CN1032814A - 植物组织的培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种培养植物组织的方法，利用含有磷脂作为动 员细胞中钙离子的物质的培养基培养植物的组织切 段或培养的细胞。此方法可用于高效率地大量培养 高质量的植物体，因此能用于植物的大量繁殖。

Description

本发明涉及根据特殊程序培养植物组织的方法，具体说是涉及适于使植物进行大量繁殖的方法。
蔬菜如卷心菜、蕃茄、土豆、天门冬、胡萝卜、大豆、洋葱等以及稻米被用作食品，而郁金香、蓝猪耳、复活节百合（Easterlily）、矢车菊、金光菊等，人们则喜欢用来作为观赏植物。迄今为止，这些植物的增殖都是通过播种、鳞茎分裂、块茎分裂等进行的。但这些增殖方法不仅需要许多人力和土地，而且，由于近年来病毒疾病的漫延，还会降低种子和籽苗的生长速率及花的质量。此外，为了种植及保持具有优良性质的品种，也可使植物进行无性繁殖。最近，已有了一些关于利用植物组织培养技术解决这些问题和提高增殖效率的报道（例如公开号为15734/1980的日本专利申请）。还考虑过通过下述组织培养技术完成增殖，即使来自培养的组织切段或培养细胞的不定芽、不定胚、鳞茎等进行分化，用作为植物激素的生长素和细胞激动素的浓度比例控制分化（Annals    of    Botany，Vol.45，pp.321-327，1980）。然而，有许多种植物仅仅使用植物激素不会产生分化，即使发生分化，有些植物的分化频率也很低，因此，期望建立一种更为直接和有效的诱导分化的方法。
认识到培养植物组织的常规方法存在前述各种问题后，本发明者研究了一种不同于常规方法而是基于一种新程序的植物组织培养法，尤其是一种与常规方法相比，适合于使植物高效率增殖的方法。
作为其研究结果，本发明者发现了一种物质，它能促进不定芽、不定胚和植物鳞茎的分化。在此发现的基础上，他们发现了适于使植物高效率增殖的植物组织培养法。
这就是说，本发明的目的是提供一种植物组织的培养方法，其特征在于在一种培养基中培养植物的组织切段或培养细胞，该培养基中含有一种能动员细胞中钙离子的物质。
使用本方法培养植物组织，与常规方法相比较，能够由植物的组织切段或培养细胞高效率地大量培养高质量的植物体，从而使植物能够大量增殖。
在本发明之前，本发明者发现，在进行组织培养时，如果使钙离子由细胞之外进入植物细胞，则会促进植物细胞分化成不定芽或不定胚。基于这种发现，他们向日本专利局提交了申请号为157809/1987和165196/1987的专利申请。在本发明中，他们继续了该项工作，并发现在进行植物组织培养时如果使用某种物质也能够促进植物细胞的分化，该物质能使原来位于和聚积于细胞中特殊细胞器上的钙离子转移至胞质中，从而活化钙离子，所以即使进行组织培养时没有通过向培养基中加入钙离子以从外部向细胞内转移钙离子时也行，由此发现他们完成了本发明。
在下面的描述中，为方便之故，钙离子向细胞质中的转移将称为“动员细胞中的钙离子”。
能够应用本发明的组织培养法的植物没有特别限制。也就是说，本方法能够应用于所有植物。
作为能够应用本方法的植物的实例，可以列举属于下列目的植物：茄目、罂粟目、伞形目、蔷薇目、百合目、菊目、
Figure 881072656_IMG1
牛儿苗目、禾本目等。作为这些植物的具体实例，可以列举的有《植物系统的分类基础》（T.Yamagishi编，Hokuryukan，1974）中所述的植物。作为其中更为具体的实例，可以列举的有属于茄目的植物如茄子、蕃茄、土豆、烟草等;属于罂粟目的植物如卷心菜、日本萝卜等，属于伞形目的植物如胡萝卜、绉叶欧芹等;属于蔷薇目的植物如玫瑰、草莓、大豆等;属于百合目的植物如洋葱、郁金香、复活节百合等;属于菊目的植物如菊花、矢车菊、向日葵等;属于
Figure 881072656_IMG2
牛儿苗目的植物如老鹳草、亚麻等以及属于禾本目的植物如水稻、玉米等。在这些植物中，可以作为优选植物的具体实例列举的有蕃茄、茄子、蓝猪耳、胡萝卜、卷心菜、洋葱、紫苏、大豆、矢稻铡⒔鸸饩铡⒏椿罱诎俸稀⒂艚鹣恪⑻烀哦⒀锹椤⑺镜取?
