DE3614432A1

DE3614432A1 - Verfahren zum antigennachweis

Info

Publication number: DE3614432A1
Application number: DE19863614432
Authority: DE
Inventors: Iosif Grigorievic Atabekov; Svetlana Michailovna Avaeva; Aleksandr Andreevic Baikov; Aleksandr Valentinovic Kulinic; Geb Jakovleva Mizenina; Vladimir Nikolaevic Kaso; Irina Nikolaevna Smirnova
Original assignee: Moskovsky Gosudarstvenny Universitet Imeni M V Lomonosova
Current assignee: Moskovsky Gosudarstvenny Universitet Imeni M V Lomonosova
Priority date: 1986-04-24
Filing date: 1986-04-29
Publication date: 1987-11-05
Also published as: FR2597981B1; US4808522A; JPS62288573A; GB2190194B; GB2190194A; FR2597981A1; GB8611205D0; JPH0627740B2; CH670709A5

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunofermentanalyse und insbesondere auf ein Verfahren zum Antigennachweis.

Die Verfahren zum Antigennachweis dienen zu Zwecken der Diagnostik von Erkrankungen bei Menschen, Tieren und Pflanzen, der Selektion von Pflanzen und Tieren und Analyse von Verunreinigungen der Umwelt.

Zum Antigennachweis werden weitgehend immunologische Methoden verwendet, die auf der Antigen-Antikörper- Reaktion beruhen. Um die Empfindlichkeit dieser Methoden zu erhöhen, verwendet man die Antikörper, die mit radioaktiven oder fluoreszierenden Verbindungen oder Fermenten markiert werden. Die immunologische Analysenmethode unter Verwendung von fermentmarkierten Antikörpern (Immunofermentanalyse) wird in den letzten Jahren dank der hohen Empfindlichkeit und fehlenden Notwendigkeit, mit gesundheitsschädlichen Stoffen zu arbeiten, immer weiter verbreitet.

Bekannt sind einige Methoden der Immunofermentanalyse. Am weitesten verbreitet ist die Methode der heterogenen Immunofermentanalyse (ELISA), bei der das nachweisbare Antigen mit einer festen Phase gekoppelt wird. Diese Kopplung erfolgt meistens durch Absorption des Antigens aus der analysierbaren Lösung unmittelbar auf der Oberfläche eines polymeren Stoffes oder nach vorherigem Überziehen derselben mit spezifischen Antikörpern. Dann kommt es zur Reaktion des adsorbierten Antigens mit der Lösung der angegebenen fermentmarkierten Antikörper (Konjugat), wodurch sich das Konjugat an die feste Phase bindet. Man trennt danach die feste Phase von der flüssigen Phase und bestimmt in der einen der Phasen die Fermentaktivität, aus deren Betrag die Antigenmenge in der analysierbaren Lösung (US-PS 37 20 760) resultiert. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Herstellung eines für jedes nachweisbare Antigen charakteristischen Konjugats.

Um die Universalität des Konjugats zu sichern, stellt man es unter Verwendung von artfremden Antikörpern her. In diesem Falle werden an das mit der festen Phase verbundene Antigen spezifische Antikörper und dann das artfremde Antikörper enthaltende Fermentkonjugat gebunden, welche gegen zur Herstellung der spezifischen Antikörper verwendete Species (GB-PS 15 49 069) gewonnen wurden.

Die konkreten Methoden, bei denen diese Gesamtprinzipien in Frage kommen, unterscheiden sich im Typus des Ferments, zur Herstellung des Konjugats. Die Eigenschaften des Ferments bestimmen in bedeutendem Maße die Möglichkeiten der konkreten Methode ELISA vor allem die Analysenempfindlichkeit und -Kosten. Als erwünschte Eigenschaften des Ferments erscheinen die hohe spezifische Aktivität und die Aufbewahrungstabilität. Zu diesen Zwecken dienten früher alkalische Phosphatase, Peroxydase, β-Galaktosidase, Lysozym, Δ₅, 3-Ketosteroidisomerase, α-Amylase, Glukoseoxydase und einige andere. Am weitesten verbreitet sind alkalische Phosphatase, Peroxydase und β-Galaktosydase.

Eine wichtige Charakteristik der Methode ELISA ist auch ein Typ des bei der Bestimmung der Aktivität des Ferments verwendeten Substrats. Das Ferment bestimmt wesentlich die Auswahl des Substrats voraus, aber die meisten Fermente lassen einige Variationen der Substratstruktur zu. Dabei sind hohe Nachweisempfindlichkeit beim Produkt der Hydrolyse von Substrat, geringe Substratkosten und Aufbewahrungsstabilität des Substrats erwünscht.

