CH689251A5

CH689251A5 - Produit destiné à la création de modifications souhaitables de la pharmacodynamique de substances pharmacologiques.

Info

Publication number: CH689251A5
Application number: CH03715/94A
Authority: CH
Inventors: Erich Hugo Cerny
Original assignee: Bio Dev Ltd
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 1999-01-15

Description

Le brevet décrit un produit et un procédé de fabrication pour une ou plusieurs combinaisons immuno-pharmacologiques selon les revendications 1 à 6.

Les substances ou préparations pharmacologiques ne possèdent pas toujours toutes les qualités que l'on pourrait souhaiter pour obtenir un effet donné. La présente invention décrit une méthode pour créer des anticorps, qui possèdent une affinité pour une substance ou une préparation pharmacologique donnée. L'administration de la substance ou préparation pharmacologique en présence de ces anticorps spécifiques permet d'en modifier les qualités dans le sens désiré.

La durée d'action d'une substance ou préparation pharmacologique peut être prolongée. Les combinaisons immuno-pharmacologique selon la description qui figure dans la revendication 1, circulent pendant des semaines dans l'organisme et la composante pharmacologique est lentement relâchée par les anticorps. La mise en Öuvre d'une prophylaxie antiparasitaire (par exemple, contre la malaria) en présence des anticorps spécifiques (anti-chloroquine ou nivaquine) est un exemple de cette application.

Un autre des buts de cette invention est la faculté de concentrer une substance ou préparation pharmacologique dans les zones de concentration des anticorps (le sang et les organes bien vascularisés). Le taux de la composante pharmacologique est alors élevé dans ces organes (il s'agit d'une sorte d'immuno-concentration).

Un autre des buts de cette invention est d'utiliser des substances ou préparations pharmacologiques d'une manière plus efficace et en quantités moindres ce qui diminue les effets secondaires et réduit les coûts. La substance ou composition pharmacologique, relâchée progressivement par l'anticorps qui l'aura préalablement séquestrée, peut exercer son action pharmacologique, puis être à nouveau liée par un anticorps spécifique pour être relâchée à nouveau ultérieurement. (Une espèce de recyclage chimique).

Un autre des buts de cette invention est d'utiliser la réaction croisée immunologique entre différentes compositions pharmacologiques afin d'obtenir une interaction séquentielle. L'opiacé héroïne et un de ses antagonistes auprès des récepteurs morphiniques, le naltrexone par exemple, montrent tous deux une réaction croisée immunologique avec des anticorps anti-héroïne. La prise d'un surdosage d'héroïne (première étape) en présence du complexe naltrexone-anticorps va donc protéger l'individu par le relâchement du naltrexone, remplacé dans l'anticorps spécifique par l'héroïne (deuxième étape), entraînant le bloquage des récepteurs morphiniques par l'antagoniste (troisième étape). Le mécanisme décrit prévient des suites de surdosage d'une drogue.

Un autre des buts de cette invention est de stabiliser les taux disponibles d'une substance ou préparation pharmacologique, et ce pendant une période prolongée ainsi que de réduire l'écart entre les concentrations maxima et minima dûs aux cycles alternés d'une prise fréquente et d'une élimination rapide de la substance ou préparation pharmacologique. Les combinaisons immuno-pharmacologiques circulent normalement pendant plusieurs semaines dans le corps et la variation des titres de la substance ou préparation pharmacologique libre et complexée dans le sang ne varie que relativement peu d'un jour à l'autre. Ainsi, la prise de la substance anti-rétrovirale AZT (3 min -Azido-3 min -deoxythymidine), de composés similaires et/ou d'un ou plusieurs inhibiteurs des protéases rétrovirales en présence des anticorps spécifiques peuvent bénéficier de ce mécanisme.

Il est possible d'induire la fabrication par un système immunologique d'anticorps contre des substances pharmacologiques de type endogène alors que cette dernière caractéristique empêche précisément l'organisme de le faire en situation normale. Ainsi, les interférons et les interleukines ou des hormones telle, par exemple que l'Östrogène ou l'hormone lutéotrope sont des exemples de substances pharmacologiques de type endogène. La théorie immunologique actuellement admise nous enseigne que ces substances endogènes induisent dans un très jeune organisme une tolérance par l'élimination de toutes les cellules (clones) immuno -compétantes produisant des anticorps contre des épitopes de ces substances pour éviter la production d'anticorps contre l'organisme lui-même.

