CH674087A5 - - Google Patents

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CH674087A5
CH674087A5 CH3142/86A CH314286A CH674087A5 CH 674087 A5 CH674087 A5 CH 674087A5 CH 3142/86 A CH3142/86 A CH 3142/86A CH 314286 A CH314286 A CH 314286A CH 674087 A5 CH674087 A5 CH 674087A5
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Description

674 087
2
RIVENDICAZIONE Dispositivo per la valutazione diagnostica qualitativa di herpes virus, virus Eppstein-Barr, virus Varicella Zoster, virus Human T-Lymphocyte, comprendente un supporto, una zona del quale essendo rivestita con una quantità prestabilita degli anticorpi (3) specifici corrispondenti a questi virus, caratterizzato dal fatto che detta zona ha una forma adatta per il prelievo diretto degli antigeni non solubili per contatto puntura da corpo o tessuto umano o animale.
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a un dispositivo diagnostico per la valutazione di virus mediante prelievo diretto di materiali biologici.
Il dispositivo dell'invenzione comprende un supporto solido (di natura, forma e dimensioni opportune), sulla superficie del quale è fissata con tecnica adeguata una quantità predeterminata di un anticorpo che possa interagire con il virus da determinare in detto materiale biologico.
Il metodo diagnostico consiste nel mettere in contatto detto dispositivo con i tessuti biologici contenenti anticorpi o antigeni da analizzare e quindi nell'immergere detto dispositivo in opportuna soluzione rivelatrice, previo allontanamento degli anticorpi o antigeni legati in maniera non specifica.
E'noto dalla letteratura che la valutazione di molti parametri di interesse clinico, tramite analisi di un liquido biologico, richiede il trasferimento di ima quantità esattamente misurata di un idoneo contenitore dove viene incubata con una quantità predeterminata di reattivi al fine di far awernire una reazione evidenziatrice.
Se i metodi convenzionali non presentano particolari difficoltà quando i materiali biologici sono facilmente prelevabili e disponibili in quantità relativamente elevata, come normalmente si verifica per l'urina ed il sangue, lo stesso non vale qualora le analisi debbano essere effettuate su materiali biologici disponibili in piccola o piccolissima quantità (essudati, pus, muco, saliva ecc.) o di difficile prelievo da tessuti istologicamente alterati e/o situati in aree difficilmente accessibili (ad esempio, pustole, sifilomi, ulcerazioni ecc.).
Gli svantaggi della tecnica antecedente sono superati grazie al dispositivo oggetto della presente invenzione, che consentono di effettuare il prelievo diretto del materiale biologico da esaminare senza ricorrere alla misurazione del campione. Il prelievo può avvenire direttamente sul paziente, o successivamente sul campione di fluido o tessuto biologico precedentemente prelevato con una delle normali tecniche di laboratorio.
Secondo l'invenzione, il dispositivo viene messo in contatto con il materiale biologico da esaminare, detto dispositivo essendo essenzialmente costituito da un'impugnatura e da una porzione terminale destinata a venire in contatto con il materiale biologico e sulla quale si sono fissate, con tecniche opportune, quantità predeterminate di anticorpi specifici o parzialmente specifici per le sostanze antigeniche da determinare oppure, nel caso che queste ultime siano esse stesse degli anticorpi, di antigeni.
Gli antigeni o gli anticorpi presenti sulla porzione terminale del dispositivo dell'invenzione legheranno così, per reazione immunochimica, rispettivamente gli anticorpi o gli antigeni presenti nel materiale da analizzare in quantità proporzionale a quella contenuta nel materiale stesso.
Dopo lavaggio con opportuno solvente o soluzione per eliminare le sostanze non fissate con legame specifico all'antigene o all'anticorpo preventivamente fissato al dispositivo, è conveniente effettuare una determinazione diretta quantitativa e/o qualitativa del parametro clinico in esame ricorrendo a tecniche note basate ad esempio su reazioni chimiche, immunochimiche, immunoenzimatiche, enzimatiche ecc.