在本发明中，可以使用植物的组织切段或培养细胞进行植物的组织培养。
作为组织切段的具体实例，可以列举的通过切割得到的植物组织切段有子叶、下胚轴、茎尖、茎、叶、鳞片、根或其他组织的切段。这些组织切段通常用次氯酸钠和乙醇使有关植株消毒后再收集和使用。但如果使用无菌培养的植株，则不必进行上述消毒步骤。在增殖没有疾病或病毒的植株时，可以使用顶端分生组织的邻近组织、得自顶端分生组织的邻近组织的植株的上述组织切段作为培养材料。可用于本发明植物组织培养的培养细胞有包括愈伤组织在内的未分化的变形细胞，愈伤组织可通过众所周知的方法培养上述组织切段得到。通过培养植物的组织切段或培养细胞形成植物时，本发明采用了下面详述的方法。
在本发明的组织培养法中，用于培养植物的组织切段或培养细胞的培养基含有一种能动员细胞中钙离子的物质。作为这种物质，可以列举的有磷脂。此处的磷脂是指花生四烯酸、前列腺素、甘油磷脂等，尤其优选的是甘油磷脂。甘油磷脂的具体实例包括磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、作为合成磷脂的二油精等。本发明的组织培养法所用的培养基中至少含有一种由上述磷脂中选出的化合物。根据该方法，植物的组织切段或培养细胞至不定芽、不定胚和鳞茎的分化得到显著促进。上述使用含有特异化合物的培养基进行组织培养以促进分化的方法是由本发明者完成的一个新发现。
在本发明中，用来加入上述特异化合物（例如磷脂酸或其类似物）的培养基含有无机组分，作为基本组分的碳源、植物激素、维生素等，如果需要的话还含有氨基酸。作为培养基的无机组分，可以列举的无机盐类所含元素有例如氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘、钴、铜等。具体地说，可以作为例子的化合物有例如硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸铵、三氧化钼、钼酸钠、碘化钾、硫酸锌、硼酸、氯化钴等。
作为培养基的碳源，可以作为例子的有碳水化合物如蔗糖或其类似物及其衍生物、有机酸如脂肪酸或其类似物、一级醇如乙醇或其类似物等。
作为培养基的植物激素，可以作为例子的有生长素如1-萘乙酸（NAA）、3-吲哚乙酸（IAA）、对-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、3-吲哚丁酸（IBA），及它们的衍生物等，以及细胞激动素如6-苄基腺嘌呤（BA）、激动素、玉米素等。
作为培养基的维生素，可以作为例子的有生物素、硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺、核黄素（维生素B2）等。
作为培养基的氨基酸，可以作为例子的有甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸等。
用来加入上述组分的本发明的上述培养基最好以下述浓度加入：无机组分大约0.1μM至约100mM;碳源大约1至约100g/l;植物激素0.01至约10mg/l;维生素大约0.1至约150mg/l;氨基酸为0至大约1，000mg/l。
作为用于本发明组织培养的上述培养基的具体实例，可以列举的有通过下述方法制备的培养基：即在公知的植物组织培养的常规培养基中如Murashige-Skoog氏培养基（′62）、White氏培养基（′63）、Gamborg氏B-5培养基、Mitsui氏M-9培养基、Nitsch-Nitsch氏培养基等，加入上述碳源和植物激素，如果需要的话还要加入上述维生素和氨基酸。在这些培养基中，特别优选使用的是通过利用Nitsch-Nitsch氏培养基、Linsmaier-Skoog氏培养基或Murashige-Skoog氏培养基而制备的培养基。顺便指出，上述公知的常规培养基的组成见（例如）《植物细胞的组织培养》（H.Harada    and    A.Komamine，pp.390-391，Rikougakusha，1979）。
上述可用于本发明的培养基是液体培养基或通常含有0.2-1.5%琼脂或0.2-0.4%凝胶石（gellite）的固体培养基。
在本发明中，加入上述培养基中的磷脂浓度的范围一般是10-9-10-5M，优选范围为10-7-10-5M。
