JPH0728728B2 - 細胞をインビトロで生長させるための細胞生長培地補足剤およびそのための方法 - Google Patents

細胞をインビトロで生長させるための細胞生長培地補足剤およびそのための方法

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JPH0728728B2 JP58168520A JP16852083A JPH0728728B2 JP H0728728 B2 JPH0728728 B2 JP H0728728B2 JP 58168520 A JP58168520 A JP 58168520A JP 16852083 A JP16852083 A JP 16852083A JP H0728728 B2 JPH0728728 B2 JP H0728728B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 動物血清及び特に胎児の子牛血清は普通の組織培地への
補足剤として知られている。たとえば、牛血清をハム
（Ham）F12、ダルベコ（Dulbecco）部分修正イーグル培
地等のような標準組織織生長培地中で動物細胞の組織培
養に20容量％、しばしば10容量％まで添加することが知
られている。該血清は仮にも公知の補足剤では容易に与
えられない、組織培養のための数種類の必須物質を与え
るように思われる。生育培地への補足剤として動物血清
を使用することは、細胞が分化機能を示し、所望の濃度
まで増大し、かつ長期間の生長及び生存力を維持するの
をしばしば促進するものである。
しかしながら、動物血清の使用には組織培養における若
干の問題点が存在し得る。それらの問題点の中の主なも
のは血清の組成における変動性である。例えば、血清の
個々のロツトの生長促進能は非常に大きく変動し得るも
のである。動物血清の製造業者は、多数の動物からの血
清をプールすること及び公知数量の動物の供与獣群を維
持すること及び（又は）ホルモン、生育因子及び他の血
清成分のレベルをスクリーニング又は検定することによ
つて、このような変動を最小限度に押えることを試みて
いる。しかしながら、このような試みは費用のかかるも
のであり、又変動性の問題を軽減するのに常に効果的で
あることは限らない。これらの問題はユーザーによる使
用を制限し、かつ調査結果の変動をもたらす。しばしば
ユーザーは時間と金のかかる使用に先立つて血清の広範
囲にわたる試験を行わなければならない。牛血清の量的
な利用価値も牛肉産業の景気不景気に左右されるので問
題である。例えば、胎児の子牛血清及び他の牛血清は副
製品としての利用価値を有し、かつ周期的に変動する獣
群の大きさに関連している。
こうして、標準生長培地への補足剤としての動物血清の
使用が欠点を有するものであることが認識された。他
方、組織培養において使用される血清の量を減らすか又
は血清を全く使用しない試みもなされた。血清を含有し
ない生長培地が設計されたが、これは特定の型の詳細に
特有のものである。
同様に、特定の細胞系のために設計された他の補足剤に
おける生長因子の添加に伴つて通常添加される血清の量
も減少せしめられた。こうして、過去、標準組織生長に
おいて血清量はカツトされるか又は排除されたが、この
ようなことは特定の型の細胞に関連していた。すなわ
ち、先行技術は、線維芽細胞様及び上皮様起始の変換し
た及び変換していない原始細胞、並びに変換した及び変
換していない継続細胞系を包含する広範囲に異なる型の
細胞と共に使用するために産業上受け入れられる、組織
培養のための実質上普遍的な補足剤を提供し得なかつた
のである。
（発明の概要） 本発明の目的は、動物血清を含有する細胞生長培地補足
剤、及び補足剤が培地中で細胞の生長を促進するのに有
用である動物血清成分のための基質の組合せを提供する
ことにある。
本発明の他の目的は、細胞生長に使用するための通常の
組織培地と組み合わせて、前記目的に従つた細胞生長培
地促進剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、本発明の細胞生長培地補足剤を使
用する有利な方法を提供することにある。
本発明によれば、細胞生長培地補足剤は、原始及び継続
細胞培養系、すなわち線維芽細胞様細胞及び上皮様細胞
からの変換した及び変換していない細胞系において非常
に広範囲の細胞型の急速かつ豊かな生長を可能にする、
水性塩基中の、チロイド及びペプチドホルモン、コルチ
コイド、アンドロゲン、エストロゲン、生長因子、栄養
及び輸送因子、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖から選
択される大量成分に加えて動物血清、好ましくは新生子
牛血清の少量成分、及び他の微量成分から成る。
