CN101942425A - 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将本发明采用定点突变(C197L/G256L/S338I)技术对PcPKS2进行了突变研究，PcPKS2的三联体突变体命名为PcmBAS，结果显示，突变后的PcmBAS苯亚甲基丙酮合成能力较PcPKS2提高了7.52倍。

Description

与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。

背景技术

覆盆子酮，又名悬钩子酮(raspberry ketone)，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮，(4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone)，是一种经过美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可使用的一种具有幽雅果香香韵的安全食用香料，其FEMA编号为2588，属于国家海关承认、产业政策鼓励发展的高新技术产品，其被广泛用于食品、化妆品及医药中间体的合成。作为覆盆子果实特征性香味物质，在覆盆子植物中含量低并且资源非常有限，从植物中提取天然覆盆子酮是不经济的，天然提取的覆盆子酮成本高达每公斤2万美元。

在自然界中，覆盆子酮广泛存在于悬钩子属植物覆盆子中。覆盆子，今称树莓，为悬钩子属，蔷薇科，半灌木，小桨果类。覆盆子可做水果食用，其红熟果称树莓果，口感香、甜、酸，可鲜食，在欧美是一种极具营养价值和经济价值的高端水果，在中国少为人知，仅在东北地区有少量栽培，市场上比较少见。覆盆子同时具有很高的药用价值；其绿果经炮制制成传统中药覆盆子，《本草纲目》等文献记载具有“气味甘，平，无毒”，有益肾固精缩尿壮阳作用。

覆盆子酮是一种酚类化合物，其生物合成来源于聚酮化合物生物合成途径，苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase(BAS))(EC 2.3.1.-)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A分子通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮(p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one)，之后苯亚甲基丙酮再还原酶的催化下直接生成覆盆子酮。BAS是植物类型III聚酮合酶(PKS)超家族成员，在构建具有重要药理价值的一系列苯丁烷类化合物及其衍生物的C₆-C₄分子骨架方面具有重要的功能。BAS是覆盆子酮生物合成途径的关键酶和限速酶，是利用基因工程技术分子调控覆盆子酮生物合成的靶点。BAS在覆盆子植物中一直未得到分离，但在蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum)中得到分离。

发明内容

本发明的一个目的是提供与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白质，人工合成，命名为PcmBAS，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。

上述序列4由389个氨基酸残基组成，上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白质的编码基因PcmBAS也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)序列表中序列3自5’末端第4位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列3自5’末端第1位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子。

上述序列3由1167个核苷酸组成，OFR的序列为序列3的自5’末端第1-1167位核苷酸序列。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为将上述编码基因插入载体pET-30b(+)的NdeI和SalI识别位点间得到的重组载体。

扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。

上述蛋白质在合成苯亚甲基丙酮中的应用，上述编码基因在合成苯亚甲基丙酮中的应用都是本发明要保护的范围。所述合成苯亚甲基丙酮为体外合成苯亚甲基丙酮。

本发明另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。

本发明提供的方法，为以4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，在权利要求1所述蛋白质的催化作用下，得到苯亚甲基丙酮。

本发明的实验证明，将本发明采用定点突变(C197L/G256L/S338I)技术对PcPKS2进行了突变研究，PcPKS2的三联体突变体命名为PcmBAS，结果显示，突变后的PcmBAS苯亚甲基丙酮合成能力较PcPKS2提高了7.52倍。PcmBAS突变基因及其应用为覆盆子酮的生物合成提供了直接有效的技术及应用基础。

附图说明

图1为PcmBAS原核表达载体的构建

图2为原核表达载体的NdeI和SalI双酶切鉴定

图3为BAS纯化SDS-PAGE分析

图4为BAS催化合成苯亚甲基丙酮高效液相色谱(HPLC)测定结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PcPKS2定点突变的获得

1.PcPKS2的定点突变

人工合成PcPKS2(序列表中的序列1)。PcPKS2的定点突变(C197L/G256L/S338I)采用QuikChange site-directed mutagenesis kit(购自Stratagene，Catalog #200518)试剂盒方法，具体突变引物如下(突变位点用下划线标出)：PcPKS2C197T/G256L/S338I(5’-CATCGTTTGCTCGGAGATGACGGCAATTACATTCCGTGGGCCATCTGAAACAAAC-3’，5’-GAATCCGATGGTGCAGTCGAGTTACATTTGCTCGAATCTGGGCTTAGTTGCC-3’and 5’-CAAGTGTTGAACGACTATGGAAACATGATTAGTGCTACTGTGTTTTTCATCATG-3’)，模板为人工合成PcPKS2，进行PCR扩增，将得到的PCR产物送去测序，结果表明，该PCR产物具有序列表中序列3的序列，该PCR产物的基因命名为PcmBAS，OFR为序列表中序列3的第1-1170位核苷酸，PcmBAS编码的蛋白命名为PcmBAS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。PcmBAS与PcPKS2(序列2)相比，突变位点为：第197位由Cys(半胱氨酸)突变为Leu(亮氨酸)，第256位由Gly(甘氨酸)突变为Leu(亮氨酸)，第338位由Ser(丝氨酸)突变为Ile(异亮氨酸)。PcmBAS与PcPKS2相比，突变位点为第583-585位由TGC突变为ACA，第760-762位由GGC突变为TTA，第1006-1008位TCA突变为ATT。