Il est donc impossible ou très difficile d'induire chez un individu la production d'anticorps contre ce type de substances.

Le mécanisme suivant permet de surmonter ce problème: un marqueur, qui comprend un épitope non-endogène avec une forte capacité d'induction de grandes quantités d'anticorps est chimiquement lié (avec ou sans covalence) à cette substance pharmacologique. Après vaccination avec un composé comprenant le marqueur lié à une substance porteuse, des anticorps spécifiques dirigés contre ce marqueur sont fabriqués. Le produit immuno-pharmacologique est alors constitué de l'anticorps spécifique dirigé contre le marqueur et de la substance pharmacologique. Ainsi, par exemple, des hormones peuvent être liées à un marqueur pour créer une inhibition de l'ovulation pendant une période prolongée en présence d'anticorps spécifiques contre ce marqueur.

Dans cet exemple comme dans tous les autres exemples, les anticorps spécifïques peuvent être soit créés par immunisation active soit amenés par immunisation passive.

Le mécanisme suivant permet de créer des produits immuno-pharmacologiques avec des substances de type endogène, dans lesquels les anticorps spécifiques n'ont aucune action sur la substance endogène produite par l'organisme. L'exemple suivant illustre ce point. Un marqueur, un décapeptide, lié à une protéine porteuse, le KLH (keyhole limpet hémocyanin) sert de vaccin pour induire la fabrication d'anticorps spécifiques contre le décapeptide marqueur. Le décapeptide est lié chimiquement à une substance pharmacologique de type endogène, par exemple le gamma interféron, et le composé est injecté au patient. Les anticorps spécifiques dirigés contre le marqueur, créés par immunisation active ou amenés par immunisation passive déterminent la pharmaco-dynamique de ce composé.

Le mécanisme suivant permet de créer des anticorps, qui peuvent influencer la pharmaco-dynamique de plusieurs substances en même temps. Le même type de marqueur peut être lié à plusieurs substances pharmacologiques comme par exemple l'interféron alpha, béta et gamma. Un seul vaccin anti-marqueur peut donc être utilisé pour influencer la pharmaco-dynamique de plusieurs substances pharmacologiques (dans ce cas, les interférons alpha, béta et gamma, liés au marqueur).

Le mécanisme suivant permet de créer des substances pharmacologiques avec une pharmaco-dynamique modifiée par la présence d'anticorps préexistants. Le marqueur peut être choisi dans le groupe des épitopes contre lequel le système immunologique a déjà produit des anticorps, par exemple, chez l'homme, dans le cadre du vaccin anti-tétanique ou le vaccin antipoliomyélitique. Un épitope linéaire du tétanus toxoide, par exemple, peut être lié à l'interféron gamma (ou à un fragment ayant une activité pharmacologique) pour modifier la pharmaco-dynamique de cette substance et ce, sans vaccination préalable contre le marqueur. (Nous supposons naturellement, que l'individu a été vacciné contre le tétanus toxoid).

Définitions

Composé pharmacologique, substance pharmacologique, composante pharmacologique, préparation pharmacologique

Ces termes définissent dans le sens le plus large toute substance ou ensemble de substances qui exercent un effet pharmacologique. Par exemple, entrent dans cette définition des substances ou préparations anti-parasitaires comme la chloroquine, des anti-inflammatoires comme l'acide acétylsalicylique, des hormones, des drogues qui créent une dépendance comme l'héroïne ou leurs antagonistes comme le naltrexone.

Agoniste, Antagoniste

Un agoniste est une substance qui se lie de manière réversible ou irréversible à un ou plusieurs types de récepteurs correspondants et qui le stimule. Par exemple, la morphine ou l'héroïne sont des agonistes des récepteurs des opiacés.

Un antagoniste est une substance ou une préparation pharmacologique, qui bloque ou inverse l'effet pharmacologique d'une autre substance. Par exemple, le naltrexone (Merck Index, 10 th. édition, 6209), qui se lie aux récepteurs des opiacés sans induire l'effet pharmacologique des opiacés. L'interaction de l'antagoniste avec le récepteur peut être réversible (naltrexone) ou irréversible (clocinnamox).

