CH680668A5

CH680668A5 -

Info

Publication number: CH680668A5
Application number: CH847/90A
Authority: CH
Inventors: Volker Prof Dr Kasche; Fridolin Dr Loeffler; Dieter Dr Kraemer; Gerd Janowski
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1989-03-18
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1992-10-15
Also published as: GB2230010B; JPH02283280A; GB2230010A; FR2644474B1; DE3909018A1; FR2644474A1; GB9005900D0; US5326698A

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung bzw. zur Reinigung von Enzymen, welche auf aromatische Gruppen enthaltende Substrate gerichtet sind. Es erlaubt die Reinigung von Enzymen aus Biomasse, insbesondere des Enzyms Penicillinamidase.

Es ist bekannt, Proteine, insbesondere Enzyme über hydrophobe Chromatographie aufzureinigen. So kann man beispielsweise das Enzym Penicillinamidase (Penicillinacylase PcA) aus E.coli (E.C. 3.5.1.11), das zur technischen Umwandlung fermentativ hergestellter Penicilline in 6-Aminopenicillinsäure eingesetzt wird (vgl. H.J. Rehm & G. Reed in Biotechnology, vol. 7a, pg. 168, 169 VCH 1987) an Phenylglycin-sepharose mittels Affinitätschromatographie reinigen (Indisches Patent 155 051 A; Purification of Penicillin Acylase Enzyme; P.S. Borkar and P.B. Majahan).

Weiter wird Benzyl-EUPERGIT zur affinitätschromatographischen Reinigung von PCA eingesetzt. Affinitätschromatographie mit Affinitätsliganden bestehend aus Phenylessigsäure bzw. ihren Derivaten wird in Chem. Abstr. 97,35 363a beschrieben.

Andere Arbeiten benutzten Konjugate aus Agarose bzw. Sepharose mit Ampicillin oder Amoxicillin als Matrices für die Affinitätschromatographie (Ind. Patent 155 050; P. B. Mahajan et al. Hind. Antibiot, Bull. 24 (1-2) 38,1982, Chem. Abstr. 97, 87 551 e sowie Chem. Abstr. 95,110 740 K).

Die bisher vorgeschlagenen Verfahren sind ausnahmslos aufwendig, sowohl in bezug auf Anzahl der notwendigen Einzeloperationen als auch hinsichtlich des dort notwendigen apparativen Aufwandes. Der damit verbundene erhöhte Zeitaufwand ist für die Nativität des zu reinigenden Proteins nachteilig. Es besteht daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Proteinreinigung bzw. Isolierung zu entwickeln, welches eine möglichst rasche, verlustfreie und schonende Reinigung gestattet.

Es wurde nun gefunden, dass das erfindungsgemässe Verfahren diesen Forderungen der Technik weitgehend entspricht.

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen. Gegenstand der Erfindung ist auch das im Patentanspruch 8 definierte Verfahren zur Reinigung von Enzymen. Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung des Enzyms Penicillinamidase (PcA) (vgl. E.C.3.5.1.11), speziell das Enzym aus E.coli oder aus B. Megaterium. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird das zu immobilisierende Enzym (Protein) mittels hydrophober Adsorption an einen spezifischen Träger T, enthaltend Phenylbutylamin, fixiert (das durch Reaktion mit einer aktiven Gruppe AG des Trägermaterials kovalent an den Träger gebunden worden war).

Das Trägermaterial kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die aktiven Gruppen AG des Trägermaterials sollen mit Phenylbutylamin über einen elektroneutralen Bindungsmechanismus reagieren. Es soll also hierbei keine Veränderung des elektrochemischen Charakters des Liganden Phenylbutylamin erfolgen. Diese Forderung wird beispielsweise in besonders günstiger Weise erfüllt, durch ein Copolymerisat, welches aus der Matrixkomponente (Meth)acrylamid, einem Vernetzer z.B. N,N-Methy-len-bis-(meth)acrylamid und den bindungsaktiven Komponenten Glycidyl(meth)acrylat und/oder Allylgly-cidylether besteht. Entsprechende Produkte sind unter dem Warenzeichen ©EUPERGIT C im Handel (Fa. Röhm GmbH). Des weiteren eignen sich auch andere Trägermaterialien, z.B. quervernetzte Agarose, die mit Epoxidgruppen substituiert ist («epoxyactivated ©SEPHAROSE») sowie synthetische Polymerträger auf Basis vernetzten Polyvinylacetats, dessen Acetylgruppen hydrolytisch entfernt und mit Epoxygruppen substituiert worden sind. (VA-Epoxyträger der Fa. Riedel-De Haen). Geeignete Träger T-PbA werden auch erhalten, wenn man die oben genannten Trägermaterialien anstelle der Epoxygruppen mit Tresylgruppen (K. Nilsson und K. Mosbach, Biochem. Biophys. Res. Communications, Vol. 102, No. 1 pp. 449-457 (1981) als aktiven Gruppen AG substituiert (z.B. «tresyl activated ®Sepharose» oder tresylaktiviertes ®EUPERGIT-Diol).