2.PcmBAS异源表达和蛋白纯化

PcmBAS cDNA的ORF使用含有特定限制性内切酶位点的N-末端和C-末端引物进行PCR扩增。正义引物为：5’-TATACATATGGCGGCTTCAATTGAGGAGATT-3’(序列5)，下划线表示NdeI酶切位点；反义引物为：5’-TATAGTCGACCTAATGAATGATGGGCACGCTGCG-3’(序列6)，下划线表示SalI酶切位点。以步骤1)获得的PCR产物(或人工合成序列3)为模板，进行PCR，得到的PCR产物经过NdeI/SalI双酶切后得到的片段，插入原核表达载体pET-30b(+)(Novagen，Darmstadt，Germany)的NdeI和SalI的识别位点间，获得重组载体(图1为载体结构示意图)，将重组载体用NdeI和SalI酶切鉴定，结果如图2(M，DL15000+2000 Marker；1-3，阳性质粒。)所示，从图中看出，得到约1.2Kb的DNA片段。将酶切鉴定结果正确的重组阳性质粒测序，该重组载体为在pET-30b(+)的NdeI和SalI的识别位点插入序列表中序列3的第4-1167位核苷酸构成，将该阳性重组载体命名为pET-30b(+)-PcmBAS。

将pET-30b(+)-PcmBAS转入E.coli BL21-Rosetta(DE3)(TransGen，Beijing，China)中，获得重组菌，将重组菌提取质粒后酶切鉴定，获得约1.2Kb片段的重组菌命名为BL21/pET-30b(+)-PcmBAS。

将BL21/pET-30b(+)-PcmBAS接入10ml含有卡那霉素(50μg ml^-1)和氯霉素(34μg ml^-1)的LB培养基，37℃培养过夜，次日稀释100倍接入200ml LB培养基中于37℃、200rpm继续培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加终浓度为1mM的IPTG，降温至30℃，6h后，通过离心收集菌体并重悬于3ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，超声波冰上破碎菌体。冰上破碎的菌体匀浆于4℃10,000g下离心10min，收集上清。

上清通过Ni²⁺-琼脂糖柱(Novagen).用含有0.5M NaCl and 40mM咪唑(imidazole)的0.1M磷酸钾缓冲液洗涤Ni²⁺-琼脂糖柱三次后，用含有400mM imidazole的0.1M磷酸钾缓冲液洗涤洗脱，收集洗涤洗脱液，为了长期保持重组蛋白活性，再将洗涤洗脱液通过PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，用含10％(v/v)甘油的0.1M Tris-HCl(pH 7.5)置换缓冲液重新洗脱，收集洗脱液，得到重组蛋白PcmBAS，保存于-80℃。

重组蛋白的纯化效率用SDS-PAGE检测。

采用同样的方法将PcPKS2导入大肠杆菌BL21中，获得重组菌BL21/pET-30b(+)-PcPKS2，再将该重组菌采用上述方法发酵、纯化获得重组蛋白PcPKS2。

采用同样的方法将空载体pET-30b(+)导入大肠杆菌BL21中，获得重组菌BL21/pET-30b(+)，再将该重组菌采用上述方法发酵、纯化获得对照组蛋白。

组氨酸六聚体标签构筑在重组蛋白的C末端上。将上述纯化得到的重组蛋白PcmBAS和PcPKS2进行SDS-PAGE电泳检测，以上述获得的对照组蛋白为对照，结果如图3(M，分子质量标准；1，PcmBAS纯化结果；2，PcPKS2纯化结果)所示，结果显示纯化的重组蛋白PcmBAS和PcPKS2均在43kDa的位置上形成一个单一条带，这与PcmBAS和PcPKS2的预期大小一致，说明蛋白纯化成功。对照组蛋白中未有目的蛋白条带。

