CN102123731A - 作为抗癌疫苗的来源于中期因子蛋白质的免疫原性肽 - Google Patents

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Abstract

一种来源于中期因子蛋白质的肽，该肽包含至少一个受白种人群体中主要的HLA分子限制的CD4+T或者CD8+T表位，或者编码所述肽的多核苷酸，作为在癌症或者抗癌治疗过程中一种抗癌疫苗或者用于免疫监控针对中期因子的细胞反应的试剂。

Description

作为抗癌疫苗的来源于中期因子蛋白质的免疫原性肽
技术领域
本发明涉及来源于中期因子(midkine)蛋白质的肽在许多癌症类型中作为抗癌疫苗的应用，该肽可以诱导CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞，该淋巴细胞可识别在白种人群体的大部分个体中的所述中期因子蛋白质。
本发明也涉及在许多癌症类型中，在白种人群体的大多数个体中，这种被对中期因子蛋白质具有特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞所识别的肽作为试剂的用途，用于免疫监控癌症或者抗癌治疗过程中针对中期因子的细胞反应。
背景技术
肿瘤细胞可表达许多健康细胞不表达或者表达极少的蛋白质、或者仅在几个细胞类型中发现的蛋白质。这些在肿瘤细胞中被优先表达的蛋白质可以构成肿瘤抗原，即存在于肿瘤中的蛋白质，并且该抗原可以诱导能识别肿瘤并且(理想的是)除去肿瘤的免疫反应。该免疫反应既可以是一种抗体反应，只要抗原是一种细胞膜抗原，也可以是一种涉及CD8+T或者CD4+T淋巴细胞的细胞反应。大部分肿瘤抗原是细胞内抗原并且可诱导细胞反应。它们构成了用于疫苗开发的优选目标。
T淋巴细胞可促进直接针对肿瘤的细胞免疫反应。它们偶尔可以在经受癌症折磨的病人体内自然地被诱导出来并且渗入肿瘤，导致自然退化。它们可以被所设计的疫苗诱导，以便促进它们的补充。它们是涉及抗肿瘤免疫的两种类型的T淋巴细胞。CD8+T淋巴细胞是细胞毒性的(CD8+CTL)，并且可以裂解肿瘤细胞。在细胞识别期间它们的裂解涉及穿孔素和粒酶。CD8+T淋巴细胞识别被称为CD8+T表位的肽形式的肿瘤抗原，该抗原通过存在于肿瘤表面的I型HLA分子(HLA-A、HLA-B和HLA-C)被呈递给CD8+T淋巴细胞。辅助CD4+T淋巴细胞识别被称为CD4+T表位的肽形式的肿瘤抗原，该抗原通过II型HLA分子被呈递给辅助CD4+T淋巴细胞。当肿瘤表达II型分子时，可以直接发生CD4+T淋巴细胞对肿瘤的识别；或者通过树状细胞摄取细胞碎片而间接发生CD4+T淋巴细胞对肿瘤的识别，树状细胞是表面有许多II型HLA分子的细胞。涉及抗肿瘤免疫的CD4+T淋巴细胞在肿瘤控制中起着多重作用，尤其是涉及补充和维持CD8+CTL。CD4+T淋巴细胞通过CD40依赖性机制在激活树状细胞(DC)中起着作用。CD4+T淋巴细胞通过DC增加IL-12的分泌和在CD4+T淋巴细胞表面上共刺激分子或粘附分子(I-CAM-1、CD80、CD86)的表达。该活化使得CTL得到补充。此外，在不表达I型分子的小鼠中观察到的结果也显示，辅助T淋巴细胞通过独立于CTL的机制而发挥控制肿瘤的作用，可能是通过巨噬细胞活化而起作用。最终，CD4+T淋巴细胞可能自身是细胞毒性的。通过启动该反应，树状细胞也涉及抗肿瘤免疫。天然的肿瘤特异性的T淋巴细胞实际上是通过树状细胞而不是通过肿瘤细胞被补充和活化的。
在九十年代，第一个肿瘤抗原的发现代表着在肿瘤中表达的蛋白质上的许多研究成果。根据肿瘤抗原的表达模式，它们已经被分为几个类别。
*肿瘤特异的抗原
这是最大组的抗原，起初在黑素瘤中发现，但是实际上在许多肿瘤中被表达。由于这些抗原可在睾丸中表达，睾丸是表达它们的仅有的健康组织，这些抗原也被称为“癌症睾丸”。这些抗原中的一些也在胎盘或者卵巢中表达。因为睾丸和胎盘缺少常规的HLA分子，在健康组织中，对于T淋巴细胞而言这些抗原是看不见的。主要的抗原是MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、GAGE、LAGE和SSX抗原。
*分化的抗原
分化的抗原是被肿瘤和被产生肿瘤的细胞组织所表达的蛋白质。最有名的例子是黑色素瘤抗原，其也在会黑色素细胞中表达。它们是酪氨酸酶(TYRO、TRP-1和TRP-2)和Gp 100和MELAN-A/MART-1抗原。其它分化的抗原对于前列腺肿瘤(激肽释放酶-4和PSA)或者消化道癌症(CEA)也是已知的。
*过表达的抗原
虽然这些抗原的表达水平在正常细胞中不是很高，但是在许多肿瘤细胞中过表达的抗原是被高度表达的蛋白质。在大约30％乳腺癌和卵巢癌中和在一些结肠癌和肾癌中可发现HER-2/neu抗原的例子。在肿瘤中P53也是经常被过表达的。抑制细胞增殖的P53蛋白质在肿瘤细胞中通常是非常快速地重复循环的。不论其组织来源如何，端粒酶(hTERT)在大于80％的肿瘤中被发现，然而它在正常细胞中是不存在的或者被低量地表达。端粒酶的作用是用于补偿细胞分裂期间发生的端粒减少。通过端粒酶维持端粒长度不变，来促进细胞增殖以及因此的肿瘤发生。凋亡蛋白质抑制因子(IAP)，例如存活素蛋白质组成了通过抑制胱天蛋白酶而抑制细胞死亡的蛋白质家族。
*其它抗原
其它抗原种类是源于突变或者基因重排的抗原(MUM-1、CDK4、β-连环蛋白，HLA-A2，BCR-ALB，CASP-8)和病毒来源的肿瘤抗原(涉及子宫颈癌的乳头状瘤病毒的E6和E7蛋白质)。
虽然已经发现许多肿瘤抗原，但用于抗击癌症的疫苗并不是完美的。疫苗接种试验仍然令人失望，并且由疫苗引起的退化的例子是很少的。这些失败是如下情况造成的结果：被识别的抗原的弱免疫原性；或者逃避机理，即肿瘤不再表达目标抗原。被靶向的抗原对于细胞常常不是致命的，以致于可以发生肿瘤逃逸。已被识别的抗原主要发生在黑素瘤上，并不适用于其它很多癌症。有少数几种已知的抗原具有宽的表达谱并且因而可能具有适用于许多癌症的疫苗。这些抗原主要是过表达的抗原例如端粒酶和存活素(PCT国际申请WO2007/036638)。
然而，有许多蛋白质在肿瘤细胞中被优先表达，无论肿瘤细胞来源如何，并且因此可能组成适用于许多癌症的疫苗。为了使这些被关注的蛋白质可以用于疫苗，有必要显示它们可诱导能够识别肿瘤细胞的T淋巴细胞，该肿瘤细胞表达这些蛋白质。实际上，由于耐受机理或者这些蛋白质的序列中没有T表位，它们有可能仅仅具有弱的免疫原性。它们能够诱导免疫反应也是有可能的，除非被诱导的细胞不识别肿瘤。由于这些肿瘤细胞中的蛋白质的表达水平不充分或者加工不正确，来源于这些蛋白质的T表位实际上可能不在肿瘤细胞的表面被呈递。
中期因子(MDK)蛋白质，也称为NEGF2(神经突起生长促进因子2)，在1988年被证明是一种被视黄酸诱导的胚胎癌细胞蛋白质(Kadomatsu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，151，1312-1318；一篇综述，参见http://www.midkine.org)。在人类体内，中期因子基因位于第11号染色体位置11p11.2上。它包含4个外显子并且大小为3.5kb；编码序列对应于NCBI登录号M69148(附后的序列表中的SEQ ID NO：1)。调控性的5’区域包含一种视黄酸反应位点和两个WT 1(肾胚胎性瘤抑制因子1)肿瘤抑制反应位点。视黄酸反应位点负责通过视黄酸诱导中期因子的表达，同时WT 1反应位点涉及通过WT 1降低表达。已经描述了被称为INSP106的人类中期因子蛋白质剪接变体(PCT国际申请WO 2004/052928)。
中期因子是一种富含碱性残基的143个氨基酸的蛋白质，有五个二硫键[(37，61)；(45，70)；(52，74)；(84，116)；(94，126)]。人类序列对应于SwissProt登录号P21741(图1和附后的序列表中的SEQ ID NO：2)。它呈包含信号肽和22个氨基酸的前体的形式被表达(图1)。它呈现出与多效生长因子蛋白质大约50％同源性。在1997年通过NMR解析了中期因子的结构。该蛋白质包含两个不同的结构域，每个结构域由通过二硫键维持的三个反平行β折叠组成；两个结构域通过柔性区域相连接。生物活性(神经突生长、纤维蛋白溶解和神经细胞迁移)仅需要C末端结构域。这个结构域是保守的，并且从果蝇至人中都被发现，确认了它的功能作用。C末端结构域也包含两个肝素结合位点。至少四个能够结合中期因子的受体是已知的，这赋予它许多活性：共结合聚糖(syndecan)家族的成员，其是包含硫酸肝素的蛋白聚糖；PTPζ，其是包含硫酸软骨素的蛋白聚糖；ALK(间变性淋巴瘤激酶)；LRP，其是低密度脂蛋白(LDL)受体家族的成员。
在正常个体中，中期因子主要是在胚胎发育期间表达的，在怀孕的中间达到了表达的峰值。中期因子涉及神经元发展。它引起神经突生长和神经细胞迁移。它也涉及神经肌肉接头发展和神经元的保护。在胚胎发育期间，中期因子涉及牙齿、肺、肾和骨的生长。中期因子基因缺陷型小鼠是能存活的，根据中期因子在神经系统发展中的作用，它们仅仅在神经元功能方面受影响。也观察到中期因子基因缺陷型小鼠与对照小鼠相比，更少地受到软玉(nephrite)诱导影响。它们也很少遭受到再狭窄(由于受损害的动脉组织增殖所引起的动脉狭窄)。
中期因子可在许多肿瘤中被过表达，然而在健康的成人个体中，它表达较少并且是局部地表达(小肠、脑)。与健康的组织相比较，中期因子是肿瘤中表达最多的40个基因之一(Velculescu等人，Nat.Genet.，1999，23，387-388)。在很多人类癌症中大约80％的例子中，尤其是癌中，中期因子被过表达。尤其是在食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌和前列腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、恶性胶质瘤、星细胞瘤、白血病和肾胚细胞瘤中可以观察到中期因子的高表达(Moon等人，Gynecologic Oncology，2003，88，289-297；Hidaka等人，Leukemia Res.，2007，8，1045-1051；Maeda等人，Br.J.Cancer，2007，97，405-411；Ren等人，World J.Gastroenterol.，2006，12，2006-2010)。高度表达与膀胱癌、胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤的不良预后相关(O’Brien，Cancer Res.，1996，56，2515-2518)。此外，中期因子的过表达与人类胃癌细胞系中对化疗的耐受性提高相关。中期因子不仅仅是在组织中表达。在大于60％的罹患癌症的病人的血清中可以观察到高水平的中期因子(Muramatsu等人，J.Biochem.，2003，132，259-371)。当肿瘤被去除后，这个水平会降低。因此血清中中期因子的存在具有一种诊断学上的价值。中期因子看起来有许多活性与肿瘤发生相关。实际上它具有转化、抗凋亡、致有丝分裂、血管生成、溶解血纤维蛋白和趋化性的活性(Kadomatsu等人，Cancer Letters，2004，127-143)。已经表明，靶向中期因子基因的反义策略抑制了小鼠中癌的肿瘤发生(Takei等人，Cancer Research，2001，61，8486-8491)。