好ましい態様において、用いられる血清は新生子牛血清
であり、ペプチドホルモンはインシユリンであり、輸送
因子はトランスフエリンであり、生長因子は表皮生長因
子及び内皮細胞生長補足剤であり、一方栄養因子は亜セ
レン酸及びＯ−ホスホリル−エタノールアミンを含有
し、チロイド（甲状腺）ホルモンはトリヨードチロキシ
ンであり、コルチコイドはヒドロコルチゾンであり、エ
ストロゲンはエストラジオール17、プロゲステロンであ
り、アンドロゲンはテストステロである。
好ましくは本発明の補足剤は調合され、完全に混合さ
れ、過工程が該混合物を滅菌するために使用される。
過は好ましくは補足剤の調合の最後の工程として行わ
れる。補足剤がロツトからロツトへの血清組成の変動と
関連した問題を減少するか又は除去し得ることが本発明
の１つの特徴である。使用される少量の血清は実質的な
影響なしに変えることができる。というのは血清はわず
かな量、しばしば普通に用いられる量よりも1/4又はそ
れ以下の組織培養成分にすぎないからである。驚くべき
ことに、たとえわずかな量の血清が使用されるとして
も、血清は例えば細胞結合因子及び水不溶性物質のため
の担体蛋白質のような普遍的な組織生長培地のために必
要な成分を与えるのである。少量の血清ベースの添加は
細胞増殖のための他の因子を与える。血清の量が少ない
ために、血清中に通常含有されている有毒物質のレベル
は、減少する。最終細胞培養中の蛋白質レベルは血清単
独の使用によつて減少するので、最終産物からの蛋白質
の分離は容易になる。培地中で生長した細胞産物の濃度
は、本発明の補足剤が生長を強化するために用いられた
ときに増大せしめることができる。同様に、細胞生長培
地の全蛋白質含量の減少は所望の細胞産物の回収及び精
製の効率及び容易性を高めることができる。このことは
製薬及びワクチン工業において非常に重要である。一定
の産物の再現性は本発明の補足剤中で高められる。この
ことは全動物血清の種々のロツトにおいて通常観察され
る生長促進の変動性を排除することができ、かつ望まし
いロツトを見い出すために多数のロツトの血清を試験す
る必要性を排除することができる。組織培養設備の全般
にわたる操作における費用と時間の減少を獲得すること
ができる。
（好ましい態様の説明） 本発明の細胞生長培地補足剤は細胞及び組織培養におい
て動物血清の代りに用いられる。通常、動物血清は標準
組織培地の５〜20容量％の量で細胞培養中に使用され
る。しかし本発明の細胞生長培地補足剤を標準組織培地
の１〜25容量％の量で用いることが好ましい。限定され
た細胞系において、標準培地に対する高割合又は低割合
の補足剤が例えば99.9％〜60％の標準培地に対して0.1
％〜40％の補足剤のように使用することができる。血清
のみと一緒に先に使用された本発明の補足剤と併用する
のに適したそのような標準組織培地は限定される訳では
ないが、次の成分を含有する。
McCoy′s 5a培地 McCoy′ T.A,Maxwell.M.及びKruse,P.F.,Proc.Soc.Expe
r.Biol.and Med.,100,115−118（1959）． 最少必須培地−MEM Eagle,H.,Science 130, 432（1959） 部分修正イーグル培地 Daniel,M.D.及びMelendez,L.V.,Proc.of the Soc.for E
xp.Biol.and Med. 127,No.3（1969） ダルベコ部分修正イーグル培地 Dulbecco,R.及びFreeman,G.Virology ８,396（1959） Smith,J.D.,Freeman,G.,Vogt,M.及びDulbecco,R.,Virol
ogy 12,185−196（1960） 組織培養基準委員会,In Vitro ６,No.2,93 Ｌ−15（ライボビツツ）培地 Leidovitz,A.,Am.J.Hyg・78,173−180（1963） 栄養素混合物−Ｆ−10及びＦ−12倍地 Ham,R.G.,Exp.Cell Res.29, 515−526（1963） Ham,R.G.,Proc.Nat.Acad.Sci.53,288−293（1965） ウエイマウス培地 Waymouth,C.,J.Nat.Cancer Inst. 22,1003−1017（195
9） このような培地の水性調合物の例は次のとおりである。
ハムの栄養培地Ｆ−12（Gibco Laboratoriesから入手可
