CH670709A5

CH670709A5 -

Info

Publication number: CH670709A5
Application number: CH1581/86A
Authority: CH
Inventors: Iosif Grigorievich Atabekov; Svetlana Mikhailovna Avaeva; Alexandr Andreevich Baikov; Alexandr Valentinovic Kulinich; Olga Alexeevna Mizenina; Vladimir Nikolaevich Kasho; Irina Nikolaevna Smirnova
Original assignee: Univ Moskovsk
Priority date: 1986-04-24
Filing date: 1986-04-18
Publication date: 1989-06-30
Also published as: JPH0627740B2; US4808522A; GB2190194A; GB8611205D0; GB2190194B; FR2597981B1; FR2597981A1; JPS62288573A; DE3614432A1

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum immunologischen Antigennachweis.

Die Verfahren zum Antigennachweis dienen zu Zwecken der Diagnostik von Erkrankungen bei Menschen, Tieren und Pflanzen, der Selektion von Pflanzen und Tieren und der Analyse von Verunreinigungen der Umwelt.

Zum Antigennachweis werden weitgehend die immunologischen Methoden verwendet, die auf der Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen. Um die Empfindlichkeit dieser Methoden zu erhöhen, verwendet man die Antikörper, die mit radioaktiven oder fluoreszierenden Verbindungen oder Fermenten markiert werden. Die immunologische Analysenmethode unter Verwendung von fermentmarkierten Antikörpern (Immunofermentanalyse) wird in den letzten Jahren dank der hohen Empfindlichkeit und fehlenden Notwendigkeit, mit gesundheitsschädlichen Stoffen zu arbeiten, immer weiter verbreitet.

Bekannt sind einige Methoden der Immunofermentanalyse. Am weitesten verbreitet ist die Methode der heterogenen Immunofermentanalyse (ELISA), bei der das nachzuweisende Antigen mit einer festen Phase gekoppelt wird. Diese Kopplung wird am meisten durch Adsorption des Antigens aus der zu analysierenden Lösung unmittelbar auf der Oberfläche eines polymeren Stoffes oder nach dem vorherigen Überziehen derselben mit spezifischen Antikörpern verwirklicht. Dann kommt er zur Reaktion des adsorbierten Antigens mit der Lösung der angegebenen fermentmarkierten Antikörper (Konjugat), wodurch sich das Konjugat an die feste Phase bindet. Man trennt danach die feste Phase von der flüssigen Phase und bestimmt in der einen der Phasen die Fermentaktivität, aus deren Betrag die Antigen-menge der analysierbaren Lösung (US-PS 3 720 760) resultiert. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Herstellung eines für jedes nachweisbare Antigen charakteristischen Konjugats.

Um die Universalität des Konjugats zu sichern, stellt man es unter Verwendung von artfremden Antikörpern her. In diesem Falle werden an das mit der festen Phase verbundene Antigen spezifische Antikörper und dann das artfremde Antikörper enthaltende Fermentkonjugat gebunden, welche gegen zur Herstellung der spezifischen Antikörper verwendete Species (GB-PS 1 549 069) gewonnen wurden.

Die konkreten Methoden, bei denen diese Gesamtprinzipien in Frage kommen, haben verschiedene Arten des Ferments zur Herstellung des Konjugats verwendet. Die Eigenschaften des Ferments bestimmen in bedeutendem Masse die Möglichkeiten der konkreten Methode ELISA vor allem die Analysenempfindlichkeit und-kosten. Als erwünschte Eigenschaften des Ferments erscheinen die hohe spezifische Aktivität und die Aufbewahrungsstabilität. Zu diesen Zwecken dienten früher alkalische Phosphatase, Peroxydase, ß-Galaktosidase, Lysozym, As, 3-Ketosteroidisomerase, a-Amylase, Glukoseoxydase und einige andere. Am weitesten verbreitet sind alkalische Phosphatase, Peroxydase und ß-Galaktosydase.

Die wichtige Charakteristik der Methode ELISA ist ebenfalls der Typ des bei der Bestimmung der Aktivität des Ferments verwendeten Substrats. Das Ferment bestimmt wesentlich die Auswahl des Substrats voraus, aber die meisten Fermente lassen einige Variationen der Substratstruktur zu. Dabei sind hohe Nachweisempfindlichkeit beim Produkt der Hydrolyse von Substrat, geringe Substratkosten und Auf-bewahrungsstabilität des Substrats erwünscht.

Bei der Verwendung von alkalische Phosphatase enthaltenden Konjugaten kommt als Substrat meist p-Nitrophenyl-phosphat (US-PS 3 879 262) in Frage. Das Ferment, die alkalische Phosphatase, weist eine hohe spezifische Aktivität auf, ist jedoch ungenügend aufbewahrungsstabil. Das Hydrolyseprodukt von p-Nitrophenylphosphat ist schwach gelb gefärbt, was das Auge schlecht wahrnimmt. Man braucht deshalb ein Messgerät, um den Analysenbefund auszuwerten.

