CH678328A5 - - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 328 A5

Descrizione

La presente invenzione ha per oggetto il tripeptide di formula I Arg-Lys-Glu(l)

dove Arg, Lys e Giù rappresentano rispettivamente gli amminoacidi L-arginina, L-lisina e acido L-glutam-mico.

L'invenzione ha inoltre per oggetto composizioni farmaceutiche ad attività immunostimolante contenenti come principio attivo il tripeptide di formula (I).

La ricerca di farmaci capaci di interagire con il sistema immunitario suscita da tempo notevole interesse per le ampie possibilità di intervento terapeutico che comprendono ad esempio il trattamento di tumori, metastasi, di infezioni batteriche e virali, di malattie autoimmune, il controllo delle reazioni dì rigetto dopo trapianti e simili.

Si è ora trovato che il tripeptide (I) è dotato di un'attività immunostimolante particolarmente elevata.

CARATTERISTICHE CHIMICHE

PESO MOLECOLARE: 431.52

ROTAZIONE OTTICA: [a]20 = 5.13 (c = 1, acido acetico)

ANALISI HPLC

li tripeptide è stato analizzato mediante HPLC a coppia ionica, secondo le condizioni di separazione qui descritte.

Eluente: NaH2P04 0.05M pH 4.3 + SDS 5x10*4 m, MeOH 50:50

Flusso: 1 mi/min

Lunghezza d'onda: 225 nm

Volume iniettato: 20 mei

Campione: 20 meg

Colonna: u Bondapack C18 (WATERS), 300 x 3.9 mm

La strumentazione usata è stata la seguente:

Cromatografo liquido: SERIES 4 (PERKIN ELMER)

Valvola di iniezione: Reodyne mod. 7125-075 con loop da 20 ul.

Rivelatore: Spettrofotometro LC 95 (PERKIN ELMER).

Integratorecomputerizzato: Data Station 3600 (PERKIN ELMER).

If profilo del tripeptide in HPLC è riportato nella figura.

RESISTENZA ALL'AMBIENTE GASTRICO SIMULATO IN VITRO

Il tripeptide è risultato resistente all'ambiente gastrico simulato in vitro, in cui si è utilizzata la soluzione di fluido gastrico simulato USP XXI (HCI+ pepsina) a T 37°C per 5 ore.

METODO DI SINTESI

£Z(C1) £C3e Eoc-ì^ys-Glu-OBe (1)

P Z(CI )

\ (0.1 mole) disciolto in cloruro di metilene e raffredato a 0°C è stato aggiunto a N-Metil-Soc-Lys morfolina (NMM) (0.1 mole). La soluzione è stata raffredata a -15°C +/-1 e a questa temperatura trattata con isobutilcloroformiato (0.1 mole) sotto agitazione. Dopo aver mantenuto la miscela di reazione in agitazione a-15°C per 15 minuti, è stata aggiunta lentamente una soluzione preraffreddata del dibenzilestere dell'acido glutammico p-tosilato (0.1 mole) e NMM (0.1 mole) in dimetilformamide. La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione per una notte.

I solventi sono stati rimossi per evaporazione a pressione ridotta ed il residuo ottenuto ripreso in acetato di etile.

L'acetato di etile è stato lavato, in fasi successive, con acqua, con aciào cloridrico 1N, con una soluzione acquosa di sodio bicarbonato al 5%, e ancora con acqua, quindi anidrificato su sodio solfato. Il solvente è stato rimosso per evaporazione a pressione ridotta ed il prodotto ottenuto, un liquido molto den2

CH 678 328 AS

so, è stato cromatografato mediante TLC con il sistema CHCl3:MeOh:AcOH (90:8:2). La purezza era dei 95% e le rese dell 80%.

(1) Il gruppo Boc è stato rimosso mediante trattamento con la miscela acido trifluoroacetico 50% - cloruro di metilene 1:1,10 mi per g, per 30 min. La miscela di reazione è stata evaporata a pressione ridotta, il 5 procotto ottenuto triturato con etere etilico, filtrato, lavato con etere ed essicato sotto vuoto. Le rese sono state del 98%.

£Z(Cl)£OBe

II prodotto ottenuto TFA-Lys-Glu-OBe è stato neutralizzato con NMM e fatto reagire con 10 Z3-Arg disciolta in dimetilformamide-tetraidrofurano, usando NMM e isobutilcloroformiato e operando nelle stesse condizioni descritte per (1). Resa 60%.

