CN102215860A - 治疗认知损害的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗具有认知损害的人和动物的物质和方法。在一个实施方案中，所述方法包括向需要治疗的动物或人施用有效量的一种或多种炎症介质，例如fms相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、低氧诱导的转录因子(HIF-1α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、阿法达贝泊汀(ARANESP)和金属蛋白酶。

Description

治疗认知损害的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求于2008年8月5日提交的美国临时申请序列号61/086,351的权益，其全部内容在此通过引用并入本文，包括任何附图、表、核酸序列、氨基酸序列和附图。

发明背景

记忆丧失早已被认为是常见的老龄化伴随物。不能回想起近来熟悉的名字或简短的购物列表内容对每个人而言是熟悉的经历，而这种经历随我们年龄的增大似乎变得更为平常。

在过去的几十年间，医疗机构已改变其对老年人记忆丧失的看法。这些问题在过去被看作是不可避免的老龄化伴随物，通常被称为“衰老”或“年老时刻”。最近，医生已转变其对记忆丧失的看法，以至于某种程度的记忆损害目前认为是病理性的，因此表明影响脑的疾病过程。多数医生用于进行这种判断的界限是记忆丧失已发展成这样的程度，以至于正常的独立功能是不可能的；例如，如果一个人不再能够成功地管理自己的资金或提供自己的基本需求。这种程度的认知损害则被称为痴呆。

然而，很多年长的个体可能抱怨记忆问题，但是仍设法独立地完成所有他们的日常工作。通常，他们运转良好的能力是基于对这些困难的补偿，例如对日历或对提醒备忘录、目录等的依赖性增加。在某些情况下，这些记忆困难是记忆丧失恶化迫近的标志。

主观记忆综合征问题已经被普遍称作“轻度认知损害”(MCI)，尽管已使用其它术语，包括“非痴呆型认知损害”(CIND)。患有MCI的患者主诉记忆困难。通常，主诉包括记住他们最近遇到的人的名字有困难、记住滔滔不绝的谈话有困难和增加的遗忘事物的趋势或类似问题。在很多情况下，个体将十分清楚这些困难，将用增加的对备忘录和日历的依赖性进行补偿。最重要的是，MCI的诊断依赖于这样的事实：个体能成功地完成所有他们的惯常活动，得到他人的帮助也不比他们之前需要的多。

数项研究已检查了MCI患者的认知表现。这些已证明，一般而言，这些患者即使当与他们年龄组的其它个体相比，在正式的记忆测试上进行得相对较差。他们也显示，在思考的其它区域有轻微困难，例如命名对象或人(提出事物的名称)和复杂的计划任务。这些问题类似，但不及与阿尔茨海默病有关的神经心理学发现严重。仔细的询问也已揭示，在某些情况下，日常活动例如完成嗜好的轻微困难是明显的。

数项研究已证明，长者的记忆主诉与高于正常的将来发展痴呆的风险有关。通常，具有MCI的患者处于发展风险的痴呆类型是阿尔茨海默病，尽管其它痴呆例如血管性痴呆或额颞痴呆也可发生。但是，也清楚的是，某些具有这些主诉的患者决不会发展痴呆。

某些特征与较高的进展可能性有关。这些包括信息了解者(例如配偶、孩子或密友)确认记忆困难、实物记忆测试的成绩差和完成日常工作如爱好或财务、处理紧急事件或照料个人卫生的能力的任何变化。

在许多此类研究中必须被控制的一种因素是抑郁，因为很多抑郁患者也抱怨他们的记忆力。数项研究已表明，关于脑影像(PET或MRI扫描)的萎缩(收缩)或代谢下降的某些测量增加了将来发生痴呆的可能性。

尽管这些上述因素增加了接着发生痴呆的可能性，但是现在不可能肯定地预测具有哪些MCI患者将接着发生痴呆或将不会接着发生痴呆。因此，仍认为许多此类测量、特别是来自脑影像的测量仅对研究有用。

一种因记忆能力的进行性丧失而广为人知的神经障碍是阿尔茨海默病(AD)。全球大约有两千万人患有阿尔茨海默病。AD临床上的特征在于，开始出现记忆缺失，然后定向障碍，判断和推理受损，这通常被认为是认知损害，最终完全痴呆。在这种疾病发作后4-12年，AD患者最终陷入极度虚弱的、不变的状态。

AD的主要病理学证据是脑中存在胞外淀粉样蛋白斑和胞内tau缠结，这与神经元退化有关(Ritchie和Lovestone(2002))。认为胞外淀粉样蛋白斑块由不溶性淀粉样蛋白β肽1-42的增加导致，后者由淀粉样蛋白-β前体蛋白(APP)代谢产生。在β、γ分泌后，相比于淀粉样蛋白β1-40肽，这些淀粉样蛋白β1-42肽更易形成淀粉样蛋白原纤维，其主要在健康人群中生成。看来淀粉样蛋白β肽在神经毒性级联的顶端：实验显示，淀粉样蛋白β原纤维当注射到P301 L tau转基因小鼠的脑中时，增强了神经原纤维缠结的形成(

等人(2001))。事实上，多种淀粉样蛋白β肽已被鉴定为淀粉样蛋白β肽1-42、1-40、1-39、1-38、1-37，其可存在于斑块中，并经常可见于脑脊髓液中。

淀粉样蛋白β肽在位置671和711或713处分别被β分泌酶和γ分泌酶裂解后，由膜锚定APP产生(或处理)。此外，β分泌酶的高活性导致断裂从位置1转移到位置11。通过α分泌酶活性裂解淀粉样蛋白-β前体蛋白质将产生Aβ1-17，并且在位置40或42的γ分泌酶活性产生非病理性p3肽。β分泌酶被鉴定为膜锚定天冬氨酰蛋白酶BACE，而γ分泌酶是含有早老蛋白1(PS1)或早老蛋白2(PS2)、呆蛋白(nicastrin)、Anterior Pharynx Defective 1(APH1)和早老蛋白增强子2(PEN2)的蛋白质复合物。在这些蛋白质中，早老蛋白被广泛认为构成γ分泌酶的催化活性，而其它组分在复合物的成熟和定位中起作用。尽管一些结果指向蛋白酶ADAM 10和TACE(其可具有丰余功能)，但是α分泌酶的鉴定仍是出色的。

小部分的AD病例(主要是早发性AD)由编码早老蛋白1和2(PS1；PS2)的基因以及淀粉样蛋白-β前体蛋白质(APP)中的常染色体显性突变引起，且已显示APP、PS1和PS2中的突变改变了淀粉样蛋白-β前体蛋白质的代谢，导致脑中所产生的淀粉样蛋白β1-42的水平增加。尽管在晚发型AD患者中未鉴定到PS1、PS2和淀粉样蛋白-β前体蛋白质的突变，但是病理学特征与早发型AD患者高度类似。这些淀粉样蛋白β肽水平的增加可随年龄增长逐渐源自扰乱的淀粉样蛋白-β前体蛋白质加工(例如高胆固醇水平增强淀粉样蛋白β肽产量)或源自减少的淀粉样蛋白β肽分解代谢。因此，人们普遍认为，晚发型AD患者的AD也由脑中淀粉样蛋白肽水平的异常增加引起。与健康人群中这些肽的水平相比，阿尔茨海默症患者中这些淀粉样蛋白β肽、更特别是淀粉样蛋白-β肽1-42的水平增加。

发明概述

本发明提供了用于治疗具有认知损害的人或动物的物质和方法，其中所述方法包括施用有效量的能跨过血脑屏障的炎症介质。在一个实施方案中，所述炎症介质使脑中认知反应增加和/或发挥神经保护效应。涵盖在本发明范围内的炎症介质包括但不限于fms相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、低氧诱导的转录因子(HIF-1α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、阿法达贝泊汀(Darbepoetin/ARANESP)和金属蛋白酶。在一个实施方案中，所述炎症介质是GM-CSF、或其功能片段或变体。在特定的实施方案中，认知损害由阿尔茨海默病引起或产生。而且，还预期，根据本发明，可以使用能够诱导GM-CSF在哺乳动物中生成、随后使脑中认知反应增加的化合物。在一个实施方案中，向人或动物的非神经细胞或组织施用或递送所述炎症介质。

本发明还涉及在具有与认知功能或相关性痴呆有关的记忆问题的人或动物中减少或抑制认知损害的进展的方法，包括施用如本文所述的有效量的炎症介质。

附图简述

图1和2示出用于小鼠认知疾病性行为测试的典型的辐射臂状水迷宫装置的图。图1示出俯视装置的迷宫图。图2示出用于动物行为测试的装置本身。

图3和4示出GMCSF干扰试验-区组1(图3)和区组2(图4)。

图5A和5B示出小鼠海马中不溶性淀粉样蛋白β水平的下降。图5C示出小鼠海马中可溶性淀粉样蛋白β水平随GM-CSF血浆浓度增加而增加。

图6A和6B：图6A示出海马内注射GM-CSF(左半球)和aCSF(右半球)。将代表性冠状组织以14μm冷冻切片，用MabTech α-Aβ/Alexa 546染色。图像是约145张以10X拍摄的照片的拼叠(montage)。白点表示淀粉样蛋白斑块免疫标记(参见图13A-13D，所有4只小鼠的代表性拼叠切片)。图6B：在所测量的所有4个斑块参数中可见全部斑块减少，这根据每只小鼠5个定量切片计算得到(n＝4只小鼠)。错误柱为±SEM。统计学显著性由配对Students t-检验得到，具有下述P值(面积：P＜1.11E-07；周长：P＜1.41E-06；费雷特(Feret)直径：P＜2.36E-09；积分密度：P＜1.11E-07)。

图7A-7F示出每天皮下GM-CSF注射之后的行为分析。图7A-7D示出标准辐射臂状水迷宫错误。示出与测试各区(图7A和7B)的NT对照小鼠(n＝8)和总体4天试验(图7C和7D)相比，工作记忆试验T4和T5的Tg对照小鼠(n＝8)受到严重损害。在各区和全部试验期间，GM-CSF治疗的Tg小鼠(n＝7)的表现与工作记忆试验T4和T5的NT对照小鼠一样好或比其更好。GM CSF治疗的NT小鼠(n＝9)的表现与NT对照类似或比其略好(对于区组1的T4，注意到相比于NT组，NT+GMCSF组的表现显著更好，图7A)，尽管这种效果总体不显著。统计学显著性通过单因素ANOVA确定(^＊＊P＜0.05或更高显著性，相对于所有其他组；

P＜0.05或更好的显著性，相对于Tg+GM-CSF和NT+GM CSF)。图7E示出总体(4天)认知干扰任务，显示对于所评价的所有4个认知量度，Tg对照小鼠与NT小鼠相比受到损害。GM-CSF治疗的Tg小鼠相比于Tg对照显示出显著更好的3个试验回忆(A1-A3)和延迟回忆(A5)，并且其表现在所有4个认知量度上与NT小鼠类似。与NT对照相比，GM-CSF治疗的NT小鼠没有产生显著更好的表现，尽管总体而言GM-CSF在NT小鼠中具有有益作用的趋势。统计学显著性通过单因素ANOVA确定(^＊Tg与NT+GM-CSF具有显著性差异，^＊＊Tg与所有其它组具有显著性差异)。图7F示出认知干扰任务。前摄干扰试验(头2天)。GM-CSF治疗的Tg小鼠的表现比Tg对照显著更好，与NT和GM-CSF治疗的NT小鼠相等。统计学显著性通过单因素ANOVA确定(^＊＊P＜0.05或具有更高的显著性，相对于所有其他组)。

图8A-8E示出皮下注射GM-CSF的小鼠中的淀粉样蛋白沉积。图8A-8D是用抗-Aβ抗体(克隆4G8)免疫标记的冠状5μm石蜡包埋切片的显微照片。照片代表淀粉样蛋白载荷最接近于GM-CSF治疗的或盐水治疗的Tg组的平均值。比例柱＝50μm。图8E示出每只GM-CSF治疗的小鼠(n＝5)相比于盐水治疗的小鼠(n＝6)，5个切片平均的淀粉样蛋白负荷百分比。通过双尾同方差Student t-检验确定统计学显著性：内嗅皮层(^＊P＜0.026)和海马(P＝0.12)。