实施例2、突变体的功能研究

1、体外酶促反应及产物分析

250μl标准体外酶促反应体系含有150μM的4-香豆酰辅酶A(Beuerle T，Pichersky E(2002)Enzymatic synthesis and purification of aromatic coenzymea esters.Anal Biochem 302：305-312；公众可从北京农学院获得。)、280μM丙二酰辅酶A(Sigma-Aldrich Catalog #M4263)、0.1M磷酸钾缓冲液(pH 9.0)以及2.0μg的由实施例1获得的重组蛋白PcmBAS，反应体系的pH值为9.0。上述反应体系置于30℃下30分钟后，加入终浓度为5％的乙酸(检测副产物)，之后用250μl的乙酸乙酯抽提并于10,000g下离心10分钟。取上清真空干燥后，加入50μl 50％(v/v)的甲醇水溶液。以实施例1获得的重组蛋白PcPKS2和对照组蛋白为对照。

酶促产物的分析使用配备有Kromosil C18反相柱(5μm，250mm×4.6mm；Macherey Nagel)的Waters Alliance 2695高效液相色谱系统(HPLC)完成。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为0.6ml min^-1，使用以下梯度条件：30％B 3分钟、30-70％B 27分钟、70-80％B 2分钟、80-95％B 3分钟以及95％B 5分钟。检测波长针对以下化合物分别为：柚皮素查儿酮(naringenin chalcone)，289nm；苯亚甲基丙酮(p-hydroxybenzalacetone)，323nm。用相应的标准品：柚皮素查尔酮(Catalog #W530098，购自Sigma-Aldrich公司)和苯亚甲基丙酮(Catalog#11960，购自Sigma-Aldrich公司)，对各种化合物进行定量。

对于高效液相色谱-质谱分析，液相分离由Shimadzu LC-10ADvp HPLC系统完成。质谱测定由Shimadzu LCMS-2010A质谱系统完成(Shimadazu，Kyoto，Japan)。ShimadzuLC/ESIMS-2010软件系统完成数据采集和处理。液相色谱条件同前述。最适的质谱条件如下：所有的m/z波普范围设定在120-350；干燥气体流速，1.5L min^-1；CDL温度，250℃；block温度，200℃；probe电压+4.5kV。

酶动力学常数及催化效率(绝对活性)(Kcat/Km)是最准确的酶活性指标。

苯亚甲基丙酮标准品的保留时间为31.7分钟，酶促产物的定性及定量分析结果见图4所示(A为PcPKS2催化结果；B为PcmBAS催化结果)，结果显示，PcmBAS催化生成苯亚甲基丙酮的保留时间为31.7分钟，PcPKS2催化生成苯亚甲基丙酮的保留时间为31.7分钟。对照组蛋白没有得到苯亚甲基丙酮，表明其没有酶活性。

质谱检测结果为苯亚甲基丙酮标准品的分子量为146.19，PcmBAS催化生成苯亚甲基丙酮的分子量为146.19，PcPKS2催化生成苯亚甲基丙酮的分子量为146.19，表明，得到的物质为苯亚甲基丙酮。

重组的PcmBAS与4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A共同在标准酶促反应体系中孵育且酶促反应体系pH值为9.0时，PcmBAS能够高效地生成苯亚甲基丙酮为主产物，且活性远高于PcPKS2。

证明：PcmBAS为苯亚甲基丙酮合成酶。

2、动力学分析

重组蛋白动力学常数的测定是在丙二酰辅酶A浓度饱和(浓度为280μM/l)的情况下，用4-香豆酰辅酶A介于其K_m的0.2-6.0范围内的5个浓度值进行计算获得。

实验使用上述标准的250μl 0.1M磷酸钾缓冲液反应体系，每个实验重复3次。反应体系的pH值为9.0，上述反应体系置于30℃下30分钟后，加入终浓度为5％的乙酸，之后用250μl的乙酸乙酯萃取，将有机相于10,000g下离心10分钟。取上清真空干燥后，加入50μl 50％(v/v)的甲醇水溶液。

K_m和K_cat值由Lineweaver-Burke曲线的结果得出。

对于苯亚甲基丙酮的合成，PcPKS2的动力学常数为：K_m＝46.7μm、K_cat＝0.24min^-1(4-香豆酰辅酶A)；PcmBAS的动力学常数为：K_m＝35.7μm、K_cat＝1.38min^-1(4-香豆酰辅酶A)。突变体PcmBAS(Kcat/Km)较PcPKS2催化效率提高7.52倍，PcmBAS突变基因及其应用为覆盆子酮的生物合成提供了直接有效的技术及应用基础。

Claims (9)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)序列表中序列3自5’末端第4位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列3自5’末端第1位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述编码基因插入载体pET-30b(+)的多克隆位点间得到的重组载体。

6.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或任一片段的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。

7.权利要求1所述蛋白质在合成苯亚甲基丙酮中的应用，或权利要求2或3所述编码基因在合成苯亚甲基丙酮中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述合成苯亚甲基丙酮为体外合成苯亚甲基丙酮。

9.一种制备苯亚甲基丙酮的方法，其特征在于：为以4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，在权利要求1所述蛋白质的催化作用下，得到苯亚甲基丙酮。

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