Bei der Verwendung von die alkalische Phosphatase enthaltenden Konjugaten kommt als Substrat meist p-Nitrophenylphosphat (US-PS 38 79 262) in Frage. Das Ferment, die alkalische Phosphatase, weist eine hohe spezifische Aktivität auf, ist jedoch ungenügend haltbar. Das Hydrolyseprodukt von p-Nitrophenylphosphat ist schwach gelb gefärbt, was das Auge schlecht wahrnimmt. Man braucht deshalb ein Meßgerät, um den Analysenbefund auszuwerten.

Die Peroxydase wird oft wegen ihrer niedrigen Kosten zur Herstellung von Konjugaten nach der Methode ELISA (US-PS 37 91 932) eingesetzt. Sie hat jedoch eine geringe spezifische Aktivität; infolgedessen ist die Empfindlichkeit der Methode unter Verwendung derselben nicht groß. Eine Reihe von Substraten besitzt außerdem kanzerogene Eigenschaften.

Die β-Galaktosidase ist sehr aktiv und haltbar.

Als Substrate verwendet man p-Nitrophenylester, bei deren Hydrolyse die schwach gelbe Farbe entsteht, die das Auge schlecht wahrnimmt (FR-PS 22 88 312).

Die Substrate der alkalischen Phosphatase, Peroxydase und β-Galaktosidase, die bei der Immunofermentanalyse in Frage kommen, sind in wäßrigen Lösungen instabil und teuer, und die Substrate der alkalischen Phosphatase und β-Galaktosidase sind auch bei der dauernden Aufbewahrung in trockenem Zustand unbeständig.

Die bekannten Verfahren zum Antigennachweis bewirken somit nicht gleichzeitig eine hohe Analysenempfindlichkeit, fordern kostspielige Reagenzien und Geräte zu Zwecken der Analyse und lassen sich deshalb lediglich in Speziallaboratorien verwenden.

Zweck der vorliegenden Erfindung bestand in der Entwicklung solch eines Verfahrens zum Antigennachweis, welches eine hohe Nachweisempfindlichkeit, besonders beim visuellen Antigennachweis, besitzt, stabile Reagenzien nutzt und deswegen einem breiteren Kreis von Verbrauchern zugänglich ist.

Das gestellte Ziel ist durch ein Verfahren zum Antigennachweis gelöst worden, das Herstellung eines Konjugats durch Vernetzung des Antikörpers mit einem Ferment, Bindung des nachweisbaren Antigens an eine feste Phase, Durchführung der Reaktion zwischen dem angegebenen Konjugat und dem an die feste Phase gebundenen nachweisbaren Antigen unter Bildung der festen und der flüssigen Phase, Trennung der festen und flüssigen Phase, Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat und Bestimmung der Antigenmenge aus dem Betrag der Fermentaktivität vorsieht, wobei es erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet wird, daß als Ferment bei der Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase (Pyrophosphat-phosphohydrolase EC 3.6.1.1) dient.

Die Erfindung ermöglicht es, die Stabilität des Konjugats von Antikörpern mit Ferment bei erhöhten Temperaturen zu steigern, weil die anorganische Pyrophosphatase eine hohe Wärmebeständigkeit aufweist und das Erhitzen auf eine Temperatur von 80°C aushält.

Erfindungsgemäß schlägt man vor, nach der Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat in das Reaktionsgut ein färbendes Reagens einzuführen, wobei als solches eine starke anorganische 3 bis 7,5 n-Säure dient, die folgende Bestandteile (in Masse %) enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün. Dadurch wird die hohe Analysenempfindlichkeit bei der visuellen Bestimmung der optischen Dichte erzielt.

Als Substrat ist erfindungsgemäß zweckmäßigerweise ein Pyrophosphat zu verwenden. Dieses Salz besitzt eine genügende Löslichkeit und kann zum Beispiel Natrium-, Kalium- oder Ammoniumpyrophosphat sein. Das genannte Salz der Pyrophosphorsäure wird in geringen Mengen verwendet, weil die Michaelis-Konstante für die anorganische Pyrophosphatase nur einige Mikromole je 1 Liter beträgt. Gegenüber den bei der Immunofermentanalyse anwendbaren bekannten Substraten ist das Pyrophosphat außerdem haltbarer. Die Konzentration dieses Salzes im erfindungsgemäßen Verfahren liegt zwischen 0,02 und 0,5 mM.