Les agonistes et les antagonistes sont importants dans le cadre de cette invention du fait qu'il est possible de créer dans un organisme des anticorps qui montrent une réaction croisée entre ces deux groupes de substances, les deux substances ayant une structure stérique similaire. La prise de l'agoniste en présence des combinaisons anticorps-antagoniste peut déclencher la protection et la désensibilisation de l'individu. L'agoniste va se substituer à l'antagoniste dans la composition immuno-pharmacologique, l'antagoniste ainsi libéré va donc pouvoir se lier aux récepteurs spécifiques.

Anticorps, anticorps spécifiques, anticorps polyclonaux et monoclonaux, anticorps par génie génétique

Les anticorps sont un type de protéines plasmatiques produit par la branche des cellules B du système immunitaire après stimulation par un antigène. Les anticorps ayant une affinité pour une substance donnée sont aussi appelés des anticorps spécifiques. Les anticorps monoclonaux sont des anticorps identiques, qui dérivent du même clone de cellules B. La méthode classique pour produire des anticorps monoclonaux consiste en la transformation d'une cellule B de la rate en lignée cellulaire, mais des anticorps monoclonaux peuvent aussi être produits par le génie génétique.

Antigène, haptène, protéine porteuse

Un antigène est une substance qui est reconnue comme étant étrangère à l'organisme par son système immunitaire et qui induit la production d'anticorps spécifiques. Le poids moléculaire d'un antigène est en règle générale supérieur à 5000 daltons.

Un haptène est une substance avec un poids moléculaire plus bas, qui doit être liée à une protéine porteuse pour induire la production d'anticorps. La protéine porteuse peut contenir des lipides ou des sucres. Comme exemples de protéines porteuses, on peut citer le tetanus toxoïd, le cholera toxoïd ou l'albumine serique.

Il est possible, dans certaines circonstances, de lier un haptène à un autre haptène directement ou par l'intermédiaire d'une autre molécule (crosslinking). Cette procédure permet à un haptène de devenir antigénique sans avoir recours à une protéine porteuse selon la procédure classique. Une molécule comme l'acide aminé lysine (haptène) peut donc être liée par carbodiimide ou glutaraldéhyde pour produire un polymer de polylysine qui est antigénique.

Composition immuno-pharmacologique, combinaison immuno-pharmacologique, complexe immuno-pharmacologique

Cette composition a pour composantes une substance ou une préparation possédant une activité pharmacologique et son anticorps spécifique. L'anticorps spécifique peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal, induit par vaccination, par transformation des cellules B (anticorps monoclonaux classiques) ou produit par le génie génétique. La composition immuno-pharmacologique peut aussi contenir plusieurs paires de substances pharmacologiques avec leurs anticorps spécifiques.

Interaction entre un anticorps spécifique et un antigène ou un haptène

L'interaction d'un anticorps spécifique avec la surface de l'antigène correspondant (ou haptène) est réversible et la composition peut se dissocier en fonction de la force de liaison. La force de l'interaction est déterminée par le fait que les nuages des électrons sont complémentaires comme une clef avec sa serrure. Les bases de cette force sont l'interaction par les ponts des atomes d'hydrogène, les forces van der Waals, les forces électrostatiques et les interactions hydrophobiques.

Vaccination, vaccin, adjuvants, immunisation active et passive

La vaccination est une procédure destinée à induire des anticorps spécifiques chez un sujet (humain ou animal). Le vaccin contient un antigène ou un haptène lié à une protéine porteuse, ainsi qu'en règle générale, un adjuvant qui augmente la capacité du vaccin à induire la création d'anticorps. Par exemple, comme adjuvant, on utilise souvent l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium ou l'adjuvant de Freund. L'induction d'anticorps chez un sujet constitue une immunisation active. Introduire des anticorps produits in vitro ou chez un autre sujet constitue une immunisation passive. Les anticorps requis pour une composition immuno-pharmacologique sont normalement induits par immunisation active mais l'immunisation passive reste néanmoins possible.