Die Peroxydase wird oft wegen ihrer niedrigen Kosten zur Herstellung von Konjugaten nach der Methode ELISA (US-PS 3 791 932) eingesetzt. Sie hat jedoch eine geringe spezifische Aktivität; infolgedessen ist die Empfindlichkeit der Methode unter Verwendung derselben nicht gross.

Eine Reihe von Substraten derselben besitzen ausserdem die kanzerogenen Eigenschaften.

Die ß-Galaktosidase ist sehr aktiv und aufbewahrungsstabil. Als Substrate derselben verwendet man p-Nitrophenyl-ester, bei deren Hydrolyse die schwach gelbe Farbe entsteht, die das Auge schlecht wahrnimmt, (FR-PS 2 288 312).

Die Substrate der alkalischen Phosphatase, Peroxydase und ß-Galaktosidase, die bei der Immunofermentanalyse in Frage kommen, sind in wässrigen Lösungen instabil und teuer, und die Substrate der alkalischen Phosphatase und ß-Galaktosidase sind auch bei der dauernden Aufbewahrung in trockenem Zustand unbeständig.

Die bekannten Verfahren zum Antigennachweis bewirken somit gleichzeitig keine hohe Analysenempfindlichkeit, fordern kostspielige Reagenzien und Geräte zu Zwecken der Analyse und lassen sich deshalb lediglich in Fachlaboratorien verwenden.

Zweck der vorliegenden Erfindung bestand in der. Entwicklung solch eines Verfahrens zum Antigennachweis, welches eine hohe Nachweisempfindlichkeit besonders beim visuellen Antigennachweis besitzt, stabile Reagenzien nutzt

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und deswegen einem breiteren Kreis von Verbrauchern zugänglich ist.

Das gestellte Ziel ist durch ein immunologisches Verfahren zum Antigennachweis gelöst worden, das Herstellung eines Konjugats durch Vernetzung des Antikörpers mit einem Ferment, Bindung des nachzuweisenden Antigens an eine feste Phase, Durchführung der Reaktion zwischen dem genannten Konjugat und dem an die feste Phase gebundenen nachzuweisenden Antigen unter Bildung einer festen und einer flüssigen Phase, Trennung der festen und flüssigen Phase, Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat und Bestimmung der Antigen-menge aus dem Betrag der Fermentaktivität vorsieht, wobei es erfindungsgemäss dadurch gekennzeichnet wird, dass als Ferment bei der Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase (Pyrophosphat-phosphohydrolase EC 3.6.1.1) dient.

Die Erfindung ermöglicht, die Stabilität des Konjugats von Antikörpern und Ferment bei erhöhten Temperaturen zu steigern, weil die anorganische Pyrophosphatase eine hohe Wärmestandfestigkeit aufweist und das Erhitzen auf eine Temperatur von 80 °C aushält.

Vorzugsweise wird nach der Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Stubstrat in das Reaktionsgut ein färbendes Reagens eingeführt, wobei als solches eine starke anorganische 3 bis 7,5 n-Säure dient, die folgende Bestandteile (in Masse-%) enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün. Dadurch wird die hohe Analysenempfindlichkeit bei der visuellen Bestimmung der optischen Dichte erzielt.

Als Substrat ist erfindungsgemäss ein Pyrophosphat zweckmässigerweise zu verwenden. Dieses Salz besitzt eine genügende Löslichkeit und kann zum Beispiel Natrium-, Kalium- oder Ammoniumpyrophosphat sein. Das genannte Salz der Phyrophosphorsäure wird in geringen Mengen verwendet, weil die Michaelis-Konstante für die anorganische PyrophosphatasenureinigeMikromoleje 1 Liter beträgt. Gegenüber den bei der Immunofermentanalyse anwendbaren bekannten Substraten ist das Pyrophosphat ausserdem aufbewahrungsstabiler. Die Konzentration dieses Salzes im angegebenen Verfahren liegt zwischen 0,02 und 0,5 mMol.

Man schlägt vorzugsweise vor, die anorganische Pyrophosphatase aus Escherichia coli durch Wärmebehandlung des Zellhomogenats bei einer zwischen 83 und 93 °C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylaga-rose zu isolieren. Dadurch wird das Verfahren zum Isolieren des genannten Ferments vereinfacht.

Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert.

Auf der ersten Stufe der Durchführung des Verfahrens wird das Konjugat von Antikörpern mit einem Ferment gewonnen, wobei als solches in der vorliegenden Erfindung eine anorganische Pyrophosphatase dient. Dieses Ferment ist breit bekannt und ist in der Fachliteratur ausführlich beschrieben worden (Josse J., Wong S.C.K. The Enzymes, v. 4, p. 495-527) (1971); Butler L.G. p. 529-541).