Man schlägt erfindungsgemäß insbesondere vor, die anorganische Pyrophosphatase aus E. coli durch Wärmebehandlung des Zellhomogenats bei einer zwischen 83 und 93°C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose zu isolieren. Dadurch wird das Verfahren zum Isolieren des genannten Ferments vereinfacht.

Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert.

Auf der ersten Stufe der Durchführung des Verfahrens wird das Konjugat von Antikörpern mit einem Ferment gewonnen, wobei als solches in der vorliegenden Erfindung eine anorganische Pyrophosphatase dient. Dieses Ferment ist weit bekannt und in jeder Fachliteratur ausführlich beschrieben worden (Josse J., Wong S. C. K. The Enzymes, v. 4, p. 495-527 (1971); Butler L. G. p. 529-541).

Man verwendet insbesondere die anorganische Pyrophosphatase, isoliert aus Escherichia coli. Das Verfahren zum Isolieren dieses Ferments ist in der Fachliteratur beschrieben /Wong S. C. K., Hall D. C., Josse J. J. Biol. Chem. v. 245, p. 4335 (1970)/.

Ein wichtiger Vorteil dieses Ferments besteht in seiner hohen Wärmebeständigkeit. Es hält beispielsweise das Erhitzen bei einer Temperatur von 80°C innerhalb von 1 Stunde aus und ist innerhalb von 2 Jahren bei Raumtemperatur haltbar. Die Molekularmasse des Ferments beträgt 120 000 Dalton, wobei es aus 6 gleichartigen Untereinheiten, deren jede ihr aktives Zentrum hat, besteht. Die katalytische Aktivität des Ferments liegt bei 2400 s^-1 bei 25°C. Diese Eigenschaften des Ferments machen es sehr wirksam für den Antigennachweis bei der Immunofermentanalyse.

Um das Konjugat zu gewinnen, setzt man der wäßrigen Lösung des Gemisches aus anorganischer Pyrophosphatase und Antikörpern ein bifunktionelles Vernetzungsmittel (Glutaraldehyd) zu und inkubiert damit eine bestimmte Zeit. Das entstandene Konjugat wird von den Ausgangsverbindungen durch Gelfiltration abgetrennt.

Dann kommt es zur Bindung des gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifischen Antikörpers an eine feste Phase, wobei als solche die Oberfläche einer polymeren Mikroplatte zur Immunofermentanalyse oder eine andere ähnliche Vorrichtung benutzt werden kann. Zu diesem Zweck wird die Oberfläche mit der Antikörperlösung in Kontakt gebracht, wodurch der Antikörper auf der Oberfläche adsorbiert wird.

Die Reaktion zwischen dem Konjugat und dem nachweisbaren Antigen, verbunden mit der festen Phase, wird nach 2 Verfahren je nach dem zur Gewinnung des Konjugats genommenen Antikörper durchgeführt. Wenn der Antikörper gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifisch war, so wird die feste Phase mit der Lösung des Konjugats in Kontakt gebracht, wodurch es an die feste Phase in einer zur Menge des nachweisbaren Antigens proportionalen Menge gebunden wird. Falls der Antikörper gegenüber dem spezifischen Antikörper artfremd war, so wird die Reaktion zwischen Konjugat und Antigen in zwei Stufen durchgeführt. Die feste Phase mit dem gebundenen Antigen bringt man zunächst mit der Lösung des spezifischen Antikörpers in Kontakt, wodurch der Antikörper an das Antigen gebunden wird. Dann tritt die feste Phase mit der Konjugatlösung in Kontakt, wodurch das Konjugat an den spezifischen Antikörper in einer zur Menge des nachweisbaren Antigens proportionalen Menge gebunden wird.

Nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem Konjugat und dem nachweisbaren Antigen trennt man die flüssige und die feste Phase und bringt die eine von ihnen mit der Lösung eines Substrats in Kontakt, wobei als Substrat ein [³²P]-markiertes Pyrophosphat dient. Nach einer bestimmten Zeit wird [³²P]-Phosphat nachgewiesen, das durch Hydrolyse des Substrats mit anorganischer Pyrophosphatase entsteht. Letzten Endes wird die Radioaktivität von [³²P]-Phosphat gemessen, aus deren Betrag auf die Antigenmenge in der Probe geschlossen wird.

Eine Ausführungsform dieses Verfahrens besteht darin, daß man nach der Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat dem Reaktionsgut ein färbendes Reagens zusetzt, wobei als solches eine starke anorganische 3 bis 7,5 n-Säure dient, welche folgende Bestandteile (in Masse%) enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün.