L'administration de la composition immuno-pharmacologique se fait généralement par voie intramusculaire ou sous-cutanée, mais elle peut également être effectuée de n'importe quelle autre manière, telle que la voie orale (en capsules avec une couche protectrice), sur la peau comme composante d'une pommade, d'une crème ou d'un gel, sur la muqueuse etc...

Complexes immuns, complexes immuno-pharmacologiques, combinaison immuno-pharmacologique

Les anticorps spécifiques se lient à l'haptène ou à l'antigène d'une manière réversible. Le complexe s'appelle complexe immun ou, si l'haptène est une substance pharmacologique, nous l'appelons complexe immuno-pharmacologique ou combinaison immuno-pharmacologique. La durée de l'interaction est déterminée par l'affinité de l'anticorps pour son antigène. En présence de réactions croisées, l'haptène cherchera, compétitivement, à se lier à l'anticorps. Un haptène libre peut donc remplacer un haptène lié à un anticorps.

Les relations stoechiométriques entre haptène lié et haptène libre, d'une part, et entre les différents haptènes ayant une réaction croisée pour le même anticorps, d'autre part, sont principalement déterminées par l'affinité de l'anticorps pour l'haptène, les relations quantitatives entre les molécules et les zones de distribution des différents partenaires de la réaction.

Un haptène avec une haute affinité pour l'anticorps peut donc facilement remplacer un haptène doté d'une affinité plus faible. Prenons l'exemple d'un sujet immunisé contre les opiacés. Lorsqu'il prend un comprimé de naltrexone, cette substance va se lier à l'anticorps anti-opiacés ayant une réaction croisée avec le naltrexone. Une haute dose d'opiacé va donc facilement saturer les anticorps spécifiques et chasser le naltrexone, dont une partie va aller se lier, par voie de conséquence, aux récepteurs spécifiques.

Marqueur

Pour certaines substances pharmacologiques, il est préférable de fabriquer des anticorps non dirigés contre ladite substance pharmacologique mais contre un marqueur lié à la substance pharmacologique. Un marqueur est généralement un peptide de cinq à dix acides aminés, qui contient un épitope immunologique. En principe, toute substance antigénique avec un seul épitope peut être utilisée comme marqueur. Le marqueur peut être directement lié à la substance pharmacologique ou à l'aide d'un "spacer" (par exemple, une séquence additionnelle de trois à six acides aminés) qui sert comme pont entre le marqueur et la substance pharmacologique, ce qui a pour effet de rendre le marqueur, pour des raisons stériques, plus accessible à l'attachement de l'anticorps.

Un marqueur peut être une substance, contre laquelle l'organisme n'a pas encore produit d'anticorps ou au contraire, une substance contre laquelle des anticorps spécifiques sont déjà présents (par exemple fragment du tetanus toxoide chez un individu adulte dans le monde développé). Il est aussi possible d'utiliser le même marqueur pour plusieurs substances pharmacologiques. Les anticorps contre le marqueur peuvent être créés par immunisation active ou amenés, soit par immunisation passive, soit produits par des hybrides dits "monoclonaux" ou encore par le génie génétique.

Si on utilise un marqueur dans la combinaison immuno-pharmacologique, l'anticorps spécifique peut être remplacé par un autre ligand, qui a une haute affinité et spécificité pour le ligand et dont l'interaction est réversible, par exemple une lectine et son sucre (concrètement, l'avidine remplace l'anticorps et le biotine est utilisé comme marqueur attaché à la substance pharmacologique).

Le titre d'anticorps specifiques libres pour la substance ou la préparation pharmacologique

En présence d'un excédent d'anticorps spécifiques dans une solution (en général le sang), ces anticorps spécifiques peuvent encore lier une certaine quantité de la composition pharmacologique jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint.

Le taux total d'anticorps spécifiques pour la substance ou préparation pharmacologique

Après dissociation des complexes immuno-pharmacologiques, les anticorps sont purifiés et on mesure le taux des anticorps spécifiques susceptibles de lier la substance ou la préparation pharmacologique.

Le degré de substitution de la substance ou préparation pharmacologique par une autre substance ou préparation pharmacologique ayant une réaction croisée immunologique avec des anticorps spécifiques

Les anticorps peuvent souvent lier plusieurs substances ou préparations pharmacologiques avec une structure stérique similaire. Le degré de substitution est mesuré en ajoutant une quantité donnée d'une deuxième substance ou préparation pharmacologique et en dosant la quantité de la première substance ou préparation pharmacologique relâchée après un temps donné.