Da un controllo fatto con cromatografia su strato sottile con il sistema cloroformio: metanolo (92:8) è risultata una sola macchia principale.

Il tripeptide è stato idrogenato con Pd/C in acido acetico-metanolo-acqua. A fine reazione, la sospen-15 sione è stata filtrata per rimuovere il catalizzatore ed il filtrato è stato concentrato sotto vuoto.

Il prodotto ottenuto, il tripeptide, è stato purificato mediante distribuzione in contro corrente nel sistema n-butanolo: acido acetico: acqua (4:1:5) con rese del 50%.

Dalla cromatografia su strato sottile con sistema butanoIo:acido acetico:acqua:piridina (32:6:22:20) è risultata una macchia principale e dai controllo HPLC una purezza del 97%.

20

ATTIVITÀ' BIOLOGICHE

1 .A INDUZIONE IN VITRO DELL'ANTIGENE THY1.2

25 La capacità di Arg-Lys-Glu di indurre in vitro il differenziamento dei precursori delle cellule T del topo in linfociti esprimenti markers T cellulari è stata provata evidenziando l'induzione dell'antigene di membrana Thy 1.2.

30

MATERIALI E METODI

TOPI: topi nudi atimici (nu/nu) SPF dell'età di 8 settimane.

PREPARAZIONE DELLE CELLULE:

35 i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale e le milze sono state prelevate asetticamente.

Queste sono state sminuzzate con le pinze in una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) (Gibco Ltd., Paisley, Scozia).

Gli splenociti, lavati e risospesi in mezzo di coltura 199 (Gibco Ltd.) supplementato con P1% di BSA 40 (Boehringer Mannheim) e con 100 mcg/ml di gentamicina, sono stati incubati per 45 min. in colonne di lana di nylon equilibrate secondo il metodo di Julius et al. (Eur. J. immunol. 3,645,1973).

Sono state utilizzate le popolazioni cellulari effluenti arricchite in precursori delle cellule T.

45

INDUZIONE:

0,5 x 106 cellule effluenti in 0,1 mi di mezzo di coltura, sono state incubate a 379C per 18 ore, con o senza tripeptide. Le colture sono state eseguite in duplicato.

Al termine dell'incubazione le cellule sono state lavate con lo 0,87% di ammonio cloruro per lisare gii eritrociti, poi con HBSS.

50 L'induzione dell'antigene di membrana Thy 1.2 è stata determinata mediante immunofluorescenza diretta.

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA:

55 |e cellule sono state incubate a 4°C per 20 min. con anticorpo monoclonale anti Thy 1.2 coniugato con la fluoresceina (Bio-Yeda) alla diluizione di 1:200. La miscela è stata centrifugata a 300 g per 5 min., lavata 2 volte in HBSS e poi sospesa per il conteggio al microscopio a fluorescenza (Leitz Orthoplan).

La differenza in percentuale di cellule fluorescenti tra colture con e senza tripeptide, ha dato l'attività inducente del prodotto.

60 RISULTATI: come mostrato nella tabella, il tripeptide induce la comparsa del marker Thy 1.2 in cellule T immature con una risposta ottimale a 1 mcg/ml. La curva dose-risposta è a forma di campana, poiché concentrazioni maggiori e minori dì 1 mcg/ml provocano una induzione inferiore.

65

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 328 A5

Concentrazione % cellule THY 1.2+

del peptìde Media +/- E.S. Variazione

(mcg/ml)

0

11 +/-1.6

-

0.0001

19+/-1,2

+ 8

0.001

34+/-3.3

+ 23

0.01

44+/- 3.1

+ 33

0.1

50+/-1.2

+ 39

1

54+/-5.0

+ 43

10

45+/-4.9

+ 34

20

40+/-1.2

+ 29

50

2&+/—4.5

+ 17

100

21 +/-1.7

+ 10

200

16+/-2.4

+ 5

1-B INDUZIONE DELL'ANTIGENE THY 1.2 IN VIVO

Il tripeptide è stato somministrato per 4 giorni consecutivi e i topi sono poi stati sacrificati 24 ore dopo l'ultima somministrazione. Le milze sono state rimosse e le cellule esaminate per l'espressione dell'antigene Thy 1,2 mediante fluorescenza. I topi di controllo hanno ricevuto il Medium 199 (M 199), il mezzo in cui il farmaco è stato dissolto.

I topi avevano un peso medio di circa 24 g.

Risultati

% cellule THY 1.2+ orale i.p.

