CH672500A5

CH672500A5 -

Info

Publication number: CH672500A5
Application number: CH4458/86A
Authority: CH
Inventors: Eliora Z Ron; Eugene Rosenberg
Original assignee: Univ Ramot
Priority date: 1985-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1989-11-30
Also published as: DE3638062C2; DK530186D0; ZA868050B; GB8626693D0; DK530186A; CA1301683C; US4921793A; FR2589881A1; GB2183665B; IL76981A0; ES2003745A6; DE3638062A1; IL76981A; FR2589881B1; GB2183665A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen polymeren Substanzen gemäss dem Oberbegriff von Anspruch 1. Diese neuen Polymere können für die Dispersion einer Vielzahl von Mineralien verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Dispersionsmittel, die solche polymere Substanzen enthalten, und Mikroorganismen zur Durchführung des obigen Verfahrens.

Mikroorganismen, die ein grosses Verhältnis von Oberfläche zu Volumen aufweisen, bilden eine Vielzahl von Oberflächen aktiven Mitteln. Eine grosse Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln mit einem Molekulargewicht unter ungefähr 2000 Dalton wird durch Mikroben gebildet. Unter diesen können Substanzen erwähnt werden, welche oberflä-s chenaktiv sind und welche durch Spezies, wie Rhodococcus, Torulopsis, Pseudomonas, Corynebacterium, B. subtilis etc. gebildet werden.

Eine Vielzahl von mikrobiellen oberflächenaktiven Mitteln, welche im allgemeinen Gemische von Proteinen und io Polysacchariden sind, werden von Acinetobacter calcoaceticus gebildet. Andere oberflächenaktive Mittel werden von Candida tropicalis, Pseudomonas aeruginosa, Phormidium J-l gebildet. Keines der bekannten oberflächenaktiven Mittel, das durch Bakterien gebildet wird, und keiner der ls oben erwähnten Mikroorganismen sind als Dispersionsmittel für feinverteilte Materialien wirksam.

Dispersionsmittel sind spezifische oberflächenaktive Substanzen, welche so ausgebildet sind, dass sie die Bildung und Stabilisierung von feinverteilten Feststoffen in einer Flüssig-20 keit, im allgemeinen in einem wässrigen System, erleichtern. Dispersionsmittel werden in grosser Vielzahl bei verschiedenen Herstellungsverfahren, wie bei der Herstellung von Papier, Druckfarben, Anstrichmitteln, Pharmazeutika, Kunststoffen, Farbstoffen, Nahrungsmitteln, keramischen 25 Materialien, Kautschuk, Zement und ähnlichen, verwendet. Dispersionsmittel werden viel in den Bergbau-Industrien verwendet. Solche Dispersionsmittel zeigen im allgemeinen ihre Aktivität, indem sie an festen Teilchen absorbiert werden, was eine elektrische Ladung dieser bewirkt und wobei sie 30 anschliessend von Gegenionen umgeben werden, was eine Abstossung benachbarter Teilchen voneinander bewirkt, wodurch eine Ausflockung vermieden wird und wodurch die feinverteilten Teilchen in Suspension gehalten werden.

Bis heute sind keine bakteriell gebildeten polymeren Dis-35 persionsmittel für feinverteilte Mineralien bekannt. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer polymerer Substanzen gemäss kennzeichnendem Teil von Anspruch 1. Diese Substanzen sind als Dispersionsmittel in vergleichsweise geringen Konzentrationen wirksam. Sie 40 können in vergleichsweise reiner Form nach Fermentationsverfahren hergestellt werden. Sie können als Dispersionsmittel bei einer Vielzahl von Industrien, wie oben angegeben, verwendet werden. Sie sind wirksame Dispersionsmittel für die Dispersion in Wasser von Substanzen, wie feinverteiltem 45 Kalkstein, Calciumcarbonat, Phosphaten (Apatiten), Titandioxid etc. Die erfindungsgemäss durch bestimmte Stämme von Acinetobacter calcoaceticus erhaltene, hochmolekulare Substanzen sind jene des Polysaccharidtyps. Die Substanzen, welche in im wesentlichen reinem homogenem Zustand iso-50 liert wurden, zeichnen sich durch eine hohe spezifische Aktivität als Dispersionsmittel aus.

Die erfindungsgemässen Dispersionsmittel sind im allgemeinen Heteropolysaccharide, welche Carboxygruppen enthalten, und Salze davon mit Kationen, wie auch Amino-55 und/oder Acylaminomonosaccharid-Molekülteile, einschliesslich der sauren Additionssalze von solchen Amino-gruppen. Beispiele von Kationen sind Natrium-, Kaliumoder Ammoniumionen, und die Säureadditionssalze können solche mit Chlorwassersäure oder einer ähnlichen Säure sein. 60 Solche polymeren Produkte, die durch Bakterien gebildet werden, sind ein Gemisch aus Verbindungen mit individuellen Molekulargewichten.

Die Erfindung umfasst auch Carboxyl enthaltenden und Amino (oder/und Acylamino) enthaltenden Heteropolysac-65 charide, welche Dispersionsmittel für Mineralien sind, welche niedrigere oder höhere Molekulargewichte aufweisen als die, die in den spezifischen Beispielen aufgeführt sind.