Als Molybdat kann man ein beliebiges Salz nehmen, das eine genügende Löslichkeit aufweist, beispielsweise ein Ammoniumsalz. Die Konzentration dieses Salzes im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt höchstens 1,5 Masse%. Bei einer unter 0,75 Masse% liegenden Konzentration vermindert sich die optische Dichte und folglich die Empfindlichkeit der Methode. Eine über 4,5 Masse% liegende Konzentration ergibt die bedeutende Steigerung der optischen Dichte in Abwesenheit des nachweisbaren Antigens, was die Empfindlichkeit besonders bei der Analyse von kleinen Mengen des nachweisbaren Antigens herabsetzt.

Als oberflächenaktive Stoffe lassen sich Tween 20, Triton X 305 und Sterox verwenden. Die optimale Konzentration des oberflächenaktiven Stoffes erweist sich als 0,2 Masse%, in jedem Falle erreicht das System bei der Messung der optischen Dichte eine Transparenz von bis 5 Einheiten. Durch Abnahme der Konzentration des oberflächenaktiven Stoffes unter 0,05 Masse% wird die obere Grenze der optischen Dichte herabgesetzt, die die optische Transparenz des Systems erhält, während die Erhöhung der Konzentration über 0,3 Masse% die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens herabsetzt.

Die optimale Malachitgrünkonzentration beträgt 0,085 Masse%. Eine unter 0,025 Masse% liegende Malachitgrünkonzentration vermindert die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens, und eine über 0,25 Masse% liegende Malachitgrünkonzentration erhöht wesentlich die optische Dichte in Abwesenheit des nachweisbaren Antigens.

Als Säure kann man Schwefelsäure, Salzsäure und Perchlorsäure verwenden. Optimal ist 5 n-Schwefelsäure.

Die Verminderung der Säurekonzentration unter 3 n. oder die Erhöhung derselben über 7,5 n. führt die Herabsetzung der optischen Dichte in Anwesenheit nachweisbaren Antigens herbei.

Die Wirkung des färbenden Reagens beruht auf der Reaktion, die zwischen demselben und dem aus dem Substrat entstehenden Phosphat stattfindet. Bei den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Säurekonzentrationen wird eine gute Löslichkeit von Malachitgrün erreicht und kein Niederschlag gebildet.

Durch Einführung des genannten färbenden Reagens wird das Reaktionsgut blaugrün gefärbt. Der Extinktionskoeffizient der entstehenden gefärbten Verbindung beträgt mindestens 50 000 M^-1 · cm^-1. Bei fehlendem Antigen in der Analysenprobe ist die Farbe blaßgelb, wodurch der hohe Kontrast erzielt wird. Diese Farbumschlag sichert eine hohe Nachweisempfindlichkeit bei der visuellen Auswertung des Analysenbefunds.

Als Substrat dient ein Pyrophosphat in einer zwischen 0,02 und 0,5 mM liegenden Konzentration. Optimal ist die Konzentration von 0,05 mM. Bei einer Pyrophosphatkonzentration von unter 0,02 mM nimmt die optische Dichte in Anwesenheit des nachweisbaren Antigens wesentlich ab, während die optische Dichte bei einer über 0,5 mM liegenden Konzentration in Abwesenheit des Antigens wesentlich zunimmt. Die Verwendung von Pyrophosphat als Substrat ist dadurch vorteilhaft, daß es bedeutend billiger gegenüber anderen Substraten ist, die bei der Immunofermentanalyse zum Einsatz kommen. Es ist außerdem in trockenem Zustand unbegrenzt und in wäßriger Lösung zumindest 1 Jahr lang haltbar.