图9A-9E示出皮下注射GM-CSF的小鼠的突触泡蛋白免疫染色。图9A-9D是用抗-突触泡蛋白抗体免疫标记的冠状5μm石蜡包埋切片的显微照片。照片代表最接近GM-CSF治疗的或盐水治疗组的平均的突触泡蛋白免疫标记。比例柱＝50μm。图9E示出每只GM-CSF-治疗的小鼠(n＝5)相比于盐水治疗的小鼠(n＝6)，5个切片的平均值的突触泡蛋白免疫反应性百分比。虽然数值上较小，但是通过双尾同方差Student t检验，两组之间的差异具有统计学显著性：CA1(P＜0.0013)，CA3(P＜0.0023)。

图10示出小鼠之间的淀粉样蛋白斑块载荷的显著性差异。相似年龄(根据出生日期连续编号)的PS/APP小鼠在两侧脑室内输注M-CSF。编号148、160、171和211的小鼠接受M-CSF，而编号164、170、176和177的小鼠接受aCSF。输注持续2周。以14μm进行冷冻切片，并用6E10/Alexa488和Hoechst染色。亮绿色点表明淀粉样蛋白斑块。照片以5X拍摄。

图11A-11C示出海马内注射M-CSF(左半球)和aCSF(右半球)。在图11A中，图像是约145张10X照片的拼叠，并且代表所有4只M-CSF注射的小鼠中的前海马至后海马可见的效应。M-CSF注射的半球显示半球之间的淀粉样蛋白沉积没有差异。图11B：这张相片示出M-CSF注射的左半球的放大，如在盐水输注后可见。注意到在注射部位有小肿块。图11C是显示在M-CSF注射部位于针迹中形成的囊样或肿瘤样生长的图像。以14μm进行冷冻切片，并用6E10/Alexa 488和Hoechst染色。亮绿色染色是非特异性的，不代表淀粉样蛋白斑块。照片以20X拍摄。

图12A和12B示出海马内注射G-CSF(左半球)和aCSF(右半球)。淀粉样蛋白斑块以白点显示。尽管以轻微的角度对脑进行切片，但是目视观察显示整个G-CSF注射的左半球中的淀粉样蛋白斑块普遍下降。以14μm进行冷冻切片，并用6E10/IR800染色。在Licor Odyssey上扫描，并放大以显像。切片以1至6编号，与前海马至后海马对应。

图13A-13D示出海马内注射GM-CSF(左半球)和aCSF(右半球)。每只小鼠的代表性切片与注射部位邻近。组织切片用MabTech α-Aβ/Alexa 488染色。白点表示淀粉样蛋白斑块免疫标记。图像是约145张以10X拍摄的照片的拼叠。图13A-13C来自14μm冷冻的切片，而图13D来自5μm石蜡包埋的切片。

图14A-14F示出GM-CSF注射的左半球相比于aCSF注射的对侧右半球中，淀粉样蛋白沉积减少的定量。每只小鼠有5个切片定量。每个拼叠的切片含有超过140张10X照片，在这些照片中每个半球挑选15-25张定量。在使用Axiovision 4.7软件并载有Zeiss Axiocam Mrm照相机的Zeiss Imager.Z1荧光显微镜(Oberkochen，Germany)上，以相同的曝光拍摄每个切片的所有照片。每个图示出5个切片/小鼠的总值或平均值，以及每个单独小鼠和全部的显著性。错误柱为±SEM：(图14A-14B)斑块面积、(图14C-14D)周长值、(图14E)平均费雷特直径、(图14F)平均积分密度。

发明详述

本发明提供了治疗具有认知损害的人和动物的方法，其中所述方法包括向所述人和动物施用有效量的一种或多种能够跨越血脑屏障的炎症介质、或编码炎症介质(如果炎症介质是多肽)的多核苷酸、或包含所述炎症介质或多核苷酸的组合物。认知损害可以是渐进性认知损害。在具体的实施方案中，认知损害由阿尔茨海默病引起或产生。在一个实施方案中，认知损害由中风、唐氏综合征、拳击手痴呆(dementia pugilistica)、创伤性脑损伤、AIDS相关性痴呆、路易体病(Lewy body disease)或皮克病(Pick’s disease)引起或产生。在一个实施方案中，所述炎症介质提供脑中认知反应增加和/或神经保护效应。在一个实施方案中，所述炎症介质或编码所述炎症介质的多核苷酸是人源的或人序列。

涵盖在本发明范围内的所述炎症介质包括但不限于fms相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、低氧诱导的转录因子(HIF-1α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、阿法达贝泊汀(ARANESP)和金属蛋白酶或其基本上表现出与全长或非变体炎症介质相同生物活性的功能片段或变体。通常，为了在人中治疗认知损害，炎症介质将具有人蛋白质或编码其的多核苷酸的序列。本文所述的炎症介质的人序列在本领域中是已知的(参见例如GenBank登记号NM_013520.3、NM_000799.2、NM_000759.2、M11220.1、NM_181054.2、NG_011713.1、NG_008851.1、NM_000588.3、NG_011640.1、NM_000757.4、NG_012099.1、NM_004530.4、NG_011468.1、NG_007462.1和NG_008732.1)。在一个实施方案中，所述炎症介质是GM-CSF或其表现出GM-CSF生物活性的功能片段或变体。在具体的实施方案中，所述GM-CSF是人GM-CSF。在一个实施方案中，在本发明用于治疗认知损害的方法中施用GM-CSF和阿法达贝泊汀和/或EPO。在另一个实施方案中，施用G-CSF和阿法达贝泊汀和/或EPO。此外，还预期根据本发明可以使用能够诱导本发明炎症介质如GM-CSF在哺乳动物中生成、随后使脑中认知反应增加的化合物。此类化合物的实例包括但不限于EPO和HIF-1α(Fisher(2003))。在一个实施方案中，向人或动物的非神经组织施用或递送所述炎症介质。

在一个实施方案中，本发明的炎症介质、或编码所述炎症介质的多核苷酸、或含有所述炎症介质或多核苷酸的组合物以有效剂量皮下或通过输注、颅内、口服、胃肠外、鼻内、通过吸入、鞘内、肌内、舌下或通过任何其它已知且可接受的药物递送方法递送至需要这种治疗的人和动物。

本发明还涉及在具有与认知功能或相关性痴呆有关的记忆问题的人和动物中减少或抑制认知损害进展的方法。在一个实施方案中，本发明方法包括向所述人或动物施用有效量的本发明炎症介质、或编码所述炎症介质的多核苷酸、或包含所述炎症介质或多核苷酸的组合物。

本发明炎症介质、编码所述炎症介质的多核苷酸、和/或包含它们的组合物的体内应用可通过本领域技术人员目前或预期已知的任何适合的方法和技术来完成。主题化合物可以以生理学或药学上可接受的形式配制并且通过本领域已知的任何适合的途径来施用，所述途径包括例如口服、鼻、直肠和胃肠外施用途径。如本文所用的术语胃肠外包括皮下、真皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用，例如通过注射。本发明的主题炎症介质的施用可以是单次施用，或以可由本领域技术人员容易确定的连续间隔或不同间隔施用。

本发明炎症介质、编码所述炎症介质的多核苷酸和包含它们的组合物也可利用脂质体技术、缓释胶囊、可植入泵和可生物降解的容器来施用。有利地，这些递送方法可在延长的时段内提供均匀剂量。本发明的炎症介质还可以以其盐衍生物形式或结晶形式施用。

本发明炎症介质和编码所述炎症介质的多核苷酸可以根据用于制备生理学上可接受的和/或药学上可接受的组合物的已知方法来配制。制剂详细记载于本领域技术人员熟知和容易得到的许多来源中。例如，E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Science记载了关于本发明可以使用的制剂。一般而言，本发明的组合物将被如此配制以至于有效量的化合物与适合的载体组合，从而有利于有效施用组合物。用于本发明方法的组合物也可以是多种形式。这些形式包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或混悬液、栓剂、注射和输注溶液以及喷雾剂。优选的形式取决于预期施用方式和治疗应用。所述组合物还优选包括本领域技术人员已知的常规生理上可接受的载体和稀释剂。与本发明化合物一起使用的载体或稀释剂的实例包括乙醇、二甲亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水和等效载体和稀释剂。为了提供用于所需治疗性疗法的此类剂量的施用，本发明的组合物可包含以包括载体或稀释剂的总组合物的重量计约0.1％至99％、尤其1％至15％重量的一种或多种主题炎症介质的总量。

本发明炎症介质、编码所述炎症介质的多核苷酸和包含它们的组合物可通过直接与细胞接触或经由载体方式递送至细胞。用于向细胞递送炎症介质和组合物的载体方式是本领域已知的，并且包括例如将组合物包囊在脂质体部分中。另一种用于向细胞递送本发明的炎症介质和组合物的方式包括将炎症介质与靶向用以向靶细胞递送的蛋白质或核酸连接。美国专利号6,960,648以及公布的美国专利申请号20030032594和20020120100公开了可与另一种组合物偶联且使组合物被易位跨过生物膜的氨基酸序列。第20020035243号公布的美国专利申请也描述了用于转运生物部分跨过细胞膜以进行胞内递送的组合物。炎症介质也可结合到聚合物中，其实例包括用于颅内递送的聚(D-L乳酸-乙交酯)共聚物；以20∶80摩尔比率的聚[二(对羧基苯氧基)丙烷∶癸二酸](如GLIADEL中所用)；软骨素；壳多糖；和脱乙酰壳多糖。

尽管本发明炎症介质和编码所述炎症介质的多核苷酸可单独地施用，但是这些炎症介质也可作为药物组合物的部分施用。因此，本发明还提供了包含一种或多种炎症介质以及至少一种可药用载体的组合物。所述药物组合物可适用于各种施用途径，例如肠内、胃肠外、静脉内、肌内、局部、皮下等等。施用可以是连续的或具有不同的间隔，如可通过本领域普通技术人员确定。

适用于施用的炎症介质和编码它们的多核苷酸的其它制剂包括例如无菌注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和赋予制剂与预期受者血液等渗的溶质；以及可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬液。制剂可以以单位剂量或多剂量容器、例如密封安瓿和小瓶呈示，并且可以以冷冻干燥的(冻干的)状态贮存，在使用之前仅需要无菌液态载体例如注射用水的条件。临时注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应理解，除上文特别提及的成分之外，本发明组合物可包括关于所述制剂类型的领域中常用的其它试剂。

本发明炎症介质、编码所述炎症介质的多核苷酸及其组合物可任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂组合而在一个或多个解剖部位局部施用。本发明炎症介质及其组合物可任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂或用于口服递送的可同化的食用载体组合而全身施用，例如静脉内或口服。它们可包封在硬或软壳明胶胶囊中，可压制成片，或可直接与患者饮食的食物混合。对于口服治疗施用，所述炎症介质可与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄取片(ingestible tablet)、口含片(buccal tablet)、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸(wafer)、气雾喷雾剂等形式使用。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下：粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂如薄荷、冬绿油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可包含液态载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以以包衣形式存在或者更改固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙子香料。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可接受的，并且其所用的量基本上无毒。此外，活性化合物可加入到持续释放制剂和装置中。

炎症介质和编码所述炎症介质的多核苷酸以及本发明的组合物、包括其药学上可接受的盐或类似物可通过输注或注射静脉内、肌内或腹膜内施用。活性剂或其盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散液也可在甘油、液态聚乙二醇、三醋精及其混合物和油中制备。在常规的贮存和使用条件下，这些制剂可包含预防微生物生长的防腐剂。

适用于注射或输注的药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其适用于无菌注射或输注溶液或分散液的临时制剂，任选地包囊在脂质体中。在生产和贮存的条件下，最终的剂型应该是无菌的、液态的和稳定的。液态载体或媒介可以是溶剂或液态分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适合的混合物。可以例如通过形成脂质体、通过在分散液的情况下维持所需的粒度或通过使用表面活性剂维持适当的流动性。任选地，可通过各种其它抗菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等产生预防微生物的作用。在很多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。可通过加入延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶导致可注射组合物的吸收延长。

无菌注射溶液可以通过向适当的溶剂中加入所需量的本发明炎症介质以及酌情上面所列举的各种其它成分进行制备，随后过滤灭菌。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，得到活性成分以及先前过滤灭菌的溶液中存在的任何其它所需成分的粉末。