能）成 分 mg/L 無機塩： CaCl2・2H2O 44.00 CuSO4・5H2O8 0.00249 FeSO4・7H2O 0.834 KCl 223.60 MgCl2・6H2O 122.00 NaCl 7599.00 NaHCO3 1176.00 Na2HPO4・7H2O 268.00 ZnSO4・7H2Ob 0.863 他の成分： Ｄ−グルコース 1802.00 ヒポキサンチン 4.10 リノール酸 0.084 リポ酸 0.21 フエノール赤 1.20 プトレツシン2HCl 0.161 ピルビン酸ナトリウム 110.00 チミジン 0.73 アミノ酸： Ｌ−アラニン 8.90 Ｌ−アルギニンHCl 211.00 Ｌ−アスパラギン・H2Ob 15.01 Ｌ−アスパラギン酸 13.30 Ｌ−システイン−HCl・H2O 35.12 Ｌ−グルタミン酸 14.70 Ｌ−グルタミン 146.00 グリシン 750 Ｌ−ヒスチジンHCl・H2O 20.96 Ｌ−イソロイシン 3.94 Ｌ−ロイシン 13.10 Ｌ−リジンHCl 36.50 Ｌ−メチオニン 4.48 Ｌ−フエニルアラニン 4.96 Ｌ−プロリン 34.50 Ｌ−セリン 10.50 Ｌ−スレオニン 11.90 Ｌ−トリプトフアン 2.04 Ｌ−チロシン 5.40 Ｌ−バリン 11.70 ビタミン： ビオチン 0.0073 Ｄ−パントテン酸カルシウムｂ 0.4800 塩化コリン 13.9600 葉酸 1.3000 ｉ−イノシトール 18.000 ナイアミンアミド 0.0370 ピリドキシンHCl 0.0620 リボフラビン 0.0380 チアミンHCl 0.3400 ビタミンB12 1.3600 ダルベコ部分修正イーグル培地（水中）成 分 mg/L 無機塩： CaCl2（無水） 200.00 Fe（NO3）３・9H2O 0.10 KCl 400.00 MgSO4・7H2O 200.00 NaCl 6400.00 NaHCO3 3700.00 Na2HPO4・H2O 125.00a 他の成分： Ｄ−グルコース 1000.00 フエノール赤 15.00 ピルビン酸ナトリウム 110.00 アミノ酸： Ｌ−アルギニンHCl 84.00 Ｌ−シスチン 48.00 Ｌ−グルタミン 584.00 グリシン 30.00 Ｌ−ヒスチジンHCl・H2O 42.00 Ｌ−イソロイシン 105.00 Ｌ−ロイシン 105.00 Ｌ−リジンHCl 146.00 Ｌ−メチオニン 30.00 Ｌ−フエニルアラニン 66.00 Ｌ−セリン 42.00 Ｌ−スレオニン 95.00 Ｌ−トリプトフアン 16.00 Ｌ−チロシン 72.00 Ｌ−バリン 94.00 ビタミン： Ｄ−パントテン酸カルシウム 4.00 塩化コリン 4.00 葉酸 4.00 ミオ−イノシトール 7.20 ニコチンアミド 4.00 ピリドキサールHCl 4.00 リボフラビン 0.40 チアミンHCl 4.00 ビタミンB12 −− 上記の数値（ａ）は組織培養基準委員会、In Vitro,９,
No.6（1970）と一致している。
他の標準組織培地が細胞を生長させる本発明の補足剤に
加えて一緒に使用することができる。そのような培地に
は非常に多くの種類がある。唯１つの制約事項は動物血
清の存在下に生長を促進させることの知られた培地と一
緒に該補足剤を使用することである。
本発明の補足剤の血清部分としては新生子牛血清が好ま
しい。なぜなら、それは他の動物血清と比べてより普遍
性を有するからである。“新年”子牛血清は生後10日目
又はそれ以前の子牛から得られる。ある場合には、新生
子牛血清は他の牛血清又は他の動物血清、例えば馬血
清、牛血清、鶏血清、うさぎ血清、豚血清、羊血清、又
は山羊血清又はそれらの組合せ血清で置換することがで
きる。新生子牛血清よりも他の血清中で正常に生長する
細胞系を生長させる場合には、他の血清は本発明の細胞
生長補足剤の血清部分として用いることができる。
すべての場合において、高度の万能性を有し、かつ細胞
系の多きな多様性に関して有効である該補足剤中の成分
の適当な組合せを得ることが好ましい。したがつて、ホ
ルモン及び他の成分は、その中のいくつかはすべての細
胞系での使用を要しないかも知れないが、どれもすべて
の細胞系中の他の成分の作用を妨げないというような基
準で選択される。
本発明のペプチドホルモン成分はインシユリンを含むこ
とができる。輸送因子は同様にペプチドホルモンである
ところのトランスフエリンである。甲状腺ホルモンはト
リヨードチロキシン及びチロキシンである。
使用される生長因子は好ましくは表皮生長因子であり、
これはCR−EGFという商品名でマサチユセツツ州ウオル
サムのコラボラテイブ リサーチ社によつて市販されて
いる。このようなEGFはSavage,C.R.及びCohen,S.J Bio
l.Chem.,247,7609−7611（1972）の文献に記載されてい
る。内皮細胞生長因子を含有する、本発明において有用
な内皮細胞生長補足剤はCR−ECGという商品名で同じく
コラボラテイブリサーチ社から入手することができる。
この生長因子はさらにMaciag,T.,Cerundolo,J.,Ilsley,