Controllo

3%

5%

ELS142 ug/kg

3%

6%

ELS1 420 ug/kg

5%

8%

ELS1 1055 ug/kg

7%

12%

ELS1 2110 ug/kg

15%

18%

ELS1 4220 ug/kg

14%

17%

ELS1 8440 ug/kg

15%

16%

(ELS1 = Tripeptide Arg-Lys-Glu)

I dati mostrano che il tripeptide ELS1 è in grado di indurre la maturazione degli splenociti sìa dopo somministrazione orale che intraperitoneale.

II dosaggio ottimale è di 2110 ug/kg mentre con dosaggi più alti si osserva un andamento a plateau della curva dose-risposta,

2. STIMOLAZIONE IN VITRO DELLA PRODUZIONE DI LINFQCHINE MATERIALI E METODI

PREPARAZIONE DELLE CELLULE MONONUCLEATE DI SANGUE UMANO PERIFERICO (PBMC). Il sangue venoso periferico viene ottenuto da volontari sani.

Gli eritrociti sono separati dalle cellule bianche mediante gradienti Ficoll-Hipaque. Il «buffy coat» (PBMC) viene rimosso e lavato, e le cellule sono risospese ad una concentrazione di 1 x IO6 cellule/ml in RPMI, addizionato con l'1% di penicillina/streptomicina, l'1%di glutamina e 1*1% di siero di feto di vitello inattivato riscaldato (FCS, 56 C, 30 min.).

4

CH 678 328 A5

PREPARAZIONE DEL FATTORE DI CRESCITA

Le PBMC, alla concentrazione di 1 x 106 cellule/ml in FCS 1% inattivato riscaldato, vengono incubate con o senza fitoemoagglutinina (PHA) alla concentrazione di 0.75% (v/v).

5 II tripeptide viene aggiunto alla concentrazione di 1 ug/ml alle culture. Il periodo di incubazione è di 1S— 24 ore a 37°C in atmosfera umidificata. Le culture vengono poi filtrate attraverso filtri con porosità 0.22 mM e i supernatanti vengono esaminati per la presenza dei fattori di crescita.

MISURAZIONE DEI FATTORI DI CRESCITA NEI SUPERNATANTI

10

A. Cellule usate nei test.

Le cellule B usate per esaminare la presenza del fattore di crescita delle cellule B (BCGF) appartengono a culture di linee cellularia lungo termine, mantenute con BCGF e sono EBV-negative. Queste cellule sono cresciute in mezzo prive di siero usando Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemicals), e non 15 rispondono alla lL-2.

Le cetluleT usate per esaminare la presenza di lL-2 sono isolate di fresco. Esse vengono inizialmente stimolate con PHA (0.75%) e vengono mantenute in cultura almeno per 10 giorni prima dell'uso (per ridurre il »background» e stabilire la loro dipendenza alla IL-2).

B. Preparazione delle cellule per l'utilizzazione nel saggio.

20 1. Le cellule B sono di solito utilizzate 4 giorni dopo l'ultimo trattamento con BCGF. Vengono lavate 4 volte con RPM11640 per rimuovere ogni traccia di BCGF e sospese alla concentrazione di 15 x 104 cel-lule/ml in RPM11640 e Nutridoma (alla concentrazione finale del l'I %).

2. Le cellule T vengono utilizzate 4 giorni dopo l'ultimo trattamento con IL-2. Vengono lavate 4 volte e sospese alla concentrazione di 50 x 104 cellule/ml in RPMI col 5% di FCS.

25 C. Procedura del saggio

1. Le cellule B coltivate a lungo termine vengono incubate con varie concentrazioni di supernatante proveniente dalle culture di PBMC in piastre a 96 pozzetti a fondo piatto.

Ciascun pozzetto ha un volume totale di 200 ul, costituito da 100 ul di cellule B (15x IO3 cellule) e 100 ul di supernatante. Si esamina l'efficacia delle cellule B incubandole con varie concentrazioni di BCGF puri-30 Acato (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.).

Le culture vengono incubate per 24 ore, dopo di che 1 uCì di [3H-Tdr] viene aggiunto e si incuba nuovamente per 12 ore.

Le culture sono poi raccolte e contate in uno scintillo-scopio.

2. Le cellule T vengono incubate in pozzettia fondo piatto. Il volume totale in ciascun pozzetto è di 35 200 ul contenente 50 x IO3 cellule. Il periodo di incubazione è di 72 ore, comprese 12 ore di marcatura con

[3H-Tdr].

RISULTATI

40 1) PRODUZIONE DEL FATTORE DI CRESCITA ESPERIMENTO 1

45

Attività del BCGF (Ç.P.M.) '

Provenienza supernat. %Sup.