Zur Herstellung des zur Proteinreinigung einsatzfähigen Trägermaterials T-PbA kann in an sich bekannter Weise vorgegangen werden: (Die Trägermaterial-Vorstufen seien im folgenden mit T-VS, ihre aktivierte Form mit T-VS-A bezeichnet). Die bindungsaktive Komponente AG kann entweder durch polymeranaloge Umsetzung (z.B. durch Addition von Epichlorhydrin an Hydroxylgruppen des Polymeren) oder durch direkte Copolymerisation von diese bindungsaktive Gruppen enthaltenden Monomeren eingeführt werden.

Als Matrixmonomere MM eignen sich am besten elektroneutrale, hydrophile Vinylverbindungen wie (Meth)acrylamid, wobei die Amidgruppe gegebenenfalls mit (hydroxylsubstituierten) Ci-C4-Alkylgrup-pen substituiert sein kann, ferner Hydroxyalkylester mit Ci-C6-Alkylgruppen im Esterrest der (Meth)acrylsäure, z.B. Ester von Polyolen, ferner Vinylalkohole, Allylalkohol, Vinylester wie Vinylace-tat, Vinylpropionat. Der Anteil der die bindungsaktive Komponente AG enthaltenden Monomeren am Trägermaterial beträgt in der Regel zwischen 4 bis 40 Gew.-%. Der Anteil an der vernetzenden Monomer-komponente liegt im allgemeinen zwischen 5-80 Gew.-%. Entsprechend ergänzt sich der Anteil des Ma-trixmonomeren zu 100 Gew.-%.

Als vernetzende Monomere eignen sich an sich bekannte Vernetzer, vorzugsweise elektroneutrale, hydrophil vernetzende Monomere wie N,N'-Methylen-bis(meth)acrylamid, mehrfach, aber mindestens zweifach mit (Meth)acrylsäure veresterte Polyole, insbesondere Pentaerythrit-(Meth)acrylsäureester dieses Typs.

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Die Ligandendichte beträgt zweckmässig 10-2000 uMoi PbA-Gruppen pro g Trägermaterial im Trockenzustand, vorzugsweise 50-500 |iMol.

Besonderes Interesse kommt im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung Trägermaterialien mit makroporöser Struktur und vorzugsweise sphärischer Gestalt zu, an die der Phenylbutylaminrest kova-lent gebunden wird (vgl. Jahrbuch der Biotechnologie, 1986-1987, S. 404, Carl-Hanser-Verlag). Derartige makroporöse Strukturen weisen z.B. die Handelsprodukte des ®EUPERGIT C-Typs, (EUPERGIT C, Eupergit C30N, EUPERGIT C250 L), ferner das ©FRACTOGEL bzw. ®TOIOPEARL sowie entsprechende makroporöse Ionenaustauscher (z.B. ©LEWATITE der Fa. Bayer AG., AMBERLITE der Fa. Röhm & Haas) auf nach entsprechender Umwandlung zu elektroneutralen Materialien.

Wie bereits ausgeführt, sind von besonderem Interesse die (aktivierten) Trägermaterial-Vorstufen T-VS-A vom Typ des ®EUPERGIT C. Bei diesem Material handelt es sich um ein vernetztes Copolymeri-sat aus Acrylamid bzw. Methacrylamid und Glycidylacrylat bzw. -methacrylat, das vorzugsweise aus periförmigen Partikeln besteht. Derartige Matrixpolymerisate werden in der DE-C 2 722 751 bzw. US-A 4 190 713 sowie der US-A 4 511 694 beschrieben. Die Perlen besitzen in der Regel einen Durchmesser von 5-1000 um, insbesondere 30-1000 jim. Als Anhalt für den Gehalt an Glycidylgruppen im Trägermaterial T-VS-A, die zur Reaktion gebracht werden können, sei ein Wert von 0,8-2,5 ixMol pro mg trockenes Trägermaterial genannt. Weitere Kenndaten lassen sich der folgenden Tabelle entnehmen.