Ohne dass dies eine Beschränkung der vorliegenden Erfin

dung sein soll, nimmt man an, dass solche Dispersionsmittel im allgemeinen ein durchschnittliches Molekulargewicht entweder im Bereich von etwa 46 000 bis etwa 57 000, bestimmt durch Sedimentations-Geschwindigkeitsanalyse, oder im Bereich von etwa 55 000 bis etwa 68 000, bestimmt durch die Intrinsikviskosität bzw. grundmolare Viskositätszahl, besitzen.

Das polymere Produkt wird durch Fermentation der Stämme A5 und HE5 von Bakterium Acinetobacter calcoaceticus gebildet. Diese Mikroorganismen wurden am 4.11.1986 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Griese-bachstr. 8, D-3400 Göttingen hinterlegt. Die Hinterle-gungs-Nr. für A2 ist DSM 3894 und für HE5 DSM 3895.

Die erfindungsgemässen Produkte besitzen weiterhin die Eigenschaft, dass sie in bestimmten Konzentrationen als Ausflockungsmittel für Mineralien in wässrigem Medium und insbesondere für Kalkstein, präzipitiertes Calciumcarbonat und insbesondere für Kalkstein, präzipitiertes Calciumcarbonat, wasserunlösliche Phosphate und Titandioxid sind. Die Produkte müssen, damit sie als Dispersionsmittel für Mineralien aktiv sind, nicht isoliert werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Dispersionsmittel für anorganische Mineralien in wässrigem Medium. Das Dispersionsmittel kann entweder die rohe Brühe, die beim Bakterienfermentationsverfahren gebildet wird oder das teilweise gereinigte Produkt enthalten. Als wässrige Dispersionen von Mineralien kommen insbesondere solche von Kalkstein, präzipitiertem Calciumcarbonat, einem wasserunlöslichen Phosphat (insbesondere Apatit) oder Titandioxid in Frage.

Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird in Anwesenheit von Nährstoffen das Bakterium aerob gezüchtet, das, wenn es wächst, die gewünschten neuen Polysaccharide ausscheidet. Das Rohprodukt kann gegebenenfalls durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden und gegebenenfalls weiteren Behandlungsstufen unterworfen werden, die beispielsweise die Ausfällung mit Ammoniumsulfat, die Lösungsmittelextraktion zur Entfernung von nicht kovalent gebundenen Lipiden, einen Ionenaustausch zum Ersatz der Gegenionen, die Dialyse zur Entfernung von zellularen Materialien und/ oder die Behandlung mit Enzymen zur Entfernung von Proteinen umfassen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird das polymere Produkt nach einem Verfahren hergestellt, welches umfasst:

(a) Herstellung des Rohmaterials nach dem oben beschriebenen Verfahren, wobei die Abtrennung bevorzugt durch Zentrifugieren erfolgt,

(b) Unterwerfen des Rohmaterials der Präzipitation mit Ammoniumsulfat und/oder der Lösungsmittelextraktion und/oder des Ionenaustausches und/oder der Dialyse und/ oder der Behandlung mit Enzymen,

(c) Extraktion einer wässrigen Lösung des bei Stufe (b) erhaltenen Materials mit Phenol bei erhöhter Temperatur und bevorzugt Abtrennung der Phasen durch Dekantieren und anschliessendes Zentrifugieren,

(d) Dialyse der so extrahierten wässrigen Lösung und

(e) Entfernung des Wassers aus der so dialysierten Lösung, bevorzugt durch Gefriertrocknung.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Verfahrensstufe (b) die darauffolgende Präzipitation mit Ammoniumsulfat, die Abtrennung des Präzipitats durch Zentrifugieren, die Dialyse gegenüber destilliertem Wasser und die Lyophilisierung.

Für die Herstellung wässriger Dispersionen aus Mineralien kann das Dispersionsmittel als wässrige Lösung oder Aufschlämmung oder in Form des trockenen Materials verwendet werden.

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Die Acinetobacter calcoaceticus A2- oder HE5-Stämme können im Gemisch zusammen in einem Nährmedium oder verarmten Nährmedien für das Wachstum solcher Bakterien und mindestens eine annehmbare Menge an Heteropolysac-charid, das durch ein solches Bakterium abgeschieden wird, vorliegen.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise mit zwei unterschiedlichen Stämmen von Acinetobacter calcoaceticus ausgeführt werden, wobei die polymeren Substanzen, auch Biodispersionsmittel genannt, in das umgebende Medium während der Züchtung dieser Stämme in einem belüfteten flüssigen Medium abgeschieden werden. Die Biodispersionsmittel können aus dem verarmten Nährmedium konzentriert und gereinigt werden durch Dialyse, Ammoniumsulfatpräzipitation und Phenolextraktion. Die hochgereinigte Fraktion besteht aus einem anionischen Heteropolysaccharid (1,4 p,mol Carboxylgruppe pro mg Trok-kengewicht) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 50 000 Dalton. Dieses Heteropolysaccharid, welches einen Aminozucker enthält und ein potentes Dispersionsmittel ist, wird im folgenden als Biodispersan bezeichnet.

