, et les lignes ou souches de cellules continues, transformées ou non transformées.
Dans ces conditions, l'invention a pour objet de réaliser une composition-supplément pour milieu de croissance de cellules contenant du sérum animal et une combinaison de substituts des composants du sérum animal, ce supplément pouvant être utilisé pour promouvoir la croissance des cellules dans la culture.
Elle a aussi pour objets:
a) de réaliser une composition-supplément pour milieu de croissance de cellules suivant l'objet mentionné ci-dessus, qui puisse être produite avec des propriétés essentiellement compatibles en volumes désirés pour être utilisée en rapport avec la croissance des cellules dans une variété de milieux, ces cellules pouvant être choisies dans une large variété de types de cellules;
b) de réaliser des compositions-suppléments pour milieu de culture des cellules en concordance avec les objectifs mentionnés ci-dessus, formant en combinaison avec des milieux de culture courants pour tissus des compositions finales destinées à être utilisées pour la croissance des cellules;
c) de réaliser des procédés avantageux pour fabriquer et utiliser la composition-supplément et la composition finale suivant l'invention.
Suivant l'invention, la composition-supplément est constituée essentiellement d'une quantité mineure de sérum animal et d'une proportion majeure d'un mélange d'hormones peptidiques et thyroïdiennes, d'oestrogènes, d'androgènes, de corticoïdes, de produits nutritifs, de facteurs de croissance, de facteurs de transport, de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines, de sucre et de faibles quantités d'autres composants dans une phase aqueuse. La composition-supplément est destinée au remplacement partiel du sérum animal, dans la culture de tissus et cellules, d'un milieu de croissance destiné au développement de cellules in vitro.
Dans un mode de réalisation recommandé, sérum animal, hormones, œstrogènes, androgènes, corticoïdes, facteurs de croissance, produits nutritifs et facteurs de transport sont constitués essentiellement de sérum de mammifère, de préférence du sérum de bovin, spécialement le sérum de veau nouveau-né, insuline, transferrine, EGF, EFFS, acide sélénieux, o-phosphoryléthanolamine, triiodothyroxine, hydrocortisone, œstradiol 17, progestérone et testostérone.
La composition-supplément est préparée par un procédé comprenant les étapes qui consistent à solubiliser le sérum animal dans une portion de cette composition-supplément, à compléter le mélange de composants de la composition-supplément et, comme étape essentiellement finale, à ajouter le reste du sérum animal, et enfin à filtrer la composition-supplément pour la stériliser.
La composition-supplément présente l'avantage de réduire ou de supprimer les problèmes soulevés par la variabilité de la composition du sérum d'un lot à l'autre. La petite quantité de sérum utilisé peut varier sans avoir un effet substantiel du fait qu'elle constitue seulement un faible composant de la culture des tissus, le plus souvent un quart ou moins de la quantité qui est utilisée normalement. D'une façon surprenante, alors même que l'on utilise seulement une faible proportion de sérum, celle-ci assure les composants nécessaires pour un milieu de culture universel pour la croissance des tissus, par exemple les facteurs de réunion des cellules, les protéines assurant le transport des substances insolubles à l'eau. La faible addition de sérum de base collabore avec les autres facteurs à la multiplication des cellules. Comme la proportion de sérum est faible, les taux de substances toxiques normalement apportées par le sérum sont diminués. Du fait que le taux de protéines dans la culture ultime des cellules est réduit par rapport à l'utilisation du sérum seul, la séparation des protéines du produit final est rendue plus facile. La concentration des cellules produites, développées dans les milieux de culture, peut être accrue quand on utilise la composition-supplément suivant l'invention pour exalter la croissance. La diminution de la
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10
15
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teneur totale en protéines du milieu de croissance des cellules peut aussi avoir pour résultat une augmentation de l'efficacité et de la facilité de récupération et de purification des produits cellulaires désirés. Cela peut être extrêmement important dans l'industrie de la pharmacie et des vaccins. La reproductibilité d'un produit constant est augmentée par la composition-supplément suivant l'invention. Cela peut supprimer la variabilité de la promotion de croissance observée habituellement avec différents lots de sérum animal entier, et supprime la nécessité d'essayer de nombreux lots pour trouver un lot acceptable. On peut ainsi obtenir facilement une diminution des frais et du temps passé dans l'ensemble des opérations de culture des tissus.