Kenndaten Dimension

- Mittlere Korngrösse

140-180 Jim

- Porendurchmesser:

40 nm

- Ausschlussgrenze = Mum:

2.105 Daltons

- Bindungsaktive Oberfläche:

180 m2/g (trocken)

- Epoxidgehalt:

800-1000 mmoi/g (trocken)

- Wasseraufnahme:

2,3 ml/g (trocken)

- Dichte = cU20:

1,20

- Schüttdichte:

0,34 g/ml

- Bindungskapazität: (bei üblichen Bedingungen)

Humanalbumin:

48 mg/g (feucht)

Human IgG:

34 mg/g (feucht)

- Quellverhalten gegenüber Wasser:

1 ml (trocken) ergibt 1,4 ml (feucht)

- Löslichkeit: (in Wasser, Puffern und organ. Lösungsmitteln)

unlöslich

— Druckstabilität:

300 bar

Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man die makroporöse Struktur der Perlen mit Kanälen und Hohlräumen, die einen Durchmesser von 0,1-2,5 um (1000-25 000 A) besitzen, so dass Enzym- bzw. Substratmoieküle mit einer Grösse von 10-100 Â das gesamte Innere der makroporösen Matrix erreichen können.

Anbindung des Phenylbutylamins

Der für die Proteinreinigung verantwortliche Ligand wird in der Regel durch Umsetzung der Trägerma-terial-Vorstufe T-VS-A mit dem Amin Phenylbutylamin hergestellt. Allgemein kann die Reaktion durch direkte Umsetzung z.B. des epoxidgruppenhaltigen Trägermaterials mit Phenylbutylamin vorzugsweise in einem geeigneten flüssigen Medium z.B. Wasser oder einem Alkohol wie Ethanol durchgeführt werden. Zweckmässig wird das Amin in einem gewissen Überschuss, bezogen auf die funktionalen Gruppen des T-VS-A, angewendet. Die Umsetzung wird vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich 30 bis 100 Grad C durchgeführt. Nach der Reaktion wird das überschüssige Amin durch Säurebehandlung, beispielsweise mit verdünnter Schwefelsäure und Waschen mit Wasser entfernt. Im einzelnen kann die Bindung des Phenylbutylamins an die Trägermaterial-Vorstufe T-VS-A in folgender Weise vorgenommen werden. In einem geeigneten inerten flüssigen Medium, wie beispielsweise Ethanol, oder einem Keton wie Aceton wird die Trägermaterial-Vorstufe T-VS-A mit vorzugsweise einem Überschuss (bezogen auf die Zahl der bindungsaktiven Gruppen AG des Vorstufenmaterials) an Phenylbutylamin z.B. einem bis zu fünffachen, vorzugsweise einem etwa doppelten Überschuss zweckmässig versetzt und über einen gewissen Zeitzraum, in Abhänigkeit von der gewählten Temperatur, die zwischen RT und ca. 100 Grad C liegen kann, beispielsweise bei der Siedetemperatur des Mediums, im allgemeinen zwischen 3 und 72 Stunden reagieren lassen. Anschliessend wird das Produkt zur Entfernung überschüssigen Amins mit dem Lösungsmittel und anschliessend mit Wasser gewaschen, wobei das organische Medium das 5-15fache und das Wasser das 10-30fache des Gewichts des trockenen Trägermaterials aus3

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macht. Anschliessend wird noch mit einer verdünnten Mineralsäure, insbesondere mit 0,5 M Schwefelsäure (3-5-faches Gewicht des trockenen Trägermaterials) gewaschen und gegebenenfalls noch 10-30 Minuten in 0,5 M Schwefelsäure (3fache Gewichtsmenge) refluxiert, sodann bis zur neutralen Reaktion mit Wasser gewaschen.