由于具有许多生物活动性，中期因子或者它的调剂因子(抑制剂)可用于刺激血管生成和血细胞生成，防止粥样硬化和再狭窄，以及抑制凋亡，并且用于预防和治疗炎症性的、心脏的(心肌梗死)、大脑的、肝脏的、神经的、肾的、眼的(视网膜病)、神经纤维瘤的(neurofibromatous)、呼吸的(哮喘和肺部增生)和术后的病理状况(美国专利申请US 2003/0072739，US 2003/0185794，US 2004/0077579，US 2005/0079151，US2006/0148738和US 2005/0130928；欧洲专利申请EP 1832296，PCT国际申请WO2007/055397和WO 2000/031541；和美国专利US 5,629,284；US 6,383,480and US6,572,851)。
此外，由于中期因子在肿瘤中的经常表达，结合血液和小便中该蛋白质的存在，以及与癌症风险相关的中期因子的存在，中期因子表现为一种标记物用于癌症的风险评估和诊断以及预测(美国专利US 7,090,983和美国专利申请US 2003/0149534and US2004/0219614)。尤其是可通过使用对相当于中期因子前体第23至25和82至143位的截断型中期因子具有特异性的单克隆抗体，来检测中期因子(美国专利申请US2004/0219614)。中期因子启动子也可用于自杀基因策略中。
另一方面，中期因子蛋白质的免疫原性并没有被研究。
发明内容
发明人已经表明，在肿瘤中优先表达的中期因子蛋白质包含能够诱导特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞的肽，该淋巴细胞可识别在大部分白种人群体个体中被许多癌症类型的肿瘤细胞表达的中期因子蛋白质。假定这些肽能够诱导直接针对肿瘤的CD4+T和CD8+T反应，这些肽代表潜在的候选物用于在大部分预防接种病人中抗癌的预防性或者治疗性疫苗接种，因为：(i)它们来源于许多被肿瘤表达的抗原，(ii)它们能够诱导特异性的CD4+T和CD8+T淋巴细胞，该淋巴细胞可识别被肿瘤表达的抗原，以及(iii)它们可被白种人群体的大部分个体中的CD4+T和CD8+T淋巴细胞识别，是由于它们顾及HLA分子的多态现象以及被白种人群体中主要的HLA分子所限制。
此外，这些肽可被对大部分肿瘤表达的肿瘤抗原有特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞所识别，可用于免疫监控在癌症发展过程中、尤其是在抗癌治疗(外科手术、化疗、放疗、免疫疗法)后针对中期因子的细胞反应。
因此，本发明的主题是：一种来源于中期因子蛋白质的肽或者编码上述蛋白质的多核苷酸在制备抗癌疫苗中的应用，该肽包含至少一个被白种人群体中主要的HLA分子限制的CD4+T或者CD8+T表位，该疫苗用于治疗与过表达所述中期因子蛋白质的肿瘤相关的癌症。
定义
-术语“来源于中期因子的肽”是指中期因子蛋白质(143个氨基酸的前体或者成熟蛋白质(前体第23至143位))和所述蛋白质的至少8个连续氨基酸的肽片段。术语“中期因子”指的是来源于任何哺乳动物的中期因子蛋白质；它优选是人类蛋白质。来源于中期因子的肽的位置根据人类序列(SwissProt P21741，图1和SEQ ID NO：2)被标明。
-术语“白种人群体中主要的HLA分子”或者“主要的HLA分子”指的是主要的HLA I型(HLA-A、HLA-B或者HLA-C)或者HLA II型分子。它涉及包含被等位基因编码的α链的HLA-A，HLA-B和HLC-C分子，在白种人群体中等位基因的频率大于5％，如在下文表I中所述。
表I：HLA I型的基因(等位基因*)/表现型频率
Figure BPA00001314815500061
*主要的HLA I型分子(基因频率＞5％)用粗体标明。
它也涉及包含被等位基因编码的β链的HLA II型分子，在白种人群体中等位基因的频率大于5％，如在下文表II中所述。
表II：HLA II型的基因(等位基因*)/表现型频率
Figure BPA00001314815500071
*主要的HLA II型分子(基因频率＞5％)用粗体标明。
白种人群体中的一些主要的HLA分子，并且尤其是HLA-DP401和HLA-DP402分子，在其它群体中(南美洲、印度、日本、非洲；表II)也是主要的。因此，根据本发明的肽不是仅限于在白种人群体中应用，而且它们也可以用于来自于除了北美洲和欧洲外的国家的个体的预防接种，如表II所述，在这些国家中所述HLA分子是占优势的。
-为本发明的目的，术语“占优势的”和“主要的”被认为是相等的，并且无差别地被使用。
-术语“被白种人群体中的主要的HLA II型分子限制的中期因子的CD4 + T表位”指的是可与至少一种白种人群体中主要的HLA II型分子结合并且可被该群体的个体中的CD 4+T淋巴细胞识别的有11至15个氨基酸的肽；该肽包含含有用于锚定HLA II型分子的残基的9个氨基酸的序列，有至少两个氨基酸、优选3个氨基酸位于它的末端、优选两个末端的侧翼。
-术语“被白种人群体中的主要的HLA I型分子限制的中期因子的CD8 + T表位”指的是可与至少一种白种人群体中的主要的HLA I型分子结合并且可被该群体的个体中的CD 8+T淋巴细胞识别的有8至13个氨基酸的肽；该肽包含含有用于锚定HLA I型分子的残基的8或9个氨基酸的序列。
-术语“癌症”指的是与被肿瘤细胞过表达的中期因子蛋白质相关的癌症，比如但并不限于：食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌和前列腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、恶性胶质瘤、星细胞瘤、白血病和肾胚细胞瘤。
-术语“天然或者合成的氨基酸”指的是在蛋白质中普遍发现的20个天然的α-氨基酸(A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V)，蛋白质中很少遇到的一些氨基酸(羟脯氨酸、羟赖氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸等等)，不存在于蛋白质中的氨基酸例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、氨甲酰鸟氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、环己基丙氨酸等等，由L氨基酸衍生的D氨基酸，以及上述氨基酸的类似物。
-术语“疏水性氨基酸”指的是选自下组(单字母编码)的氨基酸：A，V，L，I，P，W，F和M。
-术语“芳香族氨基酸”指的是选自下组(单字母编码)的氨基酸：F、W和Y。
根据本发明的肽可被大多数个体中的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞识别，因为它们可被白种人群体中的主要的HLA I型和HLA II型分子呈递。它们是免疫原性的，即它们能够由存在于大多数天然个体中的前体诱导对中期因子具有特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞，不然就能够在患有与中期因子过表达相关的癌症的大多数个体中刺激这种T淋巴细胞。此外，在大多数个体中被诱导的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞可识别被这些个体的肿瘤表达的中期因子。肽的免疫原性可以尤其是通过使用外周血单核细胞(PBMCs)通过本领域的技术人员已知的适当的实验，例如细胞增殖试验、细胞毒性试验、酶联免疫斑点试验(Elispot，产生细胞因子的细胞分析试验)或者分析细胞因子(IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10，IL-5，TNF-α和TGF-β)的试验而被测定。
本发明包括通过中期因子序列中一个以上氨基酸的突变(插入、缺失、替换)而获得的天然或者合成的变体肽，假定所述序列保留了对主要的HLA分子良好的亲合力并且是免疫原性的。天然变体尤其是来自于中期因子的多态现象。此外，其它变体可以容易地被构建，假如本领域的技术人员已知涉及与HLA-DR和HLA-DP4分子结合的氨基酸残基(锚定残基)以及这些残基的修饰对于其与HLA-DR和HLA-DP4分子结合的影响；尤其是PCT国际申请WO 03/040299的教导：为了结合HLA-DP4，P6上的残基应当是芳香族的或者疏水性的或者由半胱氨酸残基(C)组成，并且残基P1和P9中的至少一个是这样的：P1是芳香族的或者疏水性的，并且/或者P9是芳香族的或者疏水性的或者由C、D、Q、S、T或者E组成，而在P4上的残基可以是任何氨基酸残基。美国专利US6,649,166描述了用于确定锚定HLA-DR分子的残基(P1、P4、P6、P7和P9)的一般方法和可能改变对HLA-DR分子亲合力的这些残基突变的性质。尤其是在文献Sturnolio等人，Nat.Biotech.，1999，17，533-534和Rammensee等人，Immunogenetics，1995，41，178-228中描述了HLA-DR分子结合基序。
涉及结合HLA I型分子的氨基酸残基(锚定残基)和修饰这些残基对于与HLA-I型分子结合的影响，对于本领域的技术人员是已知的。用于该肽与I型HLA分子结合的基序被描述在文献Rammensee等人，Immunogenetics，1995，41，178-228和下文表III中。