La forma e la dimensione del dispositvo dell'invenzione, ed in particolare quella dell'estremità rivestita con anticorpi o anti-s geni, non sono di per sè critiche per la natura dell'invenzione e sono ovviamente determinate dall'applicazione prevista e dal tipo di prelievo richiesto dall'analisi da effettuare.
Ad esempio, qualora il prelievo debba essere effettuato per puntura della cute, sarà convenientemente impiegato un dispo-ìo sitivo di forma più o meno appuntita, sostanzialmente conica, avente la porzione terminale rivestita di anticorpi o antigeni. Qualora invece il prelievo richieda un semplice contatto con un tessuto o l'immersione in un liquido biologico, la superficie rivestita di anticorpi o antigeni potrà avere forma cilindrica, sfe-i5 rica, ovoidale, discoidale, conica, tronco-conica ecc.
Particolarmente conveniente per il prelievo per puntura della cute è infine un dispositivo costituito da un'anima metallica, eventualmente rivestita di materiale plastico, avente all'estremità un corpo rivestito di anticorpi e/o antigeni, di forma e di-2o mensioni opportune (ad esempio una sferetta di 2-5 mm diametro) dal quale sporge di alcuni millimetri (ad esempio 0,5-2 mm) una punta metallica atta all'iniezione: nell'impiego, la punta metallica provocherà la fuoriuscita del liquido biologico (ad esempio una goccia di sangue) che impregnerà il corpo rivestito 25 di anticorpo e/o antigene, trovandosi immediatamente a contatto con esso a causa della minima distanza.
Come materiale per il supporto da rivestire si possono impiegare materiali plastici in grado di legare per adsorbimento gli anticorpi o gli antigeni secondo l'invenzione, quali polietilene, 30 polipropilene, polistirene, poliuretani, polivinil cloruro, BUNA-N, nylon, poliacrilati, polimetacrilati, polifluorurati [TEFLON (R)], resine fenoliche, poliacrilammidi, DELRIN(R), LEXAN(R), derivati cellulosa, derivati siliconici ecc.
Detti materiali possono eventualmente ricoprire un'anima 35 metallica.
Il legame dell'anticorpo o dell'antigene al dispositivo dell'invenzione può anche essere di tipo chimico qualora il materiale plastico di cui è costituito contenga gruppi funzionali am-minici, idrossilici, carbossilici o isocianici, idonei a fissare con 40 legame chimico composti proteici. Il materiale plastico opportuno può eventualmente essere attivato per immersione in una soluzione tamponata a pH 9 di glutaraldeide, secondo una tecnica di per sè nota, o con altri metodi simili comunemente impiegati ad esempio nel campo della immobilizzazione di enzimi. 45 Si possono anche utilizzare materiali metallici che vengano sottoposti ad un procedimento tale da renderli porosi o comunque in grado di adsorbire anticorpi e/o antigeni, ad esempio mediante tecniche galvaniche di deposizione di oro colloidale o altri metalli in forma colloidale.
50 Esempi di rivestimento con anticorpo o antigene di detti materiali sono descritti nel brevetto US 4 003 988 e nei seguenti riferimenti:
a) IMMUNOASSAY USING ANTIGEN-ENZYME CONJU-55 GATES
B.K. Van Weemen and A.H.W. Schuurs
Febs Letters — Vol. 15, number 3 — June 1971 — pag.
232-5.
b) SOLID PHASE ANTIBODY ASSAY BY ME ANS OF EN-60 ZYME CONJUGATED TO ANTI-IMMUNOGLOBULIN
P. Leinikki and Suvi Passila
J. Clin. Path., 1976, 29 — pag. 1116-20.
c) ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY WITH 65 POLYVALENT GONOCOCCAL ANTIGEN
B.R. Brodeur, F.E. Ashton and B.B. Diena.
The Journal of Medicai Microbiology — vol. 15, n. 1 —
1981 pag. 1-9.
3
674 087
d) A MICROPLATE ENZYME-IMMUNOASSAY FOR TOXOPLASMA ANTIBODY
A. Voller 1, D.E. Bidwell 2, A. Bartlett 2, D.G. Fleck 3, M.
Perkins 3 and B. Oladehin 3.