La composition-supplément suivant l'invention est utilisée à la place du sérum animal dans la culture des tissus et cellules. Habituellement, on utilise du sérum animal dans la culture de cellules dans des proportions de 5 à 20% en volume des milieux de culture normaux de tissus. La composition-supplément peut être intégrée dans la composition finale qui est caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une combinaison comprenant:
a) de 99,9 à 60% en volume d'un milieu de culture de cellules contenant tous les composants de croissance nécessaires à la culture de cellules animales quand il a été combiné avec un sérum animal, et b) de 0,1 à 40% en volume de la composition-supplément. Toutefois, il est préférable d'utiliser la composition-supplément dans des proportions de 1 à 25% en volume de la solution totale du milieu.
La composition finale est utilisée pour aider à la croissance d'une grande variété de types différents de cellules y compris les cellules primaires, transformées ou non transformées, d'origine aussi bien fi-broplastoïde qu'épithélioïde, et des souches continues de cellules transformées ou non transformées en vue de permettre une croissance rapide et prolifique des cellules in vitro.
Ces milieux normaux de culture de tissus utilisables avec la composition-supplément ou la composition finale et qui ont été précédemment utilisés avec du sérum seul comprennent, sans y être limités, les produits suivants:
Milieu de McCoy 5a
McCoy, T.A., Maxwell, M. et Kruse, P.F., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., 100, 115-118 (1959)
Milieu essentiel minimum Eagle, H., Science, 130, 432 (1959)
Milieu Eagle modifié
Daniel, M.D. et Melendez, L.V., Proc. of the Soc. for Exp. Biol. and Med., 127, N° 3 (March 1969)
Milieu Eagle modifié de Dulbecco
Dulbecco, R. et Freeman, G., Virology, 8, 396 (1959)
Smith, J.D., Freeman, G., Vogt, M. et Dulbecco, R., Virology, 12,
185-196 (1960), Tissue Culture Standards Committee, In Vitro, 6,
N° 2, 93
Milieu de (Leibovitz) L-15 Leibovitz, A., Am. J. Hyg., 78, 173-180 (1963)
Mélanges nutritifs — Milieux F-10 et F-12 Ham, R.G., Exp. Cell. Res., 29, 515-526 (1963)
Ham, R.G., Proc. Nat. Acad. Sci., 53, 288-293 (1965)
Milieu de Waymouth
Waymouth, C., J. Nat. Cancer Inst., 22, 1003-1017 (1959)
Comme exemples de formulations aqueuses de tels milieux, on peut citer:
Milieu nutritif de Ham F-12 (fourni par Gibco Laboratories)
Composants mg/l Sels minéraux
CaCl -2H20 44,00
CuS04-5H208 0,00249
4
Composants mgjl
Sels minéraux
FeS04 • 7H20
0,834
KCl
223,60
MgCl2 • 6H20
122,00
NaCl
7599,00
NaHC03
1176,00
Na2HP04 • 7H20
268,00
ZnS04-7H20b
0,863
Autres composants
D-Glucose
1802,00
Hypoxanthine
4,10
Acide linoléique
0,084
Acide lipoïque
0,21
Rouge de phénol
1,20
Putrescine 2HC1
0,161
Pyruvate de sodium
110,00
Thymidine
0,73
Acides aminés
L-alanine
8,90
L-arginine HCl
211,00
L-asparagine H2Ob
15,01
Acide L-aspartique
13,30
L-cystéine HC1,H20
35,12
Acide L-glutamique
14,70
L-glutamine
146,00
Glycine
7,50
L-histidine HCL,H20
20,96
L-isoleucine
3,94
L-leucine
13,10
L-lysine HCl
36,50
L-méthionine
4,48
L-phénylalanine
4,96
L-proline
34,50
L-sérine
10,50
L-thréonine
11,90
L-tryptophane
2,04
L-tyrosine
5,40
L-valine
11,70
Vitamines Biotine
D-Pantothénateb de Ca 45 Chlorure de choline Acide folique i-Inositol Niacinamide Pyridoxine HCl 50 Riboflavine Thiamine HCl Vitamine B12
Milieu Eagle de Dulbecco modifié (dans H20)
55 Composants mgjl Sels minéraux
CaCl2 (anhydr.) 200,00
Fe(N03)3 ■ 9H20 0,10
KCl 400,00
60 MgS04-7H20 200,00
NaCl 6400,00
NaHC03 3700,00
Na2HP04,H20 125,00!