Durchführung des Verfahrens

Die Reaktion des einsatzfähigen Trägermaterials T-PbA mit dem Protein, speziell dem Enzym, insbesondere dem Enzym vom Typ Penicillinamidase kann allgemein wie folgt durchgeführt werden. Das Homo-genat aus der Enzymproduktion wird vorzugsweise in einer Kühlzentrifuge sedimentiert, beispielsweise bei 5000 bis 10 000 g, dann wird der (klare) Überstand, der in der Regel 15-20 Units Penicillin-Amidase pro ml enthält, auf eine mit dem Trägermaterial T-BbA beschickte Chromatographiesäule gegeben, die mit einer Pufferlösung Puffer A (beispielsweise 0,05 molarer Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 plus 1 Mol NaCl) gefüllt war. Eine derartig beschickte Säule kann mit 30-100 Units Penicillinamidase pro ml Feuchtträger beschickt werden, so dass 10 bis 80 mg Protein pro ml Träger kommt. Die Säulen haben einen Durchmesser im Bereich von 1 mm bis 30 cm und eine Höhe von ca. 10 cm bis 1 m und darüber. Es empfiehlt sich die Einhaltung einer Fliessrate (linearer Fluss) von 60-100 cm/Stunde. Die Säule wird mit Puffer A gespült, und das Enzym wird dann mit einem Elutionspuffer, im Falle der Penicillinamidase 0,1 Mol Natriumformiatpuffer mit pH 3,8 eluiert und dann in 0,1 Volumen eines 1 Molaren Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 aufgefangen. Im allgemeinen ist der Elutionsvorgang in Abhängigkeit von der Säule in 5 min bis 60 min, vorzugsweise ca. 20 ± 10 min abgeschlossen. Das Eluat eignet sich z.B. unmittelbar zur Immobilisierung inbesondere kovalenten Immobilisierung an einem festen Träger, z.B. an EUPERGIT C. Immobilisierungsausbeute liegt bei ca. 80%, Produktaktivität 100 Units/g Feuchtgewicht.

Die gleiche Säule kann mindestens 50mal hintereinander zur Enzymaufreinigung verwendet werden, sofern die Säule nach jedem Lauf mit 2-5 Säulenvolumina einer Proteaselösung vorzugsweise mit 0,006 Anson-Einheiten bei pH 10 behandelt wurde. Als Protease eignen sich vorzugsweise alkalische Proteasen, insbesondere solche bakteriellen Ursprungs. (Vgl. Keay, Process Biochemistry, 17-21, 1971; H.J. Rehm, G. Reed Biotechnology Vol. 7a, loc. cit pg. 156-168; Ullmann's Encyclopédie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 10, 517-522, Verlag Chemie 1975).

Genannt seien beispielsweise alkalische Proteasen aus Bacillus subtilis ferner aus Aspergillus sp. insbesondere A. oryzae. Die proteolytische Wirksamkeit der Enzyme wird zweckmässig nach der sogenannten Löhlein-Volhard-Methode («die Löhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität», Gerbereitechnisches Taschenbuch, Dresden-Leipzig 1955) bestimmt und in «LVE» (Löhlein-Volhard-Einheiten) angegeben bzw. bestimmt. Unter einer LVE-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Kasein verdaut. Für die Aktiviätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme, die aus der Anson-Methode (M. L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)) abgeleitet wird, gilt: Die Einheiten werden als «Proteinase-Units (Hämoglobin)» = Uhò bezeichnet. Eine Uhò entspricht derjenigen Enzymmenge, welche die Freisetzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Hämoglobin äquivalent 1 Mol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) kakalysiert. 1 mUHb = 10_3UHb-

Vorteilhafte Wirkungen

Die vorteilhaften Wirkungen verglichen mit dem Stand der Technik liegen u.a. in der ausserordentlich hohen Bindungskapazität des erfindungsgemässen Trägermaterials. Daraus resultiert auch die Möglichkeit, durch Quervernetzung das Protein direkt am Träger zu immobilisieren, wodurch man ein Produkt mit befriedigender Aktivität z.B. für den industriellen Bereich gewinnen kann.

Ein weiterer Vorteil besteht in der Möglichkeit der raschen Durchführung der Enzymreinigung. Die Zeitersparnis gegenüber den Verfahren des Standes der Technik kann mit dem Faktor 2 bis 5 angesetzt werden. Dazu tritt als Vorteil, dass zur Elution ein relativ kleines Volumen benötigt wird.

Alternativ zur Isolierung der Enzyme kann auch das am Trägermaterial adsorbierte Enzym nach entsprechender Quervernetzung unmittelbar als immobilisiertes Enzym eingesetzt werden. (Vgl. Ullmann's Encyclopédie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 10, S. 542, Verlag Chemie 1975).