表III：用于结合主要的HLA-A*等位基因的基序
Figure BPA00001314815500091
*主要锚定残基是粗体的。
也已知某些取代提高了肽对HLA I型分子的亲合力而没有扰乱它们的抗原性；这是个在HLA-A2结合肽的位置1上引入酪氨酸的例子(Tourdot等人，Eur.J.Immunol.，2000，30，3411-3421)。
本发明也包括通过在结合肽或者肽末端的氨基酸残基水平上引入任何修饰的来源于上述肽的被修饰的肽，如果所述被修饰的肽保留对主要的HLA分子的良好亲合力并且是免疫原性的。通过本领域的技术人员已知的常规方法引入肽中的这些修饰包括，并不限于：用非蛋白氨基酸(D氨基酸或者氨基酸类似物)取代氨基酸；在反应性功能水平上添加化学基团(脂类、低聚糖或者多糖)，尤其是侧链R；肽键(-CO-NH-)的修饰，特别是反向或者反转型(-NH-CO-)或者除了肽键外其他键的修饰；环化；肽的融合(用于疫苗接种研究的表位；用于纯化肽的标记，尤其是以可被蛋白酶切割的形式)；所述肽序列与蛋白质序列尤其是HLA I型或者HLA II型分子中的α链、HLA II型分子中的β链或所述链的胞外结构域、或者用于靶向内体的序列尤其是来源于恒链Ii或者来源于LAMP-1蛋白质的融合；与合适的分子尤其是标记比如萤光染料或者生物素偶联。这些修饰尤其是用于增加稳定性，更特别是抗蛋白水解性，以及增加溶解度或者免疫原性，或者便于纯化或者检测本发明的肽或者对所述肽特异的CD4+和/或CD8+细胞。
根据所述应用的一个优选的实施方式，所述肽由中期因子蛋白质组成。优选地，它是序列SEQ ID NO：2的人类蛋白质。
本发明包括通过本领域中任何已知的合适方法变性的中期因子蛋白质、尤其被还原的中期因子蛋白质的应用。
本发明也包括中期因子蛋白质变体的应用，其中涉及二硫键的至少一个半胱氨酸被另一个氨基酸比如丝氨酸取代。
本发明也包括来源于中期因子蛋白质的有至少8个氨基酸的肽的应用，该肽包括如上所述的至少一个CD4+T或者CD8+T表位。本发明包括可与白种人群体中最常见的HLA I型分子之一和/或HLA II型分子之一尤其是HLA-A2分子(表I)和/或HLA-DR7、HLA-DRB4、HLA-DP401或者HLA-DP402分子(表II)结合的肽的应用。本发明也包括可与几个不同的主要的HLA I型和/或HLA II型分子结合的肽的应用，以便拓宽对于大多数白种人群体的疫苗覆盖。
本发明也包括中期因子N-末端结构域(根据中期因子前体序列的第1至84位)中至少8个氨基酸的肽的应用，该肽包括如上所述的至少一个CD4+T或者CD8+T表位。
根据本发明，所述片段具有8至100个氨基酸的长度，优选8至50个氨基酸，优选10至25个氨基酸(10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或者25个氨基酸)。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，所述肽是中期因子蛋白质中至少8个氨基酸的片段，该肽包含至少一个受HLA-A2分子限制的CD8+T表位，所述肽至少包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列的第14至21或者114至122位。
优选的是，所述肽包含所述中期因子蛋白质氨基酸序列的第12至21位，第13至21位，第13至22位，第14至22位，第113至122位。
优选的是，所述肽由中期因子蛋白质的氨基酸序列的第12至21位(MDK 12-21)，第13至21位(MDK 13-21)，第13至22位(MDK 13-22)，第14至22位(MDK 14-22)，第113至122位(MDK 113-122)或者第114至122位(MDK 114-122)组成；这些肽分别对应于附后的序列表中的序列SEQ ID NO：3至8。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，所述肽是中期因子蛋白质中至少8个氨基酸的片段，该肽包含至少一个受白种人群体中主要的至少一个HLA II分子限制的CD4+T表位，所述肽包含至少所述中期因子蛋白质的氨基酸序列的第9至15位，第14至28位，第52至64位，第64至78位，第70至84位，第74至88位，第78至92位，第84至98位，第99至113位，第105至119位，第110至124位或者第119至133位。这些肽的例子是序列SEQ ID NO：9、10、13至15、21至26、28、29和30(表VII)的肽。
优选的是，所述白种人群体中的主要的HLA II型分子选自下组：HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DP40和HLA-DP402分子。所述HLA II型分子优选地分别被HLA DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501、DRB3*0101、DRB4*0104、DRB5*0101、DP*0401和DP*0402等位基因编码。
优选的是，所述肽可结合白种人群体中的至少四个不同的主要的HLA II型分子，并且包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列的第9至15位、第14至28位或者第110至124位。所述肽优选地包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列的第1至15位、第4至18位、第9至21位、第9至22位、第9至23位或者第14至28位。
优选的是，所述肽由中期因子蛋白质的氨基酸序列的第1至15位(MDK 1-15)，第4至18位(MDK 4-18)，第9至21位(MDK 9-21)，第9至22位(MDK 9-22)，第9至23位(MDK 9-23)，第14至28位(MDK14-28)或者第110至124位(MDK 110-224)组成；这些肽分别对应于附后的序列表中的序列SEQ ID NO：9至15。
根据本发明，所述肽优选地包含中期因子蛋白质的几个CD4+和/或CD8+T表位，任选地与其它CD4+T、CD 8+T或者B表位结合。表位优选地是来源于如网址：http:www/cancerimmunity.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm中所述的肿瘤抗原的CD4+T或者CD8+T表位，尤其是来源于MAGE、NY-ESO-1或者存活素的CD4+T或者CD8+T表位。
根据上述实施方式的一个优选的方案，所述肽是中期因子蛋白质的一个片段，包含至少一个受HLA-A2分子限制的CD8+T表位和至少一个受白种人群体中主要的至少四个不同的HLA II分子限制的CD4+T表位，所述肽包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列的第9至21位，第9至23位或者第110至124位。优选的，所述肽由中期因子蛋白质的氨基酸序列的第9至21位(MDK 9-21)，第9至22位(MDK 9-22)，第9至23位(MDK 9-23)或者第110至124位(MDK 110-224)组成。
这种肽优选地可以诱导CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，这两种淋巴细胞对于患有这些肿瘤的白种人群体的大多数个体中的许多肿瘤是特异性的。
不同的表位可以呈分离的肽的混合物、多表位肽、融合蛋白或者编码上述肽/蛋白质的多核苷酸的形式被包括在疫苗组合物中。所述肽/蛋白质可以被脂质体或者脂质修饰或者相连，尤其是呈脂肽的形式。优选的是，所述多核苷酸被包括在载体中，尤其是表达载体中。
在可以被并入本发明的疫苗组合物的表位中，尤其值得一提的是：
-如在美国专利6,063,900和PCT申请WO 2004/052917中所述的MAGE CD8+T表位，
-MAGE的CD4+T表位，比如受DR1限制的MAGE-A3267-282(PCT国际申请WO 02/095051)；受DR4和DR7限制的MAGE-A3149-160(Kobayashi等人，Cancer Research，2001，61，4773-4788)，受DR11限制的MAGE-A3191-205和281-295(Consogno等人，Blood，2003，101，1038-1044；Manici等人，J.Exp.Med.，1999，189，871-876)和受DR13限制的MAGE-A3121-134(美国专利US 6,716,809)；受DR15限制的MAGE-A1281-292(PCT国际申请WO 00/78806)；受DR4限制的MAGE-A6102-116，121-144，140-170，145-160，150-165和246-263(Tatsumi等人，Clinical Cancer Research，2003，9，947-954)；受DR15限制的MAGE-A1281-292(PCT国际申请WO 00/78806)；受DR4限制的MAGE-A6102-116，121-144，140-170，145-160，150-165和246-263(Tatsumi等人，Clinical Cancer Research，2003，9，947-954)和受HLA-DP4限制的MAGE表位，如在PCT国际申请WO 2007/026078中所描述的那些，
-存活素的CD8+T表位，选自：存活素96-104(LTLGEFLKL，SEQ ID NO：39)或者95-104(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO：40)，存活素-2B 80-88(AYACNTSTL，SEQID NO：41)和文献Bachinsky等人，Cancer Immun.，2005，5，6-的表I中所描述的肽，
-如在PCT国际申请WO 2007/036638中所描述的存活素的CD4+T表位，尤其是肽19-33，90-104或者93-107，