Die neuen Biodispersionsmittel können in teilweise gereinigten oder gereinigten Formen verwendet werden. Die Bio-dispersionsmittelherstellungen können mit Lösungsmittel extrahiert werden zur Entfernung von nichtkovalent gebundenen Lipiden, dem Ionenaustausch unterworfen werden zum Ersatz von Gegenionen und mit Enzymen behandelt werden, um inaktive Proteine zu zersetzen. Die Biodispersionsmittel können als flüssige Lösungen, Aufschläm-mungen oder als getrocknetes Pulver verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass sie bei der Dispersion und/oder Flokku-lation unterschiedlicher Formen von Calciumcarbonat, Titandioxid und Phosphatmineralien nützlich sind.

Die Dispersionseigenschaften der Biodispersionsmittel zeigen, dass sie ebenfalls bei vielen anderen Mineralien nützlich sind.

Isolierung und Charakterisierung von Acinetobacter cal-coaceticus-Stämmen HE5 und A2:

Acinetobacter-Spezies sind in der Natur weit verbreitet. Die Quellen der beiden Acinetobacter, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Menschenhaar (Stamm HE5) und Boden (Stamm A2).

Die erfindungsgemässen Stämme HE5 und A2 wurden als A. calcoaceticus gemäss den folgenden Kriterien klassifiziert:

Die Zellen sind gramnegativ, nichtmobil, oxidasenegativ, aerob, kokkoide Stäbchen, die auf McConkey-Agar wachsen, aber Glucose nicht fermentieren. Ein weiterer Beweis, dass A2 und HE5 A. calcoaceticus-Stämme sind, wird erhalten, indem man das Interspezies-DNA-Transformationsver-fahren von Juni (J. Bacteriol. 112:917 (1972)) verwendet. DNA, extrahiert von entweder HE5 oder A2, transformiert kompetente auxotrophe A. calcoaceticus BD4I3.

Zusätzliche biochemische und Wachstumseigenschaften der Stämme HE5 und A2 sind in den folgenden Tabellen III und IV angegeben. Der Stamm A2 kann auf wesentlich mehr Kohlenstoffquellen wachsen und diese oxidieren als der Stamm HE5.

Tabelle III

Biochemische Eigenschaften von A. calcoaceticus-Stämmen HE5 und A2:

Test* A2 HE5

Glucosefermentation

Glucoseoxidation +

Haemolyse (5%iges Schaf-RBC)

3

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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4

Tabelle III

Biochemische Eigenschaften von A. calcoaceticus-Stämmen HE5 und A2:

Test*

A2

HH5

H2S-Produktion (Kligler)

_

Säure- und Gasproduktion (Kligler)

-

Oxidation von Galactose

+

-

Oxidation von Mannose

+

-

Oxidation von Rhamnose

-

Oxidation von Xylose

+

-

Oxidation von Lactose

+

-

* Die Medien für die verschiedenen Tests werden von MacFaddin (Bioche-mical Tests for Identification of Medicai Bacteria. 2. Auflage, Williams und Williams, Baltimore, 1980)) und in Manual of Clinical Microbiology, 3. Auflage, American Society for Microbiology, beschrieben.

Tabelle IV

Wachstum der Stämme von HE5 und A2 auf verschiedenen Kohlenstoffquellen

Kohlenstoffquelle *

HE5

A2

Glucose

schlecht

Glucose 0,5%

-

+

Saccharose

-

Saccharose 0,5%

-

schlecht

Arginin

-

+

Alanin

+

Prolin

+

Tryptophan schlecht

-

Tryptophan 0,01%

+

Tyrosin schlecht

+

Ethanol, 2%, 42 °C

+

* Das Wachstum wird bei 30 °C geprüft. Die Kohlenstoffquelle wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1%, sofern nicht anders angegeben, zugegeben. Zusätzlich zu der Kohlenstoffquelle enthalten die Medien 0,11% Dikaliumhy-drogenphosphattrihydrat, 0,36% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,4% Ammoniumsulfat, 0,4% Magnesiumsulfatheptahydrat (End-pH 7,0) und 2% Agar.

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 einen Standarddispersionsversuch. Das Biodispersionsmittel, das bei diesem Versuch verwendet wurde, war die ungereinigte dialysierte extrazellulare Kulturflüssigkeit des Stammes A2.

Fig. 2 das l3C-NMR-Spektrum von dem Biodispersionsmittel A2.

Fig. 3 die Dispersion von Kalkstein von Biodispersionsmitteln von HE5: dialysierte zellfreie Kulturbrühe (O), Ammoniumsulfat, präzipitiertes rohes Biodispersionsmittel (□), gereinigtes Biodispersionsmittel (•).

Diese Symbole werden ebenfalls in den Fig. 4 bis 8 verwendet.

Fig. 4: Dispersion von Kalkstein mit den Biodispersionsmitteln von A2.

Fig. 5 : Dispersion von Titandioxid mit den Biodispersionsmitteln von HE5.