Die in industriellem Massstab hergestellten Proteine, insbesondere die Enzyme, werden allgemein aus Biomasse gewonnen. Über die Produktion von Biomasse, aus weicher das Enzym Penicillinamidase (3.5.5.1.11) gewonnen werden kann, gibt die Literatur hinreichende Auskunft. (z.B. H.J. Rehm & G. Reed in Biotechnology Vol. 7a, VCH 1987; Ullmann's Encyclopädiea of Industriai Chemistry, 5th Ed. Vol. A9, pg. 371-382; VCH 1987). Zur Aufarbeitung muss eine Homogenisierung der Biomasse vorgenommen werden, beispielsweise nach dem French Press-Verfahren mit einer French Pressure Cell Press (SLM-Aminco) oder mit dem Hochdruck-Dispersionsgerät von Manton-Gaulin (vgl. Ullmann's Encyclopédie der Technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 10, loc.cit., S. 493-495). Anschliessend an die Homogenisierung erfolgt die Abtrennung der Enzymlösung mittels Zentrifugation oder Filtration wie bereits oben beschrieben.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

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BEISPIELE Beispiel 1

Herstellung von Phenybutylamin substituiertem ®EUPERGIT C (PbA-EUPERGIT)

In einem 4-l-Dreihalsrundkolben werden 50 ml Phenylbutylamin 98%ig in 1325 ml Ethanol absolut vorgelegt und unter Rühren (Säbelrührer) 250 g trockenes EUPERGIT C eingetragen. Diese Suspension wird unter leichtem Rühren 4 Stunden am Rückfluss gekocht. Anschliessend wird das etwas abgekühlte Material auf eine Fritte Gl überführt und mit ca. 3 I Ethanol, techn. und mit ca. 7 I Millipore-Wasser in kleineren Portionen (500 ml) gewaschen. Nach scharfem Absaugen wird das Material einmal mit 0,5 M Schwefelsäure aufgeschlemmt (einwirken lassen), wieder abgesaugt und mit 750 ml 0,5 M Schwefelsäure zurück in den Reaktionskolben überführt. Diese Suspension wird 30 min am Rückfluss gekocht. Anschliessend wird das Material auf der Fritte Gl mit Millipore-Wasser säurefrei gewaschen (ca. 10 I). Das Material wird in 30 min bei 121 Grad C hitzesterilisiert.

Beispiel 2

Affinitätschromatographische Reinigung der Penicillinamidase aus E.coli.

Säulenmaterial: Mit Phenylbutylamin substituiertes ®EUPERGIT C (PbA EUPERGIT C) gemäss Beispiel 3)

Auf eine Säule (Volumen: 8 ml; 1 cm 0) in Puffer A (0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 plus 1 MNacl), wurden mit 1 ml/min (= 76,4 cm/Stunde linearer Fluss) 15 ml Überstand des E.coli-Homogenats aufgetragen (10,7 mg/ml Protein, 39 U/ml Feuchtträger-Aktivität), mit 30 ml Puffer A gewaschen und mit Puffer B (0,1 M Natriumformiatpuffer pH 3,8) das Enzym in 35 ml eluiert. Die Ausbeute an Enzymaktivität beträgt 89%, die spezifische Aktivität erhöht sich von 2,0 U/mg im Überstand des Homogenats auf 10,2 U/mg im Eluat. Um das Enzym nur kurz dem sauren Elutionspuffer auszusetzen, wird in die Vorlage der Fraktionen (je 5 ml) des Eluats 1 ml Kaliumphosphatpuffer (1 M, pH 7,5) gegeben. Anschliessend wird die Säule mit 40 ml einer Lösung von 0,006 Anson Units bakterieller alkalischer Protease in 0,02 M Gly-cin-NaOH-Puffer, pH 10 regeneriert und mit 60 ml Puffer A neutral gewaschen, bevor ein neuer Cyclus beginnt.

Beispiel 3

Immobilisierung von Penicillinamidase an EUPERGIT C

Die über eine PBA-Eupergit-Säule aufgereinigte Penicillinamidase (PcA) wurde gegen Wasser dialy-siert und über den Rotationsverdampfer eingeengt. Da die PcA stark trüb war, wurde sie bei 20 000 U 15 min bei 4 Grad C zentrifugiert. Der Überstand war anschliessend klar.