S.,Kelley,P.R.,及びForand,R.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA
76,5674−5678（1979）の文献に記載されている。
使用されるアンドロゲンはテストステロン、ジヒドロテ
ストステロン、ナンドロロン及びオキシメトロンであ
り、使用されるエストロゲンはプロゲステロン、17（ベ
ータ）エストラジオール、エストロンである。
コルチコイドは好ましくはヒドロコルチゾンであるが、
しかし他の物質、例えばコルチゾン、デキサメタゾン、
プレドニゾロン及びコルチコステロンも使用することが
できる。栄養素は好ましくは亜セレン酸、Ｏ−ホスホリ
ル−エタノールアミン及び細胞内酵素作用に関与してい
る他の物質を包含する。
本発明に有用な無機塩は組織培地中に普通に用いられる
もの、例えば塩素、硫酸、リン酸等のカルシウム、銅、
鉄、マンガン、アンモニア、カリウム、マグネシウム、
ナトリウム、亜鉛塩等であり、その中のいくつかは水和
されていてもよい。
組織培地に対する慣用のアミン酸添加剤、例えばＬ−ア
ラニン、Ｌ−アルギニンHCl、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−
アスパラギン酸、Ｌ−システインHCl、H2O、Ｌ−イソロ
イシン、Ｌ−リジンHCl、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フエニ
ルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−トリプトフアン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ
−ヒスチジン及びＬ−ロイシンも同様に有用である。
必須ビタミンはｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシ
ウム、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ニコチ
ンアミド、ピリドキシンHCl、リボフラビン、チアミンH
Cl及びビタミンB12を包含する。他の種々雑多な成分は
グルコースのような糖、ヒポキサンチン、リノール酸、
フエノール赤、プトレツシン2HCl、ピルビン酸ナトリウ
ム、チミジン、アスコルビン酸、カルシフエロール、ナ
イアシン、パラ−アミノ安息香酸、ピリドキサールHC
l、ビタミンＡを包含する。好ましくは８メガオームよ
り大きい好ましい抵抗率を有する脱イオンした蒸留水が
使用される。しかし、組織培養中に普通に用いられる水
ならどのような水でも用いることができる。
上記成分はそれらの水溶性の形、例えばホルモン、アミ
ノ酸、ビタミン等の塩の形で使用することができること
を理解すべきである。
本発明の補足剤は好ましくは組織培養中に普通に用いら
れるような血清の代りに使用することができる。したが
つて、好ましくは該補足剤は慣用の組織培地の全溶液の
１〜25容量％の量で用いることができ、例えばハムF12
又はイーグル培地中で例えば1:99〜1:4の割合で用いる
ことができる。それ故、子牛血清のレベルは、動物血清
が子牛血清である場合には、好ましくは全組織培地の0.
25〜6.25容量％のレベルである。この全組織培地中の子
牛血清の量は、従来、動物血清が10〜25容量％の量を加
えられていたことと比較すると、非常に少量である。
したがつて、本発明における血清のこのようなレベルは
有毒な因子のいかなる実質的な添加をも避けるのに十分
な低さであり、何らかの影響力を有する血清コンシステ
シン−の変動を減少させ、かつ完全に蛋白質をベースと
した物質以外の、細胞生長に必要な物質を与えるもので
ある。
本発明の好ましい調合物において、細胞生長培地補足剤
は以下のとおりに調合され、かつ本発明の好ましい普遍
的な血清置換物であると考えられる。
調合物１ 成 分 濃 度 新生子牛血清 補足剤の25容量％ mg/ インシユリン 25 トランスフエリン 50 EGF ５ ECGS 77.5 亜セレン酸 0.1612 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン 56.44 Ｌ−3,5,3′トリヨードチロキシン 1.683×10-4 ヒドロコルチゾン 4.33×10-3 エストラジオール17 3.41×10-3 プロゲステロン 3.93×10-3 テストステロン 3.61×10-3 無機塩 mg/ CaCl2 23.24 CuSO4・5H2O 0.00174 FeSO4・7H2O 0.58 KCl 156.56 MgCl2・6H2O 85.40 NaCl 5,319.30 Na2HPO4 99.40 ZnSO4・7H2O 0.60 アミノ酸 Ｌ−アラニン 6.24 Ｌ−アルギニンHCl 