CN101942425B - 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 - Google Patents
与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101942425B CN101942425B CN2010102619681A CN201010261968A CN101942425B CN 101942425 B CN101942425 B CN 101942425B CN 2010102619681 A CN2010102619681 A CN 2010102619681A CN 201010261968 A CN201010261968 A CN 201010261968A CN 101942425 B CN101942425 B CN 101942425B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- benzalacetone
- protein
- pcmbas
- pcpks2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- BWHOZHOGCMHOBV-BQYQJAHWSA-N trans-benzylideneacetone Chemical compound CC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 BWHOZHOGCMHOBV-BQYQJAHWSA-N 0.000 title claims abstract description 33
- BWHOZHOGCMHOBV-UHFFFAOYSA-N Benzalacetone Natural products CC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 BWHOZHOGCMHOBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- -1 acyl coenzyme A Chemical compound 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LTYOQGRJFJAKNA-IJCONWDESA-N malonyl-coenzyme a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-IJCONWDESA-N 0.000 claims 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000001211 (E)-4-phenylbut-3-en-2-one Substances 0.000 description 24
- 229930008407 benzylideneacetone Natural products 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 12
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 12
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- NJGBTKGETPDVIK-UHFFFAOYSA-N raspberry ketone Chemical compound CC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NJGBTKGETPDVIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VWMVAQHMFFZQGD-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxybenzyl acetone Natural products CC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VWMVAQHMFFZQGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108030002058 Benzalacetone synthases Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N trans-4-coumaroyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N 0.000 description 7
- DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 4-Coumaroyl-CoA Natural products S(C(=O)/C=C/c1ccc(O)cc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@@](=O)(O[P@@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 5
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- YQHMWTPYORBCMF-ZZXKWVIFSA-N 2',4,4',6'-tetrahydroxychalcone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O YQHMWTPYORBCMF-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N Naringenin chalcone Natural products C1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000235659 Rubus idaeus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- WEXTZNXEYQAGMM-UHFFFAOYSA-N 