Man verwendet in der vorliegenden Erfindung zweckmässig die anorganische Pyrophosphatase, isoliert aus Escherichia coli. Das Verfahren zum Isolieren dieses Ferments ist in der Fachliteratur beschrieben (Wong S.C.K., Hall D.C., Josse J.J. Biol. Chem. v. 245, p. 4335 [1970]).

Ein wichtiger Vorteil dieses Ferments besteht in seiner hohen Wärmebeständigkeit. Es hält beispielsweise das Erhitzen bei einer Temperatur von 80 °C innerhalb von 1 Stunde aus und ist innerhalb von 2 Jahren bei Raumtemperatur aufbewahrungsstabil. Die Molekularmasse des Ferments beträgt 120 000 Dalton, wobei es aus 6 gleichartigen

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Untereinheiten, deren jede ihr aktives Zentrum hat, besteht. Die katalytische Aktivität des Ferments liegt bei 2400 s~' bei 25 °C. Diese Eigenschaften des Ferments machen es als sehr wirksam für den Antigennachweis bei der Immunofermentanalyse.

Um das Konjugat zu gewinnen, setzt man der wässrigen Lösung des Gemisches aus anorganischer Pyrophosphatase und Antikörpern ein bifunktionelles Vernetzungsmittel (Glutaraldehyd) zu und inkubiert damit eine bestimmte Zeit. Das entstanden Konjugat wird von den Ausgangsverbindungen durch Gelfiltration abgetrennt.

Weiter findet die Bindung des nachzuweisenden Antigens an eine feste Phase statt, wobei als solche die Oberfläche einer polymeren Mikroplatte zur Immunofermentanalyse oder eine andere ähnliche Vorrichtung benutzt werden kann. Zur Verbesserung der Bindung des nachzuweisenden Antigens kann die feste Phase mit Antikörpern bedeckt werden, die gegenüber dem nachzuweisenden Antigen spezifisch sind.

Die Reaktion zwischen dem Konjugat und dem nachzuweisenden Antigen, verbunden mit der festen Phase, wird nach 2 Verfahren je nach dem zur Gewinnung des Konjugats genommenen Antikörper durchgeführt. Wenn der Antikörper des Konjugats gegenüber dem nachzuweisenden Antigen spezifisch war, so wird die feste Phase mit der Lösung des Konjugats in Kontakt gebracht, wodurch es an die feste Phase in einer zur Menge des nachweisbaren Antigens proportionalen Menge gebunden wird. Falls der Antikörper des Konjugats gegenüber dem spezifischen Antikörper artfremd war, so wird die Reaktion zwischen Konjugat und Antigen in zwei Stufen durchgeführt. Die feste Phase mit dem gebundenen Antigen bringt man zunächst mit der Lösung des spezifischen Antikörpers in Kontakt,

wodurch der Antikörper an das Antigen gebunden wird. Dann tritt die feste Phase mit der Konjugatlösung in Kontakt, wodurch das Konjugat an den spezifischen Antikörper in einer zur Menge des nachweisbaren Antigens proportionalen Menge gebunden wird.

Nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem Konjugat und dem nachweisbaren Antigen trennt man die flüssige und feste Phase und bringt die eine von ihnen mit der Lösung eines Substrats in Kontakt, wobei als Substrat ein [32P]-markiertes Pyrophosphat dient. Nach einer bestimmten Zeit wird [32P]-Phosphat nachgewiesen, das durch Hydrolyse des Substrats mit anorganischer Pyrophosphatase entsteht. Letzten Endes wird die Radioaktivität von [32P]-Phosphat gemessen, aus deren Betrag auf die Antigenmenge in der Probe geschlossen wird.

Eine Ausführungsform dieses Verfahrens besteht darin, dass man nach der Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat dem Reaktionsgut ein färbendes Reagens zusetzt, wobei als solches eine starke anorganische 3 bis 7,5 n-Säure dient, welche folgende Bestandteile (in Masse-%) enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün.

Als Molybdat kann man ein beliebiges Salz nehmen, das eine genügende Löslichkeit aufweist, beispielsweise Ammoniumsalz. Die Konzentration dieses Salzes im erfindungsge-mässen Verfahren beträgt höchstens 1,5 Masse-%. Bei einer unter 0,75 Masse-% liegenden Konzentration vermindert sich die optische Dichte und folglich die Empfindlichkeit der Methode. Eine über 4,5 Masse-% liegende Konzentration ergibt die bedeutende Steigerung der optischen Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens, was die Empfindlichkeit besonders bei der Analyse von kleinen Mengen des nachweisbaren Antigens herabsetzt.