在本发明中，与本申请者提交的128348/1985号日本专利申请（公开号为285928/1986）相似，可以使用通有含氧气的液体培养基培养植物的组织切段或培养细胞。
根据本发明的方法，能够由植物的组织切段或培养细胞高效率地得到大量不定芽、不定胚、子代鳞茎（小鳞茎）等。进一步，使通过本方法得到的不定芽和不定胚生根以形成植物体，然而将其切成组织切段。由本方法得到的子代鳞茎也切成组织切段。这些组织切段通过本发明的上述组织培养法进一步培养，从而能使种子和籽苗大量繁殖。顺便指出，本发明得到的植株可通过普通的栽培方法长成具有相同性质的完整植株体。
实例
在下面的实例和比较实例中，具体描述了本发明的步骤和效果。
实例1-8
从无菌培养的复活节百合的鳞茎上采集鳞片并切成2mm宽的切段。另一方面，制备无菌的Murashige-Skoog氏固体培养基（1962）（pH5.7，凝胶石浓度0.2%），它含有4%蔗糖、10-7M1-萘乙酸、10-7M6-苄基腺嘌呤和由磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和二油精中选出的一种化合物（作为本发明的特殊化合物）。将上述制备的复活节百合鳞片切段置于上述培养基上，在光照下于25℃培养5星期。表1给出了在每个处理样品中每个鳞片分化的鳞茎数。
与下述比较实例1相比较，每一个处理样品中得到的分化的鳞茎数都有增加。
比较实例1
用与实例1相同的方式进行复活节百合鳞片切段的组织培养，只是所用培养基中不含本发明的特殊化合物。结果示于表1中。
实例9-16
用与实例1-8相同的方式进行复活节百合鳞片切段的组织培养，只是所用的Murashige-Skoog氏培养基中不含钙离子，而且，为了去掉细胞外的钙离子，向培养基中加入0.8mM乙二醇乙胺醚四乙酸。结果示于表2中。
培养一星期后，用Queen2作为专一于钙离子的荧光试剂使切段染色，利用显微光度计测量细胞中的钙离子浓度。
由表2清楚可见，虽然培养基中不含钙离子，但通过向培养基中加入磷脂，细胞中的钙离子被动员并促进了分化。
比较实例2
用与实例9相同的方式培养复活节百合鳞片切段，只是所用培养基不含本发明的特殊化合物。结果示于表2中。
实例17-35
用与实例1相同的方式进行组织培养，只是所用材料为蕃茄愈伤组织细胞、蓝猪耳下胚轴切段、天门冬茎切段、茄子下胚轴切段、紫苏叶切段、矢车菊下胚轴切段、金光菊叶切段和亚麻茎切段。结果示于表3中。
在所有处理样品中，分化的不定芽数目都比下述比较实例3-10的高。
比较实例3-10
用与实例17-35相同的方式进行蕃茄愈伤组织细胞、蓝猪耳下胚轴切段、天门冬茎切段、茄子下胚轴切段、紫苏叶切段、矢车菊下胚轴切段、金光菊叶切段和亚麻茎切段的组织培养，只是所用培养基不含本发明的特殊化合物。结果示于表3中。
实例36-42
用与实例1相同的方式进行组织培养，只是所用材料为卷心菜愈伤组织细胞、大豆愈伤组织细胞、水稻愈伤组织细胞和胡萝卜下胚轴切段。结果示于表4中。
在所有处理样品中，分化的不是芽数目都比下述比较实例11-14的高。
比较实例11-14
用与实例36-42相同的方式进行卷心菜愈伤组织细胞、大豆愈伤组织细胞、水稻愈伤组织细胞和胡萝卜下胚轴切段的组织培养，只是所用培养基不含本发明的特殊化合物。结果示于表4中。
实例43-46
用与实例1相同的方式进行组织培养，只是所用材料为洋葱鳞片切段和郁金香鳞片切段。结果示于表5中。
在所有处理样品中，分化的不定芽数目都比下述比较实例15和16的高。
比较实例15和16
用与实例43-46相同的方式进行洋葱鳞片切段和郁金香鳞片切段的组织培养，只是所用培养基不含本发明的特殊化合物。结果示于表5中。
Figure 881072656_IMG3
Figure 881072656_IMG4
Figure 881072656_IMG5

Claims (3)

1、一种植物组织的培养方法，其特征在于用含有能动员细胞中钙离子物质的培养基培养植物的组织切段或培养细胞。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于其中动员细胞中钙离子的物质是磷脂。
3、根据权利要求2的方法，其特征在于其中的磷脂是磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱或磷脂酰甘油。
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