65 Autres composants
D-glucose 1000,00
Rouge de phénol 15,00
Pyruvate de sodium 110,00
0,0073 0,4800 13,9600 1,300 18,000 0,0370 0,0620 0,0380 0,3400 1,3600
5
666048
Acides aminés
L-arginine HCl
84,00
L-cystine
48,00
L-glutamine
584,00
Glycine
30,00
L-histidine HC1,H20
42,00
L-isoleucine
105,00
L-leucine
105,00
L-lysine HCl
146,00
L-méthionine
30,00
L-phénylalanine
66,00
L-sérine
42,00
L-thréonine
95,00
L-tryptophane
16,00
L-tyrosine
72,00
L-valine
94,00
Vitamines
D-pantothénate de Ca
4,00
Chlorure de choline
4,00
Acide folique
4,00
Myo-inositol
7,20
Nicotinamide
4,00
Pyridoxal HCl
4,00
Riboflavine
0,40
Thiamine HCl
4,00
Vitamines B12
—
a Les valeurs indiquées sont en conformité avec celles du «l'issue Culture Standards Committee», In Vitro, 9, N° 6 (1970).
D'autres milieux de culture des tissus standards peuvent être utilisés en commun avec la composition-supplément suivant l'invention pour la croissance des cellules. Les variations de ces milieux sont nombreuses. La limitation consiste uniquement en ce que l'on utilisera la composition-supplément seulement avec des milieux connus pour promouvoir la croissance en présence de sérum animal.
Le sérum de veau nouveau-né est préféré comme constituant la partie sérum de la composition-supplément suivant l'invention parce qu'il est plus universel que les autres sérums animaux.
Le sérum de veau nouveau-né est prélevé sur des veaux âgés de 10 jours et moins. Dans certains cas, le sérum de veau nouveau-né peut être remplacé par un autre sérum de bovin, ou le sérum d'un autre animal, tel que le sérum de cheval, le sérum de bovidés, le sérum de poulet, le sérum de lapin, le sérum de porc, le sérum d'ovins ou de caprins, ou une combinaison de ces sérums. Quand des lignées de cellules en cours de développement croissent normalement dans d'autres sérums que celui du veau nouveau-né, on peut utiliser cet autre sérum comme le constituant sérum de la composition-supplément de croissance des cellules.
Dans tous les cas, il est préférable d'obtenir une combinaison d'ingrédients qui assurent à la composition-supplément une grande souplesse d'emploi et qui le rendent utilisable pour une large variété de lignées de cellules. De même, les hormones et autres ingrédients sont choisis tels que, bien que certains ne soient pas indispensables à l'utilisation dans toutes les lignées de cellules, aucun n'interfère avec l'action des autres dans aucune lignée de cellules.
Les composants hormones peptidiques de la composition-supplément ou de la composition finale peuvent comprendre l'insuline. Le facteur de transport est la transferrine qui est aussi une hormone peptidique. Les hormones thyroïdiennes sont la triiodothyroxine et la thyrosine.
Les facteurs de croissance utilisés sont de préférence le facteur de croissance épidermique, tel qu'il est vendu par Collaborative Research, Inc., de Waltham, Massachusetts, sous leur désignation CR-EGF. Cet EGF est tel qu'il est décrit dans la littérature, référence Savage C.R. et Cohen S., J. Biol. Chem., 247, 7609-7611 (1972). Un facteur de croissance des cellules endothéliales utilisables comme constituant de la composition-supplément ou de la composition finale peut être obtenu de Collaborative Research, Inc., de Waltham, Massachusetts, sous sa désignation CR-ECGS. Ce facteur de croissance est en outre décrit dans la littérature, référence Maciag T., Cerundolo J., Ilsley S., Kelley P.R. et Forand R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 5674-5678 (1979).
L'androgène utilisé peut être la testostérone, la dihydrotestosté-rone, la nandrolone et l'oxymétholone; l'œstrogène utilisé peut être la progestérone, le 17-(bêta)-œstradiol, l'œstrone.
Le corticoïde est de préférence l'hydrocortisone, mais on peut utiliser d'autres matières comme les cortisones dexaméthasone, prednisolone, et corticostérone.
Les agents nutritifs comprennent de préférence l'acide sélénieux, l'orthophosphoryléthanolamine et d'autres matières qui interviennent dans les fonctions enzymatiques cellulaires.
Les sels minéraux utilisables dans la composition-supplément ou la composition finale sont ceux que l'on utilise couramment dans les milieux de culture des tissus tels que les sels de calcium, cuivre, fer, manganèse, ammonium, potassium, magnésium, sodium et zinc,
sous forme de chlorure, sulfate, phosphate ou autres, certains d'entre eux pouvant être hydratés.
