CH693558A5

CH693558A5 - Pharmazeutische Zusammensetzung.

Info

Publication number: CH693558A5
Application number: CH01643/98A
Authority: CH
Inventors: Francesco Mehlem
Original assignee: Ptc Pharma Ag
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2003-10-15

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, in welcher pharmazeutisch aktive Peptide, die L-m-Sarcolysin als Aminosäurebaustein enthalten, formuliert sind. Die Wirkstoffe dienen insbesondere zur Chemotherapie gegen Krebsleiden und werden speziell gegen Melanome eingesetzt. Eine Trägersubstanz, ausgewählt aus einer Gruppe von Cyclodextrinderivaten, dient dem Transport der Wirkstoffe innerhalb der Körpers, ihrer verzögerten Freisetzung und ist für eine genügende Bioverfügbarkeit während einer ausreichend langen Zeitdauer verantwortlich.

Ein Komplex von sechs Peptiden, die m-L-Sarcolysin enthalten, ist unter dem Warennamen "Peptichemio" (Istituto Sieroterapico Milanese S. Belfanti, Milano, IT) für die Chemotherapie gegen Krebs bekannt geworden. Es wurde gefunden, dass die Aktivität der einzelnen Peptide verschieden ist und dass besonders ein Vertreter eine sehr hohe Toxizität für Melanomzellen aufweist. Die Peptide sind eine Entwicklung, welche mit dem Produkt "Melphalan", d.h. 4-[bis(2-Chlorethyl)]-amino-L-phenylalanin begonnen hat. Es wurde gefunden, dass dieses Produkt eine zytostatische Wirkung hat und sowohl für die Myelom- als auch für die Melanomtherapie eingesetzt werden kann. Zur Weiterentwicklung des Wirkstoffes wurden Derivate des Produktes hergestellt.

Daraus resultierte auch das L-m-Sarcolysin, das weiter deriviert wurde, indem Peptide hergestellt wurden, welche die modifizierte Aminosäure als Baustein enthielten. Eine Kombination von 6 derartigen Oligopeptiden bildete das aktive Prinzip der Antitumormittel "Peptichemio". Die 6 Peptide sind folgende:

- L-Seryl-L-p-fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysyl-ethylester

- L-Prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester

- L-m-Sarcolysyl-N-nitro-L-arginyl-L-norvalin-ethylester

- L-p-Fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysil-L-asparagin-ethylester

- L-p-Fluorphenylalanyl-glycyl-L-m-sarcolysyl-norvalin-ethylester

- L-m-Sarcolysyl-L-arginyl-L-lysyl-L-m-sarcolysyl-L-histidin-methylester

Es wurde gefunden, dass Peptichemio weniger toxisch gegen humane Lymphoplasten ist als m-L-Sarcolysin allein. Zusätzlich zur kleineren Toxizität von Peptichemio wurde eine verminderte Bildung von DNA-Vernetzungen festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde eine erhöhte Zytotoxizität von Peptichemio gegen humane Melanomzelllinien festgestellt, im Vergleich zum m-L-Sarcolysin. Hier war die höhere Zytotoxizität mit einer grösseren DNA-Vernetzung verbunden. Die Vergleichsanalyse der 6 Peptide zeigte Unterschiede in der Zytotoxizität gegen Melanomzellen. Eines der 6 Peptide zeigte eine beträchtlich höhere Zytotoxizität im Vergleich zum Peptichemio selbst (R. Levenson, et al. Radiumhemmet, Karolinska Hospital, Stockholm SE, Eur. J. Cancer Clin. Oncol.; 23: 6 783-788, 1987).

Gemäss diesen Studien wurde gefunden, dass das Peptid L-Propyl-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin (PSF) 35 x bzw. 28 x toxischer gegen RPMI 8322 Melanomzellen war als Melphalan bzw. m-Sarcolysin. Ähnliche Unterschiede zwischen den Wirkstoffen wurden auch für andere Melanomzelllinien gefunden.

Damit die in vitro gefundene Aktivität ebenfalls in vivo entfaltet werden kann, muss die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes im Körper ausreichend sein. Es muss eine genügend hohe Konzentration während einer genügenden Zeitdauer an der richtigen Stelle vorhanden sein bzw. die Halbwertszeit des aktiven Prinzipes muss genügend sein.

Es ist demzufolge Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu Stellen, durch welche eines oder mehrere der 6 Peptide in solcher Weise verabreicht werden können, damit die Bioverfügbarkeit den gestellten Anforderungen genügt.