-一种天然或者合成的一般的CD4+T表位，例如破伤风毒素TT 830-846(O’Sullivan等人，J.Immunol.，1991，147，2663-2669)，流感病毒血凝素肽HA 307-319(O’Sullivan等人，如上述的)，PADRE肽(KXVAAWTLKAA，SEQ ID NO：16；Alexander等人，Immunity，1994，1，751-761)和来源于恶性疟原虫抗原的肽比如CS.T3肽(Sinigaglia等人，Nature，1988，336，778-780以及CSP、SSP2、LSA-1和EXP-1肽(Doolan等人，J.Immunol.，2000，165，1123-1137)。
-由糖组成的B表位(Alexander等人，如上所述)，所述B表位优选呈糖肽的形式，以及
-可被直接抗所述肿瘤抗原的抗体特异性地识别的中期因子的B表位。
中期因子CD4+T和/或CD8+T表位与上述至少一个表位的组合物优选地可以提高抗肿瘤免疫反应，并且尤其是可以建立长时间的免疫记忆。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，来源于中期因子的所述肽是一种包含至少两个相同的或者不同的表位多联体的多表位肽，表位中至少一个表位是中期因子CD4+T和/或CD8+T表位。多表位肽优选地包含上述的其它表位(另一种肿瘤抗原的CD4+T或者CD8+T表位)。根据本发明，不同的表位的序列通过肽键互相连接或者通过异源序列，即不同于中期因子氨基酸序列中自然存在于这个位置的序列被分开。优选地，所述多表位肽有20至1000个氨基酸的长度，优选20至100个氨基酸。
所述多表位肽优选地包含融合于它的一个末端的标记物，用于纯化或者检测所述片段。该标记物，尤其是多聚组氨酸序列或者抗原的B表位，优选通过蛋白酶的切割位点与多表位序列分开，以便将多表位序列从融合体中分离出来。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，来源于中期因子的所述肽是如上所述的一种包含多表位片段或者肽的脂肽。
所述脂肽尤其是通过添加脂类至所述多表位片段或者至肽的氨基酸的侧链的α氨基官能团或者反应性的官能团而获得的；它可以包含一种以上来源于C4-20脂肪酸的链，该脂肪酸可以是任选的支链或者不饱和的脂肪酸(棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、2-氨基十六酸、匹美劳肽、三美肽(trimexautide))或者类固醇衍生物。优选的脂类部分尤其被表示为Nα-乙酰赖氨酸Nε(棕榈酰)基团，也称作Ac-K(Pam)。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，来源于中期因子的所述肽可与异源蛋白质或者蛋白质片段融合(融合蛋白质)。
多表位片段或者肽可以与所述蛋白质的NH2端或者COOH端融合，或者被插入至所述蛋白质的序列中。根据所述融合蛋白质的一个优选的实施方式，它由上述的肽组成，该肽与一种用于靶向内体的序列相融合，该序列优选来源于人类恒链Ii或者来源于LAMP-1蛋白质。用于靶向内体的序列和它们将抗原靶向内体的应用尤其是被描述在Sanderson等人(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，1995，92，7217-7222)，Wu等人(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，1995，92，11671-11675)和Thompson等人(J.Virol.，1998，72，2246-2252)中。
根据所述融合蛋白质的一个优选的方案，它由上述的肽组成，该肽与HLA分子的链之一、优选HLA II型分子的β链或者HLA I型分子的α链相融合，或者与其对应于可溶性HLA分子的片段、尤其是对应于前部是同源信号肽或者异源的信号肽的胞外结构域片段相融合。所述肽优选插在信号肽和α或者β链的胞外域的NH2端之间，如同对于HLA-DR分子所描述的那样(Kolzin等人，PNAS，2000，97，291-296)。
可供选择地，所述多表位片段或者肽与本领域技术人员已知的有利于其纯化或者检测的蛋白质比如尤其是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和荧光蛋白质(GFP和衍生物)相融合。在该情况下，通过蛋白酶的切割位点，多表位片段或者所关注的肽序列优选地与该蛋白质的其余部分分开，以便易于所述多表位片段或者肽的纯化。
根据所述应用的另一个优选的实施方式，所述多核苷酸编码上述的肽、多表位片段或者融合蛋白质。
根据本发明，所述多核苷酸序列是编码所述多表位片段或者肽或者所述融合蛋白质的cDNA的序列。所述序列可以优选地被修饰得使得密码子的使用在表达所述序列的寄主中是最优的。此外，所述多核苷酸可以被连接至至少一个异源序列。
为本发明的目的，术语“相对于编码中期因子的核酸序列的异源序列”指的是除了那些天然地与编码所述中期因子肽的所述核酸紧接相连的那些核酸之外的任何核酸序列。
优选地，所述多核苷酸被插入载体中。
为本发明的目的，术语“载体”指的是能够将与它结合的另一个核酸转运的核酸分子。可被用于本发明的载体类型包括并不限于，由染色体核酸、非染色体合成核酸或者半合成核酸组成的线形的或者环形的DNA或者RNA分子，比如尤其是病毒载体、质粒载体或者RNA载体。
其内插入所关注的核酸分子以便将该核酸分子引入或者维持在真核的或者原核的寄主细胞中的许多载体本身是已知的：适当载体的选择取决于想用这个载体的用途(比如所关注序列的复制、该序列的表达、以染色体外的形式维持该序列，或者合并入寄主的染色体物质中)，以及取决于寄主细胞的种类。比如，可能使用所关注的序列预先被插入其内的裸核酸(DNA或者RNA)或者病毒载体例如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒属和腺病毒相关病毒；也可能将(被分离的或者被插入质粒载体的)所述序列与一种能使它穿过寄主细胞膜的物质相结合，该物质比如是转运蛋白如纳米转运蛋白或者脂质体、阳离子聚合物制品，或者使用物理方法例如电穿孔法或者微量注射法将其引入所述寄主细胞。此外，这些方法可以优选地被结合，比如使用电穿孔法结合脂质体。
优选地，所述载体包含所有用于上述肽或者蛋白质表达的必需元件。比如，所述载体包含表达盒，该表达盒包括受适当序列控制的上述至少一个多核苷酸，该控制序列用于调节转录和任选的翻译(启动子、增强子、内含子、起始密码子(ATG)、终止密码子、聚腺苷酸化信号、剪接位点)。
根据本发明的疫苗组合物优选包含药学上可接受的媒介物、载体物质和/或佐剂。
药学上可接受的媒介物、载体物质和佐剂是常规被使用的那些。
佐剂优选地选自下组：油状的乳状液、矿物质、细菌提取物、包含CpGs的寡核苷酸、皂苷、氢氧化铝、单磷酰脂类A和鲨烯。
载体物质优选地选自下组：单层脂质体或者多层脂质体、ISCOM、病毒颗粒、类病毒粒子、皂苷胶束、本质是糖类(聚(丙交酯-乙交酯)或者含金固体的微球体、以及纳米微粒。
如上所述，疫苗组合物包含有效剂量的肽/蛋白质/脂肽/载体，其有可能在与中期因子过表达的肿瘤相关的癌症上获得预防/治疗效果。可根据某些因素例如年龄、性别和个体重量来确定和调整该剂量。疫苗组合物通常根据通常的疫苗接种流程、在一定的剂量下、在足以能够诱导直接抗中期因子蛋白质的细胞反应的时期内被给药。给药可以通过皮下的、肌肉内的、静脉的、皮内的、腹腔内的、口服的、舌下的、直肠的、阴道的、鼻内的、通过吸入或者通过经皮的施用方式被给药。
组合物呈适用于被选给药方式的盖仑制剂形式：可注射的无菌溶液、粉末、片剂、凝胶胶囊、悬浮液、糖浆、栓剂，可以根据标准流程而制备。
根据所述组合物的一个优选的实施方式，它包含上述中期因子的至少一个CD4+T表位和一个CD8+T表位，呈肽混合物、多表位片段和/或编码所述肽或者所述片段的表达载体的形式。
根据所述组合物的该实施方式中的一个优选方案，它至少包含MDK 9-21、MDK 9-22、MDK 9-23或者MDK 110-124肽。
优选的，将MDK 9-21、MDK 9-22或者MDK 9-23肽与MDK 74-88或者78-92肽相结合、与MDK 14-28或者99-113肽相结合、以及与MDK 4-18肽相结合。
这种可结合HLA-A2分子和所有HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DP401和HLA-DP402(表VII)分子的肽组合物优选地可以在所有的被接种个体中诱导CD4+T和CD8+T淋巴细胞。
根据所述组合物的另一个优选的实施方式，它包含如上所述含有普通CD4+T表位的肽和/或另一个肿瘤抗原的CD4+T和/或CD8+T表位。
根据本发明的肽和衍生产物(多表位肽、融合蛋白质、脂肽、重组体载体)可在过表达中期因子的肿瘤治疗中被用于免疫疗法。所述肽或者衍生产物可或者用于疫苗，或者用于细胞治疗，或者另外通过两种方法的组合被使用。
细胞疗法包括通过常规的流程制备抗原呈递细胞(树状细胞)，包括从待治疗的病人中分离外周血单核细胞(PBMC)并且在肽存在的情况下培养树状细胞。在第二个步骤中，加载了肽的抗原呈递细胞被再次注射入病人中。
本发明的目的还在于提供一种疫苗组合物，其特征在于，它包含上述至少一个来源于中期因子的肽片段、多表位肽、融合蛋白质、脂肽或者载体，和一种药学上可接受的媒介物、载体物质或者佐剂。
本发明的目的还在于提供一种预防性或者治疗性的抗肿瘤疫苗接种方法，其特征在于，它包括通过上述任何合适的方法将上述疫苗组合物给药至个体。
本发明的目的还在于提供上述至少一种肽在制备用于免疫监控针对中期因子的细胞反应的试剂中的应用，准备用于评估预后或者监控癌症的治疗(外科手术、放疗、化疗、免疫疗法)。优选地，所述试剂包含上述肽或者融合蛋白质，该肽或融合蛋白质比如被标记并且/或者呈多聚体HLA/肽复合物的形式如被标记的四聚体HLA/肽复合物而与HLA分子复合。
本发明的目的还在于提供一种体外方法用于免疫监控在患有癌症的个体中针对中期因子的细胞反应，其特征在于，它包括：
-使来自于所述个体的生物样品与上述的肽相接触，和
-通过任何适当方法检测中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞。
根据本发明的方法可以在癌症过程或者抗肿瘤治疗过程中，尤其是抗肿瘤免疫疗法中，监控直接针对中期因子的CD4+T和/或CD8+T反应的变化；中期因子特异性的CD4+T淋巴细胞可以是TH 1型(分泌IFN-γ)、TH 2型(分泌IL-4)或者调节因子T型(分泌IL-10或者TGF-β)；预期TH1型T反应是癌症顺利发展的信号，反之调控性T反应是癌症发展不顺利的信号。通过使用包含CD4+T和/或CD8+T细胞的生物样品，尤其是从周围血液样品中分离出的单核细胞样品(PBMC)，可进行该检测。