Fig. 6 : Dispersion von Titandioxid mit den Biodispersionsmitteln von A2.

Fig. 7 : Dispersion von Apatit mit den Biodispersionsmitteln von HE5.

Fig. 8 : Dispersion von Apatit mit den Biodispersionsmitteln von A2.

Beispiel 1

Herstellung der Biodispersionsmittel mittels A. calcoace-ticus-Stämmen HE5 und A2. Analytische Verfahren:

Sofern nicht anders angegeben, ist das feste Material, das s für die Dispersionsanalysen verwendet wird, gepulverter Kalkstein aus der Umgebung von Jerusalem, zerkleinert und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,044 mm (325 mesh) durchgesiebt.

Das Material enthält über 99% Calciumcarbonat. Das prä-10 zipitierte Calciumcarbonat ist ein chemisch reines Produkt von Merck, Art. 2066, Ansatz 5204195. Das Titandioxid ist ein im Handel erhältliches Pigment, das von einem lokalen Händler erhalten wird. Die Apatit(phosphat)Herstellung wird aus Phosphatgestein durch wiederholte Extraktion mit 15 Citratpuffer hergestellt. Die letzte kalksteinfreie gewaschene Präparation wird getrocknet und gepulvert, so dass sie durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,044 mm (325 mesh) hindurchgeht.

Die Standardmineraldispersionsanalyse wird wie folgt 20 durchgeführt:

(1) In einen 12 ml konischen Messzylinder gibt man 400 mg von einem der gepulverten Mineralien (beispielsweise Kalkstein, Apatit oder Titandioxid).

(2) Zu dem gepulverten Mineral gibt man 3,8 ml einer

25 wässrigen Lösung, welche unterschiedliche Konzentrationen des Biodispersionsmittels enthält, und dann wird die Suspension durch Wirbeln während 30 Sekunden vermischt.

(3) Nachdem 30 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung bei Raumtemperatur vergangen sind, wird die Suspen-

30 sion erneut durch Aufwirbeln während 30 Sekunden (Zeit Null) vermischt, und dann wird der Zylinder ungestört stehengelassen.

(4) Nach 30 Minuten werden die oberen 2 ml sorgfältig entfernt und auf verbleibendes dispergiertes Mineral durch die

35 Trübigkeit in einem Klett-Summerson-Photometer mit einem Grünfilter untersucht (die Suspensionen werden mit Wasser verdünnt, so dass die letzte Ablesung unter 150 Klett-Einheiten (K.U.) liegt. Die Werte werden als End-K.U. x Verdünnung angegeben).

40 Unter Verwendung dieses Analysenverfahrens werden Standardkurven für die Biodispersionsmittelaktivität als Funktion der Konzentration unter Verwendung verschiedener Präparationen aus Biodispersionsmittel hergestellt. Ein Beispiel ist in Fig. 1 dargestellt. Eine Einheit der Disper-45 sionsaktivität wird als 1000 K.U. unter Verwendung des Standardanalysenverfahrens definiert. Beispielsweise ergeben 0,065 mg/ml des dialysierten A2-Biodispersionsmittels, welches in Fig. 1 verwendet wird, 1 Einheit der Aktivität. Daher beträgt die spezifische Aktivität dieser Präparation 1 50 Einheit/(0,65) (4 ml) oder 3,85 Einheiten pro mg.

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Wachstumsversuche in einem 1-1-Kolben durchgeführt, welcher 100 ml des folgenden Mediums enthielt: 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0,0,4% Ammoniumsulfat, 0,04% Magnesiumsulfathep-55 tahydrat und 2 ml Ethanol. Die Kolben werden durch Schütteln mit einem Gyratorygerät bei 30 °C nach der Inokulation mit 1 ml Übernachtkulturen der Stämme A2 oder HE5 inkubiert. Die Kulturen werden nach 1,2 und 3 Tagen für Kultur-trübigkeit (K.U.) und pH geprüft. Die Proben werden dann 60 entfernt, zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren, und die extrazellulare Flüssigkeit wird extensiv gegenüber destilliertem Wasser dialysiert.

65

Beispiel 2

Herstellung der Biodispersionsmittel in 4-1-Schüttelkolben und die Konzentration durch Ammoniumsulfatpräzipita-tion:

Zwanzig 4-1-Kolben, wovon jeder 11 Standardmedium ent-

hält, werden mit 7,0 ml Starterkultur von entweder A2 (10 Kolben) oder HE5 (10 Kolben) inokuliert. Die Starterkul-turen werden während 1 Tages auf dem gleichen Medium gezüchtet, ausgenommen, dass sie 1% Ethanol anstelle von 2% Ethanol enthielten. Die Trübigkeiten der Starterkulturen zum Zeitpunkt der Inokulation sind 425 bzw. 134 Klett-Ein-heiten für die Stämme AI und HE5. Die Kulturen werden bei 30 °C während 3 Tagen unter Gyratory-Schütteln (150 Upm) inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, einmal gewaschen und das Zelltrockengewicht wird bestimmt. Die flüssigen Überstände werden auf 55% Ammo-niumsulfat-Sättigung zur Präzipitation des aktiven Biodispersionsmittels eingestellt. Die Präzipitate von jeder der 10-1-Fermentationsversuche werden durch Zentrifugieren gesammelt und dann in 450 ml Wasser gelöst. Nach einer extensiven Dialyse gegenüber destilliertem Wasser bei 4 °C werden die Lösungen lyophilisiert. Die Endausbeuten an extrazellu-laren Materialien betragen 3,7 g für A2 und 2,7 g für HE5.

