CN101106955A - 用于sci和pnt再生的透明质酸衍生物和神经干细胞 - Google Patents

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Abstract

用于治疗脊髓损伤或外周神经损伤的生物材料，其通过以下途径获得：a)用促进神经干细胞黏附、分支和分化的包被溶液处理透明质酸衍生物；b)用从步骤a)获得的透明质酸衍生物接触分离的神经干细胞，并且在生长因子或神经营养因子存在下培养和扩大吸收的细胞，所述生长因子或神经营养因子选自βFGF(基本成纤维细胞生长因子)、CNTF(睫状神经营养因子)、BDNF(脑衍生神经营养因子)和GDNF(胶质细胞衍生神经营养因子)或其混合物。

Description

用于SCI和PNT再生的透明质酸衍生物和神经干细胞
技术领域
本发明涉及移植支架后脊髓损伤和外周神经损伤的再生，所述支架由透明质酸衍生物单独制成或者在其中接种了神经干细胞。
发明背景
透明质酸(HA)是围绕正在迁移和增殖细胞的细胞外基质的主要成分。它是非常长并且带负电荷的多糖，其每个分子包含多达50,000个由葡糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的简单二糖的重复。事实上，重点要提及的是在体内它的衍生物成功应用于创伤愈合、糖尿病性溃疡、白斑治疗、预防腹腔镜检粘附、抗黏附表面包被、软骨再生。
一类HA衍生物被称为自交联的多糖。这种情况下，通过产生交联键来获得聚合物的稳定性，而没有另外的化学物质涉及乙酰透明质酸链的桥接。沿着多聚链，以相同或不同乙酰透明质酸分子的羟基直接酯化某一百分比的葡糖醛酸羧基，从而完成稳定作用。这些材料是高度粘性的悬浮液，其为可变浓度在30到60mg/mL之间的自成网微粒悬浮于无菌蒸馏水中。
获得HA衍生物的可选方法涉及偶联反应的使用，其中通过化学反应(例如酯化作用、硫酸化作用、酰胺化作用等等)修饰多糖的特殊官能团(例如羧基、羟基、N-乙酰基)。
所有这些HA修饰的生物材料在体内通过酶活性或水解作用被自发地降解，形成HA分子的片段和先前结合的官能团(苯甲基或乙醇、酰胺等)。
HA衍生物的合成通常涉及两步骤的操作：HA四价盐的制备和其在受控温度下、在非质子溶剂中与一种化学剂的后继反应(酯化、酰胺化等)。多种醇可用于酯化作用(脂肪族、芳香脂肪族(araliphatic)、脂环族和其它)。根据EP 1095064能够制备酰胺化的HA。例如从EP 216453已知透明质酸酯。从EP 702699已知HA的O-硫酸化衍生物。
从EP 1339753已知HA的过羧酸酯化衍生物。
根据在化学反应中取代的化学基团(以及取代的百分比)，产生的生物材料能够提供完全不同的机械性质：例如，在酯化的HA情况下，通过增加疏水性和降低羧基的负电荷来增加停留时间。
已经证明角质形成细胞、成纤维细胞、软骨细胞、间充质干细胞、内皮细胞、肝细胞、urethlial细胞和神经细胞能在HA修饰的生物材料上有效地增殖。然而，绝大多数前面提到的交联的HA衍生物表现为高度水合的材料，其为非细胞黏附的，因而最初被考虑用作预防外科粘连的可再吸收材料。
我们的第一个组织工程方法是测试完全可生物降解生物材料的这一重要的多样性。基于HA的产品已经获得欧共体的临床应用许可，且三种产品已经被FDA认可。
SCI(脊髓损伤)可以表征为受损部位周围的组织破坏、不完全修复和创伤愈合持续过程的结果。显著的身体证据证明SCI涉及自始至终的三个时期：急性期、续发期和慢性期。最初的中心损伤进行性地扩展，并且SCI发展进入其慢性期。白质表明导致传导缺陷的部分或全部的脱髓鞘作用。大约25％的SCI患者发展出中央定位的囊，其进行性扩展导致脊髓空洞症。
更多的组织病理学特征包括灰质分解、结缔组织沉积和神经胶质增生。损伤的范围和位置决定整体上的神经缺陷、过度兴奋性的发展和慢性疼痛综合征。