通过任何本身已知的方法，可检测中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+淋巴细胞。比如，使用的方法可以包括直接的方法比如上述的在多聚体复合物存在时的流式细胞术，或者间接的方法比如淋巴细胞增殖试验、细胞毒性试验和用于细胞因子如IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的试验，尤其是通过免疫酶技术(ELISA、RIA、酶联免疫斑点(ELISPOT))或者通过流式细胞术(胞内细胞因子的试验)。
更具体地说：
细胞(PBMC、缺乏CD4+或者CD8+细胞的PBMC、利用上述肽通过体外培养步骤预富集的T淋巴细胞、或者克隆的T淋巴细胞)悬浮液被放置得与所述肽相接触，根据需要，也可以与合适的呈递细胞如树状细胞、自身的或者异源的PBMC、淋巴样干细胞如被EBV病毒感染后获得的那些细胞、或者基因修饰细胞相接触。根据下列方法之一，通过肽检测初始悬浮液中的中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+T细胞的存在：
*增殖试验：
通过将被滴定的胸腺嘧啶插入细胞的DNA中，测定中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+T细胞的增殖。
*酶联免疫斑点试验：
酶联免疫斑点试验可以显示分泌细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β)的、且对于上述肽有特异性的T细胞的存在。在文献Czerkinsky等人，J.Immunol.Methods，1983，65，109-121和Schmittel等人，J.Immunol.Methods，1997，210，167-174中描述了该试验的原理，以及在国际申请WO 99/51630或者Gahéry-Ségard等人，J.Virol.，2000，74，1694-1703中举例说明了它的实施。
*检测细胞因子：
或者通过酶免疫测定，尤其是使用商品试剂盒检测存在于培养物上清液中的细胞因子，或者通过流式细胞术检测胞内细胞因子，来检测分泌细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β)的中期因子特异性的T细胞的存在。在文献Goulder等人，J.Exp.Med.，2000，192，1819-1832和Maecker等人，J.Immunol.Methods，2001，255，27-40中描述了检测胞内细胞因子的原理，以及在Draenert等人，J.Immunol.Methods，2003，275，19-29中举例说明它的实施。
*多聚体复合物：
-一种生物样品，优选外周血单核细胞(PBMC)，与被标记的多聚体复合物尤其是用荧色物标记的多聚体复合物相接触，该多聚体复合物是通过可溶性HLA分子与上述肽结合形成的，并且
-分析用所述多聚体复合物标记的细胞，尤其是通过流式细胞术进行分析。
优选地，在生物样品与所述复合物相接触之前，通过将它与抗CD4或者抗CD8抗体相接触，其在CD4+T和/或CD 8+T细胞中被富集。
HLA-肽多聚体复合物可以由从表达HLA I型和/或HLA II型分子的细胞中提取的天然分子、或者从合适的寄主细胞中产生的重组体分子制备而来，如Novak等人(J.Clin.Investig.，1999，104，R63-R67)或者Kuroda等人(J.Virol.，2000，74，18，8751-8756)所述。尤其是这些HLA分子可以被截断(缺失跨膜结构域)，并且它们的序列可以被修饰以致于它们可溶或者易于α和β链的配对(Novak等人，参见上述)。
用肽加载HLA分子可以通过将上述HLA分子制品与肽相接触来进行。比如，在包含0.15mM NaCl的10mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，pH在4.5和7之间，生物素化的可溶性HLA分子与上述10倍过量的肽在37℃下一起温育72小时。
可选择地，肽的序列可以被引入HLA分子的链中呈融合蛋白质的形式，该融合蛋白允许由表达所述融合蛋白质的合适寄主细胞中制备HLA/肽多聚体复合物。然后所述复合物可以被标记，特别是被生物素标记。
尤其是，四聚体型多聚体复合物是通过将被萤光染料标记的链亲和素以少于相对于HLA分子四倍的量(摩尔比摩尔)添加至被加载的HLA分子上而获得的，然后整个混合物被温育足够的时间，比如在室温下过夜。
多聚体复合物也可以或者通过将HLA-肽与连接至链亲和素的磁珠经温育形成，如用于HLA-I型分子(Bodinier等人，Nature，2000，6，707-710)所描述的；或者通过将HLA-肽单体插入脂小泡中而形成，如用于鼠MHC II型分子所描述的(Prakken，NatureMedicine，2000，6，1406-1410)。
为了使用这些HLA-肽多聚体复合物，尤其是四聚体类型，将细胞(PBMC、缺乏CD4+和/或CD8+细胞的PBMC、利用上述肽通过体外培养步骤预富集的T淋巴细胞或者克隆的T淋巴细胞)悬浮液与HLA-肽多聚体复合物在合适的浓度(如10至20μg/ml左右)下相接触足够的一段时间(如1至3个小时左右)，以足以允许复合物和中期因子特异性的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞之间相结合。洗涤后，通过流式细胞术分析悬浮液：通过荧光性的多聚体复合物目测细胞的标记。流式细胞术可以将用HLA-肽多聚体复合物标记的细胞与未标记的细胞分开，从而施行细胞分选。
本发明的目的还在于提供含有至少一种上述肽的免疫监控试剂。优选地，所述试剂被包括在试剂盒中。所述免疫监控试剂优选包含上述的肽或者融合蛋白质，该肽或者融合蛋白质任选地被标记或者被复合，尤其是与被标记的如被生物素化的HLA分子复合，呈HLA-肽多聚体复合物的形式，如被标记的四聚体HLA-肽复合物。
因此本发明的目的还在于提供一种方法用于分析中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞，其特征在于，它包含至少下列步骤：
-在体外将细胞样品与被标记的HLA-肽多聚体复合物、尤其是被荧光染料标记的复合物相接触，所述复合物是通过可溶性HLA分子与上述至少一种肽相结合而形成的，以及
-分析结合于所述HLA-肽复合物的细胞，尤其是通过流式细胞术进行分析。
根据所述方法的一个优选的实施方式，细胞(CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞)的分析包含分选所述细胞。
本发明的一个目的还在于提供如上所述的来源于中期因子的肽片段、多表位肽、融合蛋白质或者脂肽。
本发明的目的还在于提供来源于上述肽/蛋白质的多核苷酸、表达盒、重组体载体或者被修饰的原核的或者真核的寄主细胞。
尤其是本发明包括：
a)表达盒，其包括上述的至少一个多核苷酸，受用于转录和任选的翻译的适当调节序列(启动子、增强子、内含子、起始密码子(ATG)、终止密码子、聚腺苷酸化信号)的控制，和
b)根据本发明包含多核苷酸的重组载体。优选地，这些载体是包含上述的至少一个表达盒的表达载体。
上述的多核苷酸、重组体载体和转化细胞尤其是用于生产本发明的肽、多表位片段和融合蛋白质。
根据本发明的多核苷酸是通过本身已知的常规方法制备而来的，根据标准的流程比如在《现代分子生物学实验技术》(Current Protocols in Molecular Biology)(Frederick M.Ausubel，2000，Wiley and Son Inc.，Library of Congress，美国)中所描述的方案。比如，它们可以通过PCR或者RT-PCR扩增核酸序列、通过与同源探针杂交来筛选基因组DNA文库，或者通过完全的或者部分的化学合成来制备。通过本身已知的常规的重组DNA和基因工程方法构建重组体载体，并将其引入寄主细胞。
通过本领域技术人员已知的常规方法，尤其是通过固相或者液相合成，或者通过在适当的(真核的或者原核的)细胞系统中的重组DNA的表达，制备上述的肽和它们的衍生物(变体、修饰的肽、脂肽、多表位片段、融合蛋白质)。
更具体地说：
-肽和它们的衍生物(变体、多表位肽)可以根据Merrifield等人(J.Am.Chem.Soc.，1965，85：2149-)最初描述的Fmoc技术被固相合成，并且通过反相高压液相色谱进行纯化。
-尤其是可以根据国际申请WO 99/40113或者WO 99/51630描述的方法制备脂肽。
-肽和衍生物例如变体、多表位片段和融合蛋白质还可以通过本领域的技术人员已知的任何方法由相应的cDNA生产出来；cDNA被克隆进入真核的或者原核的表达载体，并且在用重组体载体修饰的细胞中所产生的蛋白质或者片段可以通过任何适当的方法、尤其是通过亲和层析进行纯化。
附图说明
除了上述方案外，本发明也包括其他方案，将出现在下文的描述中，即本发明主题的实施例中。关于附图，其中：
-图1是人类中期因子(SEQ ID NO：2)的肽序列。全序列对应于前体。信号肽用黑体标明并且在下面被划线；
-图2显示了针对中期因子肽被诱导的CD8+T淋巴细胞的肽特异性。T淋巴细胞系(267.29A、278.11A、314.28)是通过刺激来自三个表达HLA-A2的健康个体(267、278、314)的T淋巴细胞而获得的。在四个星期的培养后，通过IFN-γ酶联免疫斑点法检测它们的特异性；
-图3显示了中期因子肽特异性的CD8+T淋巴细胞的HLA-A2限制。使用C1R细胞和C1R-A2细胞(用HLA-A2转染的C1R细胞)通过IFN-γ酶联免疫斑点来评估限制；
-图4显示了中期因子肽特异性的CD8+T淋巴细胞对于用中期因子表达质粒转染的细胞的识别。用含编码中期因子序列的重组质粒pcDNA3.1(pMDK)转染C1R-A2细胞。通过IFN-γ酶联免疫斑点，评估pMDK转染的C1R-A2细胞或者非转染细胞对CD8+T淋巴细胞的活化；
-图5显示了肿瘤细胞中的中期因子表达。使用抗中期因子抗体，通过流式细胞术评估C1R-A2、DLD-1和Hep G2细胞中的中期因子表达。灰色表面：阴性对照。在黑线下的区域：中期因子的天然表达。黑色表面：细胞用表达中期因子的质粒转染之后的中期因子表达；