Die spezifischen Aktivitäten der Biodispersionsmittel betragen 6,2 Einheiten/mg und 6,3 Einheiten/mg für A2 bzw. HE5. In der Tabelle VII sind die Werte der 10-1-Fermen-tationsvesuche zusammengefasst.

Tabelle VII

Herstellung der Biodispersionsmittel A2 und HE5 in 4-1-Kolben

Gemessene Parameter

Bakterienkulturen A2 HE5

Volumen

10 Liter

Anfangstrübigkeit

3 K.U.

1-2 K.U.

Endtrübigkeit

470 K.U.

335 K.U.

End-pH-Wert

6,65

6,60

Zellausbeute

9,2 g

9,4 g

Biodispersionsmittel -

3,7 g

2,7 g

Trockengewicht

Protein

55%

85%

Dispersionsaktivität

2,3 x 104U

1,7 x 104U

Bei den oben beschriebenen Beispielen werden Biodispersionsmittel durch Anwendung der Gyratory-Schüttlung von A. calcoaceticus-Kulturen in Kolben, welche ein minimales Salzmedium mit 2 Vol.% Alkohol enthalten, erhalten. Gute Ausbeuten an Biodispersionsmitteln werden aus Stämmen HE5 und A2 auf diese Weise erhalten, jedoch kann der Fachmann zahlreiche andere Wege auswählen, um die Bildung zu bewirken. Beispielsweise kann man die bekannten sub-mersen Fermentationen in Rührtanks durchführen.

Beispiel 3

Isolierung und Charakterisierung der Biodispersionsmittel

Deproteinisierung :

Die mit Ammoniumsulfat präzipitierten Biodispersionsmittel, beschrieben wie in Beispiel 1 oben, werden als rohes A2-Biodispersionsmittel und rohes HE5-Biodispersionsmittel bezeichnet. Diese rohen Materialien werden weiter mittels heissem Phenol gemäss dem Verfahren von Zuckerberg et al. gereinigt (Appi. Environ.Microbiol. 37:414 (1979)).

Die aus den rohen Biodispersionsmitteln A2 und HE5 erhalten vereinigten Wasserextrakte werden extensiv gegenüber destilliertem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man weisse flockenartige Feststoffe, die als Biodispersan A2W bzw. Biodispersan HE5W bezeichnet werden, erhält. Die Ausbeuten an A2 W und HE5 W betragen 0,72 g bzw. 0,51 g. Die spezifischen Dispersionsaktivitäten von A2W und HE5W betragen jeweils 15 Einheiten pro mg

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entsprechend einer 2,4fachen Reinigung, verglichen mit den rohen Biodispersionsmitteln.

Chemische und physikalische Eigenschaften der Biodispersionsmittel A2 und HE5. Allgemeine analytische Verfahren:

Die Proteinkonzentrationen wurden gemäss dem Verfahren von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193:265 (1951)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Kohlehydrate werden nach dem Phenolschwefelsäureverfahren (Dubois et al., Anal. Chem. 28:350 (1956)) unter Verwendung von Glucose als Standard bestimmt. Die reduzierenden Zucker werden nach dem Arsenomolybdat-verfahren (Spiro, Meth. in Enzymol. 8:7 (1966)) unter Verwendung von Glucose als Standard bestimmt. Die Hexuron-säuren werden gemäss der Carbazolreaktion (Dische, Methods of Biochemical Analysis 2:313 (1955)) unter Verwendung von Glucuronsäure als Standard geschätzt. Die Hexosamine werden gemäss dem Indol-HCl-Verfahren und anschliessender Deaminierung entsprechend Dische und Borenfreund (J. Biol. Chem. 192:583 (1951)) bestimmt. Die Titrationen erfolgten mit einem pH-Meter durch ein Mikroverfahren, bei dem 0,01 ml Teile von 0,1N HCl- oder NaOH-Lösungen unter gutem Mischen unter Stickstoffgas (zum Ausschluss von Kohlendioxid) zu 3,0 ml Lösungen, die titriert wurden, zugegeben wurden.