Als oberflächenaktive Stoffe lassen sich Tween 20, Triton X 305 und Sterox verwenden. Die optimale Konzentration

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des oberflächenaktiven Stoffs erweist sich als 0,2 Masse-%, in diesem Falle erreicht das System bei der Messung der optischen Dichte eine Transparenz von bis 5 Einheiten. Durch Abnahme der Konzentration des oberflächenaktiven Stoffes unter 0,05 Masse-% wird die obere Grenze der optischen Dichte herabgesetzt, die die optische Transparenz des Systems erhält, während die Erhöhung der Konzentration über 0,3 Masse-% die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens herabsetzt.

Die optimale Malachitgrünkonzentration beträgt 0,085 Masse-%. Eine unter 0,025 Masse-% liegende Malachitgrünkonzentration vermindert die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens, und eine über 0,25 Masse-% liegende Malachitgrünkonzentration erhöht wesentlich die optische Dichte in Abwesenheit des nachweisbaren Antigens.

Als Säure kann man Schwefelsäure, Salzsäure und Perchlorsäure verwenden. Optimal ist 5 n-Schwefelsäure. Die Verminderung der Säurekonzentration unter 3 n. oder die Erhöhung derselben über 7,5 n. führt die Herabsetzung der optischen Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens herbei.

Die Wirkung des färbenden Reagens beruht auf der Reaktion, die zwischen demselben und dem aus dem Substrat entstehenden Phosphat stattfindet. Bei den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Säurekonzentrationen wird eine gute Löslichkeit von Malachitgrün erreicht und kein Niederschlag gebildet.

Durch Einführung des genannten färbenden Reagens wird das Reaktionsgut blaugrün gefärbt. Der Extinktionskoeffizient der entstehenden gefärbten Verbindung beträgt mindestens 50 000 Mol-1 • cm-1. Bei fehlendem Antigen in der Analysenprobe ist die Farbe blassgelb, wodurch der hohe Kontrast erzielt wird. Dieser Farbumschlag sichert eine hohe Nachweisempfindlichkeit bei der visuellen Auswertung des Analysenbefunds.

Als Substrat dient ein Pyrophosphat in einer zwischen 0,02 und 0,5 mMol liegenden Konzentration. Optimal ist die Konzentration von 0,05 mMol. Bei einer Pyrophosphatkonzen-tration von unter 0,02 mMol nimmt die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens wesentlich ab, während die optische Dichte bei einer über 0,5 mMol liegenden Konzentration in Abwesenheit des Antigens wesentlich zunimmt. Die Verwendung von Pyrophosphat als Substrat ist dadurch vorteilhaft, dass es bedeutend billiger gegenüber anderen Substraten ist, die bei der Immunofermentanalyse zum Einsatz kommen. Es ist ausserdem in trok-kenem Zustand unbegrenzt und in wässriger Lösung mindestens 1 Jahr lang beständig.

Wie oben hingewiesen, verwendet man eine anorganische Pyrophosphatase, um das Konjugat herzustellen. Es ist zweckmässig, eine Pyrophosphatase, gewonnen aus Zellen Escherichia coli durch Homogenisieren derselben und Wärmebehandlung des Zellhomogenats bei einer zwischen 83 und 93 °C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagorose, auszunutzen. Dies ermöglicht das Isolieren des Ferments in hohem Masse zu vereinfachen. Durch Wärmebehandlung des aus Zellen E. coli gewonnenen Homogenats bei der angegebenen Temperatur können die fremden Eiweisse von der Pyrophosphatase auf dieser Stufe vollständiger getrennt werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die anorganische Pyrophosphatase die Wärmebehandlung bei erhöhten Temperaturen besser als die fremden Eiweisse aushält. Die Wärmebehandlung im erfin-dungsgemässen Verfahren dauert 2 Minuten. Optimal ist die Behandlungstemperatur in einem Bereich von 83 bis 85 °C. Bei Temperaturen von unter 83 °C verbleibt eine grössere Menge von fremden Eiweissen, bei 93 °C übersteigenden