就局部施用而言，本发明炎症介质和编码所述炎症介质的多核苷酸可以以液体或固体形式应用。但是，通常需要以与皮肤病学上可接受的载体(其可以是固体或液体)组合的组合物形式将它们局部施用到皮肤。炎症介质可以以制剂例如软膏、乳膏、洗剂、溶液、酊剂等的形式应用。也可以使用向真皮部位递送药理学物质的药物递送系统，例如在美国专利号5,167,649中所述的药物递送系统。

有用的固体载体包括磨碎的固体例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液态载体包括水、醇或二醇类或水-醇/二醇混合物，其中该化合物可任选地借助于无毒性表面活性剂以有效水平溶解或分散。可加入佐剂例如芳香剂和其它抗微生物剂以使给定用途的性质最优化。所得的液态组合物可以例如由具有吸收性的垫涂敷，用于浸渍绷带或其它敷料，或可以使用泵型或气溶胶喷雾器而喷雾到受累区域上。

增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可与液态载体一起使用而形成可涂布的糊剂、凝胶、软膏、皂等，用于直接涂敷至使用者的皮肤上。可用于向皮肤递送炎症介质的有用的皮肤病学组合物的实例公开于美国专利号4,608,392；美国专利号4,992,478；美国专利号4,559,157；和美国专利号4,820,508中。

本发明的炎症介质、编码所述炎症介质的多核苷酸和药物组合物的有用剂量可通过比较它们的体外活性与动物模型中的体内活性而确定。将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法为本领域所知；例如参见美国专利号4,938,949。

本发明还涉及包含本发明炎症介质或编码所述炎症介质的多核苷酸与药学上可接受的载体的药物组合物。适用于口服、局部或胃肠外施用的包含一定量化合物的药物组合物构成本发明的优选实施方案。在本发明的情况下向患者、特别是人施用的剂量应该足以在合理的时段内实现患者的治疗响应，而没有致命毒性，并且优选引起不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员应该认识到，剂量将取决于多种因素，包括对象的条件(健康)、对象的体重、同期联合治疗(如果有的话)的种类、治疗频率、治疗比率、以及病理状态的严重度和阶段。

为了提供用于所需治疗性疗法的此类剂量的施用，在某些实施方案中，本发明的药物组合物可包含以包括载体或稀释剂的总组合物重量计约0.1％至45％、尤其是1至15％重量的一种或多种所述化合物的总量。举例说明，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约20mg/kg；腹膜内，0.01至约100mg/kg；皮下，0.01至约100mg/kg；肌内，0.01至约100mg/kg；口服，0.01至约200mg/kg，优选约1至100mg/kg；鼻内滴入，0.01至约20mg/kg；和气溶胶，0.01至约20mg/kg动物(身体)重量。

本发明还涉及多核苷酸表达构建体，其包括含有编码本发明炎症介质的核苷酸序列的本发明多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码人GM-CSF或其基本上表现出与全长或非变体GM-CSF相同活性的片段或变体。

如本文所用的术语“表达构建体”是指核酸序列的组合，其提供有效连接的核酸序列的转录。如本文所用的术语“有效连接”是指所述化合物的并列，其中各组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。通常，有效连接的组分处于邻接的关系。

本发明的表达构建体也将一般包括在所述表达构建体将在其中表达的预期宿主细胞中具有功能的调控元件。因此，本领域普通技术人员可以选择用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调控元件。调控元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。

本发明的表达构建体可以包含与编码本发明炎症介质的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。使用本领域已知的标准技术可将启动子掺入到多核苷酸中。在本发明的表达构建体中可以使用启动子的多个拷贝或多个启动子。在优选的实施方案中，启动子所处的位置距转录起始位点的距离可以与其在天然遗传环境中距转录起始位点的距离大约相同。允许该距离存在某些差异，只要启动子活性并没有实质性下降。转录起始位点通常包括在表达构建体中。

就动物细胞中的表达而言，本发明的表达构建体可包含适合的启动子，所述启动子可推进多核苷酸序列的转录。如果细胞是哺乳动物细胞，那么可在表达构建体中使用以下启动子：例如肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、NF-κB启动子、EGR启动子、SRE启动子、IL-2启动子、NFAT启动子、骨钙蛋白启动子、SV40早期启动子和SV40晚期启动子、Lck启动子、BMP5启动子、TRP-1启动子、鼠乳房肿瘤病毒长末端重复启动子、STAT启动子或免疫球蛋白启动子。就昆虫细胞中的表达而言，杆状病毒多角体蛋白启动子可以用于本发明的表达构建体。适于与本发明的表达构建体一起用于酵母细胞的启动子包括但不限于3-磷酸甘油酸酯激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、金属硫蛋白启动子、醇脱氢酶-2启动子和己糖激酶启动子。

就原核系统中的表达而言，本发明的表达构建体可包含启动子，例如碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子、λPL启动子、β-内酰胺酶启动子、乳糖启动子、phoA启动子、T3启动子、T7启动子或tac启动子(de Boer等人，1983)。

如果要在植物细胞中提供表达构建体，那么可以使用植物病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S(包括增强的CaMV 35S启动子(参见例如美国专利号5,106,739))或19S启动子。也可以使用植物启动子，例如prolifera启动子、Ap3启动子、热休克启动子、根癌农杆菌(A.tumafaciens)的T-DNA 1′-或2′-启动子、聚半乳糖醛酸酶启动子、来自矮牵牛的查耳酮合酶A(CHS-A)启动子、烟草PR-1a启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、alcA基因启动子、pin2启动子(Xu等人，1993)、玉米WipI启动子、玉米trpA基因启动子(美国专利号5,625,136)、玉米CDPK基因启动子和RUBISCO SSU启动子(美国专利号5,034,322)。也可以使用种子特异性启动子，例如来自β-菜豆蛋白基因(菜豆的)或大豆球蛋白基因(大豆的)的启动子，和其它启动子。组成性启动子(例如CaMV、泛素、肌动蛋白或NOS启动子)、组织特异性启动子(例如番茄的E8启动子)、发育调节的启动子和诱导型启动子(例如可通过热、光、激素或化学品诱导的那些启动子)预期用于本发明的多核苷酸。

本发明的表达构建体可任选地含有转录终止序列、翻译终止序列、信号肽序列和/或增强子元件。转录终止区域一般可从真核或病毒基因序列的3’非翻译区获得。转录终止序列可位于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽为一组短的氨基端序列，其编码负责把有效连接的肽移到一系列翻译后细胞目的地的信息，范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和胞外环境。通过使用有效连接的信号肽序列将多肽靶向到预期细胞和/或胞外目的地被设想用于本发明的炎症介质。化学增强子为增加基因转录的顺式作用元件，并也可包括在表达构建体中。化学增强子元件为本领域已知并包括但不限于CaMV 35S增强子元件、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)(CMV)早期启动子增强子元件和SV40增强子元件。表达构建体中也可包括指导结构基因编码的mRNA多腺苷酸化的DNA序列。

表达构建体的5’和3’端可包括独特的限制性酶位点以允许插入多核苷酸载体。如本文所用的术语“载体”指任何遗传元件，其包括例如质粒、粘粒、染色体、噬菌体、病毒等等，当与适当控制元件联系时，其能复制并且可在细胞间转移多核苷酸序列。载体含有允许载体在所选宿主细胞中复制的核苷酸序列。许多载体可用于表达和/或克隆，包括但不限于pBR322、pUC系列、M13系列和pBLUESCRIPT载体(Stratagene，La Jolla，CA)。

可用本领域已知的方法将本发明的多核苷酸、载体和表达构建体引入到细胞中。此类方法包括转染、显微注射、电穿孔、脂转染、细胞融合、磷酸钙沉淀和基因枪法(biolistic method)。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸或表达构建体可通过病毒载体例如腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、腺病毒和Epstein-Barr病毒(EBV)体内引入。可以用于本发明的病毒载体的减毒或缺陷形式为本领域已知。通常，在病毒引入到细胞中后缺陷病毒不能够感染。也可通过脂转染体内引入本发明的多核苷酸、载体和表达构建体(通过由合成阳离子脂质制备的脂质体进行DNA转染)(Felgner等人，1987)。合成阳离子脂质(LIPOFECTIN，Invitrogen Corp.，La Jolla，CA)可用于制备脂质体来包囊本发明的多核苷酸、载体或表达构建体。也可以使用本领域已知的方法例如转染、显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀和通过基因枪法以裸露DNA形式体内引入本发明的多核苷酸、载体或表达构建体。

也可以就与本文所示例那些的更为具体的同一性和/或相似性范围，来定义本发明的多核苷酸和多肽。所述序列同一性通常大于60％、优选大于75％、更优选大于80％、甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。如与本文示例的序列相比较，序列的同一性和/或相似性可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。除非另有详细说明，如本文所用的两个序列的序列同一性和/或相似性百分比可以使用如Karlin和Altschul(1993)中改进的Karlin和Altschul的算法(1990)确定。该算法被结合到Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序中(1990)。BLAST搜索可用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得具有所需序列同一性百分比的序列。为了获得用于比较目的的缺口序列比对(gapped alignment)，可以使用披露于Altschul等人(1997)中的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(NBLAST和XBLAST)的缺省参数。参见NCBI/NIH网址。

本发明还涵盖那些多核苷酸分子(编码本发明炎症介质)，其具有与编码本发明炎症介质的多核苷酸序列充分同源的序列以便允许在标准严格条件和标准方法下与该序列杂交(Maniatis，T.等人，1982)。如本文所用的用于杂交的“严格”条件是指通常进行杂交的条件，即在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中，在比DNA杂种的熔化温度(Tm)低20-25℃过夜的条件。由下式描述熔化温度(Beltz，G.A.等人，1983)：

Tm＝81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/碱基对双链体的长度。

通常如下进行洗涤：

(1)在1×SSPE，0.1％SDS中于室温洗涤两次，达15分钟(低严格洗涤)。

(2)在0.2×SSPE，0.1％SDS中于Tm-20℃洗涤一次，达15分钟(适度严格洗涤)。

如本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，将包括已知天然核苷酸类似物，其可以以与天然存在核苷酸相似方式发挥作用。多核苷酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白质的RNA序列。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列。应该理解，特定的多核苷酸序列包括一种或多种天然序列的简并密码子，其可引入以在特定宿主细胞中提供密码子偏好性。落入本发明范围之内的多核苷酸序列还包括与编码本发明炎症介质的序列特异性杂交的序列。多核苷酸包括以单链或双链体形式的正义和反义链。

本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中包含炎症介质、和/或编码所述炎症介质的多核苷酸、或包含炎症介质的组合物、或诱导本发明炎症介质生成的化合物或活性剂。本发明的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明的试剂盒可包含一种或多种fms相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、低氧诱导的转录因子(HIF-1α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和金属蛋白酶。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括一种或多种其它如本文所述的组分、辅剂(adjunct)、或佐剂。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括描述如何施用所述试剂盒的炎症介质或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以是任何适合的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何适合的大小、形状或构型。在一个实施方案中，本发明炎症介质作为固体如片剂、丸剂或粉剂形式在所述试剂盒中提供。在另一个实施方案中，本发明炎症介质作为液体或溶液形式在所述试剂盒中提供。在一个实施方案中，所述试剂盒包含含有液体或溶液形式的本发明化合物和/或活性剂的安瓿或注射器。

本发明还涉及用于鉴定刺激GM-CSF活性及其减少认知损害的生物活性的化合物的方法。

本发明还涉及用于鉴定竞争性抑制GM-CSF的活性及其减少认知损害的生物活性的化合物的方法。

受益于所公开方法的哺乳动物物种包括但不限于灵长类，如猿、黑猩猩、猩猩、人、猴类；驯养动物(例如宠物)，如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南大肚猪(vietnamese pot-bellied pig)、兔和雪貂；驯养家畜例如奶牛、水牛、野牛、马、驴、猪、羊和山羊；通常在动物园中发现的外来动物，例如熊、狮子、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树懒、瞪羚(gazelles)、斑马、牛羚(wildebeest)、场拔鼠(prairie dog)、考拉熊、袋鼠、负鼠(oppossums)、浣熊、熊猫、鬣狗(hyena)、海豹、海狮、海象(elephant seals)、水獭、小鲸(porpoise)、海豚和鲸。可受益于公开方法的其它物种包括鱼、两栖动物、鸟和爬行动物。如本文所用的术语“患者”和“对象”可互换使用，并且预期包括这些人和非人物种。同样地，可以对这些人和非人物种的细胞进行本发明的体外方法。