Nous proposons quelques exemples pour affiner la compréhension de l'invention. Ils sont donnés dans un but d'illustration pour quelques-unes des applications possibles. Ils ne sont ni exhaustifs ni limitatifs.

Exemple des liaisons chimiques de l'haptène avec la protéine porteuse

Une méthode basée sur le glutaraldéhyde (liant les groupes amino):

a) 10 mg de Tétanus Toxoide sont mis en suspension dans 2 ml de tampon de borate (pH 10, 0.1 M). On ajoute 10 micromol de l'haptène.

b) 1 ml de 0.3% de glutaraldéhyde est lentement ajouté en utilisant un agitateur pour la suspension (température ambiante, 30 minutes)

c) 0.25 ml de 1 M glycine sont ajoutés pour occuper les sites libres du glutaraldéhyde (30 minutes, température ambiante) et le conjugé est dialysé dans un tube de dialyse (limite d'exclusion 10 000 Daltons) contre 10 litres de tampon de borate, (pH 7.6, 0.1 M, 4 degrés Celsius, 8 heures, 3 changes de tampon).

Méthode pour préparer un vaccin anti-morphine

La méthode de Wainer et al. est utilisée pour synthétiser la morphine 6-hémisuccinate (Wainer B. B et al. 1972, Science 176, 1143-45, Wainer B. B et al., 1972, Science 178, 647-8) et pour la lier au tetanus toxoïde. Une autre préparation est fabriquée en transformant la morphine en 3-0-carboxy-méthylmorphine par réaction avec du sodium-beta-chloracétate dans l'alcool absolu. (8 mg de Carboxyméthyl-morphine sont dissous dans 2 ml d'eau distillée qui contiennent 10 mg de tetanus toxoïde et on ajoute 8 mg de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide après ajustement du pH à 6. Après incubation à la température ambiante, le mélange est généreusement dialysé contre un tampon de phosphate (Phosphate Buffered Saline = PBS, pH 7.6) et lyophylisé.

Vaccination:

Des souris (si non autrement précisé, il s'agit de souris Balb C, femelles, âgées de 6 mois) sont vaccinées par voie sous-cutanée 2 fois à 4 semaines d'intervalle avec 20 microgrammes de vaccin, par souris et par dose. Le conjugé pour la première injection a été adsorbé avec l'hydroxyde d'aluminium comme adjuvant (méthode classique selon instructions du producteur de l'adjuvant), la deuxième dose a été préparée sans recours à l'adjuvant. Le vaccin a été dilué dans 0.2 mililitre de PBS (phosphate buffered saline), pH 7.2 ou un autre tampon physiologique.

Les souris de contrôle sont vaccinées très précisément dans les mêmes conditions mais sans l'antigène ou l'haptène conjugé à la protéine porteuse.

Prise de sang:

Le sang est pris dans la veine (ou artère) de la queue. Pour tous les tests diagnostiques, le sérum est utilisé.

Test diagnostique:

a) Dosage du taux d'anticorps spécifiques libres à se lier à la substance pharmacologique:

Les plaques microtiter pour les test ELISA et le lecteur de plaques sont fournis par Dynatech AG, Suisse, tous les autres produits par Sigma Chemicals, Buchs, Suisse. La substance pharmacologique conjugée à une protéine porteuse (qui est différente de celle utilisée pour la fabrication du vaccin) est liée à un support en matière synthétique, par adsorption, pendant la nuit à la température de 4 degrés dans un tampon bicarbonate à pH 9.2. Le support (plaque microtiter) est lavé après cette opération ainsi qu'après toutes les opérations suivantes. Le lavage se fait par 4 cycles de rinçage avec PBS-Tween 20, 0.1%, contenant 1% de lait en poudre.