Temperaturen kann die Inaktivierung der anorganischen Pyrophosphatase erfolgen. Die Chromatografie über 1,6-Di-aminohexylagarose gestattet eine wirksame Reinigung der anorganischen Pyrophosphatase durchzuführen, weil ihre Affinität mit diesem Sorptionsmittel sehr hoch ist, und sie von demselben bei einer Konzentration von 0,5 Mol abgetrennt wird. Nach den Angaben, erhalten bei der Elektrophorese auf Polyakrylamidgel, übersteigt der Reinheitsgrad des hergestellten Ferments 90%.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht es, Antigene ausgehend von der Grösse der optischen Dichte visuell zu bestimmen. Das Auge fixiert leicht die Farbe bei einer optischen Dichte von über 0,1 Einheit, wobei die Farbe innerhalb von 1 Woche unverändert bleibt. Bei fehlendem Antigen ist die Farbe blassgelb und bei vorhandenem Antigen hellblaugrün. Der molare Extinktionskoeffizient des Raktionspro-dukts liegt bei 50 000 Mol-1 •cm-1 bei 630 nm. Das erfindungsgemässe Verfahren erfordert nicht, Konjugat und Substrat dank ihrer hohen Stabilität bei niedrigen Temperaturen unbedingt aufzubewahren. Wegen hoher Stabilität des Ferments kann das Antigen bei einer Temperatur von 50 bis 60 °C nachgewiesen werden. Dies verkürzt bedeutend die Analysendauer. Die Technologie des Isolierens des Ferments, d. h. der anorganischen Pyrophosphatase ist einfach und bedient sich des zugänglichen Rohstoffs und zwar Escherichia coli. Die Verwendung von Pyrophosphat als Substrat macht es möglich, Kosten der Analyse beim Antigennachweis herabzusetzen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist einem breiteren Kreis von Verbrauchern zugänglich.

Die beste Ausführungsform des Verfahrens zum Antigennachweis besteht in folgendem.

Man verwendet als Ferment zur Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase. Diese Pyrophosphatase wird aus den Zellen Escherichia coli isoliert. Die Suspension der Biomasse Escherichia coli in einer Pufferlösung wird in einer Vorrichtung zur Zertrümmerung der Zellen und Herstellung eines Homogenats behandelt. Das gewonnene Zellhomogenat unterwirft man einer Wärmebehandlung bei 85 °C innerhalb von 2 Minuten, fällt dann das genannte Ferment mit Ammoniumsulfat aus, löst den hergestellten Niederschlag in Wasser auf, dialysiert die Lösung und chro-matografiert an einer mit 1,6-Diaminohexylagarose gefüllten Säule.

Die hergestellte anorganische Pyrophosphatase wird mit Antikörpern in Gegenwart von Glutaraldehyd vermischt und etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Das erhaltene Gemisch wird in der Pufferlösung chromatogra-fiert. Die konjugathaltigen Eluatfraktionen vereinigt man.

In der Vertiefung einer Mikroplatte zur Immunofermentanalyse wird die Pufferlösung eingebracht, die gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifische Antikörper enthält. Man entfernt dann die Lösung von Antikörpern, wäscht die Mikroplatte mit der Pufferlösung, enthaltend Natriumchlorid und Triton X 305, und bringt in die Vertiefung der Mikroplatte für 3 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C eine Lösung bzw. Suspension des nachweisbaren Antigens in einem Triton X 305 und Albumin enthaltenden tris-Puffer ein. Nach 3 Stunden entfernt man die Antigenlösung bzw. -suspension, wäscht die Mikroplatte mit der Pufferlösung, enthaltend Natriumchlorid und Triton X 305, und bringt in die Vertiefung der Mikroplatte für 20 Minuten bei einer Temperatur von 55 °C eine Lösung des Konjugats der anorganischen Pyrophosphatase mit den Antikörpern, die gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifisch sind, in Gegenwart von Puffer, Triton X 305 und Albumin ein. Die Konjugatlösung wird entfernt, die Mikroplatte mit Wasser gewaschen, und in die Vertiefungen der Mikroplatte wird für 10 Minuten bei einer Temperatur von 55 °C 0,05 mMol

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Lösung von nicht radioaktivem Natriumpyrophosphat, die eine Puffersubstanz und Magnesiumchlorid enthält, eingebracht, und dann werden 0,05 ml färbendes Reagens, welches eine Lösung von 1,5 Masse-% Ammoniummolybdat, 0,085 Masse-% Malachitgrün und 0,2 Masse-% Tween 20 in 5 n-Schwefelsäure darstellt, zugegeben, wonach die optische Dichte des Reaktionsgutes bei 630 nm gemessen wird.

Diese Ausführungsform hat folgende Vorteile. Durch Verwendung der aus Escherichia coli isolierten Pyrophosphatase gewinnt das Konjugat an höherer Stabilität dank der Beständigkeit des genannten Ferments. Die Durchführung der Wärmebehandlung des Homogenats von Zellen Escherichia coli ermöglicht es, einen hohen Reinheitsgrad des Ferments und eine hohe Fermentausbeute zu erreichen. Die Ausnutzung des färbenden Reagens in dieser Ausführungsform bewirkt den kontrastreichen Farbumschlag abhängig von dem Gehalt des nachweisbaren Antigens und bietet damit eine Möglichkeit, das Antigen mit hoher Empfindlichkeit visuell nachzuweisen.

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden Beispiele angeführt, wobei Beispiele 1 bis 5 die Isolierung des Ferments, das Beispiel 6 die Herstellung des Konjugats und Beispiele 7 bis 23 den Nachweis des Antigens näher erläutern.