J. Clin. Path., 1976, 29, pag. 150-3.
e) ENZYMOLOGY [Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides — Préparation and characterization —
Vol. 1 — Ed. Howard H. Weetall — Marcel Dekker, Inc.,
New York (1975)].
L'anticorpo o gli anticorpi impiegati secondo l'invenzione per rivestire il supporto possono essere policlonali, o monoclonali, eventualmente in miscela, e possono essere specifici verso uno o più siti attivi dell'antigene da determinare: la specificità può inoltre essere diretta verso uno o più antigeni.
Sia gli anticorpi che gli antigeni possono essere fissati sul supporto senza limiti di quantità: si sceglierà comunque una quantità opportuna per il tipo di analisi previsto che potrà essere compresa tra un picogrammo e un milligrammo per centimetro quadrato.
Esempi di possibili applicazioni del dispositivo secondo l'invenzione comprendono la determinazione diretta di virus.
Normalmente la reazione evidenziatrice viene convenientemente effettuata per mezzo di un anticorpo marcato con un enzima opportuno, e specifico verso il complesso antigene-anticorpo fissato sul supporto in seguito all'operazione di prelievo. Allo scopo, il dispositivo avente fissato a sé il complesso antigene-anticorpo viene lavato con opportune soluzioni tampone e/o acqua per allontanare l'antigene o l'anticorpo non legato specificamente e viene quindi immerso ed incubato per un tempo opportuno in una soluzione di detto anticorpo coniugato con enzima.
Dette soluzioni di anticorpo contengono preferibilmente agenti tamponanti ed emulsionanti non ionici, ionici ed anfoteri con una concentrazione di anticorpo marcato con enzima variabile dallo 0,01 allo 0,005% in peso.
Sul supporto rimarrà così fissato il complesso anticorpo-antigene-anticorpo marcato con enzima: dopo allontanamento dell'eventuale anticorpo marcato non legato specificamente per lavaggio con opportune soluzioni tampone e/o acqua, la immersione del supporto così trattato in una soluzione contenente un opportuno sistema cromogeno a base di un substrato per l'enzima, consentirà una determinazione semplice e diretta dell'antigene attraverso misure colorimetriche, spettrofotometriche o altre, del prodotto della reazione enzimatica.
Nella figura allegata, data a puro scopo illustrativo e quindi non limitativo dell'invenzione, è rappresentato schematicamente il dispositivo dell'invenzione.
Il numero di riferimento 1 indica il supporto rivestito con l'anticorpo o con l'antigene destinato a venire in contatto col materiale biologico di forma conica; lo stelo 2 funge da impugnatura e può essere di forma e dimensioni tali da renderne agevole l'impiego, mentre con 3, 4 e 5, rispettivamente, si indicano l'anticorpo, l'antigene e l'anticorpo marcato con enzima.
Il dispositivo dell'invenzione, consentendo tra l'altro di evitare una misura precisa della quantità del materiale biologico da esaminare, presenta il vantaggio, entro i limiti di sensibilità del metodo, di una maggiore attendibilità e precisione grazie anche alla minimizzazione degli errori sperimentali: le analisi ri: sultano inoltre più rapide e tempestive, senza necessità di apparecchiature costose, al punto che è possibile prevedere l'impiego di «Kit» analitici di impiego domiciliare.
A tal fine, i dispositivi oggetto dell'invenzione saranno preparati in condizioni rigorosamente sterili in opportuni locali asettici e saranno infine introdotti in opportuni contenitori sterili, ad esempio provettine di vetro chiuse da tappi sterilizzati.
I seguenti esempi non limitativi illustrano alcune delle possibili applicazioni del dispositivo dell'invenzione.
Esempio 1
a) Preparazione del dispositivo atto alla determinazione di Herpes Virus (HSV)
Sono state utilizzate, come fase solida, lancette di polivinile 5 con un'estremità a forma di cono.
La parte terminale di tali lancette è stata posta ad incubare con un antisiero anti HSV-2 diluito 1:300 in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9,6. Il fissaggio dell'antisiero al supporto è stato tecnicamente eseguito inserendo il cono delle lan-ìo cette nei pozzetti di una micropiastra di polivinile contenenti circa 0,15 mi di antisiero, in modo che tutta la parte conica fosse immersa nella soluzione. La micropiastra è stata posta ad incubare per 2 ore a 37°C in camera umida ed in seguito a 4°C per 1 notte.