1-(4-hydroxyphenyl)but-3-en-2-one 4-phenylbut-3-en-2-one Chemical compound OC1=CC=C(C=C1)CC(C=C)=O.C(C1=CC=CC=C1)=CC(C)=O WEXTZNXEYQAGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQJFBHBDOAIIGS-CMDGGOBGSA-N 3-Methyl-4-phenyl-3-buten-2-one Chemical group CC(=O)C(\C)=C\C1=CC=CC=C1 BQJFBHBDOAIIGS-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000002197 FEMA number Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000219050 Polygonaceae Species 0.000 description 1
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 1
- 235000008090 Rheum palmatum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001745 Rheum palmatum Species 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000649 benzylidene group Chemical group [H]C(=[*])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 150000005334 phenylbutanes Chemical class 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- CLBSWJNDEPQOGS-UHFFFAOYSA-K tripotassium;1h-imidazole;phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].C1=CNC=N1.[O-]P([O-])([O-])=O CLBSWJNDEPQOGS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将本发明采用定点突变(C197L/G256L/S338I)技术对PcPKS2进行了突变研究，PcPKS2的三联体突变体命名为PcmBAS，结果显示，突变后的PcmBAS苯亚甲基丙酮合成能力较PcPKS2提高了7.52倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。
背景技术
覆盆子酮，又名悬钩子酮(raspberry ketone)，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮，(4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone)，是一种经过美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可使用的一种具有幽雅果香香韵的安全食用香料，其FEMA编号为2588，属于国家海关承认、产业政策鼓励发展的高新技术产品，其被广泛用于食品、化妆品及医药中间体的合成。作为覆盆子果实特征性香味物质，在覆盆子植物中含量低并且资源非常有限，从植物中提取天然覆盆子酮是不经济的，天然提取的覆盆子酮成本高达每公斤2万美元。
在自然界中，覆盆子酮广泛存在于悬钩子属植物覆盆子中。覆盆子，今称树莓，为悬钩子属，蔷薇科，半灌木，小桨果类。覆盆子可做水果食用，其红熟果称树莓果，口感香、甜、酸，可鲜食，在欧美是一种极具营养价值和经济价值的高端水果，在中国少为人知，仅在东北地区有少量栽培，市场上比较少见。覆盆子同时具有很高的药用价值；其绿果经炮制制成传统中药覆盆子，《本草纲目》等文献记载具有“气味甘，平，无毒”，有益肾固精缩尿壮阳作用。
覆盆子酮是一种酚类化合物，其生物合成来源于聚酮化合物生物合成途径，苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase(BAS))(EC 2.3.1.-)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A分子通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮(p-hydroxyphenylbut-3-ene-2-one)，之后苯亚甲基丙酮再还原酶的催化下直接生成覆盆子酮。BAS是植物类型III聚酮合酶(PKS)超家族成员，在构建具有重要药理价值的一系列苯丁烷类化合物及其衍生物的C6-C4分子骨架方面具有重要的功能。BAS是覆盆子酮生物合成途径的关键酶和限速酶，是利用基因工程技术分子调控覆盆子酮生物合成的靶点。BAS在覆盆子植物中一直未得到分离，但在蓼科植物掌叶大黄(Rheumpalmatum)中得到分离。
发明内容
本发明的一个目的是提供与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，人工合成，命名为PcmBAS，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与苯亚甲基丙酮合成相关的由1)衍生的蛋白质。
上述序列4由389个氨基酸残基组成，上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述蛋白质的编码基因PcmBAS也是本发明保护的范围。
所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列3所示的DNA分子；
2)序列表中序列3自5’末端第4位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列3自5’末端第1位到第1167位核苷酸所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与苯亚甲基丙酮合成相关的蛋白所示的DNA分子。