Beispiel 1

Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase

Eine Suspension von 2 kg Biomasse Escherichia coli in 61 0,05 molarem Puffer tris-HCl mit 7,2 pH-Wert, der 10 mMol MgCk enthält, wird auf einem Homogenisator zur Zertrümmerung von Bakterienzellen behandelt. Das gewonnene Zell-homogenat wird mit einer Geschwindigkeit von 3,61/St durch zwei Wärmeaustauscher der Reihe nach geleitet, wobei diese mit Wasser so gespült werden, dass die Temperatur des Homogenats am Austritt aus dem ersten Wärmeaustauscher 85 °C und am Austritt aus dem zweiten Wärmeaustauscher 10 °C beträgt. Das Homogenat geht durch den ersten Wärmeaustauscher innerhalb von 2 Minuten. Man zentrifugiert das Homogenat und trennt den gewonnenen Niederschlag ab und wirft weg. Der überstehenden Flüssigkeit gibt man Ammoniumsulfat bis zur Sättigung von 55% zu, zentrifugiert, wirft den Niederschlag weg. Der überstehenden Flüssigkeit wird Ammoniumsulfat bis zur Sättigung von 75% zugegeben und zentrifugiert. Man löst den Niederschlag in 200 ml Wasser auf, dialysiert die Lösung gegen Wasser und bringt auf eine mit 1,6-Diaminohexylagarose gefüllte Säule (4 x 50 cm) auf. Die Säule wird mit 0,05 molarem Puffer tris-HCl, der MgCk und NaCl enthält, gewaschen. Die Konzentration von MgCk bleibt dabei konstant (1 mMol), und die Konzentration von NaCl steigt von 0 bis 0,8 Mol, die Säule wird mit dem genannten Puffer gewaschen, bis die Desorp-tion der Pyrophosphatase erfolgt.

Aus 2 kg Biomasse Escherchia coli erhält man 0,38 g anorganische Pyrophosphatase mit spezifischer Aktivität von 500 Einheiten je 1 mg bei 25 °C.

Die Ergebnisse, erhalten auf jeder der Stufen der Isolierung von Pyrophosphatase, sind in der Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase

Stufe Spezifische Aktivität Ausbeute des Ferments in %

in Einheiten je 1 ml

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Zellhomogenat Wärmebehandlung Fraktionierung mit Ammoniumsulfat

1,66 13,3

53,3

100 92

74

Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose

500

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Beispiel 2 bis 5 Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase Man verwirklicht die Isolierung der anorganischen Pyro-10 phosphatase wie oben in Beispiel 1 beschrieben, aber die Temperatur des den ersten Wärmeaustauscher umspülenden Wassers ändert man so, dass die Temperatur des Homogenats am Wärmeaustauscheraustritt zwischen 80 und 93 °C liegt. Die Grösse der spezifischen Aktivität und der Ausbeute an ls Ferment zeigt die Tabelle 2.

Tabelle 2

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Homogenattemperatur

Spezifische Ferment

Ausbeute in °C

aktivität in Einheiten in%

je 1mg

l

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350

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Beispiel 6

Herstellung des Konjugats einer anorganischen Pyrophosphatase mit Antikörpern

Das Gemisch von 8 mg Antikörpern, isoliert aus dem Blut-3s serum eines Kaninchens durch Fällung mit Polyäthylen-glykol und Chromatografie über DEAE-Zellulose, und 8 mg anorganischer Pyrophosphatase löst man in 8 ml 0,01 molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,15 Mol NaCl enthielt, auf, gibt 0,02 ml 25%ige Lösung von 40 Glutaraldehyd in Wasser zu und inkubiert 1 Stunde lang bei 22 °C. Dann wird das Gemisch bei 4 °C an einer mit Sepha-kryl S 300 gefüllten Säule (2,5 x 80 cm) in 0,05 molarem Puffer tris-HCl mit 7,5 pH-Wert), der 0,1 Mol NaCl und 1 mMol MgCk enthält, chromatografiert. Die Fraktionen, 45 erhalten beim ersten Eiweissmaximum, werden vereinigt und zum Antigennachweis verwendet.

