CH673028A5 - - Google Patents
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Description
DESCRIPTION
La présente invention a pour objet un nouveau composé marqué au tritium apparenté aux rétinoïdes, sa préparation et son application notamment dans la détermination de l'affinité des rétinoïdes pour leur récepteur cellulaire et/ou dans la détermination de la teneur cellulaire en récepteur correspondant.
On sait que les rétinoïdes constituent une classe connue de composés qui agissent notamment sur la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules; voir par exemple B.A. Pawson et coll., «Journal of Médicinal Chemistry», vol. 25, N° 11, pages 1269-1277 (1982).
Les rétinoïdes ont été utilisés en particulier dans le traitement de diverses maladies dermatologiques dans lesquelles un dérèglement des mécanismes de contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules épidermiques est impliqué; voir par exemple l'ouvrage «Update: Dermatology in General Medicine», édité par Thomas B. Fitzpatrick et al. (McGraw-Hill Book Company), publié en 1983, en particulier le chapitre de D.B. Windhorst et al., «The Retinoids», pages 226-237.
Le mode d'action des rétinoïdes est encore mal connu. Il a toutefois été montré qu'il existe dans les cellules un récepteur appelé cRABP (cellular Retinole Acid-Binding Protein) spécifique des rétinoïdes possédant un groupement acide.
La détermination de la constante d'affinité (Kd) pour la cRABP d'un rétinoïde possédant un groupement acide constitue un moyen particulièrement rapide d'évaluation de l'activité biologique potentielle dudit rétinoïde.
Plusieurs méthodes expérimentales permettent de déterminer la constante d'affinité d'un ligand pour son récepteur. On peut en particulier opérer par une méthode directe, si le ligand considéré est marqué radioactivement, ou encore par compétition avec un ligand radioactif, si le ligand considéré n'est pas marqué radioactivement.
Un bon ligand radioactif doit, d'une part, présenter une affinité élevée pour son récepteur et, d'autre part, présenter une faible fixation sur toute autre molécule. En outre, il doit être suffisamment stable pour permettre une utilisation commode.
Dans le cas des rétinoïdes acides, le ligand radioactif généralement utilisé est le plus souvent l'acide rétinoïque tritié, soit en position 2 («Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuti-cals», vol. XVIII, page 1099 (1980), soit en position 4 (demande de brevet allemand N° 3.142.975).
L'acide rétinoïque présente certes une excellente affinité pour la cRABP, avec une fixation non spécifique faible, mais la molécule présente l'inconvénient de se dégrader rapidement, par radiolyse, oxydation et photolyse.
On a maintenant découvert que l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyI)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique tritié constitue un nouveau ligand radioactif qui présente une excellente affinité pour la cRABP, avec une fixation non spécifique faible. De plus, ce nouveau ligand est très stable et peut être obtenu avec une haute activité spécifique, ce qui le rend particulièrement utile pour la mesure de l'affinité des rétinoïdes pour la cRABP.
La présente invention a donc pour objet l'acide 2-(5,6,7,8-tétra-hydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique marqué au tritium et en particulier dont le groupement méthy-lidyne en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène est marqué au tritium.
L'invention a pour objet aussi bien le composé marqué susmentionné à l'état pur que tout mélange de ce même composé avec le composé homologue non marqué.
L'invention a notamment pour objet un nouveau ligand radioactif, tel que défini ci-dessus, ayant une activité spécifique supérieure à 1 Ci/mmole et de préférence au moins égale à 2 Ci/mmole, soit environ 75 GBq/mmole.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation du nouveau ligand radioactif tel que défini ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on prépare un acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique et qu'on le soumet à l'action d'un agent réducteur tritié.
L'agent réducteur est par exemple de l'hydrogène tritié utilisé en présence d'un catalyseur convenable, notamment un catalyseur à base de palladium.
La réduction du dérivé 3-halogéné est effectuée de préférence à température et sous pression ambiantes, par exemple à 15-30° C sous une pression de 1 bar (soit environ 105 Pa).
Le dérivé halogéné utilisé comme produit de départ est de préférence le dérivé bromé.
