JPH0740843B2

JPH0740843B2 - 植物の組織培養方法

Info

Publication number: JPH0740843B2
Application number: JP62266519A
Authority: JP
Inventors: 静史谷本; 高橋　　滋
Original assignee: 三井石油化学工業株式会社
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1987-10-23
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: KR890006813A; DK587888A; CA1305085C; KR920004253B1; AU621562B2; ATE76251T1; EP0313402A1; EP0313402B1; CN1016515B; JPH01108920A; DE3871322D1; DK587888D0; AU2399688A; CN1032814A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は植物を特定の方法によって組織培養することに
関し、特に種苗を大量に増殖するのに適した方法に関す
る。

〔従来の技術〕

キャベツ、トマト、ジャガイモ、アスパラガス、ニンジ
ン、ダイズ、タマネギなどの野菜類やイネは食用として
利用されており、またチューリップ、トレニア、鉄砲ユ
リ、ヤグルマギク、ルドベキアなどは園芸植物として鑑
賞用に愛好されている。これらの植物の増殖は、従来、
播種、球根分割、塊茎分割などによって行われてきた。
しかし、このような増殖法は多くの人手と土地を必要と
するばかりでなく、近年ではウイルス病の蔓延により種
苗の生育速度の低下や花の品質低下が問題となってい
る。また、優良形質を持つ品種を育成維持するために
は、栄養繁殖を行わせることが有効である。これらの問
題点を改良し、植物効率の向上を目的として近年植物組
織培養技術を利用した方法も報告されている（例えば特
開昭55-15734号公報）。組織培養技術による増殖は培養
組織片、培養細胞からの不定芽、不定胚、球根等の分化
をへて達成され、またこれらの分化は植物ホルモンであ
るオーキシンとサイトカイニンの濃度比によって制御さ
れていると考えられてきた（例えばAnnals of Botany,v
ol 45,321-327,1980年）。しかし、植物ホルモンのみで
は分化が起こらない植物種や分化が起こったとしてもそ
の頻度が非常に低い植物種も多数存在し、より直接的か
つ効果的な分化誘導方法の確立が期待されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは従来の植物の組織培養方法には前記した種
々の問題点のあることを認知した上で、従来法とは異な
る新規な方法によって植物を組織培養する方法、特に、
植物の種苗を従来に比べて効率良く増殖するのに適した
方法について検討した。

〔問題点を解決するための手段〕

その結果、本発明者らは植物の細胞に作用して該植物の
不定芽、不定胚および球根の分化を促進させる物質を見
出し、これらの知見を基にして植物の種苗を効率良く増
殖するのに適した植物の組織培養方法を見出した。すな
わち本発明の方法によれば、植物の組織片または培養細
胞を細胞内のカルシウムイオンを動員する物質を含む培
地を用いて組織培養することを特徴とする植物の組織培
養方法が提供される。

本発明者らは先に、組織培養の際に植物細胞の細胞中に
細胞の外部からカルシウムイオンを細胞内へ導入して組
織培養を行うと植物細胞の不定芽、不定胚への分化が促
進されることを見出し、特願昭62-165196号及び同62-15
7809号として出願した。本発明においては、さらに研究
をすすめ、培地中にカルシウムイオンを存在させて培養
して外部から細胞内へカルシウムを導入しなくても、も
ともと細胞内の特定の場所に局在して蓄積されているカ
ルシウムイオンをその局在場所から細胞質内へ移動させ
てカルシウムを活性化する物質を用いて植物の組織培養
を行えば分化が促進されることを見出し、本発明を完成
した。なお以後の説明においてこのカルシウムの細胞質
内への移動を便宜上細胞内のカルシウムイオンを動員す
ると表現する。

本発明に係わる組織培養方法が適用できる植物は、特に
限定はされず、全ての植物に対して適用できる。

本発明の方法が適用できる植物として具体的にはナス
目、ケシ目、セリ目、バラ目、ユリ目、キク目、フクロ
ソウ目、イネ目などに属する植物を例示できる。更に該
植物として、具体的には、山岸編「植物系統分類の基
礎」北隆館、1974年に記載されている植物を例示でき、
より具体的にはナス目に属する植物としては、ナス、ト
マト、ジャガイモ、タバコなどが、ケシ目に属する植物
として、キャベツ、ダイコンなどが、セリ目に属する植
物として、ニンジン、パセリなどが、バラ目に属する植
物として、バラ、イチゴ、ダイズなどが、ユリ目に属す
る植物として、タマネギ、チューリップ、鉄砲ユリなど
が、キク目に属する植物として、キク、ヤグルマギク、
ヒマワリなどが、フウロソウ目に属する植物として、フ
ウロソウ、アマなどが、イネ目に属する植物として、イ
ネ、トウモロコシなどが示される。これらの植物の中で
も好ましい植物として具体的にはトマト、ナス、トレニ
ア、ニンジン、キャベツ、タマネギ、シソ、ダイズ、ヤ
グルマギク、ルドベキア、鉄砲ユリ、チューリップ、ア
スパラガス、アマ、イネ等を例示できる。