Beispiel 7

Nachweis von Nelkenscheckungsvirus so In Vertiefungen der Mikroplatte aus Polystyrol zur Immunofermentanalyse bringt man für 20 Stunden bei 4 °C eine Lösung von nelkenscheckungsvirusspezifischen Antikörpern (10 ng/ml) in Karbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 ein. Nach Ablauf der angegebenen Zeit entfernt man die 55 Lösung von Antikörpern, wäscht die Mikroplatten mit 0,01 molarem Puffer tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 Mol NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält, und bringt in die Vertiefungen der Mikroplatte für 3 Stunden bei 37 °C eine Suspension von Nelkenscheckungsvirus der bekannten Kon-60 zentration in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 ein, das 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält. Nach 3 Stunden wird die Virussuspension entfernt, Mikroplatten werden mit 0,01 . molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 65 0,15 Mol NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält, gewaschen, und in die Vertiefungen der Mikroplatten wird für 20 Minuten bei 55 °C eine Lösung des Konjugats von der gemäss dem Beispiel 1 isolierten anorganischen Pyrophos-

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phatase mit nelkenscheckungsvirusspezifischen Antikörpern in einer Konzentration von 0,5 Einheiten je 1 ml in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,1% Triton X305und0,l% Albumin des Stierblutserums enthält, eingebracht, wobei das Konjugat nach der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik erhalten wird. Man entfernt die Konjugatlösung, wäscht die Mikroplatten mit Wasser und bringt in die Vertiefungen der Mikroplatte für 10 Minuten bie 55 °C 0,05 mMol Lösung von [32P] Natriumpyrophosphat in 0,1 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 9,0 ein, der 5 mMol MgCk enthält, und gibt dann 60 mL 0,25 molare Ammoniummolybdatlösung und 14 ml 6 n-HCl zu. Nach dem Umrühren wird das erhaltene Gemisch in einer Menge von 0,3 ml in das Prüf glas übertragen, 0,3 ml Isobu-tanol-Benzol-Mischung (im Raumverhältnis von 1 :1) zugesetzt und kräftig geschüttelt. Nach der Trennung der wäss-rigen und der organischen Phase wird die Radioaktivität von 0,2 ml organischer Phase, enthaltend [32P] Phosphat, mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationszählers gemessen. Die gewonnenen Ergebnisse gibt die Tabelle 3 an.

Tabelle 3

Viruskonzentration in ng/ml

Radioaktivität der organischen Phase in Impuls/min

0 (Kontrolle)

450

1

710

2

995

4

1450

10

2810

20

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Viruskonzentration in ng/ml

Optische Dichte bei den angegebenen Substratkonzentrationen in mMol

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Im Falle der visuellen Analyse wurde festgestellt, dass die Farbe des Reaktionsmediums von blassgelb in Abwesenheit des Virus zu hellblau bei einer hohen Viruskonzentration umschlägt. Bei Proben mit optischer Dichte über 0,16 unterschied sich die Farbe sicher von der im Kontrollversuch.

Beispiele 9 bis 20 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus Das Verfahren wird gemäss dem Beispiel 8 verwirklicht, wobei eine Natriumpyrophosphatkonzentration von 0,05 mMol und verschiedene Konzentrationen von Ammonium-molybdat, oberflächenaktivem Stoff, Malachitgrün und Säure zur Verwendung kommen. Die Viruskonzentration betrug 10 ng/ml. Die Angaben sind in der Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

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Dieses Beispiel erläutert die Möglichkeit, die Analyse bei erhöhten Temperaturen durchzuführen (55 °C), was die Inkubationszeit von Mikroplatten mit Lösungen des Konjugats und Substrats gegenüber den allgemeingültigen zu verkürzen gestattet.

Beispiel 8

Nachweis von Nelkenscheckungsvirus unter Verwendung eines färbendne Reagens.

Das Verfahren wird wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, nur dass die Konjugatlösung und Natriumpyrophos-phatlösung in den Vertiefungen der Mikroplatte 1 Stunde lang bei 37 °C gehalten wird. Als Substrat dient nicht radioaktives Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,02,0,05 und 0,5 mMol. Nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugat und dem Substrat gibt man 0,05 ml färbbares Reagens, welches eine Lösung von 1,5 Masse % Ammo-niummolybdat, 0,085 Masse % Malachitgrün und 0,2 Masse% Tween 20 in 5 n-Schwefelsäure darstellt, zu, und die optische Dichte des Reaktionsguts bei 630 nm wird gemessen. Die Angaben für eine Reihe von Viruskonzentrationen zeigt die Tabelle 4.