Des additifs acides aminés aux milieux de culture des tissus peuvent être aussi utilisés, et l'on peut citer comme exemples les L-alanine, L-arginine HCl, L-asparagine, acide L-aspartine, L-cystéine HC1,H20, L-isoleûcine, L-lysine HCl, L-méthionine, L-phénylala-nine, L-proline, L-sérine, L-thréonine, L-tryptophane, L-tyrosine, L-valine, acide L-glutamique, L-glycine, L-glutamine, L-histidine et L-leucine.
Les vitamines essentielles comprennent les d-biotine, D-panto-thénate de Ca, chlorure de choline, acide folique, myo-inositol, nicotinamide, pyridoxine HCl, riboflavine, thiamine HCl et vitamine B12.
Comme autres composants de natures diverses, on peut citer les sucres comme glucose, hypoxanthine, acide linoléique, rouge de phénol, putrescine-2 HCl, pyruvate de sodium, thymidine, acide ascorbique, calciférol, niacine, acide para-aminobenzoïque, pyridoxal HCl, vitamine A.
On utilisera de préférence de l'eau distillée déminéralisée présentant une résistance supérieure à 8 mégohms. Toutefois, toute eau que l'on utilise habituellement dans la culture des tissus peut être utilisée.
On comprendra facilement que les composants peuvent être utilisés sous leur forme soluble à l'eau, par exemple sous la forme de sels des hormones, acides aminés, vitamines et autres.
La composition-supplément suivant l'invention est utilisée de préférence à la place du sérum que l'on utilise ordinairement dans les cultures de tissus. Ainsi, de préférence, la composition-supplément peut être utilisée dans des proportions de l'ordre de 1 à 25% en volume de la solution totale des milieux courants de culture des tissus, par exemple dans les milieux de Ham F-12 ou d'Eagle, par exemple dans une proportion de 1:99 à 1:4. Et aussi le taux de sérum de veau, quand le sérum animal est du sérum de veau, se monte de préférence à un taux de 0,25 à 6,25% en volume de l'ensemble du milieu de culture des tissus. Ce taux de sérum dans la composition-supplément ou la composition finale est assez bas pour éviter toute addition sensible de facteurs toxiques, diminue la tendance des variations dans la consistance du sérum à avoir un effet, et fournit des matières nécessaires pour la croissance des cellules autres que la matière entièrement à base de protéines.
Dans la formulation préférée de l'invention, une composition-supplément pour milieu de croissance des cellules est formulée comme suit et peut être considérée comme le substitut universel recommandé par l'invention:
Formulation 1
Composant Concentration
Veau nouveau-né 25% en volume de la compo-
sition-supplément
5
10
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35
40
45
50
55
60
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6
Composants
Insuline Transferrine EGF ECGS
Acide sélénieux o-Phosphoryléthanolamine
L-3,5,3'-triiodothyrosine
Hydrocortisone
Œstradiol 17
Progestérone
Testostérone
Sels minéraux CaCl2
CuSo4•5H20 FeS04 - 7HzO KCl
MgCl2-6H20 NaCl Na2HP04 ZnS04 ■ 7H20
Acides aminés
L-alanine L-arginine HCl L-asparagine Acide L-aspartique L-cystéine HC1,H20 Acide L-glumatique Glycine
L-histidine HC1,H20
L-isoleucine
L-lysine HCl
L-méthionine
L-phénylalanine
L-proline
L-sérine
L-thréonine
L-tryptophane
L-tyrosine
L-valine
Vitamines d-Biotine
D-Pantothénate de Ca Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Nicotinamide Pyridoxine HCl Riboflavine Thiamine HCl Vitamine B12
Composants divers
Glucose Hypoxanthine Acide linoléique Rouge de phénol Putrescine 2HC1 Pyruvate de sodium Thymidine
Bicarbonate de sodium mgll
25 50 5
77,5 0,1612 56,44 1,683 4,33 3,41 3,93 3,61
23,24 0,00174 0,58 156,56 85,40 5319,30 99,40 0,60
6,24 153,73 10,50 9,32 24,58 10,30 5,26 14,67 2,76 25,56 3,13 3,47 24,17 7,36 8,34 1,43 3,81 8,20
0,0051 0,18 9,77 0,93 12,61 0,026 0,043 0,026 0,24 0,95
maintenues dans des proportions indiquées dans la formulation 1 ci-dessus.
