CN102000330A - 一种核酸疫苗佐剂及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物学技术领域。Flt3L为集落刺激因子家族成员之一，可刺激CD34+造血干细胞的增殖和分化。本发明的目的在于提供一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂及其构建方法，本发明的核酸疫苗佐剂是一种基于Flt3L设计的用于增强核酸疫苗细胞免疫效果的质粒。本发明经体内试验证明，该质粒与核酸疫苗同时注射具有有效地诱导细胞免疫反应的能力，表现为抗原特异性脾脏IFN-γ阳性细胞增多和脾脏CD8阳性细胞杀靶能力增强。因此，本发明的疫苗佐剂可以添加到现有核酸疫苗制剂内混合注射，从而显著促进核酸疫苗诱导的细胞免疫反应，作为一种新型的细胞免疫佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物学技术领域。在本领域中，本发明尤其涉及核酸疫苗的免疫活性增强技术领域。
背景技术
核酸疫苗是指含有某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，直接导入动物细胞内，通过宿主的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使得宿主获得相应的免疫保护。由于核酸疫苗能够诱导机体产生全面的免疫应答，并且对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用，同时又具有免疫保护效果持久、安全、生产方便等一系列优点，故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。核酸疫苗的优点主要有：1、不仅可以诱导针对保守抗原的保护性抗体产生，而且可以同时激发机体的CTL免疫，这样对象病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防也就更加有效。而且，基因疫苗接种后，抗原在细胞内的表达与病毒自然感染过程中病毒抗原的表达一致，能够使抗原以自然的形式被加工后递呈给免疫识别系统。这对于构象型抗原表位诱发中和性抗体的产生是必要的；2、制备简便，省时省力基因疫苗的制备只需对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需在体外表达和纯化蛋白质，且外源基因较容易克隆进表达载体，数天内可扩增并纯化之，特别是对那些在流行病暴发时可快速开发新的疫苗。3、免疫应答较持久，文献报道在肌注后15个月可用PCR检测到外源质粒DNA的存在。有实验证明在注射后19个月仍可检测到外源基因相当数量的表达。这样外源基因及其表达持续存在，使得机体中特异的免疫记忆细胞的记忆被强化，从而使机体获得的保护性免疫较持久存在。4、同种异株交叉保护这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。选择某一病原体的编码保守蛋白的核酸序列作为基因疫苗，因其不会变异，故可对同一种病原的漂变或新型产生交叉免疫， 从而起到免疫保护作用。5、可用于肿瘤防治CTL应答也是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。若能找到在细胞恶性转化过程中的关键蛋白，就能制备肿瘤的CTL疫苗。该基因疫苗接种后，可诱发机体产生CTL免疫应答，对细胞的恶变进行免疫监视，对癌变的细胞产生免疫应答，从而为癌症的预防和免疫治疗提供强有力的新式武器。
然而DNA疫苗也存在着明显的不足，即DNA疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的免疫反应弱，这就给DNA疫苗的研究提出了新的挑战。因此，新型疫苗佐剂已成为当今倍受关注的研究热点。免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免疫应答的物质。目前在动物疫苗的配制中使用最广泛的是油佐剂和铝盐佐剂等，而作为DNA疫苗的佐剂主要有细胞因子、共刺激分子、CpG DNA和脂质体(Donnelly，JJ，Wahren，B，and Liu，MA.DNA vaccines：progress and challenges.J Immunol.，2005，175：633-639.)。
小鼠FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)为集落刺激因子家族成员之一，属于酪氨酸激酶受体，可刺激CD34+造血干细胞的增殖和分化，并诱导特定亚群的树突状细胞成熟。研究发现，通过注射Flt3L可以使抗原特异性免疫反应显著增强，并显著增加DC的数量和频率，Flt3L可与多种细胞因子有协同作用，是一种良好的DC扩增剂，在小动物和人的体内及体外进行实验都取得了良好的效果(Pulendran B.Modulatingvaccine responses with dendritic cells and Toll-like receptors.Immunol Rev.2004；199：227-50)。而抗原特异性免疫应答的诱生很大程度上取决于机体对该抗原分子的处理和提呈的效率。基于DC在基因免疫中的重要作用，如果招募包括DC在内的APC至靶抗原所在部位，增加抗原的摄取和提呈，则可能利于增强基因免疫的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂及其构建方法。
本发明设想将Flt3L做为一种的核酸疫苗佐剂分子，本发明在克隆Flt3L基因过程中获得了一段缺少部分碱基的序列，通过实验证明该序列 同样具有募集和活化DC的作用，目前未见该序列的相关报道。
本发明设计了一种编码Flt3L序列的质粒pcDNA.3.1-Flt3L，该质粒可以在体内外高效表达鼠Flt3L。经过与乙肝表面抗原核酸疫苗共注射免疫小鼠，我们发现该质粒对核酸疫苗免疫效力提高尤其是细胞免疫反应的增强有重要作用，因此，所述质粒与核酸疫苗共注射可以作为一种新的核酸疫苗免疫效力增强方法。
本发明提供了一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于该核酸疫苗佐剂是含有可以有效表达Flt3L基因剪接体分子的DNA序列的质粒，其中的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
上述的质粒是pcDNA.3.1(+)，本发明也可以用pVAX1或pEZX等其他真核表达质粒替代。质粒也可以以腺病毒、慢病毒等替代。