如果目的研究的主要领域是对损伤的生理学应答或者继发性损伤的病理生理学，那么研究者可以选择挫伤模型，因为其近似于人类SCI。然而，在挫伤模型中对再生轴突的清楚证明，尤其是对多余和再生轴突的描述提出了新的挑战。
对于运动感觉途径恢复的行为研究和统计评价也是挫伤模型非常关键的步骤，其中动物对照组(受损但是未治疗)自发地恢复部分其损失的神经连接。
如果应用设备，部分或完整的横切模型可能最适合于设备安置。对于某种实验性的范例，可以设计模型的组合。例如，探测轴突再生的实验设计早期可以利用横切模型清楚证明再生的轴突和鉴别最有希望的疗法，随后能够在挫伤模型中通过分析技术对其测试。
在横切模型中，从再生的轴突中区分多余轴突的能力不是重点。对于某一应用，单侧半切除损伤是对于完全横切的可行的备选。该方法的主要优点是保留一侧脊髓的结构完整性和功能。单侧脊髓通常保留足够维持膀胱和肠的功能，其可以减少对手术动物的照料。
由于这些原因，在损伤和移植由酯化HA制成的支架之后使用大鼠脊髓半切除作为实验动物模型测试脊髓再生，而为了测试外周神经再生，则进行坐骨神经的完全横切。
发明详述
透明质酸衍生的膜和纤维：多组分支架
本发明实验的第一步是在不同形式的透明质酸之间进行广泛的体外比较，其包括部分和完全酯化的透明质酸、N-硫酸化的透明质酸、部分酰胺化的透明质酸(凝胶)、过羧酸化的透明质酸以及一些自交联形式的透明质酸(凝胶)。已经证明HA酯，尤其是苯甲基酯(HYAFF11)特别适合这里所述发明。
以固体和部分柔性结构(从非编织网状和类似的非编织纤维到编织的管状结构和层)提供不同百分比酯化的HA(＞70％，优选从75％到100％，甚至更优选100％酯化度)，其可从其它研究中获得，并且在组织工程中应用为皮肤、血管组织、软骨再生。按照为收获和扩大NSC(神经干细胞)所建立的方案进行所有的体外筛选实验。
具体实施方式
实验方案描述如下：
-仅比较类似的三维支架(例如纤维与纤维、层与层)；
-在接种前两天机械分离神经干细胞，以维持混合细胞群中尽可能高的干细胞百分比；
-在一些情况下，将HA支架浸入不同的包被溶液中：小鼠层粘连蛋白(5μg/cm2)、人纤连蛋白(10μg/cm2)、层粘连蛋白和纤连蛋白混合物；
-每种条件接种的细胞总数为200,000-300,000，浓缩于20μl培养基中；
-各支架仅用这一高浓缩的细胞溶液浸泡30分钟；
-添加包含终浓度为20ng/ml的bFGF的培养基；
-3天以后，将培养基替换为由CNTF和BDNF组成的培养基(两者都为20ng/ml)；
-每2天更换培养基；
-在铺板后第7和14天用MTT测定测试细胞的生存力；
-在细胞存活的情况下，用共聚焦和荧光倒置显微镜进行染色成像；
-使用小鼠和人的神经干细胞。
在图1中，通过活细胞MTT染色，清楚可见蓝色的索状非编织纤维和由完全酯化的HA构成的层。
蓝色是由于活的线粒体与MTT试剂产生不可溶的蓝色甲产物。纤维完全被活细胞所覆盖。标尺为500μm。
所测试的包被溶液中，纤连蛋白和层粘连蛋白混合物显示最高的细胞存活率：对所有保持在同样细胞培养基中的先前所述生物材料进行该比较。因此从这一时间点采用该包被溶液作为我们对所有相继体外和体内实验标准方案的部分。
下一步，为了帮助NSC增殖、向神经表型分化，以及选择在体内实验中已证明能促进神经系统再生的蛋白质，我们测试了在培养基中稀释的生长因子和神经营养因子的不同组合。
我们因此测试如下因子在细胞增殖中的作用：
βFGF(基本成纤维细胞生长因子)
βFGF+CNTF(睫状神经营养因子)
βFGF+CNTF+BDNF(脑衍生神经营养因子)
βFGF+CNTF+BDNF+GDNF(胶质细胞衍生神经营养因子)
在20ng/ml浓度下测试所有这些最后提及的生长因子。
在表1中，可清楚地看到非编织纤维和层支架都在神经营养因子最完全的组合中达到吸光度的最高值(活的NSC)。
表1铺平板7天后，对接种于由100％酯化的HA构成支架的纤维和层上的小鼠NSC进行MTT测定。
100％酯化的HA  βFGF  βFGF+CNTF  βFGF+CNTF+BDNF  βFGF+CNTF+BDNF+GDNF