Bien que cette formulation spécifique ait été trouvée reçomman-dable, des variations sont possibles. Corame il est décrit précédem-5 ment, on peut utiliser d'autres sérums d'animaux à la place du sérum de veau nouveau-né. La formulation spécifique ci-dessus peut être utilisée là où l'on utilisait précédemment du sérum de bovin comme composition-supplément aux milieux courants de culture de tissus. Ainsi, on peut ajouter de 0,1 à 40% en volume de la formulation io ci-dessus à des milieux normaux de culture de tissus, pour une large variété de lignées de cellules qui auraient autrement dû se développer avec un volume égal d'une addition de sérum animal. Les conditions de croissance utilisées pour les cellules sont essentiellement les mêmes que celles que l'on utilise quand le supplément est constitué 15 par du sérum animal seul.
Les conditions courantes de culture des tissus sont utilisées quand les compositions-suppléments de cette invention sont mélangées avec des milieux de culture de tissus et utilisées pour le développement des cellules dans des cultures de tissus. Par exemple, on peut 20 utiliser des températures de culture courantes de 30 à 38° C. Les durées de croissance des cellules varient considérablement, elles sont en général de six heures et plus. Les types de culture de cellules peuvent être l'un quelconque des types normaux utilisés, y compris la culture en suspension, la croissance de cellules fixées sur un subs-25 trat, la croissance de cellules fixées sur un grain microtransporteur, la croissance sur de l'agar mou, la croissance de cellules avec du collagène ou d'autres supports formant biomatrice. On peut utiliser les techniques de culture en tambour, secoueuse, ou en suspension immobile. Les milieux auxquels on a ajouté la composition-supplément 30 de l'invention sont de préférence maintenues à un pH de 6,5 à 7,8 environ pour obtenir une croissance maximale des cellules. Les tampons normalement utilisés dans les milieux tels que F12 ou milieux Eagle modifiés tamponnent les milieux de culture de cellules de tissus animaux à un pH de l'ordre physiologique. 35 L'atmosphère gazeuse qui règne au-dessus des mélanges de culture, mentionnée ci-dessus, peut être celle que l'on utilise couramment pour la lignée de cellules particulière que l'on cultive. Ainsi, on peut utiliser des atmosphères contenant du dioxyde de carbone à raison de 0 à 15% comme atmosphère de mélanges gazeux conte-40 nant de l'oxygène, de l'azote, du dioxyde de carbone et de l'air.
Les variations recommandées à partir des proportions indiquées plus haut dans la formulation de la composition-supplément recommandée peuvent être de l'ordre indiqué ci-dessous:
Ordre de grandeur 5-25%
mg/l 5-10 20-100 2-100 2-100 0,013-013 1,4-140
45 Composants Veau nouveau-né
Insuline Transferrine ! EGF ECGS
Acide sélénieux o-Phosphoryléthanolamine
1261,12 2,86 0,059 0,87 0,11 77,07 0,51 1176
Eau distillée déminéralisée ayant une résistivité supérieure à 8 mégohms, quantité suffisant (q.s.) pour arriver à 1 litre
La formulation recommandée peut être réalisée en un lot important ou en faibles quantités, par exemple 1 litre, les quantités étant
L-3,5,3'-triiodothyrosine
6,73
X
10"
"'-6,73
X
io-4
55 Hydrocortisone
3,46
X
10'
-"-3,46
X
10~2
Œstradiol 17
2,72
X
10"
-"-2,72
X
10-2
Progestérone
3,15
X
10"
-"-3,15
X
10-2
Testostérone
2,88
X
io-
OO OO
X
10~2
Le reste des composants, qui sont des additifs courants que l'on 60 introduit dans les milieux de culture de tissus, peut varier dans une mesure plus large et une plus grande possibilité de substitution que les composants énumérés ci-dessus. Ces composants restants sont ceux qui sont énumérés en supplément dans la formulation 1 comme sels minéraux, acides aminés, vitamines et composants de natures di-65 verses.
Les proportions de chacun des composants peuvent varier, en dehors des ordres de grandeur indiqués, pour certaines lignées de cellules.
7
666048
Dans la formulation de la composition-supplément, on mélange les matières d'une manière courante quelconque. Toutefois, il est préférable de filtrer la matière totale après mélange afin de réaliser la stérilisation finale.
Une méthode recommandée de réaliser la formulation 1 préférée est exposée dans l'exemple 1 ci-dessous :
Exemple 1:
La composition-supplément avec les proportions de composants dans la formulation 1 est réalisée comme suit:
1. On dégèle du sérum de veau nouveau-né congelé et le chauffe à 37° C pour assurer la solubilisation des globulines insolubles à froid.
2. On dissout les sels minéraux, les acides aminés, les vitamines et les composants de diverses natures dans l'eau distillée déminéralisée, à une température de l'ordre de 31 à 35° C, pour former une solution.
