CH676506A5

CH676506A5 -

Info

Publication number: CH676506A5
Application number: CH35488A
Authority: CH
Inventors: Heinz Prof Dr Spitzbart; Jutta Naumann; Ulf Dr Thust; Reinhold Dr Bech; Horst Dr Koedderitzsch; Gisela Trutschel; Guenter Dr Schoeppe
Original assignee: Bitterfeld Chemie
Priority date: 1986-12-24
Filing date: 1988-02-02
Publication date: 1991-01-31
Also published as: DE3802780A1; GB2215043A; BE1001434A6; GB8802864D0; DD256760B5; GB2215043B; DD256760A1

Description

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CH 676 506 A5

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Es kann genutzt werden, um aus einer Vielzahl von Wirkstoffen, insbesondere für Produkte der agrochemischen Industrie, der Pharmazie, für Desinfektionsmittel, Farbstoffe, Gesundheitsplegemittel und Haushaltschemikalien schnell diejenigen auszuwählen, die hautverträglich sind.

Es ist bekannt, dass chemische Substanzen oder Substanzgemische, die mit der menschlichen Haut und den hautnahen Schleimhäuten in Kontakt kommen, Hauterkrankungen verursachen können. Häufig schädigen schwache lrritantien erst nach längerer Expositionszeit und bei wiederholter Einwirkung, wobei oft noch zusätzliche Faktoren hinzukommen. Dem in allen Industrieländern gewachsenen Umweltbe-wusstsein entspricht die Forderung nach einer dermato-toxikologischen Prüfung bei der Zulassung neuer Wirkstoffe in der agrochemischen Industrie, für Haushaltschemikalien, Farbstoffe, Kosmetika, Desinfektionsmittel sowie für alle chemisch-technischen Produkte, die mit menschlicher Haut in Berührung kommen können.

Die Forderung nach Aussagen über die Hautwirksamkeit gilt bekanntlich für Fertigpräparate ebenso wie für im technologischen Prozess auffallende Zwischenprodukte.

Es ist bekannt, dass es für die Prüfung der Haut- und Schleimhautverträglichkeit von Substanzen keine allgemeingültigen Prüfvorschriften gibt, die unter dem Aspekt des Exportes derartiger Produkte auch internationalen Ansprüchen gerecht werden. Die Prüfung der primären Reizwirkung von Substanzen auf die Haut ist bekanntlich sehr langwierig und aufwendig. Die toxikologischen Prüfungen erfolgen stufenweise an Versuchstieren niederer und höherer Gattungen, z.B. an Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen und nachfolgend am Menschen selbst. Dabei bemüht man sich, die tierexperimentellen Untersuchungen so auszubauen, dass nachfolgende Prüfungen am Menschen bei grösstmög-licher Sicherheit auf ein Mindestmass beschränkt werden können.

Trotz des hohen Prüfaufwandes können die Ergebnisse der Tierversuche niGht in jedem Falle befriedigen. Es kommt vor, dass sich dermatologische Bedenken erst nach einer längeren Anwendung von Substanzen am Menschen selbst herausstellen. Bei der Übertragung tierexperimenteller Ergebnisse auf den Menschen bleibt ein gewisses Risiko.

Zudem muss jeweils eine grössere Zahl von Tieren in entsprechende Versuche einbezogen werden, um den Unsicherheitsfaktor durch die Individualität der Versuchsobjekte auszuschliessen. Da die Tiere nach Abschluss der dermatologischen Prüfungen zum Zwecke einer eingehenden Untersuchung getötet werden müssen, stehen derartige Methoden auch zunehmend unter Kritik von Tierschutzvereinigungen.

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das ohne Tierversuche eine schnelle, sichere und reproduzierbare Aussage hinsichtlich der Hautverträglichkeit von Substanzen ermöglicht.

Es bestand somit die Aufgabe, ein Verfahren zur Prüfung der dermalen Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen und zur Selektion hautverträglicher Wirkstoffe zu entwickeln, das die moderne histologisch-morphologische Untersuchungstechnik nutzt.

Erfindungsgemäss wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass als Prüfkörper bei plastischen Operationen von gesunden Frauen im geschlechtsreifen Alter resezierte Scheidenhautabschnitte von mindestens zwei Patientinnen mit den jeweils zu prüfenden Substanzen in Kontakt gebracht und danach rasterelekfronenmikroskopisehe Abbildungen angefertigt werden.

Operationen, deren Ziel eine vordere oder hintere Scheidenplastik ist, werden bekanntlich schon seit vielen Jahrzehnten in gynäkologischen Kliniken durchgeführt. Die dabei vorzugsweise anfallenden gesunden Hautpartien werden verworfen. Es wurde gefunden, dass die bei den Operationen resezierte frische Scheidenhaut in besonderem Masse geeignet ist, um Aussagen über die Hautverträglichkeit von Substanzen zu gewinnen.