Les étapes suivantes sont: bloquage avec une solution contenant 1% de lait en poudre pendant 2 heures, incubation avec l'échantillon contenant les anticorps spécifiques, (le sérum est dilué à 1:100 avec PBS-Tween avec 2 heures d'incubation à la température ambiante), incubation avec les anti-anticorps IgG fragment Fe (par exemple lapin antihumain ou éventuellement un anticorps monoclonal) marqués par un enzyme (par exemple HRP = Horse Radish Peroxidase, la péroxidase de raifort, l'anti-anticorps est dilué avec PBS-Tween à une concentration optimale qui a été déterminée par une expérience préalable), l'addition et l'incubation avec le substrat spécifique pour l'enzyme marqueur (ABTS = 2,2 min -azino-bis-(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) dans un tampon contenant de sodium perborate, acide citrique et disodium hydrogène phosphate.

Après 30 minutes, le résultat est lu dans un lecteur ELISA (Dynatech) équipé d'un filtre de 405 nm.

b) Dosage du taux total d'anticorps spécifiques susceptible de lier la substance pharmacologique: la même procédure que celle décrite sous a) est utilisée, mais les éventuels composantes immunopharmacologiques de l'échantillon à tester sont préalablement dissociées et les anticorps sont purifiés en utilisant une méthode qui ne permet pas une réassociation des complexes immuns.

Dissociation du complexe immuno-pharmacologique

Il y a une dissociation spontanée de la combinaison immuno-pharmacologique, qui est déterminée par la constante de dissociation entre l'anticorps spécifique et la substance pharmacologique. Cette réaction est accélérée en y introduisant un ou plusieurs facteurs qui interfèrent avec la liaison réversible entre les deux composantes. Un pH bas ou élevé est une méthode, l'introduction des substances chaotropes en est une autre. Dans le cadre de cette invention, la méthode de prédilection pour dissocier les combinaisons immuno-pharmacologiques est l'utilisation des agents chaotropes comme par exemple 3 M sodium thiocyanate (NaSCN) ajusté à un pH de 8. Les anticorps doivent être purifiés après cette procédure, sans qu'il y ait une réassociation des complexes immuns (voir paragraphe suivant).

Purification des anticorps et du vaccin

Il est souvent nécessaire de purifier les anticorps ou le vaccin pour les débarrasser des produits toxiques ou des composantes qui interfèrent avec d'autres réactions chimiques. Il n'est pas possible, par exemple, de doser le taux total d'anticorps spécifiques en présence d'une concentration significative d'un agent chaotropique. Dans le cadre de cette invention, la méthode de purification préférée est la microdialyse par un filtre ou un tuyau de dialyse (Sigma Chemicals ou les systèmes et méthodes de microfiltrage et dialyse de type "spinfuge" vendus par Biorad SA Suisse et Pierce SA Suisse, qui combinent le principe de la filtration avec une accélération par la centrifugation) avec, normalement, une limite d'exclusion d'environ 10 000 Dalton.

c) Dosage du degré de substitution de la substance pharmacologique par une autre substance pharmacologique ayant une réaction croisée immunologique avec des anticorps spécifiques:

Une quantité précise de l'échantillon, par exemple 10 microlitres de sérum dilués 1:100 avec PBS sont incubés avec la substance pharmacologique ayant une réaction croisée avec les anticorps spécifiques de l'échantillon (par exemple 1 microgramme/ml de naltrexone marqué par l'isotope tritium ayant une réaction croisée avec des anticorps anti-morphines). Après un temps d'incubation rigoureusement respecté, le degré de substitution est déterminé par séparation du naltrexone lié aux anticorps spécifiques du naltrexone libre en utilisant des microfiltres de dialyse de type "spinfuge".

Les dosages décrits peuvent aussi être effectués par un biosensor comme par exemple le BIAcore de Pharmacia Biosensor AB, Suède, qui utilise le principe de SPR (Surface Plasmon Résonance) pour observer les interactions, directement et sans marquage. Dans ce cas, le support de la plaque microtiter est remplacé par le support du biosensor (Malmqvist M. - 1993 - "Surface Plasmon Résonance for détection and measurement of antibody-antigen-affinity and kineties". Current opinion in immunology, 5:282-286)

Exemple 1:

Cet exemple illustre l'application de cette invention dans le cas des drogues susceptibles de créer une dépendance et pour lesquelles un antagoniste est connu.