3.05 6.25 12.5 25 50

50 PBL+PHA 424 1026 1674 3172 8392

PBL+PHA + ELS1 684 1658 2863 5600 7838

Attività del TCGF (C.P.M.)

Provenienza supernat. %Sup.

3.05 6.25 12.5 25 50

PBL+PHA 542 192 224 564 1144

PBL + PHA+ELS1 624 438 1062 1926 3296

65

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 678 328 A5

ESPERIMENTO 2

Attività del BCGF (C.P.M.)

Provenienza supernat. % Sup.

3..125 6.25 12.5 25 50

PBL+PHA 1369 2187 2894 4876 8104

PBL+PHA + ELS1 1586 2837 3994 7728 10886

Attività del TCGF (C.P.M.)

Provenienza supernat. % Sup.

3.125 6.25 12.5 25 50

PBL+PHA 1482 3146 4322 7184 9012

PBL+PHA+ELS1 1908 4424 6480 9329 11656

3. EFFETTO SULLA SINTESI Dl RNA

EFFETTO DI ELS1 SULLA SINTESI DI RNA IN CELLULE T UMANE, COME OSSERVATO DALLA INCORPORAZIONE DI 3H-URIDINA. NUMERO DI PARTICELLE EMESSE AL MINIMO (C.P.M.). RISULTATI OTTENUTI DOPO 24 ORE DI INCUBAZIONE.

T 3732

T+ PHA 20752

Concentrazione ELS1 ug/ml ai i io 20

T + ELS1 5336 4868 5104 5272

T+ELS1 + PHA 32729 34 966 34497 31764

4. EFFETTO SULLA SINTESI DI DNA

EFFETTO DI ELS1 SULLA SINTESI DI DNA IN CELLULE T UMANE, COME OSSERVATO DALLA INCORPORAZIONE DI 3H-TIMIDINA. NUMERO DI PARTICELLE EMESSE PER MINUTO (C.P.M.). RISULTATI OTTENUTI DOPO 3 GIORNI DI INCUBAZIONI.

T154

T+PHA 6076

T + ELS1 T+ELS1 + PHA

Concentrazione ELS1 ug/ml

0.01 0.1 1 10

262 242 196 240

5908 6810 7264 9560

5- AUMENTO IN VITRO DEL NUMERO DI CELLULE

Il tripeptide, aggiunto sia a culture di linfociti T che di miscele di linfociti B e T ogni quattro giorni alla concentrazione di 5 ug/ml per un periodo di 30 giorni, è in grado di aumentare il numero di cellule con un massimo di + 50% rispetto alle culture di controllo osservato tra il decimo e il quindicesimo giorno dell'esperimento.

6

CH 678 328 A5

TOSSICOLOGIA TOSSICITÀ' ACUTA

5 Gli studi di tossicità acuta condotti sul topo è sul ratto hanno mostrato che fino alla dose di 1000 mg/kg i.m. il tripeptide è totalmente privo di effetti collaterali.

TOLLERABILITA'

10 Studi su conigli e topi hanno mostrato che il prodotto, alia dose di 100 mg/kg rispettivamente i.v. e i.p., non provoca alcuna modificazione emodinamica nè effetti comportamentali.

In particolare, il tempo di sonno indotto da pentobarbitale mostra solo un lieve aumento.

ATTIVITÀ' ALLERGIZZANTE

15

Il prodotto, alla dose di 100 mg/kg i.m., non induce alcun fenomeno di sensibilizzazione nella cavia.

SALI DEL TRIPEPTIDE

20 Le ricerche sopra menzionate sono state condotte con l'acetato del tripeptide; comunque è ben noto alio stato dell'arte che risultati simili possono essere ottenuti usando altri sali, per esempio il trifiuoroace-tato, il cloridrato, il solfato.

Claims (4)

Rivendicazioni 25

1. Tripeptide costituito da L-Arg (arginina), L-Lys (lisina) e L-Giu (acido glutammico) e avente la seguente struttura:

Arg-Lys-Glu

30

2. Composizione farmaceutica ad attività immunostimolante, caratterizzate dai fatto che contenente come principio attivo il tripeptide secondo la rivendicazione 1.

3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, contenente il tripeptide sottoforma di un suo sale scelto fra i sali acetato, trifiuoroacetato, cloridrato e solfato.

35

4. Uso dei tripeptide secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di composti ad attività immunostimolante.

40

45

55

60

7