153.73 Ｌ−アスパラギン 10.50 Ｌ−アスパラギン酸 9.32 Ｌ−システインHCl・H2O 24.58 Ｌ−グルタミン酸 10.30 グリシン 5.26 Ｌ−ヒスチジンHCl・H2O 14.67 Ｌ−イソロイシン 2.76 Ｌ−リジンHCl 25.56 Ｌ−メチオニン 3.13 Ｌ−フエニルアラニン 3.47 Ｌ−プロリン 24.17 Ｌ−セリン 7.36 Ｌ−スレオニン 8.34 Ｌ−トリプトフアン 1.43 Ｌ−チロシン 3.81 Ｌ−バリン 8.20 ビタミン ｄ−ビオチン 0.0051 Ｄ−パントテン酸カルシウム 0.18 塩化コリン 9.77 葉酸 0.93 ミオ−イノシトール 12.61 ニコチンアミド 0.026 ピリドキシンHCl 0.043 リボフラビン 0.026 チアミンHCl 0.24 ビタミンB12 0.95 他の種々雑多な成分 グルコース 1,261.12 ヒポキサンチン 2.86 リノール酸 0.059 フエノール赤 0.87 プトレツシン2HCl 0.11 ピルジン酸ナトリウム 77.07 チミジン 0.51 重炭酸ナトリウム 1176. １の容量に対して８メガオームより大きい抵抗率を有
する脱イオンした蒸留水 好ましい調合物は大きなバツチ又は小さな量、例えば上
の調合物１中に記載した割合に維持されるように与えら
れた量を有する１リツトルの容量に作ることができる。
このような特定の調合物が好ましいものであることが見
い出されたが、一方適当に変化させることも可能であ
る。上述したように、他の動物血清を新生子牛血清の代
りに使用することができる。牛血清が上述したように補
足剤として組織培地に対して使用される場合においても
上記の特定の調合物を使用するこができる。例えば、上
記調合物0.1〜40容量％を、さもなければ動物血清の等
容量の添加で生長せしめられたであろう多種類の細胞系
に対する標準組織培地に添加することができる。該細胞
に対して使用される生長条件は、動物血清単独が補足剤
として用いられる場合に使用される生長条件と実質的に
同一である。
本発明の補足剤が組織培地と混合され、かつ組織培養中
で細胞を生長させるのに使用される場合は、慣用の組織
培養条件が用いられる。例えば、30〜38℃の慣用生長温
度を使用することができる。細胞生長の期間は通常６時
間又はそれ以上にかなり変動する。細胞培養の型は、懸
濁培養、基質付着細胞生長、ミクロキヤリヤービード付
着細胞生長、軟質寒天中での生長、コラーゲン及び他の
バイオマトリツクス支持体を用いる細胞生長を包含する
いずれかの標準型を使用することができる。ローラー、
シエーカー又は静止状態の懸濁培養技術を用いることが
できる。本発明の補足剤で補足される培地は好ましくは
最大細胞生長のために約6.5〜7.8のpHに維持される。通
常、F12又は部分修正イーグル培地緩衝液のような普通
の培地中の緩衝液は動物細胞組織生長培地を生理学的範
囲内のpHに維持せしめる。本発明の生長混合物の上方の
気体雰囲気は生長している特別の細胞系に対して慣用的
に使用されるものである。例えば０〜15％の二酸化炭素
雰囲気を使用することができ、また酵素、窒素、二酸化
炭素及び空気の混合ガス雰囲気を使用することもでき
る。
上記の好ましい補足剤調合物中に示された量は好ましく
は下表に示すとおり変動させることができる。成 分 範 囲 新生子牛血清 ５〜25容量％ mg/ インシユリン ５−10 トランスフエリン 20−100 EGF ２−100 ECGS ２−100 亜セレン酸 0.013−0.13 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン 1.4−140 Ｌ−3,5,3′トリヨードチロキシン6.73×10-7−6.73×1
0-4 ヒドロコルチゾン 3.46×10-4−3.46×10-2 エストラジオール17 2.72×10-4−2.72×10-2 プロゲステロン 3.15×10-4−3.15×10-2 テストステロン 2.88×10-4−2.88×10-2 組織培地への慣用添加剤である残りの成分の量は、上に
表示した成分の場合と比べてより大きな程度まで変動さ
せることができる。これらの残りの成分は調合物１にお
いて無機塩、アミノ酸、ビタミン及び他の種々雑多な成
分の下方に追加的に表示されたものである。
該成分の各々の量は若干の細胞系に関しては好ましい範
囲を越えて変動することができる。
本発明による好ましい細胞生長培地補足剤の調合におい
て、原料は慣用の方法で混合される。しかし、目標の滅
菌を付与するために混合後に該原料を過することが好
ましい。
好ましい調合物１を作る好ましい方法は下の例１で説明
する。
例１ 調合物１中に示された成分の量を有する本発明の細胞生
長培地補足剤は次のとおり調合される。