Es wurde gefunden, dass eine Kombination eines oder mehrerer der 6 Peptide mit einer substitutierten Cyclodextrin-Verbindung als Träger diese Anforderungen erfüllt, wobei bestimmte Vertreter dieser Verbindungen besonders geeignet sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge die im Patentanspruch 1 definierte pharmazeutische Zusammensetzung. Als Wirkstoff enthält die Zusammensetzung mindestens eines der Peptide, ausgewählt aus der Gruppe:

- L-Seryl-L-p-fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysin

- L-Prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin

- L-m-Sarcolysyl-N-nitro-L-arginyl-L-norvalin

- L-p-Fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysil-L-asparagin

- L-p-Fluorphenylalanyl-glycyl-L-m-sarcolysyl-norvalin

- L-m-Sarcolysyl-L-arginyl-L-lysyl-L-m-sarcolysyl-L-histidin

und ihre Niederalkylester, insbesondere ihre Ethyl- und Methylester und/oder Säureadditionssalze davon.

Die Peptide liegen vorzugsweise in Form von Hydrochloriden oder Hydrobromiden vor. Vorzugsweise wird L-Prolyl-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin (PSF) verwendet. Der Cyclodextrinträgerstoff, welcher der Regulierung der Bioverfügbarkeit dient, ist vorzugsweise eine anionische beta -Cyclodextrinverbindung mit Sulfonatgruppen, die über eine C2- bis C6-Alkylengruppe mit einem Glucopyranose-Ring des Cyclodextrins verbunden sind. Derartige Verbindungen sind bekannt und einige sind bei den Gesundheitsbehörden registriert.

alpha -Cyclodextrin mit 6 Glucopyranose-Einheiten hat folgende Formel:
EMI4.1

beta - und gamma -Cyclodextrin haben entsprechende Formeln, jedoch mit 7 bzw. 8 Glucopyranose-Einheiten. In den bevorzugten Cyclodextrinen, die gemäss der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangen, ist eine oder mehrere der Hydroxy-Gruppen durch einen Rest der Formel -O-(C2-C6)-Alkylen-SO3<->M<+>substituiert (M<+> = physiologisch verträgliches Gegenion). Bei Captisol TM sind es 3 OH-Gruppen der 21 möglichen Gruppen pro beta -Cyclodextrin-Molekül, die mit einer Sulfobutoxy-Gruppe substituiert sein können. Dabei liegt als physiologisch verträgliches Gegenkation Na<+> vor. Gemäss der vorliegenden Erfindung kommen neben den oben genannten auch andere Substituenten infrage, sofern das substituierte Cyclodextrin den Anforderungen genügt, physiologisch unbedenklich und nicht toxisch ist.

Eine Anzahl derartiger Verbindungen ist beschrieben in der US-A- 5 134 127 und in den PCT-Anmeldungen WO 91/11 172 und WO 94/02 518. Auf diese Dokumente wird für die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Cyclodextrin-Verbindungen ausdrücklich Bezug genommen, sofern sie unter die in den Ansprüchen angegebene Definition fallen. Ein typischer Vertreter für die parenterale Verabreichung ist der Sulfobutylether von beta -Cyclodextrin mit dem Warennamen CAPTISOL TM der Firma CyDex 8675 W 96th St. Shawnee Mission, KS U.S.A.

Dieses Produkt, das im Handel erhältlich ist, ist dem ebenfalls ausgezeichneten Hydroxypropyl- beta -cyclodextrin (Pitha et al. in "Hydroxypropyl- beta -cyclodextrin preparation and characterization", International Journal of Pharmaceutics, 29: 73 bis 83 (1986)) für die Zwecke der vorliegenden Erfindung noch überlegen. beta -Cyclodextrine werden nur für den oralen und topischen Bereich verwendet. Zur parenteralen Verabreichung wird ein substituiertes beta -Cyclodextrin, vorzugsweise Captisol <TM>, verwendet. Die Cyclodextrinverbindung bildet mit den Peptiden einen Komplex und bewirkt bei parenteraler Applikation, dass der Wirkstoff im Organismus in genügender Konzentration in wasserlöslicher Form zur Verfügung gestellt wird.