Wie oben hingewiesen, verwendet man eine anorganische Pyrophosphatase, um das Konjugat herzustellen. Es ist zweckmäßig, eine Pyrophosphatase, gewonnen aus Zellen Escherichia coli durch Homogenisieren derselben und Wärmebehandlung des Zellhomogenisats bei einer zwischen 83 und 93°C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose, einzusetzen. Dies ermöglicht es, das Isolieren des Ferments in hohem Maße zu vereinfachen. Durch Wärmebehandlung des aus Zellen E. coli gewonnenen Homogenats bei der angegebenen Temperatur können die fremden Eiweisse von der Pyrophosphatase auf dieser Stufe vollständiger getrennt werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die anorganische Pyrophosphatase die Wärmebehandlung bei erhöhten Temperaturen besser als die fremden Eiweisse aushält. Die Wärmebehandlung im erfindungsgemäßen Verfahren dauert 2 Minuten. Optimal ist die Behandlungstemperatur in einem Bereich von 83 bis 85°C. Bei Temperaturen unter 83°C verbleibt eine größere Menge von fremden Eiweissen, bei 93°C übersteigenden Temperaturen kann die Inaktivierung der anorganischen Pyrophosphatase erfolgen. Die Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose gestattet es, eine wirksame Reinigung der anorganischen Pyrophosphatase durchzuführen, weil ihre Affinität mit diesem Sorptionsmittel sehr hoch ist und sie von demselben bei einer Konzentration von 0,5 M abgetrennt wird. Nach den Angaben, erhalten bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgel, übersteigt der Reinheitsgrad des hergestellten Ferments 90%.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Antigene ausgehend von der Größe der optischen Dichte visuell zu bestimmen. Das Auge fixiert leicht die Farbe bei einer optischen Dichte von über 0,1 Einheit, wobei die Farbe innerhalb von 1 Woche unverändert bleibt. Bei fehlendem Antigen ist die Farbe blaßgelb und bei vorhandenem Antigen hellblaugrün. Der molare Extinktionskoeffizient des Reaktionsprodukts liegt bei 50 000 M^-1 · cm^-1 bei 630 nm. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert nicht, Konjugat und Substrat dank ihrer hohen Stabilität unbedingt bei niedrigen Temperaturen aufzubewahren. Wegen der hohen Stabilität des Ferments kann das Antigen bei einer Temperatur von 50 bis 60°C nachgewiesen werden. Dies verkürzt bedeutend die Analysendauer. Die Technologie des Isolierens des Ferments, d. h. der anorganischen Pyrophosphatase ist einfach und bedient sich des zugänglichen Rohstoffs, und zwar Escherichia coli. Die Verwendung von Pyrophosphat als Substrat macht es möglich, die Kosten der Analyse beim Antigennachweis herabzusetzen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einem breiten Kreis von Verbrauchern zugänglich.

Die beste Ausführungsform des Verfahrens zum Antigennachweis besteht in folgendem.

Man verwendet als Ferment zur Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase. Diese Pyrophosphatase wird aus den Zellen Escherichia coli isoliert. Die Suspension der Biomasse Escherichia coli in einer Pufferlösung wird in einer Vorrichtung zur Zertrümmerung der Zellen und Herstellung eines Homogenisats behandelt. Das gewonnene Zellhomogenisat unterwirft man einer Wärmebehandlung bei 85°C innerhalb von 2 Minuten, fällt dann das genannte Ferment mit Ammoniumsulfat aus, löst den hergestellten Niederschlag in Wasser auf, dialysiert die Lösung und chromatografiert an einer mit 1,6-Diaminohexylagarose gefüllten Säule.

Die hergestellte anorganische Pyrophosphatase wird mit Antikörpern in Gegenwart von Glutaraldehyd vermischt und etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Das erhaltene Gemisch wird in der Pufferlösung chromatografiert. Die konjugathaltigen Eluatfraktionen vereinigt man.

In der Vertiefung einer Mikroplatte zur Immunofermentanalyse wird die Pufferlösung eingebracht, die gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifische Antikörper enthält. Man entfernt dann die Lösung von Antikörpern, wäscht die Mikroplatte mit der Pufferlösung, enthaltend Natriumchlorid und Triton X 305, und bringt in die Vertiefung der Mikroplatte für 3 Stunden bei einer Temperatur von 37°C eine Lösung bzw. Suspension des nachweisbaren Antigens in einem Triton X 305 und Albumin enthaltenden tris-Puffer ein. Nach 3 Stunden entfernt man die Antigenlösung bzw. -suspension, wäscht die Mikroplatte mit der Pufferlösung, enthaltend Natriumchlorid und Triton X 305, und bringt in die Vertiefung der Mikroplatte für 20 Minuten bei einer Temperatur von 55°C eine Lösung des Konjugats der anorganischen Pyrophosphatase mit den Antikörpern, die gegenüber dem nachweisbaren Antigen spezifisch sind, in Gegenwart von Puffer, Triton X 305 und Albumin ein. Die Konjugatlösung wird entfernt, die Mikroplatte mit Wasser gewaschen, und in die Vertiefungen der Mikroplatte wird für 10 Minuten bei einer Temperatur von 55°C 0,05 mM Lösung von nicht radioaktivem Natriumpyrophosphat, die eine Puffersubstanz und Magnesiumchlorid enthält, eingebracht, und dann werden 0,05 ml färbendes Reagens, welches eine Lösung von 1,5 Masse% Ammoniummolbdat, 0,085 Masse% Malachitgrün und 0,2 Masse% Tween 20 in 5 n-Schwefelsäure darstellt, zugegeben, wonach die optische Dichte des Reaktionsgutes bei 630 nm gemessen wird.