Aktivitätsmessung

Die PcA wird 1:10 mit 0,1 m Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) verdünnt (bei ca. 180 U/ml). Die enzymati-sche Aktivität wurde gegen Penicillin-G-Kaiium (crude) als Substrat durch alkalimetrische Titration bei pH 7,8 bestimmt. Dazu wurden jeweils 20 ml einer 2%igen Substratlösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpuf-fer (pH 7,8) eingesetzt und bei 37 Grad C mit 0,5 M NaOH titriert.

Immobilisierung

510 U PcA werden mit 1,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 auf 4 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und auf 1 g Eupergit C gegeben. Die Mischung bleibt 72 Stunden bei 23 Grad C stehen. Danach wird der Ansatz auf einer Fritte mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5 3mal gewaschen.

Feuchtausbeute: 3,49 g Aktivität: 91 U/G

Beispiel 4

Aktivitätsmessung von immobilisierter Penicillin-Amidase Prinzip

Die Methode basiert auf der Titration von freiwerdender Phenylessigsäure, die während der enzyma-tischen Hydrolyse von Penicillin-G-Kalium bei pH 7,8 und 37 Grad C entsteht.

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Apparatur

- Schreibendes pH-stat.-Autotitrations-System, von Radiometer-Copenhagen A/S oder Metrohm SA (Schweiz)

- Automatische Bürette

- pH-Meter

- Titrierstand

- Servograph

- Reaktionsgefäss (100 ml Volumen) mit temperiertem Aussenmantel und einer Rührvorrichtung (kein Ma-gnetrührer; zerstört die Perlen).

- Thermostat.

Verfahren

500 mg EUPERGIT-PcA werden nach mehrfachem Waschen mit deionisiertem Wasser in ein auf 37 Grad C temperiertes Reaktionsgefäss gegeben. 20 ml Substratlösung, auf 37 Grad C angewärmt, werden auf den Enzymträger gegeben (Substrat: 2% Penicillin-G-Kalium oder -Natrium (crude) werden in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, und der Lösung werden 0,05 Hydroxy-benzoesäure-ethyl-ester zugesetzt). Unter ständigem Rühren wird 0,5 M NaOH durch eine automatische Bürette zugegeben, gesteuert durch ein pH-Stat bei pH 7,8. Gleichzeitig wird der NaOH-Verbrauch gegen die Reaktionszeit (1. Bestimmung) aufgezeichnet. Die Inkubation wird nach 10 Minuten abgebrochen, der Enzymträger wird in eine Glasfritte (P2 oder P3) gegeben und über Vakuum abgesaugt sowie 3mal mit 2 ml 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die gewaschenen Perlen werden wieder in das Reaktionsgefäss gegeben, und wie oben beschrieben wird die Aktivitätsbestimmung (2. Bestimmung) durchgeführt. Die Aktivitätsbestimmung wird mit der auf diese Weise erhaltenen Probe nochmals wiederholt (3. Bestimmung).

Berechnung der Aktivität des immobilisierten Katalysators

Die Aktivität des Enzymträgers wird in U/g Feuchtprodukt angegeben. Units ist definiert als uMol hy-drolysiertes Penicillin-G pro Minute (U = uMol/min). 1 ml 0,5 M NaOH entspricht 500 p.Mol hydrolysier-tem Penicillin-G. Für die Aktivitätsbestimmung wird der lineare Verlauf der Kurve benutzt (für gewöhnlich der Abschnitt zwischen der 1. und 5. Minute). Aktivität des immobilisierten Katalysators ergibt sich aus dem Mittelwert der Aktivität der 2. und 3. Inkubation.

Beispiel 5

Immobilisierung des Enzyms Penicillinamidase aus PBA-Eupergit durch Quervernetzung.

10 g PBA-Eupergit (Feuchtgewicht) wird dreimal in je 10 Volumina 1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und auf Glasfritte über Vakuum abgesaugt. Das entsprechende Feuchtmaterial wird in einem Becherglas mit 20 ml eines E.coli-Homogenates nach Beispiel 6 mit einer Penicillin-Amidase-Aktivität von 39 U/ml gegeben und 60 Minuten lang bei 21 Grad C geschüttelt. Das Produkt wird dann durch Filtration (Glasfritter/Vakuum) abgetrennt, zweimal mit 1,0 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen und anschliessend in 10 ml 1,0 M Kalium-Phosphatpuffer suspendiert. Dann werden 0,250 ml einer 25%igen wässrigen Glutardialdehydlösung zugegeben (die über lonenaustauscherharz ®Amberlite A 21 stabilisiert war). Die Suspension wird 2 Stunden lang geschüttelt, sodann dreimal mit 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Feuchtausbeute 9,8 g. Die Aktivitätsbestimmung ergab 62% Aktivitätsausbeute und ein Produkt von 49 U/g Feuchtgewicht.