以下术语旨在具有随即下文所示的含义，并且可用于理解本发明的描述而并不意欲限制本发明的范围。

术语“神经细胞”是指神经来源(例如脑、脊髓)的任何细胞，包括来自中枢神经系统或外周神经系统的感觉细胞、传送细胞和运动细胞，例如神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞等。

术语“淀粉样蛋白β肽”是指由淀粉样蛋白β前体蛋白质(APP)处理的淀粉样蛋白β肽。最常见的肽包括淀粉样蛋白β肽1-40、1-42、11-40和11-42。其它并不常见的淀粉样蛋白β肽种类被描述为y-42，其中y范围为2-17，和1-x，其中x范围为24-39和41。

术语“载体”是指用于药物组合物的制剂以向药物组合物提供介质、体积和/或可用形式的无毒性材料。载体可包含一种或多种此类材料，例如赋形剂、稳定剂或pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括含水或固体缓冲剂成分包括磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。

术语“接触”或“接触(contacting)”是指无论在体外系统中还是在体内系统中，将至少两个部分联系在一起。

术语“病状(condition)”或“疾病”是指症状(即疾病)的明显呈现或异常临床指标(例如生物化学指标)的表现、或者发展此类症状或异常临床指标的倾向的遗传或环境风险。

术语“内源性”应该是指动物天然产生的物质。例如但不是限制，关于术语“激酶”的内源性应该是指由动物例如哺乳动物(例如但不限于人)或病毒天然产生的激酶。相反，本文中的术语非内源性应该是指不是由动物例如哺乳动物(例如但不限于人)或病毒天然产生的物质。两个术语可以用于描述“体内”和“体外”系统。例如但不是限制，在筛选方法中，内源性或非内源性激酶可以与体外筛选系统有关。作为另一实例，但不是限制，当操作哺乳动物的基因组以包括非内源组成型活化激酶时，可以通过体内系统筛选候选化合物。

有关术语“反应”的术语“抑制”或“遏抑”是指在化合物存在时反应被降低或阻止，这与该化合物不存在时相反。

术语“配体”是指对内源性、天然存在的受体具有特异性的内源性、天然存在的分子。

本文所用的术语“药学上可接受的前体药物”是指可用于本发明的化合物的前体药物，在合理医学判断的范围内，它们适合于与患者组织接触，具有与合理的利益/风险比相当的不适当的毒性、刺激性、过敏反应，并且对本发明化合物的预期用途有效。术语“前体药物”是指在体内被转化而生成可用于本发明的有效化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。这种转化可通过各种机理、例如通过在血液中水解而发生。携带代谢可裂解基团的化合物的优点在于，由于存在代谢可裂解的基团而赋予母体化合物增强的溶解性和/或吸收速率，它们可显示提高的生物利用度，因此，此类化合物用作前体药物。以下文献提供了详尽的讨论：Bundgaard(1985)，Widder等人(1985)，Krogsgaard-Larsen和Bandaged(1991)，Bundgard(1992)，Nielsenw和Bundgaard(1988)，Nakeya等人(1984)，Higuchi和Stella(1987)，所述文献通过引用并入本文。前体药物的例子是酯前体药物。“酯前体药物”是指在体内以代谢方式(例如水解)转化为根据本发明的抑制剂化合物的化合物。例如，含有羧基的化合物的酯前体药物可在体内经水解转化为相应的羧基。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的无毒性的无机和有机酸加成盐以及碱加成盐。这些盐可在可用于本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备。

术语“药物赋形剂”是指可加入到本发明中的无毒性佐剂或化合物，其能够增强肽的生物活性效应或其在体内的吸收度。

术语“多肽”是指由任意天然或合成氨基酸及其等效物组成的蛋白质。在本发明中，多肽可意指例如GM-CSF蛋白质或其生物活性等效物的氨基酸序列。在某些情况下，任何一种天然存在的氨基酸可被功能性氨基酸置换，而不改变肽的生物活性。例如，肽是由氨基酸组成的短的序列-和长度-特异性的低聚物。这些常见的生物分子在活细胞中无处不在，并扮演各种各样的角色，包括细胞受体配体、内源性抗生素，甚至是肺表面活性剂的组分。由生物活性肽扮演的每个角色通常对应于唯一的三维结构。因此，自然界通过进化而极其巧妙地精炼了生物活性肽序列和活性，自然地，就对开发这些分子作为药物先导化合物产生了浓厚的兴趣。通常第二代药物治疗聚焦于创造非天然肽模拟物。这些“拟肽物(peptidomimetics)”可基于任何低聚物，其通过使用酰胺键电子等排体和/或修饰天然肽主链、包括链延伸或掺入杂原子而模拟肽一级结构。拟肽低聚物通常具有蛋白酶抗性，并且相比于肽类似物可具有减少的免疫原性和提高的生物利用度。除一级结构模拟之外，挑选出来的序列特异性拟肽低聚物即所谓的“折叠体(foldamer)”亚组表现出明确的二级结构元件，例如螺旋、转角和小的薄片样结构。当肽的生物活性或其生物等效物取决于精确的3-D结构时，仿生低聚物折叠的能力是必不可少的。简单拟肽物的实例包括氮杂肽、低聚氨基甲酸酯和低聚脲，而常见的折叠体实例包括β-肽、γ-肽、低聚(苯撑乙炔)、插烯(vinylogous)磺酰肽和聚-N-取代的甘氨酸(类肽)。因此，本发明炎症介质的拟肽物例如GM-CSF多肽在本发明的范围内。

术语“溶剂合物”是指可用于本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合可以包括氢键结合。在某些情况下，例如当一个或多个溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中时，溶剂合物能够分离。“溶剂合物”包括溶液相和可分离的溶剂合物。代表性溶剂合物包括水合物、乙醇合物(ethanolate)和甲醇合物(methanolate)。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指诱发医生或其它临床医师所谋求的对象生物或医学响应的化合物或活性剂的量。具体来说，关于治疗神经元病症，术语“有效量”旨在意指可减少对象的认知损害的有效药物剂量。小鼠的平均重量通常为约0.025kg，代谢速率约为人的7.2倍。人的平均重量通常为约70kg。标准重量和代谢速率的调节在本领域普通技术人员的范围之内，他们能够导出如本文所述的本发明药物用于治疗的有效剂量。例如，在本发明范围之内的有效量是等效的小鼠剂量，其为约5mcg/天之内持续一段达到认知效应所需的时间，对人而言剂量在约2mg/天之内。可选地，人的有效剂量也可以为约50mcg/天至约2mg/天的范围，或可选地，为50mcg/天、或100mcg/天、或250mcg/天、或500mcg/天、或750mcg/天或1mg/天或1.25mg/天、或1.5mg/天或2mg/天、或2.25mg/天、或2.5mg/天，或者就个体的重量、代谢和代谢需要所需而调整以至少实现此类个体的有效认知效应。

术语“治疗(treating)”是指为了逆转或预防病症、疾病或病状、包括此类病症、疾病或病状的一种或多种症状的发展或改变其病理学、从而缓解所进行的干预。预防是指预防性或防护性措施。本文使用的相关术语“治疗(treatment)”是指治疗病症、症状、疾病或病状的行为，如上文所定义的术语“治疗(treating)”。

Flt3配体是FLT3酪氨酸激酶受体的配体，并且属于调节早期造血细胞增殖的生长因子小组。已经鉴定了多个Flt3配体同工型。主要形式是跨膜形式，其在细胞表面上具有生物活性。当被蛋白水解裂解时，跨膜同工型产生可溶性形式，其也具有生物活性。Flt3配体与表达酪氨酸激酶受体Flt3的细胞结合。Flt3配体独自不能刺激增殖，但是与其他集落刺激因子(CSF)和白介素发挥很好的协同作用，从而诱导生长和分化。

白介素6(IL-6)是多功能的24kDa蛋白质，最初发现于RNA刺激的纤维母细胞样细胞的介质中。它被IL-1、TNF、PDGF、IFN-β、TNF-α、NGF、IL-17上调，并被糖皮质激素IL-4、TGF-β下调。IL-6似乎直接牵涉于感染和细胞损伤后出现的反应中，并且证明在调节急性期反应方面与IL-1和TNF-α一样重要。IL-6也与调节脂肪质量有关。有报告称，IL-6由成纤维细胞、活化T细胞、活化单核细胞或巨噬细胞和内皮细胞产生。它作用于多种细胞，包括成纤维细胞、骨髓祖细胞、T细胞、B细胞和肝细胞。此外，IL-6在T淋巴细胞的增殖中与IL-2相互作用。IL-6加强IL-3对多能造血祖细胞的增殖效应。

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)最初被描述成抑制巨噬细胞随意游走的T淋巴细胞源因子，近30年来它一直是个神秘的细胞因子。近年来，作为脑垂体腺前叶产物的MIF的发现以及生物活性、重组MIF蛋白质的克隆和表达已经确定它在体内的关键生物角色。MIF具有独特的性质，即它从受糖皮质激素刺激的巨噬细胞和T淋巴细胞中释放。一旦被释放，MIF可克服糖皮质激素对LPS刺激的单核细胞体外生成TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8的抑制效应，并且抑制类固醇对抗体内致命性内毒素血症的保护效应。MIF通过恢复IL-2和IFN-γ生成，还拮抗糖皮质激素对体外T细胞增殖的抑制。这种观察结果确认了MIF在免疫系统中的关键作用，并且在我们对控制炎症反应和免疫反应的理解方面填补了重要的空缺。糖皮质激素长期以来被认为是对感染或组织侵袭的应激反应的重要组分，并用来调节炎症和免疫反应。MIF是第一个被鉴定为可反调节糖皮质激素的抑制效应的介质，并因而在宿主对炎症和免疫的控制方面起决定性作用。

肿瘤坏死因子(TNF)是蛋白质超家族的成员，每一个均有157个氨基酸，其诱导肿瘤细胞的坏死(死亡)并且具有多种促炎作用。肿瘤坏死因子是对脂质代谢、凝结、胰岛素抗性和内皮细胞作为内层的血管的功能有影响的多功能细胞因子。

白介素-1(IL-1)是曾描述过的第一细胞因子之一。其最初的发现是作为能够诱导发热、控制淋巴细胞、增加骨髓细胞数量和引起骨关节退化的因子。此时，IL-1被冠以其他若干名称，包括内源性热原、淋巴细胞激活因子、促红细胞生成素-1和单核细胞因子。大概在1984-1985年间，科学家证实了IL-1实际上由两种不同的蛋白质组成，目前称为IL-1α和IL-1β。

白介素-3(IL-3)是152个氨基酸蛋白质，通常被糖基化，最初作为在造血细胞中诱导20α-羟基类固醇脱氢酶合成的T淋巴细胞源因子被发现。其由活化T细胞分泌，并结合于IL-3受体，其与由GM-CSF和IL-5共享的共同的βc受体亚单位发生异二聚化。IL-3功能与GM-CSF类似，人IL-3基因位于距GM-CSF基因9千碱基的染色体5上。已显示IL-3帮助很多造血细胞类型的增殖，并与多种细胞活性有关，例如细胞生长、分化和细胞凋亡。

促红细胞生成素(EPO)是30.4kDA糖蛋白激素，主要由肾皮质的小管周围成纤维细胞产生，并且它用来保护红细胞以防细胞凋亡，以及通过与其它生长因子(IGF-1、IL-3和GM-CSF)的协同作用而促进红细胞样祖细胞的增殖和成熟。血液氧合被认为是通过被称作低氧诱导的因子的组成型合成的转录因子调节EPO表达。还报道了EPO具有神经保护和血管生成的性质。

血管内皮生长因子A(VEGF-A)是属于血小板源生长因子家族的多功能蛋白质，并且与血管发生和血管生成有关。它在低氧细胞中产生，并且通过HIF-1α表达释放，从而与细胞表面受体VEGFR-1(Flt-1)或VEGFR-2(KDR/Flk-1)结合，相应地诱导各种功能。已显示，其刺激内皮细胞有丝分裂发生和迁移、血管舒张，并且对单核细胞系造血细胞具有趋化性。

低氧诱导的转录因子α(HIF-1α)是对可利用细胞氧的变化作出反应的转录因子。在含氧量正常的条件下，HIF-1α经HIF脯氨酰-羟化酶脯氨酰羟基化、随后诱导发生遍在蛋白酶化，从而被蛋白酶体迅速降解。低氧条件防止这种脯氨酰羟基化，而HIF-1α得以被稳定，并用于上调数个促进低氧存活的基因，例如EPO和VEGF。因此，HIF-1α通过上调这些基因而增加血管发生和血管生成。