3. On prélève une fraction (25%) de la solution de la phase 2 pour solubilisation des composants restants. Le sérum de veau nou-veau-né est ajouté à cette fraction, de façon à obtenir une concentration finale de 2% en volume.
4. On prépare des solutions de réserve des composants suivants, en utilisant de l'eau distillée déminéralisée: insuline bovine (25 g/1); transferrine (25 g/1); EGF, qualité récepteur (10 mg/1); ECGS
(1,5 g/1); acide sélénieux (16,12 mg/1); o-phosphoryléthanolamine (56,44 g/1) dans de l'hydroxyde de sodium; triiodothyroxine (168,25 mg/1) et, dans l'éthanol absolu: hydrocortisone (4,12 mg/1); œstradiol 17 (3,41 mg/1); progestérone (3,93 mg/1); testostérone (3,61 mg/1).
5. On ajoute lentement le volume approprié de chacune des solutions de réserve, en agitant constamment, à la solution de la phase 2, dans l'ordre suivant: insuline, transferrine, EGF, ECGS, acide sélénieux, o-phosphoryléthanolamine, triiodothyroxine en les diluant d'abord dans un petit volume de solution de la phase 2 avant l'addition à la formulation finale. Dans des conditions similaires, l'hydro-cortisone, l'œstradiol, la progestérone et la testostérone sont dilués dans la solution de la phase 2 avant d'être ajoutés à la formulation finale.
6. Le sérum de veau nouveau-né chauffé à 37° C est ajouté lentement, tout en agitant.
7. Le pH final de la formulation est de l'ordre de pH 7,2 à 8, et elle a une osmolarité de 330 à 350 milliosmoles.
8. La solution subit une double filtration dans un filtre à 0,2 micron de façon à réaslier un produit final stérolisé ayant la composition de la formulation 1.
On a cultivé, dans des exemples spécifiques d'utilisation de la composition-supplément de sérum universel recommandée de la première formulation ci-dessus, plusieurs lignées de cellules, comme suit:
Exemple 2:
On a utilisé la composition-supplément pour milieu de culture ayant la formulation 1 en rapport avec le développement de BHK-21, cellules de la collection de l'American Type Culture, Rockville, MD ATCC N° CCL-10 (cellules de reins de jeunes hamsters). On introduit en composition-supplément 10% de sérum de veau dans le milieu Eagle de Dulbecco modifié (DMEM), en un volume de 5 ml chaque fois, dans une première série de boîtes de Pétri de 60 mm. Les cellules ont été cultivées pendant 6 jours à 37° C dans une ambiance de 5% C02/95% d'air, humidifiée.
Dans une seconde série de boîtes de Pétri de 60 mm, on a cultivé des cellules BHK-21, dans les mêmes conditions, dans du DMEM, comprenant 10% de la composition-supplément de culture de la formulation 1 de l'invention.
Les première et seconde séries ont été composées de plusieurs boîtes de Pétri dans chacun des lots A, B et C de composition-supplément et des lots A, B et C de milieu au sérum de veau modifié. Au bout de 3 jours et d'environ 5 jours, on^a remplacé le milieu comprenant la composition-supplément de formulation 1 et le milieu contenant du sérum par une quantité fraîche de chacun dans chaque boîte.
L'avantage de la substitution de la composition-supplément dans 5 la culture des cellules BHK-21 est illustré dans le graphique de la figure 1. Ainsi, la durée de génération de BHK-21 dans la composition-supplément au milieu de culture des cellules a été, suivant les constatations, de 13,1 heures que l'on doit comparer avec la durée de 16,5 heures, trouvée dans le milieu additionné de sérum de veau à io 10%. La durée de génération des cellules, ou temps nécessaire pour le doublement des cellules, est utilisée pour mesurer la vitesse de croissance, ou vitesse de doublement de la population cellulaire. La durée de génération des cellules est par suite une mesure quantitative de l'aptitude à la promotion de la croissance de la composition-i5 supplément au milieu pour culture des tissus. La densité des cellules au sixième jour est de 2,23 x 105 cellules par cm2 avec un supplément de 10% de la formulation 1 pour la culture des cellules dans le DMEM, et de 1,59 x 105 cellules par cm2 avec 10% de sérum de veau dans le DMEM.
20 De même, la formulation 1 est apparue comme étant une composition-supplément sensiblement universelle de croissance des cellules à ajouter aux milieux de culture de tissus.