L'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique peut lui-même être préparé à partir de l'acide 2-(5,6,7,8-têtrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique par l'action d'un agent d'halogénation (en particulier de bromation). Par exemple, le dérivé bromé peut être obtenu par l'action d'un agent de bromation tel que le N-bromosuccinimide dans le diméthylformamide à une température réactionnelle pouvant aller de 0 à 50° C, de préférence de 0 à 20° C.
L'acide 2-(5,6,7,8 tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique est un produit connu (appelé ci-après composé A) et peut être obtenu selon le procédé décrit par
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exemple dans la demande de brevet français N° 85.13747 (2.570.377) déposée le 17 septembre 1985.
L'invention a également pour objet, à titre de produit intermédiaire obtenu dans le procédé décrit ci-dessus, l'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique, en particulier le dérivé bromé.
Le ligand radioactif de l'invention peut également être obtenu au départ de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naph-tyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique par échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique, à une température allant de préférence de 20 à 150° C. Dans ce cas, l'échange isotopique se fait préférentiellement avec les protons aromatiques du ligand.
En fait, d'une façon plus générale, les composés marqués cités plus haut peuvent être obtenus au moyen de tout procédé connu de marquage au tritium, par exemple au moyen d'un procédé analogue à celui décrit dans «Journal of Labelled Compounds and Radio-pharmaceuticals», vol. XXII, pages 843-850 (1985).
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique tritié, en particulier tritié en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène, comme marqueur radioactif, notamment dans la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoïdes à groupement carboxylique et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits rétinoïdes.
Par exemple, le marqueur radioactif de l'invention peut être utilisé lors de la purification du récepteur cRABP par les méthodes classiques de Chromatographie d'échange d'ions ou d'exclusion sous basse ou haute pression; il suffit d'ajouter à l'extrait tissulaire utilisé comme produit de départ une quantité déterminée du ligand radioactif. Le récepteur cRABP se trouve ainsi lui-même marqué, et on peut facilement repérer sa présence ou son absence dans une fraction donnée.
La connaissance des courbes de fixation sur le récepteur permet également l'utilisation du marqueur de l'invention dans la quantification du récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut également être utilisé dans la caractérisation d'anticorps contre le composé A, ces anticorps (obtenus selon les méthodes classiques d'anticorps antihaptè-nes) étant eux-mêmes utilisables dans la détermination du produit A fixé ou non sur son récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut aussi être utilisé dans l'étude du mécanisme d'action intracellulaire et du métabolisme général du composé A.
L'exemple suivant illustre l'invention, sans toutefois la limiter.
Exemple :
Acide 2- (3-H-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tëtraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique.
a) Un mélange dudit acide non tritié (500 mg; 1,37 mmole) et de N-bromosuccinimide (302 mg; 1,70 mmole) dans 15 ml de DMF est agité à température ambiante pendant 24 heures, sous atmosphère d'azote. Le mélange obtenu est ajouté à 30 ml d'acide chlorhydrique N et le produit est extrait avec de l'éther éthylique (130 ml). La phase éthérée est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, et les solvants évaporés sous pression réduite. On obtient ainsi un solide brun pâle que l'on recristallise deux fois dans un mélange isooctane/tétrahydrofuranne (50/50) pour obtenir 380 mg (63%) d'acide 2-(3-bromo-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra-méthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique qui fond à 272-275° C.
Analyse élémentaire:
Calculé: C 62,30 H 5,23 Br 18,02 0 7,22 S 7,23%
Trouvé: C 62,49 H 5,06 Br 17,94 O 7,44 S 7,77%
La position de l'atome de brome est confirmée par analyse du spectre RMN de proton du composé ci-dessus et comparaison avec le spectre RMN du produit non bromé.
b) Le composé bromé obtenu (25 mg; 0,05 mmole) est dissous dans 2 ml de dioxanne sec. 10 mg de palladium sur charbon (10%) et 20 |il (0,14 mmole) de triéthylamine sont ajoutés. Le mélange résultant est agité à température ambiante, sous atmosphère de tritium (pression environ 1 bar), pendant 20 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration et les solvants évaporés sous vide.