层纤维  0.09±0.011.32±0.101  0.123±0.0131.88±0.162  0.2±0.0322.053±0.169  0.252±0.0442.4683±0.369
在培养基中包含的营养因子强烈地影响活细胞群的最终大小(n＝8)。数值用吸光度单位表达。使用人NSC也重现MTT测定中所有的这些趋势。
对于所有先前所述实验(同时包括小鼠和人细胞)，用正置和倒置光学显微镜评估在支架的层和纤维上的细胞形态学和拓扑分布。
图2显示接种于100％酯化HA的微纤维(a、b)和层(c、d)上5天的人神经干细胞的染色。细胞核(b、d)用DAPI染成蓝色。在左栏中，神经元和星形胶质细胞用b微管蛋白抗体染成绿色(a、c)，并用GFAP抗体染成红色(只有c)。纤维的情况可以记录分化中的NSC细胞是如何沿各纤维的纵轴延伸它们的细胞体和扩展它们的分支。标尺为50μm。
荧光标记也证明在三维支架中测试细胞形态学是必需的：在这种情况下用荧光和共聚焦荧光显微镜进行成像。
在非编织纤维和层支架获得足够均匀的细胞分布：非编织网和编织管证明在静止条件下(即，在细胞和支架不暴露于流动的任何人工培养基的情况)难以均匀接种。
在我们的体外实验末期，能够使黏附性NSC几乎完全覆盖HA纤维。为此用生长因子刺激细胞增殖和自发地在纤维间迁移。
已证明共聚焦显微镜是用于细胞-支架三维成像和基于其高分辨率扫描细胞计数的必要技术。
我们也测试了由自交联的HA(为抗黏附应用而设计)、酰胺化HA以及65％和50％酯化HA制成的凝胶生物支架：所有这些为粉末形式，并且在用蒸馏水不同的稀释下测试。
优选条件涉及如前述所公开的将自交联HA的干粉与培养基(包含bFGF、CNTF、BDNF、GDNF)以及包被溶液(优选包含纤连蛋白和层粘连蛋白)进行混合；应用这些条件可获得显著的细胞黏附和分支(见图3)并且起始体外细胞网络形成。
特别是图3显示接种于自交联HA凝胶中4天后的NSC的相差光学成像。图(a)中HA在蒸馏水中稀释，(b)中HA在我们以上提到的分化培养基和由层粘连蛋白及纤连蛋白构成的包被溶液中稀释。(a)中所示圆形细胞表明总体上缺乏细胞黏附、分支和分化，这通常将导致细胞凋亡或衰老；另一方面，(b)中显示的分支细胞提供了对NSC分化和存活更有利的环境的线索。标尺为50μm。
动物模型和支架设计
由于上述原因，大鼠脊髓半切除作为实验动物模型用于测试在损伤和移植HYAFF11构成的支架之后的脊髓再生。
为了保证在外周神经损伤实验中结果的可靠性，在大鼠中进行坐骨神经的完全横切。对于SCI和PNT(外周神经横切)，创立三个不同的动物组：仅有损伤的大鼠(对照组)、损伤并移植了在生物聚合体基质上分化的人(有时是小鼠的)NSC的大鼠、和只接受支架的大鼠。
为了尝试诱导3D定向的细胞生长和分化，我们设计并测试用于SCI和PNT的相似的支架：
-由于在体外实验中获得了有希望的结果(见前面的章节)和接近希望目标的推测生物降解时间(2-3个月)，选择100％HA苯甲基酯作为支架的主要组分。
-为了使大部分脊髓束和外周神经的细胞构筑单一化成为纵向神经纤维，我们采用纤维(20μm-50μm)作为3D支持进行空间定向，其能够影响细胞定向(在前面章节中证明)和校正存在于空间的内源轴突再生。
由于其本质上开放、多孔的结构和弱的机械硬度，在PNT情况下将这些纤维构成的基质插入2mm宽的具有连续壁或者多孔壁的管(由同样生物材料构成)中。可以对所述管进行激光穿刺，从而允许神经胶质浸入管内部，释放生长因子使神经再生更为容易。由HYAFF11纤维组成的小管是已知的，并且被用于例如尿道再生(Italiano G.等人，Urol Res，1997，26：281-284)。EP 571415公开了通常由HA组成且富含生长因子的螺旋线所支持的HYAFF11圆筒。EP 652778公开了支持HA管的几种编织线的网络，所述线由同样的材料组成，并且为了使其更紧密，将其插入管体中；在这一例子中还存在生长因子。考虑到其缺乏弹性和应用于神经通路，这些已知的支架(即使为了产生神经纤维而开发)在追踪外周神经复杂的再生过程中具有弹性方面的重要缺陷。