Diese Ausführungsform hat folgende Vorteile. Durch Verwendung der aus Escherichia coli isolierten Pyrophosphatase gewinnt das Konjugat an höherer Stabilität dank der Beständigkeit des genannten Ferments. Die Durchführung der Wärmebehandlung des Homogenisats von Zellen Escherichia coli ermöglicht es, einen hohen Reinheitsgrad des Ferments und eine hohe Fermentausbeute zu erreichen. Die Verwendung des färbenden Reagens in dieser Ausführungsform bewirkt einen kontrastreichen Farbumschlag abhängig von dem Gehalt des nachweisbaren Antigens und bietet damit eine Möglichkeit, das Antigen mit hohe Empfindlichkeit visuell nachzuweisen.

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden Beispiele angeführt, wobei Beispiele 1 bis 5 die Isolierung des Ferments, das Beispiel 6 die Herstellung des Konjugats und Beispiele 7 bis 23 den Nachweis des Antigens näher erläutern.

Beispiel 1 Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase

Eine Suspension von 2 kg Biomasse Escherichia coli in 6 l 0,05 molarem Puffer tris-HCl mit 7,2 pH-Wert, der 10 mM MgCl₂ enthält, wird auf einem Homogenisator zur Zertrümmerung von Bakterienzellen behandelt. Das gewonnene Zellhomogenisat wird mit einer Geschwindigkeit von 3,6 l/St durch zwei Wärmeaustauscher der Reihe nach geleitet, wobei diese mit Wasser so gespült werden, daß die Temperatur des Homogenisats am Austritt aus dem ersten Wärmeaustauscher 85°C und am Austritt aus dem zweiten Wärmeaustauscher 10°C beträgt. Das Homogenisat geht durch den 1. Wärmeaustauscher innerhalb von 2 Minuten. Man zentrifugiert das Homogenisat und trennt den gewonnen Niederschlag ab und verwirft ihn. Der überstehenden Flüssigkeit gibt man Ammoniumsulfat bis zur Sättigung von 55% zu, zentrifugiert und verwirft den Niederschlag. Der überstehenden Flüssigkeit wird Ammoniumsulfat bis zur Sättigung von 75% zugegeben und zentrifugiert. Man löst den Niederschlag in 200 ml Wasser auf, dialysiert die Lösung gegen Wasser und bringt auf eine mit 1,6-Diaminohexylagarose gefüllte Säule (4 × 50 cm) auf. Die Säule wird mit 0,05 molarem Puffer tris-HCl, der MgCl₂ und NaCl enthält, gewaschen. Die Konzentration von MgCl₂ bleibt dabei konstant (1 mM), und die Konzentration von NaCl steigt von 0 bis 0,8 M; die Säule wird mit dem genannten Puffer gewaschen, bis die Desorption der Pyrophosphatase erfolgt.

Aus 2 kg Biomasse Escherichia coli erhält man 0,38 g anorganische Pyrophosphatase mit spezifischer Aktivität von 500 Einheiten je 1 mg bei 25°C.

Die Ergebnisse, erhalten auf jeder der Stufen der Isolierung von Pyrophosphatase, sind in der Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1.

Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase

Beispiel 2 bis 5 Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase

Man führt die Isolierung der anorganischen Pyrophosphatase wie oben in Beispiel 1 beschrieben durch, aber die Temperatur des den ersten Wärmeaustauscher umspülenden Wassers ändert man so, daß die Temperatur des Homogenats am Wärmeaustauscher austritt zwischen 80 und 93°Cliegt. Die Größe der spezifischen Aktivität und der Ausbeute an Ferment zeigt die Tabelle 2.

Tabelle 2

Beispiel 6 Herstellung des Konjugats einer anorganischen Pyrophosphatase mit Antikörpern

Das Gemisch von 8 mg Antikörpern, isoliert aus dem Blutserum eines Kaninchens durch Füllung mit Polyäthylenglykol und Chromatografie über DEAE-Zellulose, und 8 mg anorganischer Pyrophosphatase löst man in 8 ml 0,01 molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,15 M NaCl enthielt, auf, gibt 0,02 ml 25%ige Lösung von Glutaraldehyd in Wasser zu und inkubiert 1 Stunde lang bei 22°C. Dann wird das Gemisch bei 4°C an einer mit Sephacryl S 300 gefüllten Säule (2,5 × 80 cm) in 0,05 molarem Puffer tris-HCl mit 7,5 pH-Wert, der 0,1 M NaCl und 1 mM MgCl₂ enthält, chromatografiert. Die Fraktionen, erhalten beim ersten Eiweißmaximum, werden vereinigt und zum Antigennachweis verwendet.