Unter Umgehung aufwendiger und langwieriger Tierversuche erlaubt es das erfindungsgemässe Verfahren, schnell und einfach derartige Aussagen zu gewinnen und gegebenenfalls Verträglichkeitsgren-zen für Substanzen festzulegen; hautverträgliche Substanzen können für bestimmte Anwendungsgebiete ausgewählt werden.

Ein mit dem erfindungsgemässen Verfahren zusätzlich verbundener Vorteil ist auch darin zu sehen, dass es die Möglichkeit eröffnet, die Wirksamkeit der untersuchten Substanzen gegen pathogene Erreger zu ermitteln.

Durch das Beispiel soll das erfindungsgemässe Verfahren näher erläutert und dessen Aussagefähigkeit veranschaulicht werden. Die bei plastischen Operationen resezierten Scheidenhautabschnitte werden jeweils in bis zu vier gleichgrosse Stücke geteilt.

Um die dermale Toxizität bestimmter Substanzen zu prüfen, lässt man diese in definierter Konzentration 24 Stunden auf mindestens zwei verschiedene Hautproben einwirken. Diese, mit der zu prüfenden Substanz behandelten Hautproben sowie jeweils zwei unbehandelte Kontrollen aus den gleichen Hautabschnitten werden dann elektronenmikroskopisch abgebildet, miteinander verglichen und der Grad der Hautschädigung bonitiert.

Die Präparation der Prüfmuster für die Rasterelektronenmikroskopie erfolgt in bekannterWeise:

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a) Präparation für die Rasterelektronenmikroskopie:

Die in Ethanol Regenden Hautabschnitte von ca. 8 mm2 Grösse werden 45 Minuten bei 20°C und einem Enddruck von ca. 5 Pa getrocknet. Danach werden sie mit Klebstoff auf dem Objekthalter des Rasterelektronenmikroskops befestigt und in einer Hochvakuum-Bedampfungsanlage mit Kohlenstoff und Gold als ableitende Schichten bedampft. Die Probenoberflächen werden im Rasterelektronenmikroskop 1000fach vergrössert abgebildet.

In besonderen Fällen kann man die Transmissionselektronenmikroskopie nutzen.

b) Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie:

Die Trocknung der für die Transmissionselektronenmikroskopie vorgesehenen Hautabschnitte von etwa 2x2 mm Grösse erfolgt in der gleichen Art und Weise wie für die Untersuchung im Rasterelektronenmikroskop. Nach der Trocknung werden die Gewebeproben in ein Einbettmittel eingebracht, das innerhalb von 3 bis 4 Tagen bei 48°C polymerisiert.

Dabei erfolgt die Einbettung so, dass Schnitte parallel zur Oberfläche erfolgen können.

Die Ultradünnschnitte (Dicke 150-200 nm, Abschnittfläche etwa 0,2 x 0,4 mm) werden mit einem Ultramikrotom angefertigt.

Die auf Trägernetze übertragenen Schnitte werden 2 Stunden in gesättigter Uranylacetatlösung nachkontrastiert und in einem Transmissionselektronenmikroskop 22 OOOfach vergrössert abgebildet.

Eine Auswahl der in die Prüfung der dermalen Toxizität einbezogenen Wirkstoffe bzw. Wirkstoffzubereitungen gibt Tabelle I wieder.

Tabelle I:

Zusammenstellung der in die Prüfung der dermalen Toxizität einbezogenen Wirkstoffe Prüfmuster Wirkstoff

Nr.

1

2-Hydroxybutyraldehyd

2

1,1,1 -Trichlor-4-methyl-4-penten-2-ol

3

Trinatriumphosphonoformiat-hexahydrat

4

PoIy-(dimethyl-diallyIammonium)chIorid

5

Peressigsäure

6

Ujosan (Jod/Peressigsäure)

7

Camposan (2-Ch!orethylphosphortsäure 50%ig)

Die Bonitur der rasterelektronenmikroskopischen Abbildungen erfolgt nach folgendem Schlüssel:

Boniturnote Befund

Q

A

keine Schädigung der Zellen gegenüber unbehandelter Probe

1

A

Schädigung der Zellen gering

2

A

Schädigung der Zellen stark

3

A

Ablösung mehrerer Zellschichten

4

A

schwere Schädigung und Zerstörung des Gewebes

Die den Boniturnoten entsprechenden rasterelektronenmikroskopischen Abbildungen lassen erkennen:

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Bonitumote Befund

0 die Oberfläche wurde nicht verändert; die aufgelagerten Zeilen gehören zur physiologischen Zytolyse und sind auch am unbehandelten Präparat nachweisbar;

1 die oberflächlichen Zellen zeigen eine deutliche morphologische Veränderung, die auf die Einwirkung der Prüfsubstanz zurückzuführen ist. Die einzelnen Zellen zeigen zum Teil Schrumpfungen und auch eine gewisse Zytolyse;

2 die oberflächlichen Zellschichten fehlen oder sind noch als Trümmer vorhanden. Man erkennt deutlich Strukturen, die nicht mehr oberflächlichen Zellschicht gehören;

3 die oberen und mittleren Zellschichten fehlen zum Teil. Man findet reichlich Zelltrümmerung, obwohl noch Zellfragmente deutlich erkennbar sind;

4 die Zeliabschnitte sind bis auf Reste völlig abgebaut Man erkennt bereits das Gefässsystem und Bindegewebe. Die Zerstörung des vielschichtigen Gewebes ist fast vollständig gelungen.

Aus Tabelle II ist der Grad der Schädigung der Haut durch verschiedene Substanzen bzw. Stubstanz-gemische in Abhängigkeit von der Konzentration ersichtlich. Damit ermöglicht es das erfindungsgemässe Verfahren, hautverträgliche Substanzen auszuwählen bzw. maximale Anwendungskonzentrationen dieser Wirkstoffe festzulegen, wenn jegliche Hautschädigung ausgeschlossen werden soll.

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Tabelle»:

Prüfung der dermalen Toxizität verschiedener Substanzen bzw. Substanzgemische nach dem erfindungsgemässen Verfahren*)

Prüfmuster Konzentration Dem Grad der Schädigung Nr. entsprechende Boniturnote

1

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3

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50 100

2 (K)

3

2

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3 (K)

4 (Salbe)

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1

5

1

50

—

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0,5

1

5

2

100

3-4

*) Die Nummern der Prüfmuster entsprechen den Angaben in Tabelle 1; K bedeutet Kristallausscheidung.

In Tabelle III wird das erfindungsgemässe Verfahren dem bekannten Kaninchentest gegenübergestellt.

Die Untersuchung der primären Reizwirkung einer Substanz beinhaltet die Bestimmung des Reizungsgrades der unverletzten und der verletzten Haut mit Hilfe des Index der primären Hautreizung nach der Methode von Draize [Dermal toxicity, Pubi, in Appraisol of the safely of chemicals in foods, drugs and cosmetics, Wyd. Assoc. of Food and Drug Officiais of the United States, 1959] auf die Kaninchenhaut.

Pro Substanz und Konzentration wurden 6 Albinokaninchen eingesetzt. Nach 1, 3 und 7 Tagen wurden alle Veränderungen der Haut bonitiert (Erytheme, Schwellungen und Verkrustungen).

Dabei benutzte Draize folgende Klassifizierung:

0 = nicht hautreizend 0-2 = schwach hautreizend 2-5 = mässig hautreizend 5 = stark hautreizend

Diese Klassifizierungszahlen resultieren aus dem Mittelwert aller Punkte, die aus den Bonituren nach 1, 3 und 7 Tagen für die verletzte und unverletzte Haut ermittelt wurden. Die Methode gestattet es allerdings nicht, Präparate mit einer schwachen Reizung exakt zu klassifizieren.

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Tabelle III:

Bonitur der dermalen Toxizität verschiedener Substanzen.*)

a) nach dem erfindungsgemässen Verfahren und b) nach dem Kaninchenteste nach Draize Prüfmuster Konzentration Boniturnoten

[Ma %] erfindungsgemäss nach Draize

1

—

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3

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4

3

2

50

2

3

100

3

2

0

4

3

0

4 (Salbe)

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1-2

4

1

0

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0

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1-2

6

1

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5

1

0

50

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0

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0,5

2

0

5

2

100

3-4

*) Die Nummern der Prüfmuster entsprechen den Angaben in Tabelle l.

Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Prüfung der dermalen Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen und zur Selektion hautverträglicher Wirkstoffe, insbesondere für Produkte der agrochemischen Industrie, der Pharmazie, für Farbstoffe, Desinfektionsmittel, Gesundheitspflegemittel und Haushaltchemikalien, gekennzeichnet dadurch, dass als Prüfkörper bei plastischen Operationen von gesunden Frauen im geschlechtsreifen Alter resezierte Scheidenhautabschnitte von mindestens zwei Patientinnen mit den jeweils zu prüfenden Substanzen in Kontakt gebracht und danach rasterelektronenmikroskopische Abbildungen angefertigt werden.

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