上述序列3由1167个核苷酸组成，OFR的序列为序列3的自5’末端第1-1167位核苷酸序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也是本发明保护的范围。
所述重组载体为将上述编码基因插入载体pET-30b(+)的NdeI和SalI识别位点间得到的重组载体。
扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。
上述蛋白质在合成苯亚甲基丙酮中的应用，上述编码基因在合成苯亚甲基丙酮中的应用都是本发明要保护的范围。所述合成苯亚甲基丙酮为体外合成苯亚甲基丙酮。
本发明另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。
本发明提供的方法，为以4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，在权利要求1所述蛋白质的催化作用下，得到苯亚甲基丙酮。
本发明的实验证明，将本发明采用定点突变(C197L/G256L/S338I)技术对PcPKS2进行了突变研究，PcPKS2的三联体突变体命名为PcmBAS，结果显示，突变后的PcmBAS苯亚甲基丙酮合成能力较PcPKS2提高了7.52倍。PcmBAS突变基因及其应用为覆盆子酮的生物合成提供了直接有效的技术及应用基础。
附图说明
图1为PcmBAS原核表达载体的构建
图2为原核表达载体的NdeI和SalI双酶切鉴定
图3为BAS纯化SDS-PAGE分析
图4为BAS催化合成苯亚甲基丙酮高效液相色谱(HPLC)测定结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、PcPKS2定点突变的获得
1.PcPKS2的定点突变
人工合成PcPKS2(序列表中的序列1)。PcPKS2的定点突变(C197L/G256L/S338I)采用QuikChange site-directed mutagenesis kit(购自Stratagene，Catalog #200518)试剂盒方法，具体突变引物如下(突变位点用下划线标出)：PcPKS2C197T/G256L/S338I(5’-CATCGTTTGCTCGGAGATGACGGCAATTACATTCCGTGGGCCATCTGAAACAAAC-3’，5’-GAATCCGATGGTGCAGTCGAGTTACATTTGCTCGAATCTGGGCTTAGTTGCC-3’and 5’-CAAGTGTTGAACGACTATGGAAACATGATTAGTGCTACTGTGTTTTTCATCATG-3’)，模板为人工合成PcPKS2，进行PCR扩增，将得到的PCR产物送去测序，结果表明，该PCR产物具有序列表中序列3的序列，该PCR产物的基因命名为PcmBAS，OFR为序列表中序列3的第1-1170位核苷酸，PcmBAS编码的蛋白命名为PcmBAS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。PcmBAS与PcPKS2(序列2)相比，突变位点为：第197位由Cys(半胱氨酸)突变为Leu(亮氨酸)，第256位由Gly(甘氨酸)突变为Leu(亮氨酸)，第338位由Ser(丝氨酸)突变为Ile(异亮氨酸)。PcmBAS与PcPKS2相比，突变位点为第583-585位由TGC突变为ACA，第760-762位由GGC突变为TTA，第1006-1008位TCA突变为ATT。
2.PcmBAS异源表达和蛋白纯化
PcmBAS cDNA的ORF使用含有特定限制性内切酶位点的N-末端和C-末端引物进行PCR扩增。正义引物为：5’-TATACATATGGCGGCTTCAATTGAGGAGATT-3’(序列5)，下划线表示NdeI酶切位点；反义引物为：5’-TATAGTCGACCTAATGAATGATGGGCACGCTGCG-3’(序列6)，下划线表示SalI酶切位点。以步骤1)获得的PCR产物(或人工合成序列3)为模板，进行PCR，得到的PCR产物经过NdeI/SalI双酶切后得到的片段，插入原核表达载体pET-30b(+)(Novagen，Darmstadt，Germany)的NdeI和SalI的识别位点间，获得重组载体(图1为载体结构示意图)，将重组载体用NdeI和SalI酶切鉴定，结果如图2(M，DL15000+2000 Marker；1-3，阳性质粒。)所示，从图中看出，得到约1.2Kb的DNA片段。将酶切鉴定结果正确的重组阳性质粒测序，该重组载体为在pET-30b(+)的NdeI和SalI的识别位点插入序列表中序列3的第4-1167位核苷酸构成，将该阳性重组载体命名为pET-30b(+)-PcmBAS。
将pET-30b(+)-PcmBAS转入E.coli BL21-Rosetta(DE3)(TransGen，Beijing，China)中，获得重组菌，将重组菌提取质粒后酶切鉴定，获得约1.2Kb片段的重组菌命名为BL21/pET-30b(+)-PcmBAS。
将BL21/pET-30b(+)-PcmBAS接入10ml含有卡那霉素(50μg ml-1)和氯霉素(34μg ml-1)的LB培养基，37℃培养过夜，次日稀释100倍接入200ml LB培养基中于37℃、200rpm继续培养至OD600为0.6-0.8时，添加终浓度为1mM的IPTG，降温至30℃，6h后，通过离心收集菌体并重悬于3ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，超声波冰上破碎菌体。冰上破碎的菌体匀浆于4℃10,000g下离心10min，收集上清。
上清通过Ni2+-琼脂糖柱(Novagen).用含有0.5M NaCl and 40mM咪唑(imidazole)的0.1M磷酸钾缓冲液洗涤Ni2+-琼脂糖柱三次后，用含有400mM imidazole的0.1M磷酸钾缓冲液洗涤洗脱，收集洗涤洗脱液，为了长期保持重组蛋白活性，再将洗涤洗脱液通过PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，用含10％(v/v)甘油的0.1M Tris-HCl(pH 7.5)置换缓冲液重新洗脱，收集洗脱液，得到重组蛋白PcmBAS，保存于-80℃。