Dix souris sont vaccinées avec le vaccin anti-morphine et le même nombre avec le vaccin de contrôle. Dix semaines après la vaccination de rappel, la moitié les animaux de chaque groupe reçoit 5 mg de naltrexone par jour pendant 5 jours et l'autre moitié une substance placebo (sans effet pharmacologique). Après une semaine, on injecte à tous les animaux 10 mg de morphine par voie intrapéritonéale. Seuls les cinq animaux qui ont reçu le vaccin et le naltrexone s'avèrent protégés (ainsi que le détermine leur survie) contre la toxicité de la morphine.

Le test diagnostique décrit plus haut est utilisé pour l'examen des sérums des souris de cette expérience. Des prises de sérum datant du début de l'expérience (prebleed = pb), de 72 heures avant (sérum avm) et de 48 heures après la stimulation avec la morphine (sérum apm) sont dilués 1:100 avec PBS et examinés.

Le taux d'anticorps anti-morphine libres susceptibles de lier la morphine est indétectable pour les sérum pb et tous les sérum des animaux qui n'étaient pas vaccinés contre la morphine. Par contre, pour ce qui est des animaux vaccinés, des titres significatifs sont mesurés pour les sérums avm et des titres moins élevés pour les sérums apm.

Le taux d'anticorps anti-morphine susceptibles de lier la morphine est mesuré après dissociation des complexes et purification des anticorps. Les mêmes sérums qu'au préalable sont positifs avec des titrages plus importants. Le degré de substitution de la morphine et/ou de la naltrexone par le naloxone (antagoniste des opiacés, New England Nuclear, Delaware, USA, catalogue numéro NET 719) - marqué par le tritium - montre des valeurs détectables dans les sera avm et apm.

Exemple 2:

Ce deuxième exemple illustre l'application de cette invention en présence de substances ou préparations pharmacologiques pour lesquelles on recherche une diffusion contrôlée et prolongée ainsi qu'un taux sérique libre stable pendant une période prolongée, tout en administrant une quantité minimale de la substance ou préparation pharmacologique. Cette manière de procéder est souhaitable pour la prophylaxie de certaines maladies comme la malaria ou pour la prophylaxie ou le traitement de certaines maladies chroniques comme une infection chronique par des germes (par exemple, Trimethoprime Powder, pour des infections urogénitales par les Echerischia Coli).

Les substances pharmacologiques suivantes, qui contiennent toutes un groupe de type amino sont liées separement au toxoïd tétanique en utilisant le gutaraldéhyde comme agent de liaison: Trimethoprime, Primaquine, Chloroguanide, Pyrimethamine, Sulfadiazine, Dapsone (diaminodiphenylsulfone).

Cinq souris test et cinq souris de contrôle, pour chaque substance, sont vaccinées avec chacune des substances ou préparations pharmacologiques, préparées comme décrit plus haut. Après 12 semaines, un vingtième de la dose pour un adulte humain est donné par voie orale à chaque souris. Après une semaine, les animaux sont testés à une dose létale moyenne de 50% (LD 50) d'une souche de Plasmodium sensible à ces antibiotiques. La méthode et le protocole de R. Clemens sont utilisés pour cette expérience (R. Clemens et al.: Antithrombin III substitution affects survival rate in a murine malaria model. Parasitol-Res. 1989; 76 (1):36-8). Une comparaison du temps de survie, en utilisant le "log rank test" comme dans la publication de R. Clemens et al., démontre une prolongation de la survie moyenne significative du point de vue statistique.

Exemple 3:

Cet exemple illustre l'utilisation d'un marqueur attaché à l'aide d'un linker à la substance pharmacologique. Le linker est aussi appelé "spacer" du fait que ce pont entre la substance pharmacologique et le marqueur diminue l'entrave stérique à la liaison de la substance pharmacologique et des anticorps spécifiques sur le marqueur ou vice-versa. Le marqueur choisi dans cet exemple est un peptide qui représente un épitope du tétanus toxoide. La substance pharmacologique est le leu-enkephaline, un peptide du groupe des enképhalines. La composition de la combinaison immuno-pharmacologique est donc la suivante: anticorps-marqueur-spacer-leuenkephalin (leu-enkephalin est N-terminal dans cette séquence).