本発明では植物の組織培養は該植物の組織片または培養
細胞を用いて行うことができる。該組織片として具体的
には子葉、胚軸、茎頂、茎、葉、リン片、根、またはそ
の他の組織を小片に切断した植物の組織片を例示するこ
とができ、これらの組織片は通常、植物を次亜鉛素酸ソ
ーダやエチルアルコールによって殺菌した後に採取して
使用される。しかし、無菌的に栽培した植物を使用する
場合には、上記の殺菌操作は不要である。また、無病・
無ウイルスの植物の種苗を増殖する場合には、培養材料
として生長点近傍組織、生長点近傍組織から得られた植
物の前述した組織片などを用いることができる。本発明
の植物の組織培養において用いることのできる培養細胞
とは、前記組織片を公知の方法によって組織培養するこ
とによって得られるカルス組織を含めた未分化の不定形
細胞である。

本発明において植物の組織片または培養細胞を組織培養
して植物の種苗を形成させるに当って以下に詳述する方
法が採用される。

本発明に係わる組織培養方法では、植物の組織片または
培養細胞を細胞内のカルシウムイオンを動員する物質を
含む培地を用いて組織培養する方法が用いられる。この
ような物質としてはリン脂質があげられる。ここでリン
脂質とは、、アラキドン酸やプロスタグランディン類、
グリセロリン脂質等であるが、特にグリセロリン脂質を
用いることが好ましく、具体的には、フォスファチジン
酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシ
トール、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエ
タノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファ
チジルグリセロール、合成リン脂質であるディオレイン
等であり、これらから選ばれる少なくとも１種の化合物
を添加した培地を用いて組織培養する方法が用いられ
る。該方法によれば植物の組織片または培養細胞からの
不定芽、不定胚および球根への分化が著しく促進され
る。このような特定の化合物を添加した培地を用いて組
織培養を行うと分化が促進されるということは本発明者
に係わる新規な知見である。

本発明では前記したフォスファチジン酸等の特定の化合
物を添加するのに使用される培地は、無機成分および炭
素源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン
類を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培
地である。該培地の無機成分としては、窒素、リン、カ
リウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、イオ
ウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、
ヨウ素、コバルト、銅等の元素を含む無機塩を挙げるこ
とができ、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、
硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸１水素カ
リウム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、
塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸
第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸アンモニ
ウム、三酸化モリブデン、モリブデン酸ナトリウム、ヨ
ウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化
合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（NAA）、インドール酢酸（IAA）、ｐ−クロロフエ
ノキシ酢酸、2,4−ジクロロフエノキシ酢酸（2,4−
Ｄ）、インドール酪酸（IBA）およびこれらの誘導体等
のオーキシン類およびベンジルアデニン（BA）、カイネ
チン、ゼアチン等のサイトカイニン類を例示できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンB₁）、ピリドキシン（ビタミンB₆）、パントテン
酸カルシウム、アルコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシ
トール、ニコチン酸、ニコチン酸アミド及びリボフラビ
ン（ビタミンB₂）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン、グルタミン酸、システィン、フエニー
ルアラニン、プロリンおよびリジンなどを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約0.1μ
Ｍないし約100mM、前記炭素源を約1g/lないし約100g/
l、前記植物ホルモン類を0.01mg/lないし約10mg/l、前
記ビタミン類を約0.1mg/lないし約150mg/lおよび前記ア
ミノ酸類を０ないし約1000mg/l含ませて使用されること
が望ましい。

本発明に係わる組織培養に用いられる前記培地として具
体的には、従来から知られている植物の組織培養に用い
られている培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（'62）
［Murashige＆Skoog］の培地、リンスマイヤー・スクー
グ（RM-1965）［Linsmaier＆Skoog］の培地、ホワイト
（'63）［White］の培地、ガンボルグ［Gamborg］のＢ
−５培地、三井のＭ−９培地、ニッチ・ニッチの培地
［Nitsoh＆Nitsoh］等に前記した炭素源および植物ホル
モンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミン類、
アミノ酸類を添加して調製される培地を例示できるが、
本発明ではこの中でも特にニッチ・ニッチ、リンスマイ
ヤー・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いて
調製される培地が好ましい。なお、上記した従来公知の
培地の組成に関しては、例えば、原田、駒嶺著の「植物
細胞組織培養」p390〜p391、理工学社、1979年に記載さ
れている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天を通常
0.5〜1.5％もしくはゲルライトを通常0.2〜0.4％含有さ
せた固形培地である。

本発明では前記した培地に添加されるリン脂質の培地に
おける濃度は通常10^-9〜10^-5M/l、好ましくは10^-7〜10
^-5M/lの範囲にある。

本発明では前記した植物の組織片又は培養細胞は、本出
願人に係わる特願昭60-128348号と同様に酸素含有気体
を通気させた液体培地を用いて組織培養することもでき
る。