Le résidu est dissous dans un mélange de méthanol et d'acétate d'éthyle, puis les solvants sont évaporés sous pression réduite. Cette procédure est répétée deux fois. Le résidu obtenu est alors dissous dans un minimum de tétrahydrofuranne et purifié par Chromatographie sur plaque préparative (plaque de silice 0,2 x 20 x 20 cm, éluant: mélange dichlorométhane/méthanol 9/1). La bande fluorescente sous irradiation UV à 366 nm est recueillie.
Le produit final est dissous dans 10 ml de méthanol. Sa pureté est vérifiée par Chromatographie sur couche mince (plaque de silice, éluant comme ci-dessus). Une seule tache est apparente sous irradiation UV (254 et 366 nm) et lors du comptage bêta. Par HPLC (phase inverse, colonne Zorbax ODS, éluant: mélange acétonitrile/solution d'acide acétique à 0,02% dans l'eau 95/5), un seul pic est détecté par UV ou en utilisant un détecteur bêta.
L'activité spécifique déterminée par spectrométrie de masse est environ 300 GBq/mmole (8,0 Ci/mmole).
L'activité totale obtenue, mesurée par comptage au scintillateur liquide, est 4,3 mCi.
Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple sur le récepteur soluble cRABP.
La fixation du composé revendiqué avec la cRABP a été caractérisée par des expériences de saturation. La fixation totale (non spécifique + spécifique) (courbe a) est obtenue par incubation de concentrations croissantes (jusqu'à un maximum de 50nM) du composé revendiqué avec une quantité constante (0,3 ml) d'un homogénat de testicules de rat (organe riche en cRABP). La fixation non spécifique du composé tritié est déterminée en parallèle, par la mesure de la fixation avec des concentrations croissantes du ligand radioactif en présence d'un large excès (l|iM) d'acide rétinoïque (courbe c). Un temps d'incubation de deux heures est nécessaire à l'établissement de conditions d'équilibre.
Une fois l'équilibre atteint, le complexe cRABP - ligand tritié est séparé du ligand non lié par filtration sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25 (colonnes Bio-Rad econo, 0,5 x20 cm): le complexe est élué (pic d'élution à 2,5 ml), tandis que le ligand non lié est retenu en totalité sur la colonne. Il en résulte une séparation totale entre produit lié et produit non lié. L'élution est faite directement dans des tubes à scintillation, et la radioactivité est mesurée par comptage.
Les résultats ainsi obtenus sont analysés par régression non linéaire utilisant comme modèle l'équation de Clark (A.J. Clark, «The mode of action of drugs on cells», A. Arnold and Co.,
Londres, 1933).
Sur la figure 1, on a représenté en abscisses les concentrations initiales du ligand étudié et en ordonnées les concentrations à l'équilibre du complexe ligand-récepteur.
La différence entre les courbes a (fixation totale) et c (fixation non spécifique) donne la courbe de fixation spécifique (courbe b). L'analyse de cette courbe permet d'obtenir la constante de dissociation à l'équilibre (Kd), qui est la concentration de produit nécessaire pour saturer 50% du récepteur soluble. Cette constante est une mesure de l'affinité du ligand pour son récepteur, le Kd étant inversement proportionnel à l'affinité (plus le Kd est faible, plus l'affinité est grande). La courbe de fixation totale (a) est analysée de la même manière, après introduction d'une composante linéaire (la fixation non spécifique) au modèle de régression; la courbe de fixation spécifique obtenue de cette manière (courbe b) est en parfait accord avec celle obtenue par différence.
Cette analyse donne une valeur de Kd le 2,7+0,5 nM. La fixation spécifique est saturable et réversible. La fixation non spécifique est linéaire et non saturable dans la gamme de concentrations utili5
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sée et représente moins de 10% ds la fixation totale. Dans les mêmes conditions, la valeur du Kd de l'acide rétinoïque est 2+0,8 nM, la fixation non spécifique représentant approximativement 25% de la fixation totale.
Comparaison avec l'acide rétinoïque tritié.
Les figures 2 à 7 correspondent à des expériences de compétition et montrent la similitude des caractéristiques de la fixation de l'acide rétinoïque et du composé de l'exemple 1.