Die Viskosität wird mit 1,0-ml-Proben in einem Ostwald-Fenske-Mikroviskometer bei 30 °C gemessen. Eine analytische Ultrazentrifuge, Beckman Modell E, die mit einem optischen Schlierensystem ausgerüstet war, wird für die Messung der Sedimentationsgeschwindigkeit und Diffusionskonstanten bei 20 °C verwendet. Die Absorption wurde an einem Gilford-Modell-240-Spektrophotometer abgelesen. Die NMR-Spektren wurden von S. Carmeli, Chemistry Department, Tel Aviv University, aufgenommen und auf einem Bruker-AM-360-Spektrometer mit einem Aspect-3000-Com-puter aufgezeichnet, und es wurde bei 360,1 MHz und 90,5 MHz für 'H bzw. I3C gearbeitet. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an vorbeschichteten Celluloseplatten (Merck) unter Verwendung von Lösungsmittel 1 : Ethyla-cetat, Pyridin, Essigsäure, Wasser (5:5:3:1, Volumenverhältnisse) durchgeführt. Die Zucker und Polyole wurden mit alkalischem Silbernitrat (Gai, Anal. Biochem. 24 : 452 (1968)) nachgewiesen. Die Aminozucker wurden mit einem Ninhydrin-Sprayreagenz nachgewiesen.

Ergebnisse:

Die 13C- und 'H-NRM-Spektren von gereinigten Biodisper-sanen A2 und HE5 sind im wesentlichen identisch. Die beiden Materialien ergeben ebenfalls identische Titrationskurven und TLC-Muster nach der Säurehydrolyse. Weiterhin zeigten die Biodispersane A2 und HE5 ähnliche Dispersionsaktivitäten bei verschiedenen Mineralien (vide infra). Die gereinigten Biodispersane A2 und HE5 erschienen identisch zu sein, obgleich sie von verschiedenen Acinetobacter-Stämmen gebildet wurden. Die in diesem Teil dargestellten Werte sind die für Biodispersan A2, obgleich äquivalente Ergebnisse für HE5 erhalten wurden.

Gereinigtes Biodispersan A2 enthält weniger als 2% Protein, ergibt einen negativen Test für Hexuronsäuren und eine schwache Reaktion mit Phenolschwefelsäure. Nach der Hydrolyse in 3 N HCl bei 100 °C während 4 Stunden gab das Material starke Tests für reduzierende Zucker und Aminozucker. Somit ist Biodispersan A2 ein Aminozucker enthaltendes Biopolymeres. Das gereinigte Biopolymere (1 mg/ml) zeigt keine signifikante Absorption im Bereich von 225 bis 800 nm.

Die Titration von Biodispersan A2 zwischen pH 2 und 12 zeigt einen einzigen Wendepunkt, entsprechend pK1 = 3,2

5

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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(typisch für eine Uronsäure). Das Material enthält 1,4 Mol Carboxylgruppen pro mg Polymerem. Somit ist A2 ein anionisches Biopolymeres. Die titrierbaren Aminogruppen (pH 7 bis 9) betragen weniger als 0,3 ^Mol pro mg, was anzeigt, dass die Aminozucker hauptsächlich N-acyliert sind, was üblicherweise bei bakteriellen Polysacchariden der Fall ist.

Das l3C-NMR-Spektrum von Biodispersan A2 zeigt 27 ausgeprägte Signale (Fig. 2). Die vier Signale zwischen 99 ppm und 103 ppm treten in dem anomerischen Bereich der Kohlehydrate auf (Gorin, Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 38 :13 (1981)), was nahelegt, dass AI vier unterschiedliche Monosaccharideinheiten enthält. Die fünf Signale zwischen 176 ppm und 178 ppm zeigen die Anwesenheit von Carbonyl-C-Atomen an. Eine dieser Carbonylgruppen ist wahrscheinlich in dem Carboxylion enthalten, und die vier restlichen sind wahrscheinlich Carbonylmolekülteile der Acetyl-gruppen. Daraus folgt, dass die mehrfachen Signale zwischen 23 ppm und 25 ppm den Methyl-C-Atomen der Acetyl-gruppen entsprechen. Da das identische Spektrum nach der Behandlung des Polymeren mit 0,5 M NaOH bei 100 °C während 15 Minuten erhalten wird, enthält das Polysaccharid keine O-Acetylgruppen. Die Acetylsignale kommen daher höchstwahrscheinlich von N-Acetylgruppen. Das Signal bei 18 ppm ist typisch für die Methylgruppe von 6-Deoxyhex-osen.

Das TLC-Muster des säurehydrolysierten Biodispersans A2 (3 N HCl, 100 °C, 4 Stunden), entwickelt im Lösungsmittel 1, ist in Tabelle VIII zusammengefasst. Drei ninhy-drinpositive Hauptkomponenten werden mit Beweglichkeiten, bezogen auf Glucosamin, von 1,38,1,03 und 0,69 beobachtet. Zusätzlich tritt ein Streifen von ninhydrinposi-tivem und reduzierendem Material vom Ursprung bis zur Komponente C auf. Die Komponenten A und B sind eindeutig Aminozucker, da sie starke Ninhydrin- und Reduktionsreaktionen zeigen. Die Verbindung C ergibt eine blaue Ninhydrinreaktion und einen schwachen Silbernitrattest.