1. 凍結した新生子牛血清を解凍して37℃に温め、それ
によつて冷却した不溶性グロブリンの溶解を保証する。
2. 無機塩、アミノ酸、ビタミン及び他の種々雑多な成
分を31〜35℃の範囲の温度で脱イオンした蒸留水に溶か
して溶液をつくる。
3. 第２工程における溶液のアリコート（〜25％）を残
余成分の溶解のために除去する。このアリコートに新生
子牛血清を２容量％の最終濃度になるまで添加する。
4. 次の成分から成るストツク溶液を、脱イオンした蒸
留水中の牛インシユリン（25g/）、トランスフエリン
（25g/）、BGF、レセプタ グレード（Receptor Grad
e）（10mg/）、ECGS（1.5g/）、亜セレン酸（16.12
mg/）、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン（56.44g/
）（水酸化ナトリウム中）、トリヨードチロキシン
（168.25μg/）並びに無水エタノール中のヒドロコル
チゾン（4.12mg/）、エストラジオール17（3.41mg/
）、プロゲステロン（3.93mg/）、テストステロン
（3.61mg/）を用いて作る。
5. 適当量の各ストツク溶液を撹拌しながら第２工程の
溶液に次の順序でゆつくりと添加する。すなわち、イン
シユリン、トランスフエリン、EGF、ECGS、亜セレン
酸、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン、トリヨードチロ
キシンを最終調合物への添加前に第２工程の少量の溶液
中でまず最初に希釈する。同様にして、ヒドロコルチゾ
ン、エストラジオール、プロゲステロン及びテストステ
ロンを最終調合物への添加前に第２工程の溶液中で希釈
する。
6. 37℃に加熱した新生子牛血清を撹拌しながらゆつく
りと添加する。
7. 調合物の最終pHは7.2〜8.0の範囲であり、330〜350
ミリオスモルの容量オスモル濃度を有する。
8. 最終溶液を0.2ミクロンのフイルターを通して２回
過して上記の調合物１の組成を有する滅菌した最終製
品を得る。
上記の第１調合物の好ましい普遍的血清補足剤を用いる
特定の例において、いくつかの細胞系が以下のとおり生
長した。
例２ BHK−21細胞アメリカ型培養コレクシヨン、Rockuille,M
DATCC No. CCL−10（生まれたてのハムスターの腎臓細
胞）の生長に関連して混合物１の生長培地補足剤を使用
する。60mmのペトリ皿の第１群において各5mlの容量中
のダルベコ部分修正イーグル培地（DMEM）を10％子牛血
清で補足する。その細胞を湿つた５％CO2−95％空気環
境中で37℃で６日間生長させる。
60mmのペトリ皿の第２群において、BHK−21細胞を同じ
条件下で、本発明の調合物１の生長補足剤10％で補足さ
れたDMEM中で生長させる。
第１及び第２群をいくつかのペトリ皿で構成し、それぞ
れ補足剤のロツトＡ、Ｂ、Ｃ及び子牛血清部分修正培地
のロツトＡ、Ｂ、Ｃとする。３日目及びほぼ５日目に、
調合物１補足剤−培地及び血清−培地を各皿中のそれぞ
れの新鮮なストツクと取り換える。
BHK−21細胞生長に対する本発明の補足剤の置換適性を
図面のグラフで示す。例えば、本発明の細胞生長培地補
足剤中のBHK−21世代時間は、10％子牛血清で補足した
培地中の16.5時間と比較して13.1時間であることがわか
る。細胞世代時間又は細胞倍加時間は細胞集団の生長速
度又は倍加速度を測定するために用いられる。例えば、
細胞世代時間は組織培地補足剤の生長促進能の量的割合
である。６日目の細胞密度はDMEM中の調合物１の10％細
胞生長補足剤において2.23×105細胞/cm2であり、またD
MEM中の10％の子牛血清において1.59×105細胞/cm2であ
る。
したがつて、調合物１は組織培地への添加のための実質
上普遍的な細胞生長補足剤であることが示された。
本発明の補足剤として調合物１の処方箋を使用してプラ
スの効果を有しながら生長した他の細胞は以下に示すと
おりのものである。
A431−ヒト類表皮腺癌 BALB3T3−マウス胎芽線維芽細胞 C6−ラツト神経膠腫 CV−１−アフリカグリーン猿腎臓 内皮細胞（非変換）−マウス大動脈内皮細胞 E9−マウス胎芽癌 FS−1230−ヒト２倍体線維芽細胞 HeLa−ヒト頚癌 ハイブリドーマ（融合細胞腫）Sp−２−マウス骨髄腫親
−抗体産生を続行 ハイブリドーマ−NS−１親マウス骨髄腫 KB−ヒト口腔類表皮癌 L6−ラツト骨格筋筋原細胞 MCF−７−ヒト乳癌 マウス肉腫 類筋原細胞（非変換）−ネズミ SV403T−SV−40ウイルスを変換したBALBC3T3 TR−Ｍラツト睾丸腫瘍 TR−STラツト睾丸腫瘍 TM−４マウス セルトリ細胞 TR−１ラツト睾丸細胞（非変換） VERO−アフリカグリーン猿腎臓 WI−38−ヒト２倍体線維芽細胞 MRC−５−ヒト２倍体線維芽細胞 OTMW9PL−ラツト乳房腫瘍−６個の独立したクローン ヒト線維芽細胞の一次培養物 ヒト腫瘍生検標本からの一次培養物 ラツト胎芽線維芽細胞のようないくつかの細胞系は通常