Ces expériences de compétition sont effectuées de la façon suivante: on mélange une quantité fixe de ligand radioactif (correspondant sensiblement à la demi-saturation de la quantité fixe de récepteur qui sera utilisée) avec des quantités croissantes de ligand froid (non radioactif). Puis on ajoute le récepteur, et on détermine la quantité de ligand radioactif fixée à l'équilibre (en pourcent de la fixation initiale en l'absence de ligand froid, pour la quantité de récepteur considérée).
Dans les figures 2 à 7, on a porté en abscisses les concentrations croissantes du ligand froid étudié (en moles/litre) et en ordonnées la fixation du ligand radioactif (en pourcent du maximum). Les ligands étudiés sont les suivants:
figure 2: ligand radioactif: composé de l'exemple 1
ligand froid: acide rétinoïque figure 3 : ligand radioactif: acide rétinoïque tritié
ligand froid: le même que pour la figure 2 figure 4: ligand radioactif: composé tritié de l'exemple 1 ligand froid: même composé mais non marqué (composé A)
figure 5: ligand radioactif: acide rétinoïque tritié
ligand froid; le même que pour la figure 4 figure 6: ligand radioactif: composé de l'exemple 1
ligand froid: acide p-[(E)-2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-
tétraméthyl-2-nahptyl)-propényl]benzoïque (Hoffmann-La Roche), appelé ci-après composé B figure 7: ligand radioactif: acide rétinoïque tritié ligand froid: le même que pour la figure 6 5 A partir des courbes de compétition des figures 2 à 7, on détermine dans chaque cas la IC50 (concentration de ligand froid réduisant l'attachement du ligand tritié de 50%). Cette valeur IC50 permet de calculer dans chaque cas la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour le ligand froid.
10 On a trouvé les valeurs suivantes :
figure 2: Kd= 4nM±19%
figure 3 : Kd = 4 nM+44%
figure4:Kd= 6nM+30%
figure 5: Kd= 6nM±19%
15 figureó: Kd=16nM+58%
figure 7 : Kd=20 nM+24%
Les figures 2 et 3 montrent les courbes de compétition de l'acide rétinoïque froid avec le composé de l'exemple (figure 2) et avec 20 l'acide rétinoïque tritié (figure 3). Les constantes de dissociation calculées dans l'un et l'autre cas sont les mêmes, ce qui suggère que les deux ligands radioactifs ont des spécificités de fixation similaires.
De la même manière, on voit (figures 4 et 5) que les valeurs de Kd obtenues pour le composé A, en utilisant l'un ou l'autre ligand 25 marqué, sont les mêmes.
Cela est également vérifié dans le cas du composé B (figures 6 et 7).
En conclusion, dans tous les cas étudiés ci-dessus, les Kd calculés sont indépendants du ligand tritié utilisé, ce qui montre que ces 30 ligands se lient au même récepteur avec des spécificités semblables, et que l'on peut remplacer l'un par l'autre pour la détermination de la fixation des rétinoïdes sur la cRABP.
R
2 feuilles dessins
Claims (10)
1. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique marqué au tritium.
2. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est marqué en position 3 du groupement tétrahydro-naphtalène.
3. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique tritié, tel que défini dans l'une des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il possède une activité spécifique d'au moins 75 GBq/mmole.
4. Procédé de préparation d'un composé tritié selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on prépare l'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétramêthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique par l'action d'un agent d'halogéna-tion sur l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique et que l'on soumet le produit ainsi obtenu à l'action d'un agent réducteur tritié.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'agent réducteur est l'hydrogène tritié.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'agent d'halogénation est un agent de bromation.
7. Procédé de préparation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on soumet l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique à une réaction d'échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique à une température de 20 à 150° C.
8. L'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique, comme produit intermédiaire dans le procédé selon la revendication 4.
9. Produit intermédiaire selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit dérivé halogéné est le dérivé bromé.
10. Utilisation de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétramé-thyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique tritié selon la revendication 1 comme marqueur radioactif dans la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoïdes possédant un groupement carboxylique et/ou dans la caractérisation d'anticorps dirigés contre cet acide et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits rétinoïdes.
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