-图6显示了中期因子肽特异性的CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞系的识别；使用HLA-A2+C1R-A2(MDK-)、DLD-1(MDK-)和Hep G2(MDK+)细胞，通过IFN-γ酶联免疫斑点检测对肿瘤的识别。用星号标记的细胞在IFN-γ存在的条件下被培养；
-图7显示了通过用特定的四聚体标记来检测中期因子特异性的CD8+淋巴细胞。T淋巴细胞系314.7(A和C)和314.28(B和D)分别对于MDK 114-122和MDK 13-21是特异性的。每个细胞系都通过抗CD8抗体和HLA-A2/MDK 114-112(A和B)和HLA-A2/MDK 13-21(C和D)四聚体进行标记，并且通过流式细胞术进行分析。每个细胞群的百分比被标明在每个象限中；
-图8显示了中期因子肽9-23特异性的CD4+T淋巴细胞的HLA-II限制。使用用HLA II分子(HLA-DR7、-DR11、-DR15、-DRB5)转染并用加载肽9-23的L细胞，通过IFN-γ酶联免疫斑点法评估限制性；
-图9显示了中期因子肽9-23特异性的CD4+T淋巴细胞中的331.24T-细胞系识别肿瘤裂解物的演示。使用HeLa(MDK-)、HeLa-pMDK(MDK+)和HepG2(MDK+)细胞，通过IFN-γ酶联免疫斑点法检测肿瘤识别。
具体实施方式
实施例1：对于中期因子蛋白质肽特异性的CD8+T反应的诱导
材料与方法
a)肽
7种肽代表有潜力的被HLA-A2分子限制的CD8+T表位，是在白种人群体中最具广泛代表性的I型HLA等位基因，它们通过使用BIMAS程序(http://www- bimas.cit.nih.gov)被选出来。被选择的肽的序列显示在表IV和附后的序列表中。
表IV：被选择的肽的列表
  肽   序列   SEQ IDNO：
  MDK13-21   ALLALTSAV   4
  MDK12-21   LALLALTSAV   3
  MDK14-22   LLALTSAVA   6
  MDK13-22   ALLALTSAVA   5
  MDK114-122   AQCQETIRV   8
  MDK113-122   NAQCQETIRV   7
  MDK 63-72   AQTQRIRCRV   17
根据Fmoc策略在固相平行合成中合成这些肽，通过HPLC纯化肽并且通过质谱分析(ES-MS)来验证。
b)获得中期因子肽特异性的受HLA-A2限制的CD8 + T淋巴细胞系
具有HLA-A2分子的健康个体的外周血单核细胞(PBMC)通过Ficoll梯度被分离出来。然后在AIM V培养基(生命科技公司)中培养PBMC，并在37C下在5％CO2/95％空气下温育过夜。CD8+T淋巴细胞通过免疫磁珠分选从非贴壁细胞中纯化出来，然后被冷冻。贴壁细胞通过在AIM V培养基(包含1000U/ml GM-CSF与1000U/ml IL-4)中培养5天而被分化成未成熟的树突细胞，然后通过在1μg/ml LPS、1000U/ml IL-4与1000U/ml GM-CSF存在的条件下被培养2天成为成熟的树突细胞。成熟的树突细胞在5μg/ml β-2-微球蛋白和10μg/ml表IV中每种肽存在的条件下温育。4个小时后，细胞被洗涤，然后被放在96孔板的培养基中，在IMDM培养基(包含10％的AB组人血清、IL-6(1000U/ml)和IL-12(5ng/ml))中有提纯后的CD8T淋巴细胞存在的条件下培养。每周，在包含20U/ml的IL-2和10ng/ml的IL-7的培养基中，用加载了上述肽混合物的自体成熟树突细胞再刺激培养物。培养4周后，通过IFN-γ酶联免疫斑点法检测包含在每个孔中的T细胞系的特异性。
c)中期因子蛋白质呈递至中期因子肽特异性的CD8 + T淋巴细胞
该肽特异性的CD8+T淋巴细胞系在有用重组质粒pcDNA3.1(Invitrogen)转染的C1R-A2细胞存在的情况下被培养，该质粒包含受CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号控制的中期因子编码序列。通过下述酶联免疫斑点法评估CD8+T淋巴细胞被这些受转染的C1R-A2细胞的活化情况。
d)中期因子肽特异性的CD8 + T淋巴细胞对肿瘤细胞的识别
该肽特异性的CD8+T淋巴细胞系在有下述不同肿瘤系存在的条件下进行培养：DLD-1(
Figure BPA00001314815500231
#CCL-221)和Hep G2(
Figure BPA00001314815500232
#HB-8065)。这些肿瘤细胞对CD8+T淋巴细胞的活化通过下述酶联免疫斑点法予以评估。
e)酶联免疫斑点法
在PBS缓冲液中被稀释至2.5μg/ml的抗IFN-γ抗体(1-D1K，Mabtech)在37℃下被吸附至硝酸纤维素板上(Millipore)一个小时。这些板然后用PBS洗涤，然后在37℃下用包含10％的AB组人血清(100μg/孔)的Iscove培养基饱和2小时。
抗原呈递细胞或者是类淋巴母细胞B细胞系C1R(Hogan等人，J.Immunol.，1988，141，2519-2525)，该细胞缺少HLA-A与HLA-B分子并被编码HLA-A2(C1R-A2)的cDNA转染，并且加载了单个肽(10μg的肽)或肽混合物(10μg的每一种肽)；或者是被中期因子表达质粒转染的C1R-A2细胞；或者是别的表达中期因子的肿瘤细胞。
为了验证细胞系对于HLA-A2分子的特异性，用HLA-A2转染的C1R细胞(30000个细胞/孔)与5000试验淋巴细胞然后被加在板上，并在有或没有单个肽(10μg的肽)或者有或没有肽混合物(10μg的每一种肽)存在的情况下在37℃下温育24小时。在0.001to 10μg/ml的不同浓度范围内的肽被用于剂量反应分析。
为了分析肽特异性的CD8+T淋巴细胞识别表达HLA-A2且被中期因子转染的细胞，将被HLA-A2与中期因子表达质粒转染的C1R细胞(30000个细胞/孔)和5000个试验淋巴细胞加在板上，并在37℃下温育24小时。
为了分析肽特异性的CD8+T淋巴细胞识别表达中期因子的肿瘤细胞，肿瘤细胞(30000个细胞/孔)与5000个试验淋巴细胞被加在板上，并在37℃下温育24小时。
用水、PBS缓冲液/0.05％吐温和PBS的3轮依次单独洗涤后，在包含1％BSA的PBS中稀释至0.25μg/ml的100μl生物素化抗IFN-γ二级抗体(7-B6-1-biotin，Mabtech)被加入到每个孔中。在室温温育1小时后，板再次被洗涤，然后在室温下与被稀释至1/6000的100μg/孔的Extravidin-AKP(E-2636，Sigma)一起温育一小时。板在PBS缓冲液中洗涤后，在水中(10ml水1片)稀释的100μl的NBT/BCIP底物(B-5655，Sigma)被分配至每个小孔中。免疫酶的显现通过在水中彻底地洗涤板子大约10分钟后中止。在板子干燥后，显色斑通过使用自动阅读器(AID)计数。当斑点的数目多于阴性对照(无肽对照)获得的至少50个斑点的3倍时，细胞系视为是阳性的。没有呈递细胞的对照可以验证对HLA-A2的反应特异性(限制性对照)。
2)结果
评估了中期因子蛋白质诱导肿瘤细胞特异性的细胞免疫能力。为了做这些，受HLA-A2分子--即在白种人群中最常见的HLA I型分子限制的CD8+T表位首先在中期因子序列中被识别出来。接下来，分析由这些表位诱导的CD8+T细胞选择性地识别表达中期因子的肿瘤细胞系的能力。
通过使用从具有HLA-A2分子的健康个体中收集的细胞，检验合成的肽诱导体外反应的能力。六种肽诱导了CD8+T淋巴细胞：MDK 13-21，MDK 13-22，MDK 12-21，MDK 14-22，MDK 113-122和MDK 114-122。正如图2所示，CD8+T淋巴细胞系267.29A对于肽12-21、13-21与13-22是特异性的。278.11A细胞系对于肽13-21、13-22和14-22是特异性的。314.28细胞系对于肽114-122是特异性的，并且在较小程度上对肽113-122是特异性的。因此肽12-21、13-21、13-22、14-22、113-122和114-122是免疫原性的，并且可诱导健康的HLA-A2+供体中的CD8+T淋巴细胞。
肽特异性的CD8+T淋巴细胞系的HLA-A2限制在图3中显示。仅有HLA-A2(C1R-A2)细胞可以呈递肽至特异性的T淋巴细胞系。C1R(HLA-A2-)细胞甚至在肽存在的情况下也没有刺激这些T淋巴细胞系。
为了验证呈递细胞能够正确地加工中期因子，C1R-A2细胞被用包含中期因子编码序列的重组质粒pcDNA3.1转染。图4显示，CD8+T淋巴细胞系278.11A(对肽13-22和14-22特异)，297.58(对肽12-21，13-21，14-22特异)和314.48(对肽114-122特异)可被转染后的细胞和加载了肽的C1R-A2细胞、而不是未转染细胞所活化。
还研究了对中期因子肽特异的CD8+T淋巴细胞识别表达或不表达中期因子的肿瘤细胞系。图6显示了不同细胞系表达或不表达中期因子。在图7中，观察到CD8+T淋巴细胞系267.29A(对肽13-22、12-22和13-21特异)、278.11A(对肽13-22和14-22特异)和314.48(对肽114-122特异)可识别天然表达中期因子的Hep G2细胞，而不识别不表达中期因子的C1R-A2和DLD-1细胞。当Hep G2在IFN-γ存在的条件下培养时，该识别由于细胞上提高的HLA分子表达而稍微好一些。细胞系297.58(对肽12-21、13-21和14-22特异)只识别Hep G2细胞，当它们在IFN-γ存在的条件下培养时。
所有这些结果显示，中期因子包含6种肽，可以分为2组相重叠的肽，这些肽能诱导受HLA-A2限制的CD8+T淋巴细胞的活化，该淋巴细胞可选择性地识别可表达中期因子的肿瘤细胞。
实施例2：通过用特异性的四聚体进行标记来检测对中期因子肽特异的CD8+T淋巴细胞
在实施例1中获取的每一个淋巴细胞系(500000个细胞)在黑暗中4℃下，用200μl PBS/2％FCS中的50μg/ml的四聚体做标记。这些四聚体是加载肽13-21或114-122负的生物素化的HLA-A2分子，并且与藻红蛋白标记的链霉亲和素复合，并根据Novak等人(J.Clin.Investig.，1999，104，R63-R67)或Kuroda等人(J.Virol.，2000，74，18，8751-8756)中描述的技术制备。然后在PBS中将细胞洗涤2次，后使用FITC抗CD8抗体(BD Biosciences)在4℃下标记30分钟。在PBS中洗涤后，细胞用含1％多聚甲醛(PAF)的50μl的PBS固定。这些标记在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上被分析。结果显示在图7中。