15 Al termine dell'incubazione le lancette sono state accuratamente lavate con tampone fosfato salino (KH2PO415 mM, Na2HP04 85 mM, NaCl 15 mM, KCl 25 mM) a pH 7,4 contenente lo 0,05% di Tween, poste nei pozzetti di un'altra piastra contenente lo stesso tampone salino allo 0,3% di albumina seri-20 ca bovina e lasciate incubare per 1 ora a 37°C in camera umida. Questo trattamento ha lo scopo di saturare gli eventuali siti del polivinile rimasti Uberi a cui si potrebbero adsorbire, nei seguenti passaggi, le particelle virali o lo antisiero coniugato.
b) Determinazione di Herpes Virus «in vitro»
25 Dopo un identico passaggio, le lancette sono state messe a contatto per breve tempo a temperatura ambiente con una sospensione di herpes virus diluito 1:5 in soluzione fisiologica (NaCl 0,9%).
Dopo il lavaggio, le lancette sono state poste in provette di 30 vetro contenenti antisiero anti HSV-2 coniugato con perossidasi alla diluizione di 1:150 in tampone fosfato salino contenente lo 0,05% di Tween 20. Segue un'incubazione a temperatura ambiente di 30-40 minuti, ed un lavaggio in tampone fosfato salino allo 0,05% di Tween 20 per evitare che l'antisiero coniuga-35 to, non legato specificamente all'antigene, possa interferire con l'analisi.
Dopo l'ultima fase del trattamento, le lancette vengono poste in una soluzione di cromogeno costituita da 3,4 mg di orto-fenildiamina disciolta in 10 mi di tampone formato da parti 40 uguali di acido citrico 0,1 M e Na2HP04 0,2 M a cui vengono aggiunti, appena prima dell'uso, 50 mei di una soluzione di H202 al 3%.
I risultati ottenuti hanno rilevato una buona specificità e sensibilità di questa tecnica: i campioni positivi rivelano, attra-45 verso il sistema cromogeno, un'intensa colorazione nettamente distinguibile da quelle, pressoché inesistenti, dei campioni negativi.
c) Procedura esplicativa di determinazione dì HSV con prelievo diretto
50 Le infezioni da herpes di tipo 1, di tipo 2 o 1 e 2 si manifestano usualmente con la formazione di pustole di differenti dimensioni a livello genitale e/o labiale, più rare sono le formazioni di pustole erpetiche a livello di altri organi del corpo.
Al fine di diagnosticare una reale infezione virale di origine 55 erpetica, il dispositivo preparato in accordo alla procedura di cui al punto a) viene messo a contatto con la pustola con la parte terminale la cui forma lanceolata ne permette la rottura. Conseguentemente, ruotando il dispositivo, il liquido contenuto nella pustola e fuoriuscito dopo la rottura della pustola stessa 60 andrà in contatto con gli anticorpi anti HSV precedentemente fissati sulla lancetta.
Eseguita l'operazione di prelievo il dispositivo viene intro
m ò&f
4
dotto in una fiala contenente 300 |xl di una soluzione di anti HSV coniugato con l'enzima perossidasi e diluito in tampone fosfato 30 mM allo 0,05% di Tween 20 e 1% di albumina serica bovina.
Dopo un'incubazione di 15 minuti il supporto viene lavato per circa 60' ' con acqua corrente e quindi trasferito in una fiala contenente 300 mei di una soluzione a pH 5 della seguente composizione % (p/v):
Tetrametilbenzidina 0,02
Acido citrico 2,10
Sodio perborato 0,07
Sodio fosfato bibasico 3,00
Dimetilsolfossido 20,00
Acqua distillata 75,00.
s Dopo un'incubazione di 15 minuti si osserva la soluzione contenuta nella fiala che potrà essere:
a) incolore in caso di risultato negativo (assenza di HSV nella pustoletta del paziente);
b) azzurra in caso di risultato positivo (presenza di HSV io nella pustoletta del paziente.
v
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