胰岛素样生长因子1(IGF-1)是分子结构与胰岛素相似的70个氨基酸多肽蛋白质激素，主要由肝产生。IGF-1与IGF-1受体(IGF-R)和胰岛素受体(IR)结合，并且是细胞生长和抗细胞凋亡AKT信号通道的强效激活剂。尽管IGF-1在整个一生中都产生，但是其表达在婴儿期和晚年中是最低的，已报道IGF-R和IR在阿尔茨海默病(AD)中减少，与神经退化相关联。IGF-1通过由其与胰岛素和EPO的缺陷性信号传导产生的血管并发症，还与2型糖尿病(AD的阳性风险因素)的发病机理有关。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)是集落刺激因子激素。它是糖蛋白、生长因子或细胞因子，由许多不同的组织产生，以刺激骨髓产生粒细胞和干细胞。然后，G-CSF刺激骨髓将它们释放到血液中。它还刺激嗜中性粒细胞前体和成熟嗜中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能。G-CSF也被称为集落刺激因子3(CSF-3)。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白质。GM-CSF是起白细胞生长因子作用的细胞因子。GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞和树突细胞。单核细胞脱离循环并迁移到组织中，在那里它们发育成巨噬细胞。因此，这是免疫/炎症级联的部分，由此激活少量巨噬细胞可快速导致其数量增加，这是一个对抗感染来说至关重要的过程。该蛋白质的活性形式以同二聚体形式可见于细胞外。

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)是分泌型细胞因子，其影响造血单核细胞增殖和分化成巨噬细胞或其它相关细胞类型如破骨细胞，以及激活成熟巨噬细胞、破骨细胞和小神经胶质细胞。最近报道M-CSF在AD患者中的表达减少，以及其在AD的淀粉样变性鼠动物模型中的外周施用改善了淀粉样蛋白沉积和认知功能。

金属蛋白酶(或metalloprotease)构成来自蛋白酶组的酶家族，根据在其活性部位上最突出的官能团的性质进行分类。有两个金属蛋白酶亚组：外肽酶，称为金属外肽酶，和内肽酶，称为金属内肽酶。众所周知的金属内肽酶包括ADAM蛋白质和基质金属蛋白酶。

阿法达贝泊汀是新的促红细胞生成素刺激因子(NESP)，其具有比EPO更长的血浆半衰期，并且与天然人EPO仅仅5个氨基酸位置不同。也预期阿法达贝泊汀在爆裂形成和集落形成红细胞样单位的成熟和增殖至红细胞生成的正常红细胞阶段中与GM-CSF协同地作用(Fisher(2003))。由于神经元细胞的氧合作用，以及通过补体受体1(CR1)在红细胞表面上的表达而清除结合补体的循环淀粉样蛋白β蛋白质，所以红细胞生成在阿尔茨海默病中是重要的(Rogers等人(2006)；Cadman和Puttfarcken(1997)；Helmy等人(2006))。

干细胞因子(SCF)是一种细胞因子，已报道其单独或与其它细胞因子例如GM-CSF、G-CSF和EPO组合可刺激原始多能和单能造血干细胞的生长和发育(Fisher(2003))。SCF还用于刺激成熟粒细胞的功能(Czygier等人(2007))。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容、包括所有图和表通过引用并入本文，以达到它们不得与本说明书的明确教义相矛盾的程度。

下面是示例用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制本发明。除非另有说明，所有百分比以重量计，并且所有溶剂混合物比例以体积计。

实施例1

辐射臂状水迷宫测试-使用与Morris水迷宫和平台认知测试均有关的相同池，在辐射臂状水迷宫(RAWM)任务中评价工作(短期)记忆。这项任务也使用与Morris迷宫测试相同的透明平台和视觉线索。

对于空间工作记忆的辐射臂状水迷宫任务，将铝插入物放置在100cm圆形池中以产生从中央圆形游泳区域发散的6个辐射状分布的游泳臂。在池的周围搭配2-D和3-D视觉线索。在8天治疗前测试和4天治疗后测试期间，以5次试验/天测定在定位6个游泳臂中的哪一个含有沉没式逃跑平台(9cm直径)之前的错误数。第4个试验(T4；最终习得试验)和第5个试验(T5；记忆保持试验)之间有30-min时间延迟。每天将平台位置换到不同臂，5个试验中的每一个的起始臂不同，从剩余的5个游泳臂中半随机选择。在每个试验期间(最长60秒)，在游到不正确臂中后将小鼠送回试验的起始臂，并记录找到沉没式平台所需的秒数。如果小鼠在60秒试验中未发现平台，则将它引导到平台，保持30秒。在试验4和5期间的错误数和逃跑潜伏期都被认为是工作记忆的指数，并且暂时类似于临床上用于评价AD患者的特定项目的标准登记/回忆测试。

治疗后的RAWM测试(4天)结束后，在新的认知干扰任务中进一步评价所有小鼠达6天。此项任务涉及两个不同房间中的两个辐射臂状水迷宫装置，以及3组不同的视觉线索。任务需要动物记住一组视觉线索，以至于在用一组不同的线索干扰后可以回忆起初始组的线索，从而成功地解决辐射臂状水迷宫任务。检查一组5个行为量度。行为量度是：A1-A3(来自在RAWM“A”中进行的头3个试验的复合3试验回忆评分)、“B”(由RAWM“B”中的单个试验获得的前摄干扰量度)、A4(由RAWM“A”中的单个试验获得的倒摄干扰量度)和“A5”(在A4与A5之间20分钟延迟后由RAWM“A”中的单个试验获得的延迟回忆量度)。与标准RAWM任务一样，此项干扰任务包括每天将所用的两个RAWM装置的平台位置都换到不同臂，以及每天测试时两个RAWM装置的起始臂都不同。对于A1和B试验，最初给予动物1分钟独立地寻找平台，接着将它引导到平台。然后在所有情况下进行实际试验。

在使用PS/APP小鼠的每个实验中使用小鼠重组GM-CSF。将5μg的每次注射复溶于盐水中，并在如下所述研究期间皮下注射到经治疗的小鼠中。

队列1：29只小鼠，F8 White Generation，DOB 04/20-05/07/2007

8只APP小鼠，21只非转基因小鼠

预测试RAWM：小鼠1岁大

8天RAWM：04/25-05/02/2008

在预测试与开始注射之间有15天延迟

开始治疗  05/17/2008

10天注射(5μg/天s.c.)，然后RAWM后测试，整个测试期间每天都进行注射。

开始后测试RAWM 05/27/2008-05/30/2008；05/31/2008-06/01/2008没有测试，但是每天继续注射；开始干扰RAWM 06/02/2008-06/07/2008

另外的小鼠加入到研究中＝队列2

8小鼠：F8 Bright Orange，DOB 05/27/2007，3 APP/PS1，4 APPF7 Light Blue，DOB 06/27/2007，1 APP

预测试RAWM

8天RAWM：05/12-05/19/2008

队列1后17天开始

在预测试与开始注射之间有15天延迟

开始治疗  06/03/2008

10天注射(5μg/天s.c.)，然后RAWM后测试，整个测试期间每天都进行注射。

开始后测试RAWM 06/12/2008-06/15/2008；06/16/2008-06/17/2008没有测试，但是每天继续注射；开始干扰RAWM 06/18/2008-06/23/2008

结果：

图3、4和7描述了GM-CSF测试的结果。图7A-7D：标准RAWM错误(4天测试；两个2天的区组)。对于两个区组1和2的测试，与工作记忆试验T4和T5的所有或大多数其它组相比，未治疗的APP转基因组显现出明显的损害。测试的所有治疗后天数的表现揭示：与表现彼此类似的所有3个其它组相比，未治疗的APP转基因组受到严重损害。

图7E：GM-CSF干扰试验-全部

在直接回忆试验(A1-A3)中，与所有3个其它组相比，未治疗的APP转基因组受损较重。与GM-CSF治疗的非转基因同窝出生者(littermate)对照相比，未治疗的APP转基因组显示前摄(试验B)和倒摄(试验A4)干扰试验的表现受到严重损害。APP转基因GM-CSF治疗的组的表现与这些试验中的治疗的和未治疗的非转基因同窝出生者对照组没有差异。在延迟回忆试验(A5)中，与表现彼此没有差异的所有3个其它组相比，未治疗的APP转基因组受损较重。

图3和4：GM-CSF干扰试验-区组1和区组2

在两个区组期间，与表现彼此没有差异的所有3个其它组相比，未治疗的APP转基因组显示受损的直接回忆(A1-A3)和受损的延迟回忆(A5)。在区组1期间，未治疗的APP转基因组显示前摄干扰表现的选择性损害(试验B)。在该试验期间，所有其它组表现得更好，并且表现彼此相等。在两个区组期间，在倒摄干扰(A4)中，与GM-CSF治疗的非转基因同窝出生者组相比，未治疗的APP转基因组受到损害。

由标准RAWM测试和RAWM干扰试验两者均明显可见，就工作记忆、前摄干扰、倒摄干扰和延迟回忆而言，未治疗的APP转基因组相比于其它3组均受到损害。相反，GM-CSF治疗的APP转基因组的表现与GM-CSF治疗或未治疗的非转基因同窝出生者从没有统计学差异。这清楚表明：就多个认知量度而言，未治疗的APP转基因组的表现比其它3组更差。

此外，在单独的一组实验中，其中各组小鼠用咖啡因治疗并且查明GM-CSF血浆水平以确定GM-CSF水平与海马中的淀粉样蛋白β水平是否相关联，发现：血浆GM-CSF与海马不溶性A-β水平具有强的负相关性，例如参见图5A和5B。相反，血浆GM-CSF与海马可溶性A-β水平具有显著正相关性(参见图5C)。该使用不同组实验中的动物的单独的观察研究表明，GM-CSF以某种方式从脑中除去不溶性沉积的A-β，结果使脑中的可溶性A-β增加。增加的可溶性A-β很可能是将β斑块清除到血浆中的转运机理。这可能表明GM-CSF的认知益处的机理。可解释GM-CSF或其生物等效物的认知益处的其它机理是可能的并且在本文所述的本发明范围内，其它机理将包括伴有脑血流量增加的脑中的新血管化、斑块及其相关炎症减少、骨髓源性神经形成、或对抗微血管斑块诱导的缺血和由此发生的氧化应激的神经保护。同样重要的是，本文提及的这些机理的任意组合被认为归因于GM-CSF及其生物等效物对认知益处的效应并且将在本文所述的所主张发明的实施范围内。

实施例2的材料与方法

涉及脑内施用CSF的转基因小鼠：在Swiss Webster和C57BL/6背景上将杂合PDGF-hAPP(V717F)小鼠与PDGF-hPS1(M146L)杂交而产生PS/APP小鼠。使用比较实时PCR(Bio-Rad iCycler-Hercules，CA)进行转基因检测。此模型中的致病表型是从6-8月龄开始的稳定的淀粉样蛋白斑块蓄积。所有包括动物实验的程序根据南佛罗里达大学动物管理和使用委员会(University of South Florida Animal Care and Use Committee)制定的实施细则进行。

颅内输注M-CSF：动物(PS/APP，均8.8-9.6月大，25-35g，雌雄性)用1-2％异氟烷麻醉，剃毛，在切口部位用10％聚维酮碘溶液擦洗，并放置于立体定位框架(Kopf Instruments，Tujunga，CA)中。切小(4cm)切口，露出颅骨，使用双刃剪刀沿着动物背部形成皮下袋，在皮下袋中插入渗透微泵(Alzet model 1004，Durect Corp.，Cupertino，CA)。在颅骨中钻两个孔(前囟前后-0.1mm，中位线侧+/-0.9mm，将30口径导管插入3.0mm的深度，对应于侧脑室)。由Alzet泵引出的是具有适合颅骨轮廓的递送端的专利导管系统(国际申请号PCT/US08/73974)，而不是市售可得的基座插管。这种完全包含在皮下的系统允许两侧脑内输注测试物质。这种能力通过允许输注到每个半球中而克服了动物之间的淀粉样蛋白沉积的差异性问题(参见图10)，其中测试物质可以被同侧递送而赋形剂被对侧递送，有效地使每个动物作为自己的对照。而且，使用安装基座的插管可见，头皮愈合并减少了对小鼠的慢性炎症和刺激。一旦插管都被插入，则使用Locktite454黏合剂(Plastics One，Roanoke，VA)将它们粘附在头骨上，并用1cm直径腈橡胶固定。黏合剂固化后，用6-7丝缝线缝合头皮，立即给予动物酮洛芬剂量(10mg/kg)，如有需要，每6小时再给予，持续另外48小时。