Tabelle 4

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0,02

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0,069

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0,251

0,401

4

0,317

0,416

0,582

10

0,583

0,761

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Beispiel

Ammonium-

Oberflächen

Malachit

molybdat aktiver Stoff grün

in Masse-%

Masse-%

1

2

3

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4,5

Tween 20

0,2

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0,75

Tween 20

0,2

11

1,5

Tween 20

0,2

12

1,5

Tween 20

0,2

13

1,5

Tween 20

0,05

14

1,5

Tween 20

0,3

15

1,5

Tween 20

0,2

16

1,5

Tween 20

0,2

17

1,5

Sterox

0,2

18

1,5

Triton

0,2

X-305

19

1,5

Tween 20

0,2

20

1,5

Tween 20

0,2

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Beispiel

Säure normal

Optischein

Dichte in

Abwesenheit

Anwesen

von Virus heit

von Virus

1

5

6

7

9

0,085 H2SO45

0,089

0,782

10

0,085 H2SO45

0,058

0,561

11

0,25 H2SO45

0,148

0,881

12

0,025 H2SO45

0,050

0,557

13

0,085 H2SO45

0,086

0,851

14

0,085 H2SO45

0,028

0,502

15

0,085 H2SO43

0,069

0,516

16

0,085 H2S047,5

0,041

0,591

17

0,085 H2SO45

0,049

0,682

18

0,085 H2SO45

0,128

0,780

19

0,085 HCl 5

0,054

0,811

20

0,085 HC104-5

0,098

1,01

Beispiel 21

Nachweis von 13 S-Globulin der Buchweizensamen Das Verfahren wird gemäss dem Beispiel 7 verwirklicht, 65 nur dass statt Virussuspension eine Lösung von 13 S-Globulin der nachstehend angegebenen Konzentration in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,1% Triton X305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums ent-

7

670 709

hält, verwendet wird. Vor der Zugabe der Konjugatlösung bringt man in die Vertiefungen der Mikroplatte für 2 Stunden bei 37 °C eine Lösung von aus dem Blutserum des Kaninchens isolierten Antikörpern gegen 13 S-Globulin der Buchsweizensamen in 0,1 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 ein, der 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält, wäscht die Mikroplatten mit 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 Mol NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält. Das Konjugat wird wie in Beispiel 6 beschrieben erhalten, wobei die aus dem Blutserum eines Ziegenbocks isolierten Antikörper gegen G-Immunglobulin des Kaninchens verwendet werden. Als Substrat dient das nicht radioaktive Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mMol, und nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugat und dem Substrat gibt man 0,05 ml färbbares Reagens, dessen Zusammensetzung in Beispiel 8 angegeben wird, zu.

Werte der optischen Dichte bei 630 nm für eine Reihe von Konzentrationen des 13 S-Globulins der Buchweizensamen sind in der Tabelle 6 angeführt.

Tabelle 6

Konzentration von 13 S-Globulin

Optische Dichte der Buchweizensamen in u.g/1

0

0,065

6,7

0,132

20

0,281

60

0,589

Beispiel 22

Nachweis von G-Immunglobulin einer Maus Das Verfahren wird gemäss dem Beispiel 8 unter Verwendung von Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mMol durchgeführt. Bei der Herstellung des Konjugats verwendete man die aus dem Blutserum des Kaninchens isolierten Antikörper gegen G-Immunglobulin einer Maus.

Angaben für eine Reihe von Konzentrationen des G-Immunglobulins der Maus zeigt die Tabelle 7.

Tabelle 7

Konzentration von G-Immunglobulin der Maus in ng/ml

Optische Dichte

10

0

0,055

4

0,165

15,6

0,339

31

0,563

,5 62

1,37

Beispiel 23 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus Das Verfahren wird gemäss dem Beispiel 7 durchgeführt, aber bei der Herstellung des Konjugats wird die aus Backhefe isolierte anorganische Pyrophosphatase benutzt, als Substrat dient das nicht radioaktive Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mMol, und nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugat und dem Substrat gibt man 0,05 ml färbbares Reagens der in Beispiel 8 angegebenen Zusammensetzung zu.

Angaben für eine Reihe von Konzentrationen des Nelkenscheckungsvirus sind in der Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8

Dichte

20

30

Viruskonzentration Optisci in ng/ml

0 0,075

5 0,256

10 0,485

20 0,751

B

Claims

670709 PATENTANSPRÜCHE

1. Immunologisches Verfahren zum Antigennachweis,

das

- Herstellen eines Konjugats durch Vernetzung des Antikörpers mit einem Ferment;

- Bindung des nachzuweisenden Antigens an eine feste Phase;

- Durchführung der Reaktion zwischen dem genannten Konjugat und dem an die feste Phase gebundenen Antigen unter Bildung einer festen und einer flüssigen Phase ;

- Trennung der gewonnenen festen und flüssigen Phase ;

- Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat und Bestimmung der Antigen-menge aus dem Betrag der Fermentaktivität vorsieht, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ferment bei der Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Abklingen der Reaktion der Phase mit dem Substrat in das Reaktionsgut ein färbendes Reagens einführt, wobei als solches starke anorganische 3 bis 7,5n-Säure dient, die folgende Bestandteile, in Masse-%, enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bestimmung der Fermentaktivität als Substrat ein Pyrophosphat in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 mMol zur Verwendung kommt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine anorganische Pyrophosphatase, isoliert aus

. dem Homogenat von Zellen von Escherichia coli durch Wärmebehandlung der genannten Zellen bei einer zwischen 83 und 93 °C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose verwendet.