Tous les peptides sont synthétisés en utilisant la chimie FMOC sur support et les acides aminés protégés sont commandés chez Bachem AG, Switzerland. On utilise un synthétiseur semi-automatique de Bachem (SP 650) selon le protocole FMOC standard édicté pour cette machine. La séquence du spacer est G-bA-G-bA-G-bA-G-bA (g = glycine, bA = beta-alanine) et la séquence du tétanus toxoide comprend les 28 premiers acides aminés de la séquence publiée (Genbank, premier acide aminé = N-terminal).

Le vaccin anti-tétanique de Berna AG, Switzerland, est utilisé pour la vaccination de 6 souris (2 injections intramusculaires à 4 semaines d'intervalle, une dose humaine par souris). Les 6 souris de contrôle sont vaccinées avec la même quantité d'albumine du bÖuf adsorbé à l'hydroxyde d'aluminium.

Un système de test ELISA classique (sandwich assay) est utilisé pour mesurer le taux de la substance pharmacologique et du marqueur qui lui est lié. La fraction Ig G d'un sérum humain avec un haut titre contre le toxoid tétanique est utilisé pour capturer le marqueur (les anticorps sont adsorbés sur le support) et la substance pharmacologique est détectée par un anticorps anti-Leu-enkephalin humain, produit par un lapin (Cambridge Research Biochemicals, Northwhich, United Kingdom, catalogue numéro CA-08-235), qui est marqué par la peroxidase (HRP).

Trois souris vaccinées et trois souris du groupe de contrôle reçoivent chacune 1 mg de tétanus toxoide-leuenkephalin (= TTL) par injection dans la veine de la queue. Chez les souris vaccinées, des quantités de TTL supérieures à 10 nanogrammes peuvent encore être détectées dans le sérum par le test ELISA décrit plus haut, deux semaines après administration. Chez les souris de contrôle, une prise de sang effectuée quatre jours après administration ne montre plus de valeurs détectables du TTL.

L'expérience est répétée avec deux souris qui sont immunisées contre le tétanus toxoide par immunisation passive et un résultat similaire est obtenu (le TTL peut encore être mis en évidence deux semaines après injection).

Claims

1. Un produit destiné à la création de modifications de la pharmacodynamique de substances pharmacologiques, composé d'une part, d'un vaccin pour l'induction d'anticorps spécifiques au marqueur liés à la substance pharmacologique et d'autre part, de ladite substance liée au marqueur.

2. Un produit destiné à la création de modifications de la pharmacodynamique de substances pharmacologiques, composé d'une part du ligand spécifique au marqueur lié à la substance pharmacologique et d'autre part, de ladite substance liée au marqueur.

3. Un produit selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on choisit le ligand spécifique au marqueur de la substance pharmacologique parmi les groupes des anticorps, des peptides ou des lectines.

4.

Un procédé de fabrication pour un produit destiné à l'élaboration d'une combinaison immuno-pharmacologique, selon revendication 1 comprenant les étapes suivantes: Préparation d'un vaccin destiné à induire là production d'anticorps contre une substance donnée, selon les phases suivantes: le marqueur est lié à une molécule porteuse afin de réaliser un complexe haptène/molécule porteuse. Un adjuvant est ajouté, facultativement, à ce complexe haptène/molécule porteuse. Cet adjuvant et ce complexe haptène/molécule porteuse sont préparés sous une forme galénique appropriée qui permet son administration comme un vaccin. Préparation du conjugué marqueur/substance pharmacologique: le marqueur est lié chimiquement à la substance pharmacologique et mise sous une forme galénique appropriée pour permettre son administration comme un vaccin.

5.

Un procédé de fabrication pour un produit destiné à l'élaboration d'une combinaison immuno-pharmacologique, selon revendication 2 comprenant les étapes suivantes: Préparation d'un ligand spécifique pour un marqueur conjugué à une substance donnée: le ligand est préparé sous une forme galénique appropriée qui permet son administration. Préparation du conjugué marqueur/substance pharmacologique: le marqueur est lié chimiquement à la substance pharmacologique et mis sous une forme galénique appropriée pour permettre son administration comme un vaccin.

6. Un procédé de fabrication selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on choisit le ligand spécifique au marqueur de la substance pharmacologique dans le groupe des anticorps, des peptides ou des lectines.