重组蛋白的纯化效率用SDS-PAGE检测。
采用同样的方法将PcPKS2导入大肠杆菌BL21中，获得重组菌BL21/pET-30b(+)-PcPKS2，再将该重组菌采用上述方法发酵、纯化获得重组蛋白PcPKS2。
采用同样的方法将空载体pET-30b(+)导入大肠杆菌BL21中，获得重组菌BL21/pET-30b(+)，再将该重组菌采用上述方法发酵、纯化获得对照组蛋白。
组氨酸六聚体标签构筑在重组蛋白的C末端上。将上述纯化得到的重组蛋白PcmBAS和PcPKS2进行SDS-PAGE电泳检测，以上述获得的对照组蛋白为对照，结果如图3(M，分子质量标准；1，PcmBAS纯化结果；2，PcPKS2纯化结果)所示，结果显示纯化的重组蛋白PcmBAS和PcPKS2均在43kDa的位置上形成一个单一条带，这与PcmBAS和PcPKS2的预期大小一致，说明蛋白纯化成功。对照组蛋白中未有目的蛋白条带。
实施例2、突变体的功能研究
1、体外酶促反应及产物分析
250μl标准体外酶促反应体系含有150μM的4-香豆酰辅酶A(Beuerle T，Pichersky E(2002)Enzymatic synthesis and purification of aromatic coenzymea esters.Anal Biochem 302：305-312；公众可从北京农学院获得。)、280μM丙二酰辅酶A(Sigma-Aldrich Catalog #M4263)、0.1M磷酸钾缓冲液(pH 9.0)以及2.0μg的由实施例1获得的重组蛋白PcmBAS，反应体系的pH值为9.0。上述反应体系置于30℃下30分钟后，加入终浓度为5％的乙酸(检测副产物)，之后用250μl的乙酸乙酯抽提并于10,000g下离心10分钟。取上清真空干燥后，加入50μl 50％(v/v)的甲醇水溶液。以实施例1获得的重组蛋白PcPKS2和对照组蛋白为对照。
酶促产物的分析使用配备有Kromosil C18反相柱(5μm，250mm×4.6mm；Macherey Nagel)的Waters Alliance 2695高效液相色谱系统(HPLC)完成。流动相为水(A)和甲醇(B)，流速为0.6ml min-1，使用以下梯度条件：30％B 3分钟、30-70％B 27分钟、70-80％B 2分钟、80-95％B 3分钟以及95％B 5分钟。检测波长针对以下化合物分别为：柚皮素查儿酮(naringenin chalcone)，289nm；苯亚甲基丙酮(p-hydroxybenzalacetone)，323nm。用相应的标准品：柚皮素查尔酮(Catalog#W530098，购自Sigma-Aldrich公司)和苯亚甲基丙酮(Catalog#11960，购自Sigma-Aldrich公司)，对各种化合物进行定量。
对于高效液相色谱-质谱分析，液相分离由Shimadzu LC-10ADvp HPLC系统完成。质谱测定由Shimadzu LCMS-2010A质谱系统完成(Shimadazu，Kyoto，Japan)。ShimadzuLC/ESIMS-2010软件系统完成数据采集和处理。液相色谱条件同前述。最适的质谱条件如下：所有的m/z波普范围设定在120-350；干燥气体流速，1.5L min-1；CDL温度，250℃；block温度，200℃；probe电压+4.5kV。
酶动力学常数及催化效率(绝对活性)(Kcat/Km)是最准确的酶活性指标。
苯亚甲基丙酮标准品的保留时间为31.7分钟，酶促产物的定性及定量分析结果见图4所示(A为PcPKS2催化结果；B为PcmBAS催化结果)，结果显示，PcmBAS催化生成苯亚甲基丙酮的保留时间为31.7分钟，PcPKS2催化生成苯亚甲基丙酮的保留时间为31.7分钟。对照组蛋白没有得到苯亚甲基丙酮，表明其没有酶活性。
质谱检测结果为苯亚甲基丙酮标准品的分子量为146.19，PcmBAS催化生成苯亚甲基丙酮的分子量为146.19，PcPKS2催化生成苯亚甲基丙酮的分子量为146.19，表明，得到的物质为苯亚甲基丙酮。
重组的PcmBAS与4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A共同在标准酶促反应体系中孵育且酶促反应体系pH值为9.0时，PcmBAS能够高效地生成苯亚甲基丙酮为主产物，且活性远高于PcPKS2。
证明：PcmBAS为苯亚甲基丙酮合成酶。
2、动力学分析
重组蛋白动力学常数的测定是在丙二酰辅酶A浓度饱和(浓度为280μM/l)的情况下，用4-香豆酰辅酶A介于其Km的0.2-6.0范围内的5个浓度值进行计算获得。
实验使用上述标准的250μl 0.1M磷酸钾缓冲液反应体系，每个实验重复3次。反应体系的pH值为9.0，上述反应体系置于30℃下30分钟后，加入终浓度为5％的乙酸，之后用250μl的乙酸乙酯萃取，将有机相于10,000g下离心10分钟。取上清真空干燥后，加入50μl 50％(v/v)的甲醇水溶液。
Km和Kcat值由Lineweaver-Burke曲线的结果得出。
对于苯亚甲基丙酮的合成，PcPKS2的动力学常数为：Km＝46.7μm、Kcat＝0.24min-1(4-香豆酰辅酶A)；PcmBAS的动力学常数为：Km＝35.7μm、Kcat＝1.38min-1(4-香豆酰辅酶A)。突变体PcmBAS(Kcat/Km)较PcPKS2催化效率提高7.52倍，PcmBAS突变基因及其应用为覆盆子酮的生物合成提供了直接有效的技术及应用基础。
Claims (8)
1.一种蛋白质，是由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为序列表中序列3所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌或表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述编码基因插入载体pET-30b(+)的多克隆位点间得到的重组载体。
6.权利要求1所述蛋白质在合成苯亚甲基丙酮中的应用，或权利要求2或3所述编码基因在合成苯亚甲基丙酮中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述合成苯亚甲基丙酮为体外合成苯亚甲基丙酮。