使用Alzet model 1004以0.12μL/小时的平均流速将M-CSF直接两侧输注到侧脑室(5μg/天)中，持续14天。在植入之前，将泵和导管在37℃水浴中预处理48小时。14天后，给予动物过量的戊巴比妥钠(～100mg/kg，i.p.)，然后用0.9％冷盐水穿心灌注。

立体定位注射CSF：将所有3份CSF立体定位地注射(5μg/注射)到(同侧)海马中，而将赋形剂(人工脑脊髓液(aCSF))对侧注射到4个PS/APP小鼠(均10-12月大，25-35g，雌雄性)中的每一个。在颅骨中钻两个孔(前囟前后-2.5mm，中位线侧+/-2.5mm，将30口径针插入2.5mm的深度)。使小鼠安乐死，此后用0.9％冷盐水灌注7天。在本发明中，重组小鼠GMCSF(rmGM-CSF)、重组鼠G-CSF(rmG-CSF)和重组小鼠M-CSF(rmM-CSF)(R&D Systems)将被称为GM-CSF、G-CSF和M-CSF。

海马内注射的小鼠的免疫组织化学和图像分析：将来自海马内注射小鼠的经过灌注的脑组织固定在10％中性缓冲福尔马林中达24-36小时，接着通过蔗糖梯度(10-30％)放置另外72小时。然后将脑冷冻在Histoslide(Leica，Heerbruug，瑞士)的peltier(Physitemp，Clifton，NJ)中，以14μm进行冠状切片。可选地，在10％中性缓冲福尔马林固定后，将所选择的脑进行石蜡包埋，以5μm切片并粘附到载玻片。进行脱蜡和抗原回收(在10mM柠檬酸钠缓冲液中煮沸20min)，然后进行免疫组织化学染色。为了显著降低石蜡包埋载玻片的试剂和抗体成本，开发了新的磁性免疫组织化学染色装置。标准免疫组织化学技术使用抗-Aβ抗体，即6E10(1∶1000))和MabTech’s(1∶5000)来免疫标记淀粉样蛋白沉积，然后Alexa 488和/或564二级荧光团(1∶1000，1∶4000-Invitrogen)，以及Hoechst(Sigma)核染色。在使用Axiovision 4.7软件并载有Zeiss Axiocam Mrm照相机的Zeiss Imager.Z1荧光显微镜(Oberkochen，德国)上使组织显像。以10X拍摄显微照片，用Axiovision Panarama Module拼叠以从每个脑半球的相应位置中选择相等的面积。每只小鼠有5个冠状切片，对15-25张10X照片/半球进行分析(根据前-后位置而变化)。使用ImageJ软件程序(在美国国立卫生研究所(National Institutes of Health)开发并从其得到)进行淀粉样蛋白定量。简言之，将每个冠状切片中每张经分析的照片相等地阈值化为柱状图平均的相同标准偏差，并且我们使用相同的面积阈值使背景干扰最小化，并分析面积、周长、费雷特直径和积分密度参数。费雷特直径是穿过给定斑块的最长距离，而积分密度是面积与斑块像素平均灰度值的乘积。

包括GM-CSF治疗的行为转基因小鼠研究：此项研究中的小鼠源自佛罗里达阿尔茨海默病研究中心转基因小鼠集落，其中将携带突变型APPK670N、M671L基因(APPsw)的杂合小鼠常规地与杂合PS1(Tg line 6.2)小鼠杂交以在混合型C57/B6/SW/SJL背景上获得包括APPsw/PS1、APPsw、PS1和非转基因(NT)基因型的后代。选择11只APPsw、4只APPsw/PS1和17只NT小鼠，均12月大，用于此项研究，在工作记忆的RAWM任务中评价8天(参见下面的方案)。许多实验已揭示，一旦各种AD基因型达到认知损害，它们的表现则相同。因此，将15只Tg小鼠分成两组，在RAWM表现中平衡，其中每一组中包括2只APPsw小鼠。也将17只NT小鼠分成两组，在RAWM表现中平衡。治疗前测试结束后两周，一组Tg小鼠(n＝7)和一组NT小鼠(n＝9)开始用GM-CSF(5μg/天，皮下给予)的10天治疗方案，而对照Tg和NT组中的动物(每组n＝8)每天接受赋形剂(盐水)的皮下治疗，同样持续10天。在注射的第11天，所有小鼠在RAWM任务中开始4天的评价，给予2天的休息，然后在新的认知干扰任务中进行另外4天测试(参见下面的方案)。在整个行为测试期间，持续每天GM CSF和盐水注射。进入治疗3周结束行为测试后，使所有小鼠安乐死，如上所述固定脑，进行石蜡包埋。尸检后对所有组织进行仔细的目视检查，显示没有形态学异常，小鼠对每天皮下注射耐受性良好。

皮下GM-CSF治疗小鼠的免疫组织化学和图像分析：将来自皮下注射、行为测试小鼠的经灌注的脑组织固定在10％中性缓冲福尔马林中达24-36小时，然后进行石蜡包埋。在海马(前囟-2.92mm至-3.64mm)的水平，使用滑动切片机由每只小鼠的脑制备5个5μm切片(相隔150μm)，并将切片安装在每个载玻片上。根据生产商方案，使用与二氨基联苯胺反应偶联的Vectastain ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行免疫组织化学染色，不同的是，对于Aβ免疫组织化学染色，省去生物素化二级抗体步骤。以下一级抗体用于免疫组织化学染色：生物素化人Aβ单克隆抗体(克隆4G8；1∶200，Covance Research Products，Emeryville，CA)和兔突触泡蛋白多克隆抗体(未稀释的，DAKO，Carpinteria，CA)。对于Aβ免疫组织化学染色，在预封闭步骤之前用70％甲酸治疗脑切片。使用磷酸盐-缓冲的盐水(0.1mM，pH 7.4)或正常兔血清(同型对照)替代一级抗体或ABC试剂作为阴性对照。基于之前方法进行定量图像分析(Sanchez-Ramos等人(2009))。使用连接有数字照相机系统的Olympus BX60显微镜(DP-70，Olympus，Tokyo，日本)获得图像，将数字图像传递到Windows PC中，使用SimplePCI软件(Compix Inc.，Imaging Systems，Cranberry Township，PA)定量分析。由每只动物捕获两个目标解剖区域(海马和内嗅皮层)的5个5μm切片(相隔150μm)的图像，获得区分染色与背景的阈值光密度。手动编辑每个目标区域以消除干扰。对于Aβ载荷分析，将数据报道成所捕获的免疫标记面积(正像素)相对于所捕获的全部面积(总像素)的百分比。为了评价突触泡蛋白的免疫反应性，在将所有图像模式转化为灰度后，在海马的CA1和CA3区中，将来自每个图像的正信号的平均强度定量为零(白)至255(黑)的相对数。由被隐瞒样品身份的单个检查者进行每个分析(T.M.)。

行为任务：由被隐瞒样品身份的单个检查者(N.G.)进行每个分析，并且由被隐瞒治疗组身份(M.R.)的单个检查者进行统计分析。直到分析结束才破译代码。

辐射臂状水迷宫：对于空间工作记忆的RAWM任务(Arendash等人(2001)；Ethell等人(2006)；Arendash等人(2007))，将铝插入物放置在100cm圆形池中以产生从中央圆形游泳区域发散的6个辐射状分布的游泳臂。在池的周围搭配2-D和3-D视觉线索。以5次试验/天测定在定位6个游泳臂中哪一个含有沉没式逃跑平台(9cm直径)之前的错误数。第4个试验(T4；最终习得试验)和第5个试验(T5；记忆保持试验)之间有30-min时间延迟。每天将平台位置换到不同臂，5个试验中的每一个的起始臂不同，从剩余的5个游泳臂中半随机选择。在每个试验期间(最长60秒)，在游到不正确臂中后将小鼠送回试验的起始臂，并记录找到沉没式平台所需的潜伏期时间。如果小鼠在60秒试验中未发现平台，则将它引导到平台，保持30秒。在试验4和5期间的错误数和逃跑潜伏期都被认为是工作记忆的指数，并且暂时类似于临床上用于评价AD患者的特定项目的标准登记/回忆测试。

认知干扰任务：此项任务设计用来相对应地(measure-for-measure)模拟最近临床上用于区分正常老年人、MCI和AD患者的认知干扰任务(Loewenstein等人(2004))。此项任务涉及两个不同房间中的两个RAWM装置，其具有两组与用于标准RAWM测试的那些不同的视觉线索。任务要求动物记住一组视觉线索(在RAWM-A中)，以至于在用一组不同的线索(在RAWM-B中)干扰后可以回忆起初始组的线索，从而成功地解决RAWM任务。检查五个行为量度：A1-A3(来自在RAWM-A中进行的头3个试验的复合3试验回忆评分)、B(由RAWM-B中的单个试验获得的前摄干扰量度)、A4(在RAWM-A中的单个试验期间获得的倒摄干扰测量)和A5(在A4与A5之间20分钟延迟后由RAWM-A中的单个试验获得的延迟回忆量度)。与标准RAWM任务一样，此项干扰任务包括每天将两个RAWM装置的平台位置都换到不同臂。对于A1和B试验，最初给予动物1分钟独立地寻找平台，接着将它引导到平台。然后在所有情况下进行实际试验。与标准RAWM任务一样，每个试验给予动物60秒以发现逃跑平台，每个试验记录错误数和逃跑潜伏期。

统计分析：使用配对Student t-检验进行来自同侧GM-CSF施用相对对侧aCSF-注射半球的淀粉样蛋白斑块参数的统计分析，其中P值＜0.05被认为具有显著性。对于RAWM数据的统计分析，使用单因素ANOVA，评价各个区组以及所有区组的8天治疗前测试(四个2天的区组)或4天治疗后测试(两个2天的区组)。因此，用Fisher LSD(最小显著差数)检验来解决各组之间事后成对(post hoc pair-by-pair)差异。对于认知干扰数据的统计分析，单独地分析两个2天的区组，也汇总分析所有四天的区组。单因素ANOVA用于所分析的四个行为量度的每一个，然后进行事后Fisher LSD检验以确定P＜0.05的显著性组差异。使用双尾同方差Student t-检验，进行来自皮下GM-CSF施用的淀粉样蛋白斑块沉积和突触泡蛋白染色的统计分析，其中P值＜0.05被认为具有显著性。

实施例2

阿尔茨海默病是年龄相关的、渐进性神经退化性疾病，其表示为认知和执行功能的下降增加。阿尔茨海默性痴呆与以下相关：脑血管功能障碍(Humpel和Marksteiner(2005))、淀粉样蛋白β(Aβ)肽在脑实质和脉管系统壁中的胞外蓄积(Rhodin等人(2000)；Scheuner等人(1996))(主要为Aβ1-42和Aβ1-40)和由超磷酰化Tau蛋白质组成的神经原纤维缠结的神经元内蓄积(Rapoport等人(2002))。相关的神经炎症可促成AD发病机制(Griffin等人(1989)；Akiyama等人(2000)；Wyss-Coray(2006))，因为炎性蛋白载脂蛋白质E(apoE)和α1-抗凝乳蛋白酶(ACT)体内和体外催化Aβ肽聚合成淀粉样蛋白丝(Wisniewski等人(1994)；Ma等人(1996)；Potter等人(2001)；Nilsson等人(2004)；Padmanabhan等人(2006))。但是，NSAID未能逆转或预防AD病理学，并且提示营养障碍小胶质细胞在神经退化性痴呆之前(Streit等人(2009))。还已经显示，淀粉样蛋白斑块快速形成，然后通过小胶质细胞(常驻和骨髓源性)进行修饰(Koenigsknecht-Talboo等人(2008)；Meyer-Luehmann等人(2008))，这表明除去淀粉样蛋白的能力和倾向性(Malm等人(2005)；Simard和Rivest(2004)；Simard等人(2006))。