本発明の細胞生長培地中で生長しないが、それでもなお
本発明の細胞生長培地は広範囲の種類の細胞培養物中で
生長を促進するので普遍的な補足剤であると考えられ
る。
本明細書中で用いられる「生長」という用語は、固体の
支持体上で又は自由に懸濁液中で生長した場合の培地中
の高密集度に対する細胞増殖を意味する。本発明の補足
剤が上記の慣用培地と一緒に、本発明の細胞生長培地補
足剤0.1〜40容量％対慣用培地99.9〜60容量％、好まし
くは本発明の補足剤１〜25容量％対慣用培地99〜75容量
％という広範囲の割合で使用される場合、広範囲の種類
の細胞系の細胞生長が促進される。本発明の補足剤は活
性の著しい損失なしに長期間保存することができる。例
えば、該補足剤は−20℃に凍結させることができる。該
補足剤は４℃の温度で少なくとも４週間は安定であるこ
とがわかつた。慣用培地と混合した後でさえ、該補足剤
は長期間にわたつて活性を促進しているその細胞生長を
維持する。該補足剤は別の独立した溶液として慣用培地
に添加されるものとして説明したが、しかし補足剤調合
物自体は慣用培地中でそこに所要量を添加することによ
つて直接作ることができる。すべての場合において、使
用される血清に最終工程として最初の溶解後に無機塩、
アミノ酸、ビタミン及び種々雑多な成分から成る混合物
のアリコート中の血清の少なくとも一部分を添加するこ
とが好ましい。
【図面の簡単な説明】
添付の図面はBHK−21細胞生長に対する本発明の補足剤
の置換適性を示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オリ−・マツクス・フリ−ドマン アメリカ合衆国マサチユ−セツツ02146ブ ルツクリン・ウオ−レン・ストリ−ト49 (56)参考文献 特開 昭49−75794（ＪＰ，Ａ) 特公 昭56−41230（ＪＰ，Ｂ２) Ｔ．Ｈ．Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ. “Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ ｔｈｏｄｓ”，39 Ｐ．369−375（1980)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞をインビトロで生長させるための細胞
    生長培地補足剤において、該補足剤が、細胞生長培地
    中、0.1〜40容量％の量で存在し、さらに、該補足剤が
    以下の成分から本質的に成ることを特徴とする前記補足
    剤。成 分 範 囲 動物血清 ５〜25容量％ mg/l インシュリン ５−10 トランスフエリン 20−100 EGF ２−100 ECGS ２−100 亜セレン酸 0.013−0.13 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン1.4−140 Ｌ−3,5,3′トリヨード 6.73×10-7−6.73×10-4 チロキシン ヒドロコルチゾン 3.46×10-4−3.46×10-2 エストラジオール17 2.72×10-4−2.72×10-2 プロゲステロン 3.15×104−3.15×10-2 テストステロン 2.88×10-4−2.88×10-2
  2. 【請求項２】前記の動物血清が牛血清であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載の細胞生長培地補足
    剤。
  3. 【請求項３】前記の補足剤が以下の成分から本質的にな
    ることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の細胞
    生長培地補足剤。成 分 濃 度 新生子牛血清 25容量％ mg/l インシュリン 25 トランスフエリン 50 EGF ５ ECGS 77.5 亜セレン酸 0.1612 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン 56.44 Ｌ−3,5,6′トリヨードチロキシン 1.683×10-4 ヒドロコルチゾン 4.33×10-3 エストラジオール17 3.41×10-3 プロゲステロン 3.93×10-3 テストステロン 3.61×10-3 無機塩 mg/l CaCl2 23.24 CuSO4・5H2O 0.00174 FeSO4・7H2O 0.58 KCl 156.56 MgCl2・6H2O 85.40 NaCl 5,319.30 Na2HPO4 99.40 