On peut citer, comme autres cellules que l'on a cultivées avec des résultats positifs en utilisant la formulation 1 comme composition-25 supplément, les cellules suivantes:
A 431 : adénocarcinome épidermoïde humain BALB 3T3: fibroblaste de l'embryon de souris C6: gliome du rat CV-1 : rein du singe vert africain 30 Endothéliales (non transformées) - endothéliales aortiques de la souris
F9: carcinome embryonique de la souris FS-1230: fibroblastes diploïdes humains Hela: carcinome cervical humain 35 Hybridoma Sp-2: apparenté au myélome de la souris - production continue d'anticorps
Hybridoma NS-1 : apparenté au myélome de la souris HB: carcinome épidermoïde oral humain L6: myoblaste de muscle de squelette du rat 40 MCF-7 : carcinome du sein humain Sarcome de la souris
Myoblastoïde (non transformé) - Murine j SV403T3 : SV-40, BALB C 3T3 transformé par virus TR-M: tumeur testiculaire du rat 45 TR-ST : tumeur testiculaire du rat TM-4: sertoli de la souris TR-1 : cellule testiculaire du rat (non transformée)
VERO: rein de singe vert africain WI-38: fibroblaste diploide humain MRC-5 : fibroblaste diploïde humain
OMTW9PL: tumeur mammaire du rat - 6 clones indépendants Cultures primaires de fibroblastes humains Cultures primaires de spécimens de biopsies de tumeurs humaines
55
Bien que certaines lignées de cellules telles que celles du fibroblaste de l'embryon du rat ne se développent habituellement pas dans le milieu de culture des cellules mentionnées ci-dessus, on considère cependant que cette composition-supplément est universelle 60 du fait qu'elle provoque le développement d'une grande variété de cultures de cellules.
Le terme «croissance» tel qu'il est utilisé dans ce brevet se rapporte à la multiplication des cellules qui prennent une grande densité quand on les cultive sur des supports solides ou librement en suspen-65 sion. Quand la composition-supplément suivant l'invention est utilisée avec des milieux courants du type décrit ci-dessus, dans les proportions largement indiquées de 0,1 à 40% de la composition-supplément de l'invention dans le milieu de culture pour 99,9 à 60%
666 048
8
du milieu, et de préférence de 1 à 25% en volume de la composition-supplément de l'invention pour 99 à 75% en volume du milieu de culture, la croissance des cellules d'une large variété de lignées est fortement favorisée. La composition-supplément suivant l'invention peut être conservée pendant de longues périodes de temps sans perte notable de son activité. Par exemple, la composition-supplément peut être congelée à —20° C. On a constaté que cette composition-supplément est stable à des températures de 4° C pendant des durées d'au moins quatre semaines. Même après mélange avec des milieux courants, la composition-supplément conserve ses activités favorisant la croissance des cellules pendant de longues durées. Bien que cette composition-supplément ait été décrite comme une solution séparée destinée à être ajoutée à un milieu de culture courant, on comprendra facilement que la composition-supplément elle-même 5 peut être formée directement dans des milieux courants par addition des portions nécessaires à ces derniers. Dans tous les cas, il est préférable d'ajouter le sérum utilisé comme étape finale après avoir solubilisé au moins une portion du sérum dans une fraction d'un mélange de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines et de com-îo posants de natures diverses.
R
1 feuille dessin
Claims (16)
1,683
X
IO"4
Hydrocortisone
1. Composition-supplément pour un milieu de croissance destiné au développement de cellules in vitro, caractérisée en ce que cette composition-supplément est constituée essentiellement d'une quantité mineure de sérum animal et d'une proportion majeure d'un mélange d'hormones peptidiques et thyroïdiennes, d'oestrogènes, d'androgènes, de corticoïdes, de produits nutritifs, de facteurs de croissance, de facteurs de transport, de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines, de sucre et de faibles quantités d'autres composants dans une phase aqueuse.
-2
Composants Sérum animal
Insuline Transferrine EGF ECGS
Acide sélénieux o-Phosphoryléthanolamine
2,88
X
-2
Testostérone
-2
Progestérone
2,72
X
10_
-2
Œstradiol 17
2. Composition finale dans laquelle est intrégrée la composition-supplément selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une combinaison comprenant a) de 99,9 à 60% en volume d'un milieu de culture de cellules contenant tous les composants de croissance nécessaires pour la culture de cellules animales quand il a été combiné avec un sérum animal, et b) de 0,1 à 40% en volume de la composition-supplément selon la revendication 1.