类风湿性关节炎是自身免疫性疾病，其中发炎的滑液组织和高度血管化的血管翳形成，无法挽回地损害软骨和骨。在这种炎症性血管翳中，白细胞群急剧扩张，并且产生许多在前馈机理中一起协作的促炎因子，还加剧白细胞增多、细胞因子/趋化因子释放、破骨细胞发生、血管发生和自身抗体生成(类风湿因子和抗-瓜氨酸蛋白质抗体)(Szekanecz和Koch(2007)；van der Voort等人(2005)；Schellekens等人(2000))。此外，适应性免疫系统在CD4+淋巴细胞内呈现Th17表型，最终产生白介素(IL-17)，白介素(IL-17)继而负责诱导大量促炎效应(Parsonage等人(2008)；Cox等人(2008))。白细胞群的进一步增加来自集落刺激因子：M-CSF(巨噬细胞)、G-CSF(粒细胞)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞)的局部表达(Seitz等人(1994)；Leizer等人(1990)；Nakamura等人(2000))。

尽管在RA中上调的白细胞可能进入脑中并且抑制AD病理学和/或神经元功能障碍的发展，但是还未报道进入AD患者的淋巴细胞性浸润。浸润的缺乏表明：先天免疫系统的活化可能负责预防RA患者中的AD病理学。例如，补体蛋白质在AD脑中被上调，并且对C3转化酶的抑制显著增加AD小鼠的淀粉样蛋白病理学(Wyss-Coray等人(2002))。骨髓源性小胶质细胞在限制淀粉样蛋白沉积中起关键作用，但是这种群聚随年龄而下降，尽管AD病理学在增加(Simard等人(2006))。El Khoury和同事已经证明小胶质细胞实际上以多种方法防止AD发病机制，即通过趋化因子受体(CCR2)募集延迟淀粉样变性、通过上调其配体-单核细胞趋化蛋白-1(MCP 1/CCL2)、通过诱导Aβ-结合清道夫受体的表达(CD36、清道夫受体A和高级糖化终产物的受体)，和通过诱导Aβ-降解酶的表达[neprilysin、胰岛素溶酶(insulysin)和基质金属蛋白酶(MMP9)]。但是，这些受体和酶的表达也随年龄而减少(Hickman等人(2008)；El Khoury等人(2007))。

为了研究先天免疫系统与AD的相互影响，我们研究了三种结构完全不同的集落刺激因子(M-CSF、G-CSF和GM-CSF)对AD病理学的影响，它们均在RA中被上调(Seitz等人(1994)；Leizer等人(1990)；Nakamura等人(2000))。这些CSF增强其各自白细胞的存活并且驱使它们从单核细胞前体中增殖和分化。M-CSF和G-CSF诱导特定的先天免疫系统亚组，而GM-CSF诱导全部范围的天然细胞。向PS/APP小鼠中两侧脑室内输注M-CSF两周，我们首先检查M-CSF对斑块沉积的影响。免疫组织化学分析显示：年龄类似的小鼠之间的淀粉样蛋白沉积具有相当大的差异(图10)，严重影响我们测定M-CSF在有限小鼠队列中的作用的能力。尽管通过开发新的两侧脑输注导管而改进了我们的药物递送系统，但是我们发现：经实质输注的重组肽仍集中在输注的半球。这些发现引导我们以单侧海马内推注施用CSFs，对侧注射赋形剂作为对照，因此排除了对大量转基因小鼠和年龄匹配的同窝出生者对照获得统计学显著性的需要。将每种CSF立体定位注射到4只小鼠的海马中，而对侧注射人工脑脊髓液赋形剂(aCSF)。注射后7天处死小鼠。

引人注目的是，M-CSF注射造成整个治疗半球的可见肿胀，切片时更有脆性，并且在一只小鼠中，注射部位有明显的增生(图11C)。M-CSF和/或其受体在乳腺中的过表达已类似地导致肿瘤形成和增生(Kirma等人(2004))。与对照侧相比，M-CSF注射的半球中的淀粉样蛋白斑块载荷没有明显变化(数据未示出)。但是，Boissonneault等人(2009)公布，长期腹膜内(i.p.)注射M-CSF可预防并逆转淀粉样蛋白沉积和认知损害。这些作者还发现，使用表达GFP的骨髓，M-CSF诱导了骨髓源性小胶质细胞的显著蓄积(Boissonneault等人(2009))。这些数据与我们的差异指向不同研究长度和剂量效应，其中与我们5μg海马内推注相比，Boissonneault等人长期i.p.递送M-CSF，每次注射1.3μg。

与M-CSF相比，G-CSF注射未诱导肿胀，并显示淀粉样蛋白沉积适度减少(图12A和12B)，这通过研究同仁的独立观察得到确证(Sanchez-Ramos等人(2009))。但是，与对照半球相比，GM-CSF注射导致淀粉样蛋白显著减少(图13A-13D)，因此，我们所有随后的实验集中于研究GM-CSF在AD小鼠中的效应。对淀粉样蛋白斑块的定量揭示：对所有所测量的斑块参数，各小鼠均显著减少且总体显著减少(图6B和图14A-14D-1)。在所有4只小鼠的GM-CSF注射的半球中，费雷特直径和积分密度参数下降，这表明总斑块大小和密度评分同时下降。同一小鼠的各个切片之间以及不同小鼠之间的斑块沉积的下降百分比在8至62％的范围之内变化(数据为示出)，因此进一步突显每个脑中以及多只小鼠之间的淀粉样蛋白沉积的差异。

基于这些病理学数据，我们研究了皮下GM-CSF注射对AD病理学和认知功能的效应。在GM-CSF治疗之前，通过RAWM测试首次确认APPsw+PS1(Tg)小鼠对工作记忆有认知损害。将非转基因对照小鼠(NT)和Tg小鼠均再分成两个认知平衡的组，以用于GM-CSF或盐水治疗。注射后RAWM测试再次证实：与NT对照小鼠相比，Tg对照小鼠受到严重损害。这种损害不但在测试的各个区组中是明显的，而且在所有4天的测试中也是明显的(图7A-7D)。与此呈鲜明对比，在各个区组和全部中，GM-CSF治疗的Tg小鼠的表现与NT对照小鼠一样好或比其更好。GM-CSF治疗的NT小鼠的表现与NT对照一样好或比其略好(图7A-7D)。

在于认知干扰任务中进行评价之前，小鼠休息两天。此项任务模拟人干扰试验，其区分轻度认知损害(MCI)患者与老年对照，具有高准确度(Loewenstein等人(2004))。在经过4天测试评价的所有四个认知干扰量度中(图7E)，Tg对照小鼠相比于NT小鼠明显受到损害，用GM-CSF治疗的Tg小鼠相比于Tg对照表现出显著更好的3-试验回忆和延迟回忆。事实上，对于所有四个认知量度，GM-CSF治疗的转基因AD小鼠的表现与NT小鼠相似。在测试的前半部分期间，对前摄干扰量度而言，显示GM-CSF治疗在Tg小鼠中的效应特别强(图7F)，其中GM-CSF治疗的Tg小鼠的表现显著好于Tg对照并与两组NT小鼠相等。已经报道，对前摄干扰的易感性，相比于延迟回忆和遗忘率的传统量度，是区分MCI和AD患者与正常老年人的更为敏感的标志(Loewenstein等人(2004))。顺便提及，甚至GM-CSF治疗的NT小鼠也显示在行为研究中认知提高的趋势，尽管没有统计学显著性。随后对此项研究Tg小鼠的脑的分析揭示：与对照Tg小鼠相比，GM-CSF治疗诱导内嗅皮层(↓55％)和海马(↓57％)内的淀粉样蛋白载荷大量减少(图8E)。

GM-CSF治疗的Tg小鼠的认知功能改善和皮质淀粉样变性减少与CA1和CA3中的突触泡蛋白免疫反应性增加相平行(图9A-9E)，这显示这些海马区中的突触密度增加。先前的工作已经证明，海马齿状回(DG)中的成人神经干细胞表达GM-CSF受体，并且GM-CSF以剂量依赖性方式增加这些细胞的神经元分化(Kruger等人(2007))。因此，所观察到的GM-CSF诱导的认知改善的一种机理是海马中沉积的Aβ的移除增加，跟着发生DG苔状纤维神经分布向CA3的神经元生长/突触分化，导致进入CA1的Schaffer侧枝的神经分布/突触发生增加。沉积的Aβ从内嗅皮层中的移除也可增加对DG和CA1中海马投射域的穿透途径生存能力。因此，对工作记忆(短期)很重要的GM-CSF诱导的海马/内嗅皮层电路(circuitry)的增加，可成为GM-CSF逆转阿尔茨海默氏症Tg小鼠的工作记忆损害的基础。

实施例3

对四只10-12月龄的PS/APP小鼠立体定位注射，其中用5μgrmGM-CSF注射到脑的一个半球的海马中，用赋形剂(aCSF：人工脑脊髓液)对侧注射。使小鼠安乐死，用盐水灌注7天后，用10％福尔马林固定，以14μm进行冷冻切片或进行石蜡包埋并以5μm切片。标准免疫组织化学技术使用6E10和MabTech的抗-Aβ抗体标记淀粉样蛋白沉积。使用Axiovision软件在Zeiss ImagerZ1上进行显微镜检查和图像处理。利用ImageJ定量淀粉样蛋白沉积。

通过RAWM即一个工作记忆范例，对16只10-12月龄的PS/APP小鼠和16只年龄匹配的非转基因对照进行认知预测试。半随机选择每组的8只小鼠用于皮下注射(5μg/天)rmGM-CSF。另一半每天接受赋形剂(盐水)注射。预测试之后、每天注射开始之前有15天的休息期。将小鼠注射10天，然后进行4天的RAWM后测试。在6天的认知干扰任务测试之前有2天休息期。在测试期间自始至终给予注射，并在行为测试前1小时以上进行。由被隐瞒组身份的单独工作人员进行行为测试和分析。

结果：

海马内推注注射rmGM-CSF使在各自脑半球中的淀粉样蛋白斑块沉积减少多达60％。在rmGM-CSF皮下注射中，相比于对照具有认知损害的PS/APP小鼠，在标准RAWM任务中显著逆转了它们的认知损害。在认知干扰任务中，接受rmGM-CSF的PS/APP小鼠在所有4个认知量度方面显示与非转基因小鼠类似的结果。但是，在皮下研究中未观察到淀粉样蛋白斑块沉积减少。

GM-CSF显著逆转了体内阿尔茨海默病样病理学并且改善了认知。

应该理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例目的，并且将向本领域技术人员提出根据本发明作出的各种变更或改变，这些变更或改变包括在本申请的精神和视界以及所附权利要求的范围中。此外，本文所公开的任何发明或其实施方案的任意要素或限制可以与本文所公开的任何其它发明或其实施方案的任意和/或所有其它要素或限制(单个或以任何组合)组合，并且所有这些组合均包含在本发明的范围内，本发明并不限于这些组合。

参考

美国专利号4,559,157

美国专利号4,608,392

美国专利号4,820,508

美国专利号4,938,949

美国专利号4,992,478

美国专利号5,034,322

美国专利号5,106,739

美国专利号5,167,649

美国专利号5,625,136

美国专利号6,960,648

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美国公布的专利申请号20020120100

美国公布的专利申请号20030032594

国际申请号PCT/US08/73974

Akiyama，H.等人(2000)Inflammation and Alzheimer′s disease.Neurobiol Aging 21，383-421。

Altschul，S.F.等人(1990)“Basic Local Alignment Search Tool”J.Mol.Biol.215：403-410。

Altschul，S.F.等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：A New Generation of Protein Database Search Programs”，Nucl.Acids Res.25：3389-3402。

Arendash，GW等人(2001)“Progressive，age-related behavioral impairments in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes”，Brain Res 891：42-53。

Aren dash，GW等人(2007)“A diet high in omega-3 fatty acids does not improve or protect cognitive performance in Alzheimer′s transgenic mice”，Neuroscience 149：286-302。

Beltz，G.A.，Jacobs，K.A.，Eickbush，T.H.，Cherbas，P.T.，Kafatos，F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods”，Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[编辑]Academic Press，New York 100：266-285。

Boissonneault，V.等人(2009)Powerful beneficial effects of macrophage colony-stimulating factor on beta-amyloid deposition and cognitive impairment in Alzheimer′s disease.Brain 132，1078-1092。