ZnSO4・7H2O 0.60 アミノ酸 Ｌ−アラニン 6.24 Ｌ−アルギニンHCl 153.73 Ｌ−アスパラギン 10.50 Ｌ−アスパラギン酸 9.32 Ｌ−システインHCl・H2O 24.58 Ｌ−グルタミン酸 10.30 グリシン 5.26 Ｌ−ヒスチジンHCl・H2O 14.67 Ｌ−イソロイシン 2.76 Ｌ−リジンHCl 25.56 Ｌ−メチオニン 3.13 Ｌ−フエニルアラニン 3.47 Ｌ−プロリン 24.17 Ｌ−セリン 7.36 Ｌ−スレオニン 8.34 Ｌ−トリプトフアン 1.43 Ｌ−チロシン 3.81 Ｌ−バリン 8.20 ビタミン ｄ−ビオチン 0.0051 Ｄ−パントテン酸カルシウム 0.18 塩化コリン 9.77 葉酸 0.93 ミオ−イノシトール 12.61 ニコチンアミド 0.026 ピリドキシンHCl 0.043 リボフラビン 0.026 チアミンHCl 0.24 ビタミンB12 0.95 他の種々雑多な成分 グルコース 1,261.12 ヒポキサンチン 2.86 リノール酸 0.059 フエノール赤 0.87 プトレツシン2HCl 0.11 ピルビン酸ナトリウム 77.07 チミジン 0.51 重炭酸ナトリウム 1176.0 蒸留水で１リットルの容積にする。
  4. 【請求項４】細胞をインヒドロで生長させるのに細胞生
    長培地補足剤を使用する方法において、該方法が細胞
    を、混合物の0.1〜40容量％の量で細胞生長培地補足剤
    と混合された細胞培地の存在下で生長させること、及び
    該補足剤が下記成分から本質的に成ることを特徴とする
    前記方法。成 分 範 囲 動物血清 ５〜25容量％ mg/l インシュリン ５−10 トランスフエリン 20−100 EGF ２−100 ECGS ２−100 亜セレン酸 0.013−0.13 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン 1.4−140 Ｌ−3,5,3′トリヨード 6.73×10-7−6.73×10-4 チロキシン ヒドロコルチゾン 3.46×10-4−3.46×10-2 エストラジオール17 2.72×10-4−2.72×10-2 プロゲステロン 3.15×10-4−3.15×10-2 テストステロン 2.88×10-4−2.88×10-2
  5. 【請求項５】前記の動物血清が牛血清であることを特徴
    とする前項（４）記載の方法。
  6. 【請求項６】前記の細胞生長培地補足剤が、下記成分か
    ら本質的になることを特徴とする請求項５に記載の方
    法。成 分 濃 度 新生子牛血清 25容量％ mg/l インシュリン 25 トランスフエリン 50 EGF ５ ECGS 77.5 亜セレン酸 0.1612 Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン 56.44 Ｌ−3,5,3′−トリヨーチロキシンド 1.683×10-4 ヒドロコルチゾン 4.33×10-3 エストラジオール17 3.41×10-3 プロゲステロン 3.93×10-3 テストステロン 3.61×10-3 無機塩 mg/l CaCl2 23.24 CuSO4・5H2O 0.00174 FeSO4・7H2O 0.58 KCl 156.56 MgCl2・6H2O 85.40 NaCl 5,319.30 Na2HPO4 99.40 ZnSO4・7H2O 0.60 アミノ酸 Ｌ−アラニン 6.24 Ｌ−アルギニンHCl 153.73 Ｌ−アスパラギン 10.50 Ｌ−アスパラギン酸 9.32 Ｌ−システインHCl・H2O 24.58 Ｌ−グルタミン酸 10.30 グリシン 5.26 Ｌ−ヒスチジンHCl・H2O 14.67 Ｌ−イソロイシン 2.76 Ｌ−リジンHCl 25.56 Ｌ−メチオニン 3.13 Ｌ−フエニルアラニン 3.47 Ｌ−プロリン 24.17 Ｌ−セリン 7.36 Ｌ−スレオニン 8.34 Ｌ−トリプトフアン 1.43 Ｌ−チロシン 3.81 Ｌ−バリン 8.20ビタミン ｄ−ビオチン 0.0051 Ｄ−パントテン酸カルシウム 0.18 塩化コリン 9.77 葉酸 0.93 ミオ−イノシトール 12.61 ニコチンアミド 0.026 ピリドキシンHCl 0.043 リボフラビン 0.026 チアミンHCl 0.24 ビタミンB12 0.95 他の種々雑多な成分 グルコース 1,261.12 ヒポキサンチン 2.86 リノール酸 0.059 フエノール赤 0.87 プトレツシン2HCl 0.11 ピルビン酸ナトリウム 77.07 チミジン 0.51 重炭酸ナトリウム 1176.0 蒸留水で11の容積にする。
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