Beispiel 7 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus

In Vertiefungen der Mikroplatte aus Polystyrol zur Immunofermentanalyse bringt man für 20 Stunden bei 4°C eine Lösung von nelkenscheckungsvirusspezifischen Antikörpern (10 µg/ml) in Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 ein. Nach Ablauf der angegebenen Zeit entfernt man die Lösung von Antikörpern, wäscht die Mikroplatten mit 0,01 molarem Puffer tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 M NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält, und bringt in die Vertiefungen der Mikroplatte für 3 Stunden bei 37°C eine Suspension von Nelkenscheckungsvirus der bekannten Konzentration in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 ein, das 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält. Nach 3 Stunden wird die Virussuspension entfernt, die Mikroplatten werden mit 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 M NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält, gewaschen, und in die Vertiefungen der Mikroplatten wird für 20 Minuten bei 55°C eine Lösung des Konjugats von der gemäß Beispiel 1 isolierten anorganischen Pyrophosphatase mit nelkenscheckungsvirusspezifischen Antikörpern in einer Konzentration von 0,5 Einheiten je 1 ml in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält, eingebracht, wobei das Konjugat nach der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik erhalten wird. Man entfernt die Konjugatlösung, wäscht die Mikroplatten mit Wasser und bringt in die Vertiefungen der Mikroplatte für 10 Minuten bei 55°C 0,05 mM Lösung von [³²P]Natriumpyrophosphat in 0,1 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 9,0 ein, der 5 mM MgCl₂ enthält, und gibt dann 60 ml 0,25 molare Ammoniummolybdatlösung und 14 ml 6 n-HCl zu. Nach dem Umrühren wird das erhaltene Gemisch in einer Menge von 0,3 ml in das Prüfglas übertragen, 0,3 ml Isobutanol- Benzol-Mischung (im Raumverhältnis von 1 : 1) zugesetzt und kräftig geschüttelt. Nach der Trennung der wäßrigen und der organischen Phase wird die Radioaktivität von 0,2 ml organischer Phase, enthaltend [³²P]Phosphat, mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationszählers gemessen. Die gewonnenen Ergebnisse gibt die Tabelle 3 an.
ViruskonzentrationRadioaktivität der organischen Phase in ng/mlin Impuls/min

0 (Kontrolle) 450 1 710 2 995 41450 102810 204520

Dieses Beispiel erläutert die Möglichkeit, die Analyse bei erhöhten Temperaturen durchzuführen (55°C), was die Inkubationszeit von Mikroplatten mit Lösungen des Konjugats und Substrats gegenüber den allgemeingültigen zu verkürzen gestattet.

Beispiel 8 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus unter Verwendung eines färbenden Reagens

Das Verfahren wird wie in Beispiel 7 beschrieben druchgeführt, nur daß die Konjugatlösung und Natriumpyrophosphatlösung in den Vertiefungen der Mikroplatte 1 Stunde lang bei 37°C gehalten wird. Als Substrat dient nichtradioaktives Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,02, 0,05 und 0,5 mM. Nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugats und dem Substrat gibt man 0,05 ml färbendes Reagens, welches eine Lösung von 1,5 Masse-% Ammoniummolybdat, 0,085 Masse% Malachitgrün und 0,2 Masse% Tween 20 in 5 n-Schwefelsäure darstellt, zu, und mißt die optische Dichte des Reaktionsgutes bei 630 nm.

Die Angaben für eine Reihe von Viruskonzentrationen zeigt die Tabelle 4.

Tabelle 4

Im Falle der visuellen Analyse wurde festgestellt, daß die Farbe des Reaktionsmediums von blaßgelb in Abwesenheit des Virus zu hellblau bei einer hohen Viruskonzentration umschlägt. Bei Proben mit optischer Dichte über 0,16 unterschied sich die Farbe sicher von der im Kontrollversuch.

Beispiele 9 bis 20 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus

Das Verfahren wird gemäß dem Beispiel 8 durchgeführt, wobei eine Natriumpyrophosphatkonzentration von 0,05 mMol und verschiedene Konzentrationen von Ammoniummolybdat, oberflächenaktivem Stoff, Malachitgrün und Säure zur Verwendung kommen. Die Viruskonzentration betrug 10 ng/ml. Die Angaben sind in der Tabelle 5 dargestellt.