Tabelle VIII

TLC des hydrolysierten Biodispersans A2a

Komponente

Rb|G

Reaktion AgN03[

Ninhydrin

Standards

Glucose

Galactose

Glucosamin

Galactosamin

Glucuronsäure

Galactosaminneuronsäure

Hydrolyseprodukte von

Biodispersan A2:

A

B

C

Streifen

1,50 1,33 1,00 0,87 0,58 0,29

1,38 1,02 0,69 0-0,5

+ + + +

Purpur

+(schwach) Beige

+ Purpur

+ (schwach)Blau + Braun-

Purpur a. Erhalten nach 4 Stunden Hydrolyse in 3 N HCl bei 100 °C.

b. Bewegungsgeschwindigkeit von jedem Zucker relativ zu Glucosamin.

Die Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse von 2 mg/ml Biodispersan A2 zeigt eine einzige Bande entsprechend einem S20 von 1,39 x 10~13S oder 1,39 Svedberg-Einheiten. Der Diffusionskoeffizient D, ebenfalls bestimmt in der analytischen Zentrifuge, beträgt 18,8 x 10-8 cm2 sek. Eine Schätzung des Molekulargewichts von Biodispersan A2 aus der Gleichung:

M = RTsD-10(l-VP)-\

5

worin R die Gaskonstante, T die absolute Temperatur, p die Dichte der Lösung und V das spezifische Partialvolumen von A2 bedeuten (welches als 0,65 cm3 g-1 angenommen wird, typisch für Polysaccharide), ergibt ein gewichtsdurchschnitt-10 liches Molekulargewicht von 51.400. Alternativ kann das Molekulargewicht unter Verwendung der bestimmten Werte der grundmolaren Viskositätszahl, 440 cm3 g_l, und des Sedimentationskoeffizienten entsprechend der Gleichung von Scheraga und Mandelkern (J. Am. Chem. Soc. 75:179 (1953)) 15 bestimmt werden. Das aus der Viskosität berechnete durchschnittliche Molekulargewicht für Biodispersan A2 beträgt 61.800. Obgleich die chemische Struktur von Biodispersan A2 bis jetzt noch nicht bestimmt wurde, definieren die chemischen und physikalischen Eigenschaften, die in diesem 20 Teil aufgeführt wurden, die Substanz als neues, anionisches, Aminozucker enthaltendes Heteropolysaccharid.

Beispiel 4

Verwendung der Biodispersionsmittel: 25 Die erfindungsgemässen Biodispersionsmittel können die Dispersionen bestimmter Mineralpulver in Wasser disper-gieren und/oder stabilisieren. Die Wirksamkeit des Dispersionsmittels kann leicht beobachtet werden, indem man eine 10%ige Aufschlämmung des Pulvers in Wasser durch 30 Mischen herstellt und die Suspensionen dann ungestört stehen lässt. Abhängig von der Grösse der Teilchen, die das Pulver darstellen, und ihrer Dichte, werden sich die Teilchen mit einer bestimmten Geschwindigkeit absetzen, und es verbleibt eine klare obere Wasserphase. Das Dispersionsmittel 35 wird die Geschwindigkeit beim Absetzen verlangsamen.

Eine quantitative Messung der Wirksamkeit des Dispersionsmittels kann erhalten werden, indem man die Sedimentationsgeschwindigkeit der Teilchen (Abnahme in der Trübe der oberen Phase) bei unterschiedlichen Konzentrationen 40 -des Dispersionsmittels bestimmt. Die Fähigkeit unterschiedlicher Präparationen, von Dispersionsmitteln aus A2 und JHE5 Kalkstein zu dispergieren, sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt, Titandioxid zu dispergieren in den Fig. 5 und 6 und Apatit zu dispergieren in den Fig. 7 und 8. Diese Werte 45 zeigen, dass die am meisten gereinigten Präparationen, Biodispersan HE5 und A2, Kalkstein bei Konzentrationen von weniger als 0,2 mg/ml dispergieren, was einem Gewichtsverhältnis von Kalkstein zu Biodispersan von über 5.000:1 entspricht. Die schlechtere Dispersionskraft der rohen Biodis-50 persionsmittel kann ihren niedrigeren Gehalt an aktivem Biopolymeren zugeschrieben werden. Die wirksame Dispersion des weissen Pigments Titandioxid erforderte etwa das 1 Ofache mehr von Biodispersan A2 und HE5. Schliesslich waren die gereinigten Biodispersane A2 und HE5 unfähig, ss Apatit zu dispergieren, wohingegen die rohen Präparationen von Biodispersionsmitteln A2 und HE5 bei der Dispersion der künstlich hergestellten Apatitpräparation (Citratextrak-.tion von Phosphatgestein) sehr wirksam waren.

Niedrige Konzentrationen an Biodispersionsmitteln AI so und HE5 flocken Calciumcarbonat aus (Tabelle IX). Die Absetzgeschwindigkeit von Calciumcarbonat in Wasser wurde um 20% bzw. 75% durch 5 jig/ml bzw. 15 [Lg/ml rohes Biodispersionsmittel A2 erhöht. Bei 5 M-g/ml beträgt das Gewichtsverhältnis von Bioausflockungsmittel zu Calcium-65 carbonat 1:20 000. Die rohe HE5-Biodispersionsmittelpräpa-ration ist bei der Ausflockung von Calciumcarbonat weniger wirksam, und es sind 40 ng/ml (1:2500) erforderlich, um die Absetzgeschwindigkeit um 75% zu erhöhen.