对于SCI模型，首先将纤维支架放置在受损部位，随后使用正方形的层作为补片从而将再生部位与损伤周围组织的结缔和肌细胞的有害侵入隔开。在PNT的情况下，将管缝合在神经残干上，对于SCI用纤维蛋白胶(通常用于临床外科的一种生物学膏剂)密封补片。
图4中显示SCI手术的图示。与PNT模型的主要区别在于损伤部位(坐骨神经)、神经缺口长度(1mm)、外部支架组分(管代替层)和使用缝合代替纤维蛋白胶来粘接移植体与宿主组织。
在HA支架上接种NSC，体外培养2天。通过切口产生脊髓损伤之后，立即沿脊柱束的纵轴放置细胞和纤维。然后用纤维蛋白胶密封HA膜。
利用我们最初关于培养基和包被的体外实验的详细方案：
-在接种之前2天，机械分离神经球(或NSC簇)；
-在接种细胞前一天，将支架的各组分浸在由层粘连蛋白(25μg/ml)和纤连蛋白(50μg/ml)构成的包被溶液中保留过夜；
-将5×105-7.5×105 NSC重悬于20μl培养基中。作为预黏附步骤，将细胞悬液倒在支架上，并于37℃+放置30分钟；
-随后用含有βFGF、CNTF、GDNF、BDNF的培养基体外培养接种的细胞2天。
将生物多聚体和细胞插入到成年Sprague-Dawleyl雌性大鼠(250克)脊髓急性损伤中(半切除和组织移除T9脊髓管的3mm半部分)，并用纤维蛋白胶密封。
对照动物接受没有细胞的支架或仅遭受损伤。手术以后，动物接受每日剂量的环孢霉素作为免疫抑制剂。
每周监测动物两次以评价功能性损伤实质情况，并于移植后1-2或6个月处死动物。
用4％PFA心内灌注后，移出脊髓并进行组织化学分析。
在PNT模型中，完全横切坐骨神经，移出1mm长的神经组织条，并且将两个残干与一个由细胞和支架(纤维和管)构成的桥缝合。在这种情况下，也使用动物对照组(没有细胞的支架、手术而没有任何治疗)。
基于HYAFF11的支架的体内应用：结果
对于SCI模型，使用超过40个动物：在每一天的手术中，各组至少操作一个动物。处死动物并用4％PFA包埋脊髓组织，冰冻切片切成冠状和纵向切片。随后进行形态学和免疫组织化学分析。
为了防止不需要的对移植细胞的免疫应答，动物接受每日剂量的环孢霉素直至处死。
用于移植的不同细胞系：人神经干细胞、小鼠NSC、转基因小鼠NSC(修饰使在其细胞核内表达标记物，β-半乳糖苷酶，使其定位于宿主组织的冰冻切片中)。
在移植后的前几周中，发现单核细胞、T细胞和其它免疫应答相关细胞的正常(SCI生理学追踪)侵入。图5显示治疗3周之后，对此细胞和支架的冠状切片中包含的酸性组分的甲苯胺蓝染色(主要是HA纤维-大点，和细胞核-小点)。宿主细胞的侵入填充了纤维之间的空隙。某些纤维周围重吸收的灰色阴影证明宿主对支架免疫反应的最终步骤。标尺为50μm。
然而这一反应会及时终止(＞2个月)。在单独移植支架的动物和支架上接种细胞的动物之间，这些基质的生物相容性没有显著差异。
另一方面，移植的NSC没有表现出受到这一应答的显著影响。
图6显示移植的转基因NSC的核染色。移植部位的冠状切片：手术后20天，细胞核标记为蓝色的细胞在修饰的HA纤维(空的黑色圈)之间黏附和分支。标尺为50μm。
在图6中可以看到手术后20天损伤部位(近似在支架的中部)的冠状切片：移植的转基因细胞通过X-gal反应被标记为蓝色，其标志着由移植的转基因NSC自发产生的β-半乳糖苷酶。
创伤后6个月，NSC也存在于从损伤尾侧和吻侧得到的切片中，因此显示从支架向宿主组织迁移的内在能力。
最重要的，通过常规使用的技术化学染色神经微丝，以检测损伤内部神经组织的再生长(对轴突的Bielshowsky银染)。
治疗的动物表现为神经纤维从损伤部位周围的区域侵入：在移植1个月之后可见该作用。