Vorzugsweise wird als Wirkstoff PSF zusammen mit Sulfobutylether von beta -Cyclodextrin mit 7 Subs-titutionen pro Molekül verwendet, wobei ein Mol-Verhältnis PSF zur beta -Cyclodextrin-Verbindung im Bereich von 10:1 bis 1:10 verwendet wird. Typische Beispiele derartiger Verhältnisse sind 1:1, 1:2, 1:3. Der Wirkstoff bildet mit der Cyclodextrinverbindung einen Komplex, in welchem das Peptid stabilisiert wird. Die Halbwertszeiten in der Grössenordnung von 10 bis 30 min des Wirkstoffes in einer Körperflüssigkeit werden durch Inklusion in einen Komplex mit Cyclodextrin erhöht, wobei eine Steuerung durch das oben erwähnte Verhältnis und durch den Substitutionsgrad möglich ist. Der Komplex kann durch den Organismus besser aufgenommen und absorbiert werden, wobei die Bioverfügbarkeit positiv beeinflusst wird.

Das Verhältnis muss der Krankheit des Patienten und seinem Gesundheitszustand angepasst werden. Das Produkt kann als festes Produkt oder als Konzentrat vorgelegt werden, welches zur Herstellung von injizierbaren Lösungen oder Infusionen dient. Falls therapeutisch erforderlich, kann die pharmazeutische Formulierung auch andere Wirkstoffe enthalten.

Für orale Formulierungen wird das PSF mit einer geeigneten nichttoxischen alpha - oder - beta - oder gamma -Cyclodextrin-Verbindung vermischt. Das Verhältnis von Peptid zu Cyclodextrin beträgt hier beispielsweise 1:1 bis 1:10, typischerweise 1:1, 1:2, 1:3. Die Kombination wird gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Trägerstoff in Kapseln verpackt.

Herstellungsbeispiel (Wirkstoff):

Synthese von L-prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester-hydrochlorid

a) N-Carbobenzoxy-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester
52,5 g L-p-Fluorphenylalaninethylester Hydrochlorid werden mit 75 ml Na2CO3 (Natriumcarbonat) gesättigter Lösung und 150 ml CHCI3 behandelt. Die Mischung wird ausgeschüttelt und die organische Phase wird getrennt und aufbewahrt. Die wässrige Phase wird mit 75 ml CHCI3 ein zweites Mal ausgeschüttelt. Die vereinigten Chloroformextrakte werden gemischt und einmal mit Wasser gewaschen und dann von der wässrigen Phase getrennt und auf wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Die Konzentration von Aminosäureester wird durch eine Titration mit HCIO4 (Perchlorsäure) bestimmt. Die Ausbeute entspricht ungefähr dem theoretischen Wert; sie liegt bei 98%.
EMI6.1

286,5 ml einer Chloroformlösung, die 0,1905 Mol L-p-Fluorphenylalaninethylester enthält, werden mit 83,7 g (0,1905 Mole) N-Cbzo-L-m-sarcolysin versetzt. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt.

Der gekühlten Lösung werden unter Rühren 41,25 g (0,200 Mol Dicyclohexylcarbodiimid - DCC) und 60 ml Chloroform dazugegeben, wobei die Lösung während 30 min unter gleichzeitiger Kühlung ständig gerührt wird. Unter Umständen kann die Mischung zu fester Masse erstarren. In diesem Fall wird die Masse durch Zugabe von 150 ml Chloroform wieder flüssig gemacht, wobei sie unter leichtem Erwärmen gerührt wird. Auf diese Weise wird die Auflösung des ausgefallenen Produktes beschleunigt. Die Reaktion ist 2 h nach Zugabe des DDC beendet. Das Reaktionsende wird durch TLC-Kontrolle festgestellt (Dünnschochtchromatografie; Kielgel G-Schicht, Lösungsmittel: Chloroform + Aceton 9:1, Sichtbarmachung durch Besprühen mit verdünnter, saurer KMn04-Lösung). Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration abgetrennt.

Die Lösung wird zuerst mit wenig Wasser, dann mit gesättigter Na2C03 -Lösung gewaschen. Die Chloroformlösung wird noch einmal mit Wasser ausgeschüttelt und dann mit Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum verdampft und entfernt. Nach Trocknung werden 140,25 g leicht gelblich gefärbtes Produkt erhalten (Ausbeute 98,3%). Die gewonnene Substanz hat einen Schmelzpunkt von 123-124,5 DEG C und ist chromatografisch homogen. Durch Kristallisation von 4,5 g Substanz aus 37,5 ml Ethylalkohol werden 3,75 g helleres Produkt gewonnen mit einem Schmelzpunkt von 125-126 DEG C. alpha D<20>: 27.7 (c = 2, CHCI3).
EMI7.1