实施例3：诱导对中期因子蛋白质的肽特异的CD4+T反应
1)材料和方法
a)肽
覆盖人类中期因子(SwissProt P21741，SEQ ID NO：2和图1)全部序列的15个氨基酸(15-mers)的肽，根据在位点3或4上芳香族或疏水性残基的存在被选出来，用于在HLA-DR和HLA-DP4分子的P1袋中锚定。
选择出来的肽序列显示在表V和附后的序列表中。
根据Fmoc策略在固相平行合成中合成肽，通过HPLC纯化肽，通过质谱分析(ES-MS)验证。
表V：被选择的肽(SEQ ID NO：9，10，13-15和18-30)
Figure BPA00001314815500251
Figure BPA00001314815500261
*参照含143个氨基酸的人类中期因子前体的序列(SwissProt P21741，图1和SEQIDNO：2)来编号位置。
b)HLA II/肽结合性试验
结合HLA II型分子的试验，是使用免疫酶显示的竞争性结合试验，如美国专利US6,649,166和PCT国际申请WO 03/040299描述的那样，分别用于HLA-DR和HLA-DP4分子。美国专利US 6,649,166和PCT国际申请WO 02/090382、WO 03/040299、WO2004/014936阐述了这些用于测定源自于不同抗原的肽的结合活性试验的实施方案。
更具体地说，肽：HA 306-318(PKYVKQNTLKLAT，SEQ ID NO：31)、A3152-166(EAEQLRAYLDGTGVE，SEQ ID NO：32)、MT 2-16(AKTIAYDEEARRGLE，SEQ ID NO：33)、B121-36(TERVRLVTRHIYNREE，SEQ ID NO：34)、YKL(AAYAAAKAAALAA  ，SEQ  ID  NO：35)、LOL  191-210(ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT，SEQ  ID  NO：36)、Oxy  271-287(EKKYFAATQFEPLAARL，SEQ ID NO：37)和E2/E168(AGDLLAIETDKATI SEQ IDNO：38)，根据在Texier等人，J.Immunol.，2000，164，3177-3184中所描述的方案，在NH2端的残基被生物素化，在下表所述的条件下被用做示踪物。
表VI：用于结合HLA II分子的试验条件
Figure BPA00001314815500271
每个试验的灵敏度通过用对应于示踪剂的非生物素化肽观察的IC50值反映出来。对于每个肽，计算抑制生物素化示踪物肽的50％最大结合性的竞争肽的浓度(nM)(IC50)。结果以相对活性的形式(竞争肽的IC50与参考肽(对应于示踪剂的非生物素化肽)的IC50的比值)表示。相对活性小于100可表征活性肽。
c)获得对中期因子肽特异并受主要HLA II分子限制的CD4 + T淋巴细胞系
通过使用Olerup SSPTM HLA-DPB1和HLA-DRB1试剂盒，在Ficoll梯度上分离健康个体的外周血单核细胞(PBMC)，其中健康个体的HLA-DR与HLA-DP基因型事先被SSP确定。然后PBMC在AIM V培养基(生命科技公司)中培养并在烧瓶、在培养箱中在37℃下和在5％二氧化碳/95％空气存在的条件下进行温育。经过整晚的温育，回收未贴壁细胞，然后CD4+T淋巴细胞通过使用连接至磁珠(Miltenyi Biotec试剂盒)的抗CD4抗体而被纯化与冷冻。贴壁细胞在含1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4的AIM V培养基中温育5天，然后已经分化为树突细胞(未成熟树突细胞)的细胞随后在1μg/ml的LPS、1000U/ml的IL-4与1000U/ml的GM-CSF存在的条件下培养2天，以便诱导其成熟。
成熟的树突细胞(100000个细胞/孔)与肽混合物(在添加了谷氨酸盐(24mM，Sigma)、天冬酰胺(55mM，Sigma)、精氨酸(150mM，Sigma)、青霉素(500IU/ml，Invitrogen)、链霉素(50mg/ml，Invitrogen)和10％人血清的IMDN培养基(Invitrogen)中的每种肽10μg)一起在37℃下温育4个小时。成熟的树突细胞随后被洗涤，并在提前解冻的CD4+T淋巴细胞(100000个细胞/孔)存在的情况下，在含1000U/ml的IL-6和10ng/ml的IL-12的培养基中进行温育。7天(D7)后，在含IL-2(10U/ml)和IL-7(5mg/ml)的培养基中，通过成熟的树突细胞培养物第一次刺激培养物，该成熟的树突细胞之前被解冻并加载了覆盖全部中期因子序列的肽的两种混合物(肽MDK1至MDK9的混合物，以及肽MDK 1至MDK 18的混合物)。在另外3次通过用加载的树突细胞进行刺激(D14，D1，D28)后，在最后刺激至少6天后，在仅包含IL-7(5ng/ml)的培养基中，细胞通过酶联免疫斑点进行试验。
d)酶联免疫斑点法
在PBS缓冲液中被稀释至2.5μg/ml的抗IFN-γ抗体(1-D1K，Mabtech)，在37℃下被吸附至硝酸纤维素板(Millipore)上1小时。这些板然后用PBS洗涤，并在37℃下用含10％的AB组人血清的Iscove培养基(100μg/孔)饱和2个小时。抗原呈递细胞或者是上述制备的未成熟自体树突细胞，或者是用编码待被检测的HLA-DR或HLA-DP4分子之一的cDNA(Yu et al.，Hum.Immunol.，1990，27，132-135)转染的小鼠成纤维细胞系(L系)，以便验证细胞系对于HLA-DR和HLA-DP4分子的特异性。树突细胞(105个细胞/孔)或被HLA-DR或HLA-DP4分子之一(30000个细胞/孔)转染的L细胞和5000个试验淋巴细胞被加至板上，并在有或没有单个肽(10μg)或者有或没有肽混合物(每一种肽10μg)存在的情况下在37℃下温育24小时。随后用水、PBS缓冲液/0.05％吐温和仅有PBS依次3次洗涤后，在含1％BSA的PBS中稀释至0.25μg/ml的100μl的生物素化的抗IFN-γ二级抗体(7-B6-1-生物素，Mabtech)被加入到每个孔中。在1个小时的温育后，板再次被洗涤，然后与被稀释至1/6000的100μg/孔的Extravidin-AKP(E-2636，Sigma)一起温育。板在PBS缓冲液中洗涤后，将在水中(10ml水1片)被稀释的100μl的NBT/BCIP底物(B-5655，Sigma)分配在每个孔中。免疫酶的显示通过板在水中彻底清洗大约10分钟后停止。显色斑通过使用自动阅读器(AID)计数。当斑点的数目多于阴性对照(无肽对照)获得的至少50个斑点的3倍时，细胞系被认为是阳性的。没有呈递细胞的对照可以验证对HLA-DR或HLA-DP4(限制性对照)的反应特异性。
e)中期因子肽特异性的CD4 + T淋巴细胞对肿瘤细胞的识别
被检测的肿瘤细胞系是表达中期因子的Hep G2细胞系、不表达中期因子的HeLa肿瘤细胞系、和对应于用如实施例1中所述中期因子表达质粒瞬时转染的HeLa细胞的HeLa-pMDK细胞系。被收集的细胞通过冰冻/融化循环的方法被裂解。对中期因子肽9-23特异的CD4+T淋巴细胞的331.24细胞系，在被预先加载肿瘤细胞系裂解产物的树突细胞存在的情况下被温育，并且331.24细胞系的活化根据上述的酶联免疫斑点方法被评估。
2)结果
a)中期因子肽对于HLA II型分子的结合活性
用于结合II型HLA分子的大部分位点位于中期因子即信号肽(1-22；表VII)的N-末端部分。
表VII：中期因子肽与12种主要的HLA II型分子的相对结合*活性
  肽   DR1   DR3   DR4   DR7   DR11   DR13   DR15   DRB3   DRB4   DRB5   DP401   DP402   总计
  MDK1-15   21   ＞419   226   49   7   ＞2537   211   267   204   161   20   19   5
  MDK4-18   21   ＞419   136   20   94   ＞2537   19   37   65   46   6   18   9
  MDK9-23   0,2   ＞419   1   13   0,3   ＞2537   5   ＞485   ＞28868   2   94   29   8
  MDK14-28   34   ＞419   401   590   48   45   ＞529   ＞485   ＞28868   0,1   ＞879   ＞976   4
  MDK 18-32   ＞5291   ＞419   ＞1812   ＞2479   ＞1086   132   ＞529   ＞485   ＞28868   ＞2100   ＞879   ＞976   0
  MDK 25-39   1251   ＞419   ＞1812   ＞2479   ＞1086   ＞2537   ＞529   ＞485   ＞28868   ＞2100   ＞879   ＞976   0
  MDK 38-52   1305   ＞419   1859   ＞2479   923   ＞2537   ＞529   ＞485   ＞28868   ＞2100   ＞879   239   0
  MDK 52-64   32   ＞419   701   ＞2479   833   ＞2537   ＞529   ＞485   ＞28868   ＞2100   ＞879   ＞976   1
  MDK 64-78   246   ＞419   558   2066   504   ＞2537   ＞529   ＞485   1155   61   ＞879   ＞976   1
  MDK 70-84   53   ＞419   1562   ＞2479   ＞1086   ＞2537   ＞529   621   ＞28868   ＞2100   7   ＞976   2