图7显示损伤后50天脊髓损伤部位横向切片的神经微丝染色。神经纤维染成暗褐色。在移植了人NSC和HYAFF11支架的动物中神经再生详细情况的低倍(a)和高倍(b)放大。(a)HA微纤维留下的圆形仍然清晰可见，神经纤维从左侧(通过手术使半部分保留完整)侵入支架，图像右侧部分仍然充满空穴(＝纤维)。(b)在HA微纤维中再生神经元的高倍放大图像。在某些神经束中可见单个纤维。
图8显示(a)神经微丝和(b)损伤和移植的脊髓相邻纵向切片的苏木精-伊红染色。在手术后6个月处死动物。“R”指脊髓的吻端。移植部位的形态学染色(b)以红色曲线环绕。(a)中黑色线是由于所用银染方案的人为产物。神经纤维(暗褐线)从吻端侵入损伤部位。
神经纤维从损伤部位旁侧(图7ab)和吻端(图8a)侵入支架。
特别地，可以见到再生神经纤维沿脊髓纵轴显著的延伸过程(图8a)，其为使用定向的微纤维定向神经再生的想法提供了支持。
在图8b中，使用形态学免疫组织化学染色(苏木精-伊红反应)，对细胞质和细胞核染色。损伤部位用红色曲线人为地划出边界。注意由支架纤维留下的类似组织的空穴，其为在CNS组织中植入的100％酯化HA的长生物降解时间导致的结果。
迄今为止，不论接种还是不接种NSC，在所有测试的动物中，所有的支架都防止形成水囊和神经胶质瘢痕化：在只是受损的动物中发现该结果。图9ab显示受损脊髓(对照组)相邻纵向切片的(a)苏木精-伊红染色和(b)神经微丝染色。在手术后6个月处死动物。“R”指脊髓吻端。左图显示大量组织破裂，有一个完全从神经纤维游离的圆形囊(b)。连续的线作为所用方案的人为产物存在于两个图中。
我们也在9个动物中实行了外周神经横切(坐骨神经)方案(见先前段落)，采取先前3个动物组的策略(接种细胞的支架、单独的支架、神经横断且未治疗)。手术后6个月，神经纤维侵入、再生纤维的髓鞘再形成和血管再形成只出现在移植动物的损伤部位(图10)。
特别地，图10显示坐骨神经横向切片的甲苯胺蓝反应，其经过横切并且移植了接种人NSC的100％酯化HA支架。损伤后6个月，同一切片图像的低倍(a)和高倍(b)放大。仍然存在支架纤维(HA标记圈)，并且在其间有大量的再生神经纤维(a)。单神经纤维是(b)中小的暗边界圈。纤维层越厚，髓鞘再形成就越多。(b)中血管也用红色椭圆形环绕。
由于我们在坐骨神经横切中使用完全切断模型，我们可以假定在支架纤维之间发现的所有神经纤维是再生纤维。
因此我们的结果如下：
-所选生物材料是中枢和外周神经系统良好耐受的：没有持续的慢性免疫应答或细胞凋亡；
-在SCI和PNT模型的HA纤维中发生神经再生；
-设计的支架在空间上影响神经纤维的自发再生；
-在PNT模型中，神经纤维是部分有髓鞘的；
-在移植后6个月NSC存活，并且迁移到损伤部位之外。

Claims (8)

1.用于治疗脊髓损伤或外周神经损伤的生物材料，其可以通过以下途径获得：
a)用促进神经干细胞黏附、分支和分化的包被溶液处理透明质酸衍生物；
b)用从步骤a)获得的透明质酸衍生物接触分离的神经干细胞，且在生长因子或神经营养因子存在下培养和扩大吸收的细胞，所述生长因子或神经营养因子选自βFGF(基本成纤维细胞生长因子)、CNTF(睫状神经营养因子)、BDNF(脑衍生神经营养因子)和GDNF(胶质细胞衍生神经营养因子)或其混合物。
2.根据权利要求1的生物材料，其中透明质酸衍生物选自透明质酸的酯衍生物、酰胺衍生物、交联衍生物、过羧酸衍生物和硫酸衍生物。
3.根据权利要求2的生物材料，其中透明质酸衍生物是酯化度范围从75％到100％的酯。
4.根据权利要求3的生物材料，其中透明质酸衍生物是100％的透明质酸酯。
5.根据权利要求1的生物材料，其形式为纤维、凝胶、非编织和编织的纤维、层和具有连续壁或多孔壁的管。
6.根据权利要求1的生物材料，其中包被溶液包含纤连蛋白和层粘连蛋白。
7.治疗脊髓损伤或外周神经损伤的方法，其包括在损伤部位移植权利要求1-6的生物材料。
8.移植在权利要求1-6的生物材料上的神经干细胞。
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