Beispiel 21 Nachweis von 13 S-Globulin der Buchweizensamen

Das Verfahren wird gemäß dem Beispiel 7 durchgeführt, nur daß statt der Virussuspension eine Lösung von 13 S-Globulin der nachstehend angegebenen Konzentration in 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält, verwendet wird. Vor der Zugabe der Konjugatlösung bringt man in die Vertiefungen der Mikroplatte für 2 Stunden bei 37°C eine Lösung von aus dem Blutserum des Kaninchens isolierten Antikörpern gegen 13 S-Globulin der Buchweizensamen in 0,1 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 ein, der 0,1% Triton X 305 und 0,1% Albumin des Stierblutserums enthält, wäscht die Mikroplatten mit 0,01 molarem Puffer tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 M NaCl und 0,1% Triton X 305 enthält. Das Konjugat wird wie in Beispiel 6 beschrieben erhalten, wobei die aus dem Blutserum eines Ziegenbocks isolierten Antikörper gegen G-Immunglobulin des Kaninchens verwendet werden. Als Substrat dient das nichtradioaktive Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mM, und nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugat und dem Substrat gibt man 0,05 l färbbares Reagens, dessen Zusammensetzung in Beispiel 8 angegeben wird, zu.

Werte der optischen Dichte bei 630 nm für eine Reihe von Konzentrationen des 13 S-Globulins der Buchweizensamen sind in Tabelle 6 angeführt.

Tabelle 5

Konzentration von 13 S-GlobulinOptische Dichte der Buchweizensamen in µg/l

00,065 6,70,132 200,281 600,589

Beispiel 22 Nachweis von G-Immunglobulin einer Maus

Das Verfahren wird gemäß dem Beispiel 8 unter Verwendung von Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mM durchgeführt. Bei der Herstellung des Konjugats verwendete man die aus dem Blutserum des Kaninchens isolierten Antikörper gegen G-Immunglobulin einer Maus.

Angaben für eine Reihe von Konzentrationen des G-Immunglobulins der Maus zeigt die Tabelle 7.
Konzentration von G-ImmunglobulinOptische Dichte der Maus in ng/ml

00,055 40,165 15,60,339 310,563 621,37

Beispiel 23 Nachweis von Nelkenscheckungsvirus

Das Verfahren wird gemäß dem Beispiel 7 durchgeführt, aber bei der Herstellung des Konjugats wird die aus Backhefe isolierte anorganische Pyrophosphatase benutzt, als Substrat dient das nichtradioaktive Natriumpyrophosphat in einer Konzentration von 0,05 mM, und nach der Durchführung der Reaktion zwischen dem mit der Oberfläche der festen Phase verbundenen Konjugat und dem Substrat gibt man 0,05 ml färbbares Reagens der in Beispiel 8 angegebenen Zusammensetzung zu.

Angaben für eine Reihe von Konzentrationen des Nelkenscheckungsvirus sind in der Tabelle 8 dargestellt.
ViruskonzentrationOptische Dichte in ng/ml

00,075 50,256 100,485 200,751

Claims

1. Verfahren zum Antigennachweis, das

- Herstellung eines Konjugats durch Vernetzung des Antikörpers mit einem Ferment;
- Bindung des nachweisbaren Antigens an eine feste Phase;
- Durchführung der Reaktion zwischen dem angegebenen Konjugat und dem an die feste Phase gebundenen Antigen unter Bildung einer festen und einer flüssigen Phase;
- Trennung der gewonnenen festen und flüssigen Phase;
- Durchführung der Reaktion zwischen der einen der Phasen und dem Substrat und Bestimmung der Antigenmenge aus dem Betrag der Fermentaktivität vorsieht,

dadurch gekennzeichnet, daß man als Ferment bei der Herstellung des Konjugats eine anorganische Pyrophosphatase verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Abklingen der Reaktion der Phase mit dem Substrat in das Reaktionsgut ein färbendes Reagens einführt, wobei als solches starke anorganische 3 bis 7,5 n-Säure dient, die folgende Bestandteile (in Masse %) enthält: 0,75 bis 4,5 Molybdat, 0,05 bis 0,3 oberflächenaktiver Stoff, 0,025 bis 0,25 Malachitgrün.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Bestimmung der Fermentaktivität als Substrat ein Pyrophosphat in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 mMol zur Verwendung kommt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine anorganische Pyrophosphatase, isoliert aus dem Homogenat von Zellen Escherichia coli durch Wärmebehandlung der genannten Zellen bei einer zwischen 83 und 93°C liegenden Temperatur und Chromatografie über 1,6-Diaminohexylagarose verwendet.