Bundgaard，H.编辑(1985)Design of Prodrugs，Elsevier。

Bundgard，H.(1992)Advanced Drug Delivery Reviews，8：1-38。

Cox，C.A.等人(2008)Both Th1 and Th17 are immunopathogenic but differ in other key biological activities.J Immunol 180，7414-7422。

de Boer，H.A.，Comstock，L.J.，Vasser，M.(1983)“The tac promoter：a functional hybrid derived from the trp and lac promoters”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)：21-25。

El Khoury，J.等人(2007)Ccr2 deficiency impairs microglial accumulation and accelerates progression of Alzheimer-like disease.Nat Med 13，432-438。

Ethell，DW等人(2006)“Abeta-specific T-cells reverse cognitive decline and synaptic loss in Alzheimer′s mice”Neurobiol Dis 23：351-361。

Felgner，P.L.，T.R.Gadek，M.Holm，R.Roman，H.W.Chan，M.Wenz，J.P.Northrop，G.M.Ringold，M.Danielsen(1987)“Lipofection：a highly efficient，lipid-mediated DNA-transfection procedure”Proc Natl Acad Sci U.S.A.84(21)：7413-7417。

Fisher，J.W.(2003)“Erythropoietin：physiology and pharmacology update”Exp Biol Med(Maywood)，228(1)：1-14。

J，F.Chen，J.van Dorpe，R.M.Nitsch(2001)“Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42fibrils”Science，293(5534)：1491-5。

Griffin，W.S.等人(1989)Brain interleukin 1 and S-100immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease.Proc Natl Acad Sci USA 86，7611-7615。

Hickman，S.E.，Allison，E.K.和El Khoury，J.(2008)Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer′s disease mice.J Neurosci 28，8354-8360。

Higuchi，T.和Stella，V.(1987)“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，14A.C.S.Symposium Series，and Bioreversible Carriers in Drug Design，E.B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press。

Humpel，C.和Marksteiner，J.(2005)Cerebrovascular damage as a cause for Alzheimer′s disease.Curr Neurovasc Res 2，341-347。

Karlin S.，Altschul，S.F.(1990)“Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268。

Karlin S.，Altschul，S.F.(1993)“Applications and Statistics for Multiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。

Kirma，N.等人(2004)Overexpression of the colony-stimulating factor (CSF-1)and/or its receptor c-fms in mammary glands of transgenic mice results in hyperplasia and tumor formation.Cancer Res 64，4162-4170。

Koenigsknecht-Talboo，J.等人(2008)Rapid microglial response around amyloid pathology after systemic anti-Abeta antibody administration in PDAPP mice.J Neurosci 28，14156-14164。

Krogsgaard-Larsen和Bandaged，H.编辑(1991)A Textbook of Drug Design和Development，第5章“Design and Applications of Prodrugs”113-191。

Kruger，C.，Laage，R.，Pitzer，C.，Schabitz，W.R.和Schneider，A.(2007)The hematopoietic factor GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)promotes neuronal stem cells in vitro.BMC Neurosci 8，88。

Leizer，T.，Cebon，J.，Layton，J.E.和Hamilton，J.A.(1990)Cytoline regulation of colony-stimulating factor production in cultured human synovial fibroblasts：I.Induction of GM-CSF和G-CSF production by interleukin-1 and tumor necrosis factor.Blood 76，1989-1996。

Loewenstein，D.A.等人(2004)Semantic interference deficits and the detection of mild Alzheimer′s disease and mild cognitive impairment without dementia.J Int Neuropsychol Soc 10，91-100。

Ma，J.，Brewer，H.B.，Jr.和Potter，H.(1996)Alzheimer A β neurotoxicity：promotion by antichymotrypsin，ApoE4；inhibition by A beta-related peptides.Neurobiol Aging 17，773-780。

Malm，T.M.等人(2005)Bone-marrow-derived cells contribute to the recruitment of microglial cells in response to beta-amyloid deposition in APP/PS1 double transgenic Alzheimer mice.Neurobiol Dis 18，134-142。

Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。

Martin，B.K.等人(2008)Cognitive function over time in the Alzheimer′s Disease Anti-inflammatory Prevention Trial(ADAPT)：results of a randomized，controlled trial of naproxen and celecoxib.Arch Neurol 65，896-905。

McGeer，P.L.，Rogers，J.和Mcgeer，E.G.(2006)Inflammation，anti-inflammatory agents and Alzheimer disease：the last 12 years.JAlzheimers Dis 9，271-276。

Meyer-Luehmann，M.等人(2008)Rapid appearance and local toxicity of amyloid-beta plaques in a mouse model of Alzheimer′s disease.Nature 451，720-724。

Nakamura，H.等人(2000)High serum and synovial fluid granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)concentrations in patients with rheumatoid arthritis.Clin Exp Rheumatol 18，713-718。

Nakeya，N.等人(1984)Chem.Pharm.Bull.，32：692。

Nielsenw，N.M.和Bundgaard，H.(1988)“Glycolamide esters as biolabile prodrugs of carboxylic acid agents：Synthesis，stability，bioconversion，and physicochemical properties”J.Pharm.Sci.，77(4)：285-298。

Nilsson，L.N.等人(2004)Cognitive impairment in PDAPP micedepends on ApoE and ACT-catalyzed amyloid formation.Neurobiol Aging25，1153-1167。

Padmanabhan，J.，Levy，M.，Dickson，D.W.和Potter，H.(2006)Alpha1-antichymotrypsin，an inflammatory protein overexpressed in Alzheimer′s disease brain，induces tau phosphorylation in neurons.Brain129，3020-3034。

Parsonage，G.等人(2008)Prolonged，granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent，neutrophil survival followingrheumatoid synovial fibroblast activation by IL-17 and TNFalpha.Arthritis Res Ther 10，R47。

Potter，H.，Wefes，I.M.和Nilsson，L.N.(2001)The inflammation-induced pathological chaperones ACT and apo-E are necessary catalysts of Alzheimer amyloid formation.Neurobiol Aging 22，923-930。

Rapoport，M.，Dawson，H.N.，Binder，L.I.，Vitek，M.P.和Ferreira，A.(2002)Tau is essential to beta-amyloid-induced neurotoxicity.Proc Natl Acad Sci USA 99，6364-6369。

Rhodin，J.，Thomas，T.，Bryant，M.和Sutton，E.T.(2000)Animal model of Alzheimer-like vascular pathology and inflammatory reaction.Ann N YAcad Sci 903，345-352。

Ritchie，K.和S.Lovestone(2002)“The dementias”Lancet，360(9347)：1759-66。

Sanchez-Ramos，J.等人(2009)Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)Decreases Brain Amyloid Burdenand Reverses Cognitive Impairment in Alzheimer′s Mice.Neuroscience。

Schellekens，G.A.等人(2000)The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide.Arthritis Rheum 43，155-163。

Scheuner，D.等人(1996)Secreted amyloid beta-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer′s disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer′s disease.Nat Med 2，864-870。

Seitz，M.，Loetscher，P.，Fey，M.F.和Tobler，A.(1994)Constitutive mRNA and protein production of macrophage colony-stimulating factor  but not of other cytokines by synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients.Br J Rheumatol 33，613-619。

Simard，A.R.和Rivest，S.(2004)Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia.FASEB J 18，998-1000。

Simard，A.R.，Soulet，D.，Gowing，G.，Julien，J.P.和Rivest，S.(2006)Bone marrow-derived microglia play a critical role in restricting senile plaque formation in Alzheimer′s disease.Neuron 49，489-502。

Streit，W.J.，Braak，H.，Xue，Q.S.和Bechmann，I.(2009)Dystrophic (senescent)rather than activated microglial cells are associated with tau pathology and likely precede neurodegeneration in Alzheimer′s disease.Acta Neuropathol。

Szekanecz，Z.和Koch，A.E.(2007)Macrophages and their products in rheumatoid arthritis.Curr Opin Rheumatol 19，289-295。

van der Voort，R.等人(2005)Elevated CXCL16 expression by synovial macrophages recruits memory T cells into rheumatoid joints.Arthritis Rheum 52，1381-1391。

Widder，K.等人编辑(1985)Methods in Enzymology，Academic Press，42：309-396。

Wisniewski，T.，Castano，E.M.，Golabek，A.，Vogel，T.和Frangione，B.(1994)Acceleration of Alzheimer′s fibril formation by apolipoprotein E in vitro.Am J Pathol 145，1030-1035。

Wyss-Coray，T.(2006)Inflammation in Alzheimer disease：drivingforce，bystander或beneficial response？Nat Med 12，1005-1015。

Wyss-Coray，T.等人(2002)Prominent neurodegeneration and increased plaque formation in complement-inhibited Alzheimer′s mice.Proc Natl Acad Sci USA 99，10837-10842。

Xu，D.，McElroy，D.，Thornburg，R.W.，Wu，R.等人(1993)“Systemic induction of a potato pin2 promoter by wounding，methyl jasmonate，and abscisic acid in transgenic rice plants”Plant Molecular Biology 22：573-588。

Fisher，J.W.(2003)“Erythropoietin：physiology and pharmacology update”Exp Biol Med(Maywood)，228：1-14)。

Rogers，J.等人(2006)“Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes”Neurobiol Aging，27：1733-1739。

Cadman，E.D.和Puttfarcken，P.S.(1997)“Beta-amyloid peptides initiate the complement cascade without producing a comparable effect on the terminal pathway in vitro”Exp Neurol 146：388-394。

Helmy，K.Y.等人(2006)“CRIg：a macrophage complement receptor required for phagocytosis of circulating pathogens”Cell 124：915-927。

Czygier，M.，Lawicki，S.，Stankiewicz，I.& Szmitkowski，M.(2007)[Stem cell factor(SCF)in the plasma and phagocytic functions ofgranulocytes in breast cancer patients].Przegl Lek 64：1014-1017。

Claims (19)

1.用于治疗人或动物的认知损害的方法，包括向所述人或动物施用有效量的一种或多种炎症介质、或其基本上表现出与全长或非变体炎症介质相同的生物活性的功能片段或变体、或编码所述炎症介质的多核苷酸、或诱导所述炎症介质生成的化合物或活性剂，其中所述炎症介质能够跨越血脑屏障。

2.权利要求1的方法，其中所述炎症介质包括fms-相关酪氨酸激酶3(Flt3)配体、白介素-6(IL-6)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、低氧诱导的转录因子(HIF-1α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、阿法达贝泊汀(ARANESP)或金属蛋白酶中的一种或多种，或其基本上表现出与全长或非变体炎症介质相同的生物活性的功能片段或变体。

3.权利要求1的方法，其中所述炎症介质包括GM-CSF、或其基本上表现出与全长或非变体GM-CSF相同的生物活性的功能片段或变体。

4.权利要求1的方法，其中所述炎症介质包括GM-CSF的生物等效物。

5.权利要求1的方法，其中所述炎症介质能够降低所治疗的人或动物的血浆或脑中的淀粉样蛋白β水平。

6.权利要求3的方法，其中所述GM-CSF能够减少所治疗的人或动物的血浆或脑中的神经缠结。

7.权利要求1的方法，其中所述认知损害由阿尔茨海默病引起或产生。

8.权利要求1的方法，其中颅内施用所述炎症介质。

9.权利要求1的方法，其中通过颅内输注施用所述炎症介质。

10.权利要求1的方法，其中向非神经细胞或组织施用所述炎症介质。

11.权利要求1的方法，其中所述方法还包括在治疗之前评价人或动物的认知损害。

12.权利要求1的方法，其中所述组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂、或溶质。

13.权利要求1的方法，其中在表达构建体中提供所述多核苷酸。

14.权利要求13的方法，其中所述表达构建体提供了所述多核苷酸在神经细胞中的表达。

15.权利要求14的方法，其中所述神经细胞是人细胞。

16.权利要求1的方法，其中诱导所述炎症介质生成的所述化合物或活性剂是EPO或HIF-1α。

17.权利要求1的方法，其中所述认知损害由中风、唐氏综合征、拳击手痴呆、创伤性脑损伤、AIDS相关性痴呆、路易体病或皮克病引起或产生。

18.权利要求1的方法，其中向所述人或动物施用i)G-CSF和/或GM-CSF以及ii)阿法达贝泊汀和/或EPO。

19.试剂盒，其在一种或多种容器中包含一种或多种如前述权利要求中任一项所定义的炎症介质、多核苷酸或组合物。

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