  MDK 74-88   333   2   ＞1812   ＞2479   1231   ＞2537   ＞529   877   ＞28868   714   ＞879   ＞976   1
  MDK 78-92   299   1   457   ＞2479   800   ＞2537   216   226   ＞28868   114   167   378   1
  MDK 84-98   187   ＞419   362   ＞2479   ＞1086   ＞2537   141   ＞485   ＞28868   292   52   49   2
  MDK 89-103   1460   ＞419   ＞1812   ＞2479   ＞1086   ＞2537   ＞529   2333   ＞28868   ＞2100   ＞879   ＞976   0
  MDK 99-113   3000   ＞419   ＞1812   ＞2479   ＞1086   74   ＞529   ＞485   ＞28868   215   ＞879   ＞976   1
  MDK 105-119   97   ＞419   492   ＞2479   1008   ＞2537   225   ＞485   ＞28868   ＞2100   ＞879   ＞976   1
  MDK110-124   10   ＞419   6   158   69   ＞2537   ＞529   ＞485   ＞28868   15   ＞879   ＞976   4
  MDK119-133   2   ＞419   1289   819   763   ＞2537   ＞529   ＞485   ＞28868   26   ＞879   ＞976   2
*测试值是至少两个独立试验的平均值。
N-末端区域的肽对至少4种HLA II型分子具有良好的亲和力。尤其是，肽9-23可结合8种不同的HLA II型分子，具有通常反映高亲和力的相对亲和力(相对活性低于10)。其他的肽诸如肽1-15，4-18和14-28也可结合几种HLA II型分子。
另一方面，来源于序列其他部分的肽并没有对白种人群中至少4种主要的HLA II分子表现出任何显著的结合活性，除了C-末端区域的肽(110-124)之外，后者与4种HLAII分子具有良好的亲和力。
b)中期因子肽对特异性的CD4 + T反应的诱导
使用来自健康个体(无肿瘤个体)的血液样本，评估了中期因子肽在体外诱导特异性的CD4+T淋巴细胞的刺激的能力。它涉及评估补充CD4+前体淋巴细胞的能力，虽然这些细胞在天然个体中以非常低的频率存在，即通过这些肽实施体外免疫。
通过用被加载了覆盖全部中期因子序列的两个肽库的成熟自体树突细胞进行体外刺激T淋巴细胞，获得CD4+T淋巴细胞系331.16、331.24和344.1。它们的特异性研究通过IFN-γ酶联免疫斑点法予以进行，研究显示，3个细胞系对肽9-23是特异性的。通过IFN-γ酶联免疫斑点法检测每一种细胞系被L细胞系刺激的能力，该L细胞系被HLA-DR或HLA-DP4分子转染并加载了肽9-23。图8显示了肽9-23可以被DR7分子呈递给供体331的细胞系(331.16和331.24)，并显示了细胞系343.1是受DR11限制的，而不是受DR15和DRB5限制的。
CD4+T淋巴细胞系331.24在有预先加载了肿瘤细胞系裂解产物的树突细胞存在的情况下被温育，并且它的活性用IFN-γ酶联免疫斑点法评估。图9显示，331.24细胞系可被加载了经转染的HeLa细胞裂解产物的树突细胞所刺激，而不被非转染HeLa细胞所刺激。这证明了T淋巴细胞系331.24的特异性和它识别存在于被转染细胞裂解产物中的中期因子的能力。该细胞系也能识别被Hep G2肿瘤细胞系天然产生的中期因子。
所有的结果都显示，肽9-23可结合8种不同的HLA II分子并且可诱导受不同II型HLA分子限制的体外特异性CD4+T反应。此外，被针对该肽诱导的CD4+T细胞可以识别表达中期因子并且被树突细胞呈递的肿瘤裂解产物。因为该肽与信号肽(1-22)重叠，从这些实验可以得出推论，肽9-22也包含CD4+T表位，因为中期因子信号肽在细胞中在氨基酸第22和23位之间被切割。令人感兴趣的是，注意到肽9-23和9-22包括肽12-21、13-21、13-22和14-22，其包括CD8+T表位。肽9-23和9-22因此可以诱导对表达中期因子的肿瘤有特异性的CD4+T和CD8+T反应。
从上述所示结果看，该发明并不限制于上述那些被清楚描述的实施、执行和应用的方法，相反，它包含对于本领域的技术人员来说所有的可能变型，并没有偏离本发明的内容和范围。
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Claims (24)

1.一种来源于中期因子蛋白质的肽或者编码所述蛋白质的多核苷酸在抗癌疫苗制备中的应用，所述肽包含至少一个受白种人群体中显著存在的HLA分子限制的CD4+T或者CD8+T表位。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肽由序列SEQ ID：2的人类中期因子蛋白质组成。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肽是中期因子蛋白质中至少8个氨基酸的片段，所述片段包含至少一个受HLA-A2分子限制的CD8+T表位，所述肽至少包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列第14至21位或者第114至122位。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肽由所述中期因子蛋白质的氨基酸序列第12至21位、第13至21位、第13至22位、第14至22位、第113至122位或者第114至122位组成。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肽是中期因子中的至少8个氨基酸的片段，该片段包含至少一个受白种人群体中显著存在的至少四个不同HLA II分子限制的CD4+T表位，所述肽至少包含所述中期因子蛋白质的氨基酸序列第9至15位、第14至28位或者第110至124位。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肽由所述中期因子蛋白质的氨基酸序列第1至15位、第4至18位或者第14至28位组成。
7.如权利要求1、3和5中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽包含至少一个受HLA-A2分子限制的CD8+T表位和至少一个受白种人群体中显著存在的至少四个不同HLA II分子限制的CD4+T表位，所述肽由所述中期因子蛋白质的氨基酸序列第9至21位、第9至22位、第9至23位或者第110至124位组成。
8.如权利要求1至7中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽是一种包含至少两个相同或者不同表位的多联体的多表位肽，至少一个所述表位是如权利要求1至7中任一项所限定的中期因子CD4+T和/或CD8+T表位。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多表位肽包含另一种肿瘤抗原的CD4+T或者CD8+T表位。
10.如权利要求1至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽被融合于异源蛋白质或者蛋白质片段。
11.如权利要求1至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽是脂肽。
12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求2至10中任一项所限定的肽。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸被插入至表达载体中。
14.如权利要求1至13中任一项所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含药学上可接受的媒介物、载体物质和/或佐剂。
15.如权利要求1至10中任一项所述的肽的应用，用于制备用于免疫监控针对中期因子的细胞反应的试剂，准备用于评估预后或者监控癌症治疗。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述肽呈被标记的HLA分子四聚体/肽复合物的形式。
17.如权利要求1至16中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症选自下组：食道癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌和前列腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、成神经细胞瘤、恶性胶质瘤、星细胞瘤、白血病和肾胚细胞瘤。
18.一种疫苗组合物，其特征在于，它包含至少一种如权利要求3至11中任一项所述的肽或者如权利要求13所述的载体、和一种药学上可接受的媒介物、载体物质或者佐剂。
19.一种用于免疫监控患有癌症的个体中针对中期因子的细胞反应的体外方法，其特征在于包括：
-使来自所述个体的生物样品与权利要求1至10和16中任一项所述的肽相接触，以及
-通过任何适当的方法检测中期因子特异性的CD4+T和/或CD8+T淋巴细胞。
20.一种用于免疫监控针对中期因子的细胞反应的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如权利要求1至10和16中任一项所述的肽。
21.一种来源于如权利要求3至11中任一项所述的中期因子的肽。
22.一种多核苷酸，其编码如权利要求21所述的肽。
23.一种表达载体，其包含如权利要求22所述的多核苷酸。
24.一种用如权利要求22所述的多核苷酸或者如权利要求23所述的载体修饰的寄主细胞。
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