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Tabelle IX Ausflockung von Calciumcarbonat*

Biodispersionsmittel keines (Vergleich) A2 - 5 p.g/ml 8 jig/ml 12 jig/ml 15 ng/ml HE5-5 Hg/ml 10 pg/ml 20 ng/ml 30 ng/ml 40 jig/ml

Absetzgeschwindigkeit (klares Volumen/10 min)

2,0 ml

2.4 ml 2,8 ml 3,2 ml

3.5 ml 2,2 ml

2.6 ml

2.7 ml 3,0 ml 3,5 ml beschränkt, sondern sie wird durch die folgenden Ansprüche erläutert.

Beispiel 5

5 Biodispersan ist ebenfalls bei der Dispersion von Kaolinit-tonen wirksam. Beispielsweise setzen sich ohne Dispersionsmittel 0,8 g Kaolin (BDH, schwer), suspendiert in 10 ml Wasser, in einem Messzylinder in solcher Geschwindigkeit ab, dass nach 30 min eine klare obere Schicht von 5,6 ml 10 gebildet wird. In Anwesenheit von 0,8 mg Biodispersan (Verhältnis von Kaolin zu Biodispersan von 1000:1 ) setzt sich das Kaolin wesentlich langsamer ab. Nach 30 min hat sich nur ein Sediment von 0,7 ml mit einer trüben oberen Phase von 11 000 Klett-Einheiten gebildet. Selbst nach 16 Stunden 15 stehen ist die obere Phase noch trüb (K.U. von 4600).

* 10%ige wässrige Suspensionen von ausgefälltem Calciumcarbonat, welche unterschiedliche Konzentrationen von rohem Biodispersionsmittel enthalten, werden in 10 ml geeichte Zylinder gebracht und ungestört stehengelassen.

Nach 10 min wird das Volumen der klaren oberen Schicht gemessen. 2o

Die Erfindung wurde unter Bezugnahme bestimmter spezifischer Ausführungsformen beschrieben. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass viele Modifikationen und Variationen durchgeführt werden können. Die Erfindung ist 25 daher nicht auf das, was besonders beschrieben wurde,

Beispiel 6

Biodispersan ist ebenfalls wirksam, um bestimmte organische Verbindungen zu suspendieren. Werden beispielsweise 65 mg grosse amorphe Teilchen von Ölrot (BDH) vorsichtig mit 5 ml Wasser vermischt, so flotieren die Ölrot-teilchen an der Luft/Wasserfläche innerhalb von 5 sek. Wird der gleiche Versuch in Anwesenheit von 15 mg Biodispersan durchgeführt, so bleiben die Ölrotteilchen in Wasser während 20 bis 30 Minuten suspendiert.

B

4 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer als Dispersionsmittel für wasserunlösliche feinverteilte Feststoffe in einem wäss-rigen Medium geeigneten polymeren Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Bakterienstamm von Acine-tobacter calcoaceticus fermentiert und das Fermentationsprodukt gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Stamm A2, DSM3894 oder HE5, DSM3895 von Acinetobacter calcoaceticus verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die polymere Substanz in Form der rohen Fermentationsbrühe oder der teilweise gereinigten Fermentationsbrühe gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die polymere Substanz in wesentlich gereinigter Form gewinnt.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm von Acine-tonbacter calcoaceticus unter aeroben Bedingungen solange züchtet, bis eine vorbestimmte Konzentration des polymeren Produkts im Kulturmedium vorliegt und das Produkt dann reinigt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Rohprodukt durch Sedimentation oder Zentri-fugation, Präzipitation mit Ammoniumsulfat, Lösungsmittelextraktion, Dialyse zur Entfernung von zellularem Material oder Behandlung mit einem Enzym zur Entfernung von pro-teinhaltigem Material aufarbeitet.
7. Polymere Substanz, hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polysaccharid, das Carboxygrappen enthält und Salze davon, wie auch Amino- oder Acylaminomo-nosaccharid-Moleküleinheiten und Säureadditionssalze von diesen, ist, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht des Polysaccharidmoleküls von 45 000 bis 57 000, bestimmt durch Sedimentationsanalyse, und 55 000 bis 68 000, bestimmt durch Messung der grundmolaren Viskositätszahl.
8. Polymere Substanz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2 hergestellt wurde und das in Figur 2 dargestellte Spektrum aufweist.
9. Acinetobacter calcoaceticus A2, DSM3894 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
10. Acinetobacter calcoaceticus HE5, DSM3895 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1

bis 6.
11. Dispersionsmittel für feste Mineralien mit kleiner Teilchengrösse, ausgewählt aus der Gruppe von Kalkstein, Calciumcarbonat, wasserunlöslichem Phosphat, Titandioxid und Tonen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine polymere Substanz, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, enthält.
12. Dispersionsmittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der polymeren Substanz von 1 bis 500 bis 1 bis 5000, ausgedrückt durch das Gewicht, berechnet auf ein wässriges System ist.

Verfahren zur Herstellung von als Dispersionsmittel geeigneten polymeren Substanzen