本発明の方法によれば、植物の組織片または培養細胞か
ら不定芽、不定胚、子球（小球根）などを効率良く多量
に得ることができる。この点について更に言及すると、
本発明の方法によって得られる不定芽、不定胚は、これ
を発根させ植物体とした後細断して組織片とし、また子
球も同様に切断して、これらを更に本発明に係わる前記
した培養方法によって組織培養し、種苗を大量に増殖す
ることができる。尚、本発明で得られた植物は通常の栽
培を行うと、性質が一定で健全な植物体に生長させるこ
とができる。

〔実施例〕

以下、実施例を用いて本発明の構成および効果を具体的
に説明する。

実施例１〜８無菌的に育成した鉄砲ユリの球根からリン片を採取して
幅2mmの切片とした後に、ショ糖４％、ナフタレン酢酸1
0^-7Ｍ、ベンジルアデニン10^-7Ｍ、および本発明に係わ
る特定の化合物としてフォスファチジン酸、リゾフォス
ファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォス
ファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリ
ン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセ
ロールおよびディオレインから選ばれる化合物を表１に
示した濃度で含有するpH5.7の無菌のムラシゲ・スクー
グ（1962年）の固形培地（ゲルライト濃度0.2％）を調
製し、これに先の鉄砲ユリのリン片切片を置床して、25
℃で明所で５週間培養したところ切片当たりの球根の分
化数として表１に示す結果を得た。いずれも処理した試
料では分化して得られる球根数は比較例１に比べて増加
した。

比較例１実施例１において培地として本発明に係わる特定の化合
物を含有しない以外は該実施例と同様にして鉄砲ユリの
リン片切片を組織培養した結果を表１に示した。

実施例９〜16 実施例１〜８において培地としてカルシウムを含まない
ムラシゲ・スクーグの培地を用い、さらに細胞外のカル
シウムを除去するために0.8mMのエチレングリコールア
ミノエチルエーテル四酢酸を加えた以外は該実施例と同
様にして鉄砲ユリのリン片切片を組織培養した結果およ
び、培養１週間後に切片をカルシウムイオンに特異的な
螢光試薬であるクイーン２で染色して顕微測光装置で細
胞内のカルシウムイオン濃度を測定した結果を表２に示
した。

表２より、培地中にカルシウムイオンを含まなくても、
リン脂質を培地中に含有させることにより細胞内にカル
シウムイオンが動因され、分化が促進されることがわか
る。

比較例２実施例９において培地として本発明に係わる特定の化合
物を含有しない以外は該実施例と同様にして鉄砲ユリの
リン片切片を培養した結果を表２に示した。

実施例17〜35 実施例１において、材料としてトマトカルス細胞、トレ
ニア胚軸切片、アスパラガス茎切片、ナス胚軸切片、シ
ソ葉切片、ヤグルマギク胚軸切片、ルドベキア葉切片、
アマ茎切片を用いる以外は該実施例１と同様にして組織
培養した結果、表３に示す結果を得た。いずれも処理し
た試料では分化する不定芽数は比較例３〜10に比べて増
加した。

比較例３〜10 実施例17〜35において、培地として本発明に係わる特定
の化合物を含有しない以外は該実施例と同様にしてトマ
トカルス細胞、トレニア胚軸切片、アスパラガス茎切
片、ナス胚軸切片、シソ葉切片、ヤグルマギク胚軸切
片、ルドベキア葉切片、アマ茎切片を組織培養した結果
を表３に示した。

実施例36〜42 実施例１において、材料としてキャベツカルス細胞、ダ
イズカルス細胞、イネカルス細胞、ニンジン胚軸切片を
用いる以外は該実施例と同様にして組織培養した結果、
表４に示す結果を得た。いずれも処理した試料では分化
する不定胚数も比較例11〜14に比べて増加した。

比較例11〜14 実施例36〜42において、培地として本発明に係わる特定
の化合物を含有しない以外は該実施例と同様にしてキャ
ベツカルス細胞、ダイズカルス細胞、イネカルス細胞、
ニンジン胚軸切片を組織培養した結果を表４に示した。

実施例43〜46 実施例１において、材料として、タマネギリン片切片、
チューリップリン片切片を用いる以外は該実施例と同様
にして組織培養した結果を表５に示す。いずれも処理し
た試料では分化する球根数も比較例15〜16に比べて増加
した。

比較例15〜16 実施例43〜46において、培地として本発明に係わる特定
の化合物を含有しない以外は該実施例と同様にしてタマ
ネギリン片切片、チューリップリン片切片を組織培養し
た結果を表５に示した。

〔発明の効果〕本発明の植物の組織培養方法を用いれば、植物の組織片
又は培養細胞から従来法に比べて効率良く高品質の植物
体を大量に培養することができ、種苗を多量に増殖する
ことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物の組織片または培養細胞を、細胞内の
カルシウムイオンを動員する物質を含む培地を用いて組
織培養することを特徴とする植物の組織培養方法。
【請求項２】細胞内のカルシウムイオンを動員する物質
がリン脂質である特許請求の範囲第（１）項記載の植物
の組織培養方法。
【請求項３】リン脂質がフォスファチジン酸、リゾフォ
スファジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォス
ファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミ
ン、フォスファチジルコリンもしくはフォスファチジル
グリセロールである特許請求の範囲第（２）項記載の植
物の組織培養方法。