2
REVENDICATIONS
3
666048
3,61
X
3,93
X
3,41
X
-"-3,15
X
3,15
X
10_
3,46
X
3. Utilisation de la composition-supplément selon la revendication 1 pour remplacer partiellement le sérum animal dans la culture des tissus et cellules d'un milieu de croissance destiné au développement de cellules in vitro.
4,33
X
"4-2,88
X
"4-2,72
X
"4-3,46
X
-4
Hydrocortisone
4. Utilisation de la composition finale selon la revendication 2 pour faciliter la croissance d'une grande variété de types différents de cellules y compris les cellules primaires, transformées ou non transformées, d'origine aussi bien fibroblastoïde qu'épithélioïde, et des souches continues de cellules transformées ou non transformées en vue de permettre une croissance rapide et prolifique des cellules in vitro.
5. Procédé de préparation de la composition-supplément selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à solubiliser le sérum animal dans une portion de cette com-position-supplément, à compléter le mélange de composants de la composition-supplément et, comme étape essentiellement finale, à ajouter le reste du sérum animal, et à filtrer la composition-supplément pour la stériliser.
6,24 153,73 10,50 9,32 24,58 10,30 5,26 14,67 2,76 25,56 3,13 3,47 24,17 7,36 8,34 1,43 3,81 8,20
6,73
X
6. Composition-supplément selon la revendication 1, caractérisée en ce que sérum animal, hormones, œstrogènes, androgènes, corticoïdes, facteurs de croissance, produits nutritifs et facteurs de transport sont constitués essentiellement par: sérum de mammifère, insuline, transferrine, EGF, ECGS, acide sélénieux, o-phosphoryl-éthanolamine, triiodothyroxine, hydrocortisone, œstradiol 17, progestérone et testostérone.
"7-6,73
X
7. Composition-supplément selon la revendication 6, caractérisée en ce que le sérum est du sérum de bovin.
8. Composition-supplément selon la revendication 7, caractérisée en ce que les composants sont utilisés dans les proportions suivantes du supplément:
Composants Sérum de bovin
Insuline Transferrine EGF ECGS
Acide sélénieux o-Phosphoryléthanolamine
Ordre de grandeur 5-25% en volume mg II 5-10 20-100 2-100 2-100 0,013-0,13 1,4-140
Ordre de grandeur
L-3,5,3'-triiodothyroxine
9. Composition-supplément selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement des composants suivants:
Vitamines
45 d-Biotine 0,0051
D-Pantothénate de Ca 0,18
Chlorure de choline 9,77
Acide folique 0,93
Myo-inositol 12,61
50 Nicotinamide 0,026
Pyridoxine HCl 0,043
Riboflavine 0,026
Thiamine HCl 0,24
Vitamine B12 0,95 Composants de natures diverses
Glucose 1261,12
Hypoxanthine 2,86
Acide linoléique 0,059
60 Rouge de phénol 0,87
Putrescine 2HC1 0,11
Pyruvate de sodium 77,07
Thymidine 0,51
Bicarbonate de sodium 1176 65 Eau distillée q.s. pour 1 litre
10. Composition-supplément selon la revendication 9, caractérisée en ce que le sérum animal est du sérum de veau nouveau-né et est présent particulièrement dans la proportion de 5 à 25% en volume.
10"3
23,24 0,00174 0,58 156,56 85,40 5,319.30 , 99,40 0,60
10~3
Testostérone
10"3
Progestérone
10"3
Œstradiol 17
10"
10"
10"
10"
10"
10"
10"
10"
11. Composition finale selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend de 1 à 25% en volume de la composition-supplément selon la revendication 1 en volume de la solution totale du milieu.
12. Composition finale selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la composition-supplément selon la revendication 6.
13. Composition finale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le sérum est du sérum de veau nouveau-né.
14. Composition finale selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend la composition-supplément selon la revendication 9.
15. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'on utilise une composition-supplément selon la revendication 6.
15 Sels minéraux CaCl2
CuS04 • 5H20 FeSo4 ■ 7H20 KCl
20 MgCl2 • 6H20 NaCl Na2HP04 ZnS04 • 7H20
Acides aminés
25
L-alanine L-arginine HCl L-asparagine Acide L-aspartique 30 L-cystéine HC1,H20 Acide L-glutamique Glycine
L-histidine HC1,H20 L-isoleucine 35 L-lysineHCl L-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine 40 L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine L-valine
Concentration 0,1 à 40% en volume mg II 25 50 5
77,5 0,1612 56,44
L-3,5,3'-triiodothyroxine
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le sérum est du sérum de veau nouveau-né.
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-
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