Beispiel 6

Rohextrakt-Gewinnung aus Escherichia Coli-Zellen

20 l einer Fermenterkulturlösung wurde bei 4 Grad C für 20 Minuten zentrifugiert (10 000 g, Cryofu-ge, Heraeus). Nach Dekantieren des Überstandes wurde die feuchte Zellmasse in 900 ml 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 suspendiert und erneut zentrifugiert. Nach dem Waschvorgang wurde die feuchte Zellmasse (550 g) erneut in 1200 ml 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 suspendiert. Die Zellsuspension wurde vor dem Zellaufschluss bei -80 Grad C eingefroren. Die E.coli-Zellen haben gegenüber einer 2%igen Penicillin-G-Lösung (20 ml, 37 Grad C) eine Aktivität von 58 U/g Zellen.

Der Zellaufschluss erfolgte nach dem French-Press-Verfahren (1000 bar Druckunterschied, French Pressure Cell Press, SLM-Aminco). Um Aktivitätsverluste zu vermeiden, wurde die Suspension erst kurz vor dem Zellaufschluss in Eiswasser aufgetaut.

Aliquote von 40 ml Zellsuspension wurden jeweils viermal homogenisiert um maximale Aktivität des Ho-mogenats zu erhalten. Nach vier Anschlusszyklen konnte eine Aktivität des Homogenats gegenüber einer 2%igen Penicillin-G-Lösung (20 ml, 37 Grad C) von 23 U/ml erzielt werden. Das Homogenat wurde di6

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rekt nach dem Zellaufschluss bei -80 Grad C eingefroren. Zum Abtrennen der Zelltrümmer wurde das aufgetaute Homogenat bei 4 Grad C für 30 Minuten zentrifugiert (10 000 g, Cryofuge Heraeus). Der Überstand kann direkt für die nachfolgende chromatographische Isolierung der Penicillinamidase eingesetzt worden (Aktivität des Überstandes 18,75 U/ml).

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen, welche auf aromatische Gruppen enthaltende Substrate gerichtet sind und die sich in einem wässrigen Medium befinden mittels Adsorption, welches eine schonende Reinigung der Enzyme gestattet, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme durch hydrophobe Adsorption an ein spezifisches Trägermaterial T-PbA fixiert werden, welches Phenylbutylamingrup-pen besitzt, die kovalent an das Trägermaterial gebunden sind.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial mit den kovalent gebundenen Phenylbutylamingruppen Produkt der Umsetzung einer Glycidylgruppe als aktivierte Gruppe einer Trägervorstufe T-Vs-A ist.

3. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die aktivierte Trägervorstufe T-Vs-A ein vernetztes Copolymerisat, aufgebaut aus den Matrixmonomeren Acrylamid, Meth-acrylamid, den bindungsaktiven Monomeren Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, und den vernetzenden Monomeren N.N'Methylen-bis-acrylamid und N,N'-Methylen-bis-methacrylamid ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der bindungsaktiven Monomeren an der Trägervorstufe T-Vs-A 4 bis 40 Gew.-% beträgt.

5. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligandendichte des fixierten Phenylbutylamins 10 bis 2000 iiMol pro Gramm Trägermaterial beträgt.

6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Penicillinamidase immobilisiert wird.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1 zur permanenten Immobilisierung des Enzyms Penicillinamidase, dadurch gekennzeichnet, dass das gemäss Anspruch 2 an den Träger T-PbA durch hydrophobe Adsorption fixierte Enzym mittels chemischer Agentien vernetzt wird.

8. Verfahren zur Reinigung von Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man die nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 immobilisierten Enzyme mittels einer schwach sauren Pufferlösung eluiert und das Eluat wieder auf einen pH-Wert nahe dem Neutralpunkt einstellt.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial T-PbA nach der Elution der Enzyme mit einer Protease behandelt und anschliessend gewaschen wird.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Protease eine alkalische Protease in einem alkalischen Puffer verwendet wird und dass anschliessend das Trägermaterial T-PbA mit einem Puffer im Neutralbereich gewaschen wird.

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