本发明还提供了上述核酸疫苗佐剂的构建方法，包括以下步骤：A)设计PCR引物如下，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR，得到编码Flt3L基因剪接体分子的DNA序列如SEQ ID NO：4所示；
B)将上述编码Flt3L基因剪接体分子的DNA序列克隆入质粒。
本发明的技术方案具体内容如下：
1、本发明首先根据互联网数据库www.pubmed.com信息查找了小鼠的Flt3L分子序列(GenBank：EU274583.1如SEQ ID NO：1所示)，针对其侧翼基因组编码序列设计PCR引物(上下游分别添加Xbal I和EcoR I酶切位点)，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR，克隆用PCR引物如下：
上游引物：3’cgggatcc Atg aca gtg ctg gcg cca gcc 5’(如SEQ ID NO：2所示)
下游引物：5’gctctagaggg atg gga ggg gag ggg cac c 3’(如SEQ ID NO：3所示)
从而获取了包含Flt3L分子编码序列的DNA片段(如SEQ ID NO：4所示，585bp)。
2、本发明在购自美国Invitrogene公司的商品化质粒pcDNA.3.1(+)的多克隆区域连入上述克隆的包含pcDNA.3.1-Flt3L编码序列的DNA片段(如图1所示)，采用Xbal I和EcoR I酶切位点。该插入序列 侧翼的多克隆酶切位点仍然保留，可以用于插入抗原序列并不影响其有效表达。所述即为Flt3L表达载体：pcDNA.3.1-Flt3L。
3、本发明质粒经过动物实验验证，具有以下属性：
(1)该质粒可以高效增加细胞内的Flt3L分子表达水平。
(2)该质粒可以与各种核酸疫苗共免疫而不影响后者表达抗原。
(3)将该质粒与乙肝表面抗原核酸疫苗共注射小鼠，可以诱导很强的抗原特异性细胞免疫反应，较传统核酸疫苗有显著提高。但是对抗体滴度影响不显著。
(4)在多次大剂量免疫该载体的实验中，实验动物未出现任何异常超敏反应或自身免疫现象。
附图说明
图1：pcDNA3.1-Flt3L质粒模式图
将Flt3L通过Xbal I和EcoR I位点插入pcDNA3.1(+)载体的多克隆区域，获得表达Flt3L的载体。图中绿色区域为Flt3L表达序列插入位点，绿色区域以外的多克隆位点仍然保留，可用于抗原编码序列插入。该质粒含有氨苄霉素抗性基因。
图2：将pcDNA3.1-Flt3L质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共免疫后的体内免疫效力检测抗体滴度
图3：将pcDNA3.1-Flt3L质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共免疫后的体内免疫效力检测IFN-γ分泌
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1：：pcDNA3.1-Flt3L质粒的构建
我们首先根据互联网数据库信息查找了小鼠的Flt3L分子序列(GenBank：EU274583.1，www.pubmed.com)，针对其侧翼基因组编码序列设计PCR引物(上下游分别添加Xbal I和EcoR I酶切位点)，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR，Flt3L分子序列和克隆用PCR引物如下表。从而获取了包含Flt3L分子编码序列的DNA片段。
我们在购自美国Invitrogene公司的商品化质粒pcDNA.3.1(+)的多克隆区域连入上述克隆的包含pcDNA.3.1-Flt3L编码序列的DNA片段(图1)，采用Xbal I和EcoR I酶切位点。该插入序列侧翼的多克隆酶切位点仍然保留，可以用于插入抗原序列并不影响其有效表达。所述即为Flt3L表达载体：pcDNA.3.1-Flt3L。
实施例2：pcDNA3.1-Flt3L质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共转染情况下体外表达能力检测。
利用小鼠做为实验动物模型，再对小鼠腿部注射pcDNA3.1-Flt3L质粒，24小时后采用免疫组化来分析注射局部的DC募集情况，发现pcDNA3.1-Flt3L质粒免疫后和对照组对比，免疫组有着显著的DC募集和活化。
实施例3：将pcDNA3.1-Flt3L质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共免疫后的体内免疫效力检测。
将pcDNA3.1-Flt3L以0.1mg/只与pVAX 1-HBsAg以0.1mg/只剂量免疫6-8周龄C57BL/6小鼠，共免疫3次，间隔2周，第6周末以HBsAg重组蛋白(10μg/只)混合不完全弗氏佐剂加强免疫一次，体液免疫方面，采用ELISA检测其抗体滴度(如图2所示)；细胞免疫方面，采用ELISPOT方法检测脾脏T细胞的IFN-γ分泌情况，结果发现(如图3所示)，pcDNA3.1-Flt3L以0.1mg/只与pVAX1-HBsAg以0.1mg/只共同免疫后可以有效的诱导抗原特异性CTL反应，IFN-γ分泌阳性细胞显著增多，靶细胞杀伤效率显著提高，提示抗原特异性细胞免疫获得明显增强。
表1、实验分组、免疫剂量、免疫方式
Claims (4)
1.一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于该核酸疫苗佐剂是含有可以有效表达Flt3L基因剪接体分子的DNA序列的质粒，其中的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于其中的质粒是pcDNA.3.1(+)。
3.一种如权利要求1或2所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
A)设计PCR引物如下，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR，得到编码Flt3L基因剪接体分子的DNA序列如SEQ ID NO：4所示：
上游引物如SEQ ID NO：2所示，下游引物如SEQ ID NO：3所示；
B)将上述编码Flt3L基因剪接体分子的DNA序列克隆入质粒。
4.根据权利要求3所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂的构建方法，其特征在于其中的质粒是pcDNA.3.1(+)。
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