8.一种制备苯亚甲基丙酮的方法，其特征在于：为以4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物，在权利要求1所述蛋白质的催化作用下，得到苯亚甲基丙酮。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102619681A CN101942425B (zh) | 2010-08-24 | 2010-08-24 | 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102619681A CN101942425B (zh) | 2010-08-24 | 2010-08-24 | 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101942425A CN101942425A (zh) | 2011-01-12 |
| CN101942425B true CN101942425B (zh) | 2012-06-20 |
Family
ID=43434637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102619681A Expired - Fee Related CN101942425B (zh) | 2010-08-24 | 2010-08-24 | 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101942425B (zh) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL163529A0 (en) * | 2002-02-19 | 2005-12-18 | Dow Agrosciences Llc | Novel spinosyn-producing polyketidesynthases |
| CN101302482B (zh) * | 2007-11-20 | 2010-12-08 | 大连理工大学 | 一株具有广谱抗菌活性的海洋链霉菌s187 |
-
2010
- 2010-08-24 CN CN2010102619681A patent/CN101942425B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101942425A (zh) | 2011-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104769121B (zh) | 香草醛合酶 | |
| Liebergesell et al. | Cloning and nucleotide sequences of genes relevant for biosynthesis of poly (3‐hydroxybutyric acid) in Chromatium vinosum strain D | |
| CN107723307A (zh) | 一种高效制备d‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法及其应用 | |
| CN107435049A (zh) | 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用 | |
| JP7183254B2 (ja) | パチョロールおよびエレモールをならびに好ましくはポゴストールも産生するテルペンシンターゼ | |
| JP2019530478A (ja) | 組換え宿主におけるシトロネラール及びシトロネロールの生産 | |
| EP4516900A1 (en) | Nerolidol synthase and use thereof | |
| CN115552010A (zh) | 用于产生大麻萜酚酸、大麻环萜酚酸和相关大麻素的遗传修饰的酵母 | |
| CN116656641A (zh) | 咖啡酸o-甲基转移酶突变体及其应用 | |
| CN105385700A (zh) | 一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用 | |
| JP2023514687A (ja) | グリコシルトランスフェラーゼ、これらをコードするポリヌクレオチドおよび使用方法 | |
| CN103243083B (zh) | 一种新的倍半萜合成酶及其用途 | |
| CN107099559B (zh) | 用于生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物、尤其肉桂酸酰胺的偶联产物的方法 | |
| CN114058560B (zh) | 甘氨酸的生产方法 | |
| WO2020223417A1 (en) | Biosynthesis of vanillin from isoeugenol | |
| CN104673814A (zh) | 一种来自于阴沟肠杆菌的l-苏氨酸醛缩酶及其应用 | |
| CN102031247B (zh) | 一种腈水解酶及其制备方法和应用 | |
| CN101942425B (zh) | 与苯亚甲基丙酮合成相关的酶及其编码基因与应用 | |
| CN109628421B (zh) | 一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用 | |
| GB2416769A (en) | Biosynthesis of raspberry ketone | |
| JP5911071B2 (ja) | プロトイルデンシンターゼ | |
| KR102336516B1 (ko) | 변이형 2-데옥시-실로-이노소스 합성효소 | |
| CN113025594B (zh) | 多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用 | |
| WO2022133261A1 (en) | Biosynthesis of vanillin from isoeugenol | |
| EP4560015A2 (en) | Modified polyketide synthase enzymes and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120620 |