Analyse für C32H36CI2FN3O5
N% = 6,67 (berechnet 6,66)
Cl% = 11,5 (berechnet = 11,2)

b) L-m-Sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester
EMI7.2

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Unter Ausschluss der Luftfeuchtigkeit werden zu 390 g (0,616 mol) die M-Carbobenzoxy-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester unter langsamem Rühren 600 ml HBr in Eisessig (33%) zugegeben. Die Auflösung und das Aufhören der CO2-Entwicklung findet nach 40 Minuten statt. Es wird während weiteren 20 min unter Rühren stehen gelassen und mit ca. 400 ml Ether verdünnt. Man giesst das gesamte in 5 l Ether, welcher unter ständigem Rühren gehalten wird, dekantiert und wäscht das ausgefallene \l 2 x mit 2 l Ether unter Dekantieren. Das \l wird unter Rühren mit 4 l Wasser behandelt und man erhält einen Feststoff, welcher nach ca. 30 min durch Filtration gesammelt und vollständig mit insgesamt 1500 ml Wasser und 500 ml Ether gewaschen wird.

Das so erhaltene Bromhydrat wird in 2 l Ethylacetat suspendiert und unter Rühren mit 450 ml gesättigter Natriumcarbonatlösung behandelt, derart bis die Lösung alkalisch ist. Nachdem die Auflösung stattgefunden hat, filtriert man auf der Nutsche, um den suspendierten Dicylohexylharnstoff (sehr wenig) zu entfernen. In einem Scheidetrichter trennt man die organische Schicht von der wässrigen Phase ab, und die wässrige Phase wird mit weiteren 500 ml Ethylacetat extrahiert. Die gereinigten Extrakte werden mit 300 ml Wasser gewaschen, Na2CO4 getrocknet und mit Norit behandelt. Es wird filtriert und das Filtrat wird unter dem Vakuum getrocknet (40 DEG C). Der Rückstand wird noch vor seiner Festigung in 500 bis 1000 ml Ether aufgenommen. Aus der erhaltenen Lösung wird während der Nacht ein weisses Produkt ausgefällt. Ausbeute: 247 g (80,4%) Smp.100-102 DEG C.

alpha D<20> = -7,5 DEG (c = 2, Chloroform)

TLC (BuOH/AcOH/H20 65:15:25; KMnO4 verdünnt):

Eine Bande, Rf = 0,74

Analyse für C24H30CI2FN3O3

N% = 8,34 (berechnet 8,43)

Cl% = 14,1 (berechnet 14,2)

c) N-Carbobenzoxy-L-prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalaninethylester
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Eine Mischung von 249 g (0,5 mol) L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalaninethylester, 125 g (0,5 mol) N-Cbzo-L-Prolin und 109 g (0,525 mol) DCC in 3000 ml Chloroform wird während 30 min unter Rühren stehen gelassen, mit externer Kühlung während weiteren 90 min bei Zimmertemperatur (TLC, Silikagel G, Chf/Me2CO 9:1; oder mit BuOH/AcOH/H20 65:15:25; KMnO4, verdünnt, sauer). Nach der Entfernung des Dicyclohexylharnstoffes durch Filtration wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft und der Rückstand wird noch in flüssigem Zustand in 800 ml Ether gegossen. Von der erhaltenen Lösung fällt langsam das Produkt aus, welches auf einem Filter gesammelt wird. Ausbeute 290 g (78,5%). Smp. = 148-150 DEG C, alpha D<20> = -42,4 DEG (c = 2; Chloroform)

Analyse für C37H43FCI2N4O6,
N% = 7,78% (berechnet 7,68),
Cl% = 9,6 (berechnet 9,7)

d) L-Prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester-hydrochlorid
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Eine Mischung von 157,5 (0,261 mol) N-Carbobenzoxy-L-prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin-ethylester und 30 g Palladium auf Kohlenstoff 5% wird suspendiert unter einem Stickstoffstrom in 15 ml Eisessig und 1750 ml Methanol. Die Reaktionsmischung wird unter Rühren gehalten und wird unter einem Wasserstoffstrom reduziert. Nach der Beendigung der C02-Entwicklung (nach 4-5 Stunden) wird eine TLC-Chromatografiekontrolle durchgeführt (Kieselgel G), wobei mit Chloroform-Aceton 9:1 eluiert und mit verdünntem KMnO4 sichtbar gemacht wird.

Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration wird das Filtrat mit konzentrierter ethanolischer HCI in stöchiometrischer Menge oder wenig mehr angesäuert. Der weisse, kristalline Niederschlag, welcher sich langsam bildet, wird auf einem Filter gesammelt und mit Ethanol oder mit Ether gewaschen: 85 g. Das Filtrat wird praktisch bis zur Trockenheit konzentriert und der Rückstand wird aus Ethanol umkristallisiert: 25 g. Vollständige Ausbeute: 110 g (80, 5%); Smp. 122-124 DEG C (Änderung des Aggregatszustandes)

alpha D<20> = <->13,0 DEG +/- 0,5 (c = 2; MeOH)

TLC (Kieselgel G; BuOH/AcOH/H20 65:15:25; KMnO4 verdünnt: eine

Bande Rf = 0,54.

Analyse für C29H38Cl3FN4O4

N% = 8,93% (berechnet 8,86)

CI% = 16,7% (berechnet 16,8)

CI-% = 5,65% (berechnet 5,6)

Beispiel: Parenterales Präparat zur Behandlung von Melanomen.
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 2 AL=L: Komponente
<tb>Head Col 1: Menge
<tb><SEP>Peptid <SEP>PSF-ethylester . HCI <SEP>8 g
<tb><SEP>Cyclodextrin-Träger <CEL AL=L>Sulfobutylether von beta -Cyclodextrin in der Na<+>-Form,
Substitutionsgrad 7 CAPTISOL <TM> (CyDex 8675 W 96th St. Shawnee Mission, KS U.S.A.) <SEP>25 g
<tb><SEP>andere Wirk- und Hilfsstoffe <SEP>Chlorphenamin
Wasser, steril <SEP>320 mg
ad 100 ml
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 AL=L>Dosiseinheit:<SEP>40 mg Peptid/0,5 ml Lösung,
<tb><SEP>125 mg CAPTISOL/0,5 ml Lösung,
<tb><SEP>1,6 mg Chlorphenamin/0,5 ml Lösung
<tb></TABLE>

Bemerkungen: Zur i.v. Verabreichung oder für Infusionen bestimmt.

Je nach Zweck der Verabreichung, dem Wirkstoff und dem Zustand des Patienten kann das Verhältnis des Wirkstoffes zum Cyclodextrin-Träger im Rahmen der vorliegenden Erfindung abgeändert werden, ohne dass von der Idee der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebsleiden enthaltend als aktive Komponente mindestens eine Peptidverbindung, welche verzögert freigesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe: - L-Seryl-L-p-fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysin - L-Prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin - L-m-Sarcolysyl-N-nitro-L-arginyl-L-norvalin - L-p-Fluorphenylalanyl-L-m-sarcolysil-L-asparagin - L-p-Fluorphenylalanyl-glycyl-L-m-sarcolysyl-norvalin - L-m-Sarcolysyl-L-arginyl-L-lysyl-L-m-sarcolysyl-L-histidin und Niederalkylester und/oder Säureadditionssalze davon, und dass die Zusammensetzung mindestens ein substituiertes Cyclodextrin als Hilfs- oder Trägersubstanz enthält, die mindestens einen Substituenten der Formel -O-(C2 bis C6)Alkylen-SO3<->M<+ > aufweist, worin M+ ein physiologisch verträgliches Gegenion ist.

2.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Niederalkylester Methyl- oder Ethylester sind.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 zur parenteralen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass das substitutierte Cyclodextrin ein Sulfo(niederalkyl)ether von alpha -, beta - oder gamma -Cyclodextrin mit einem Substitutionsgrad von 3 bis 10 und vorzugsweise 7 ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 zur parenteralen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass der Sulfo(niederalkyl)ether von alpha -, beta - oder gamma -Cyclodextrin Sulfobutylether von beta -Cyclodextrin in der Na+-Form mit einem Substitutionsgrad von 7 ist.

5.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur oralen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass das gegebenenfalls substituierte Cyclodextrin alpha , beta -, oder gamma -Cyclodextrin ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidverbindung L-Prolyl-L-m-sarcolysyl-L-p-fluorphenylalanin ist, vorzugsweise in Form des Hydrochlorids des Ethylesters.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das Mol-Verhältnis der Peptidverbindung zum gegebenenfalls substitutierten Cyclodextrin 10:1 bis 1:10 und vorzugsweise 1:3 bis 1:5 beträgt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich noch mindestens einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff enthält.

9.

Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der zusätzliche pharmakologisch aktive Wirkstoff Chlorphenamin ist.