CN103642829B - 一种高效率基因定向克隆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高效率基因定向克隆的方法。该方法利用Topoisomerase？I室温下5分钟快速连接以及体外环化原理实现高效率定向克隆的方法。该方法包括：带有Topoisomerase？I酶识别位点以及定向序列的载体、定向引物的设计、PCR片段的制备、以及构建目标基因的重组载体。由于所用载体带有原核表达载体的所有调控元件，因此，PCR产物可以连接该载体，经PCR鉴定后无需确定目的基因的连接方向，即可直接用于原核表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域一种高效率的基因定向克隆的方法。
背景技术
基因克隆技术是分子生物学中一项重要技术，国内外专家学者探索了很多不同的克隆方法，有非定向克隆和定向克隆，并且相应的建立了多种载体。由于非定向克隆的方法虽然操作简便，能够得到较高的克隆数，但是后续的鉴定工作比较复杂，目前较为常用的定向克隆包括2种方法：
(1)传统的T4DNA连接酶连接法
限制性酶切载体以及片段产生互补配对的粘性末端，在T4DNA连接酶作用下形成重组分子。其原理是：在目的基因片段的两端分别设计两个酶切位点(与载体上的酶切位点相同，确保片段插入方向正确)，后利用特定的限制性内切酶，分别对载体及PCR产物的片段进行双酶切后用T4DNA连接酶进行连接。该方法的缺点是：1、载体和片段包含酶切位点。目的基因片段需要根据载体的酶切位点进行比对和序列分析，确保序列内部无选定的酶切位点，设计引物，给片段的两端分别加上酶切位点和保护碱基，再次PCR后，得到带有酶切位点的基因片段序列。2、酶切后，需要对PCR产物进行纯化，该过程可采用柱式法或割胶法，耗时较长，且在一定程度上可能损伤DNA片段，或导致突变。3、T4DNA连接酶作用时间较长，一般需要再特定反应温度下，需要反应过夜或多个小时才能完成片段的连接。4、T4DNA连接酶与片段和载体的三分子碰撞连接，其三分子同时碰撞的几率与成功性都较低。
(2)DNA拓扑异构酶法
1990年，美国科学家ShumanS.发现牛痘病毒DNA拓扑异构酶I，1991年他证明该酶特异性地识别CCCTT，而且在2分钟之内可以完成80％的连接反应，从而为应用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I进行快速分子克隆提供了理论基础(SekiguchiJ，ChengC，ShumanSKineticanalysisofDNAandRNAstrandtransferreactionscatalyzedbyvacciniatopoisomerase.JBiolChem.1997Jun20；272(25)：15721-8)。
1999年，ShumanS.证明DNA和DNA拓扑异构酶I共价偶联的效率在室温5分钟可以达到93％(ChengC，ShumanS.Site-specificDNAtransesterificationbyvacciniatopoisomerase：roleofspecificphosphatesandnucleosides.Biochemistry.1999Dec14；38(50)：16599-612)。由于Topoisomerase的突出性能，它已被成功应用于TA克隆和定向克隆。
以Invitrogen公司利用TopoisomeraseI实现定向克隆为例，其设计原理为载体一端为4个碱基突出端，另一端为平末端，当平端插入片段与载体连接时，平端片段5’-OH攻击突出端，实现连接。这种方法虽然能实现定向克隆，但克隆效率低(www.invitrogen.com)。另外，ChengC，2000年报道，利用拓扑异构酶I引发的内源双链DNA断裂损伤修复途径——重组侧翼连接途径实现定向克隆(ChengC，ShumanS.RecombinogenicflapligationpathwayforintrinsicrepairoftopoisomeraseIB-induceddouble-strandbreaks.MolCellBiol.2000Nov；20(21)：8059-68)。在这一途径中，牛痘病毒拓扑异构酶共价结合于DNA平末端，并催化其同具有5’缩进和3’突出尾部的DNA双链的共价连接。该方法的缺点是用“flap”随机攻击DNA双链，因而克隆效率低。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种利用TopoisomeraseI室温下5分钟快速连接以及体外环化原理实现高效率定向克隆的方法。该方法优点：通过特定引物设计，与特定的载体连接，5分钟可以完成定向克隆，克隆效率达100％，而且不受克隆基因序列的限制。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种高效率基因定向克隆的方法，该方法包括以下步骤：
1.载体准备：所述载体一端为偶联拓扑异构酶I的平末端，另一端为包含6个碱基的突出端的定向克隆或表达载体；
2.引物设计
一条引物为非定向引物，另一条引物为定向引物，其中，所述常规引物为无额外碱基和无磷酸化的与插入片段DNA互补的引物，所述定向引物的5’端依次为与步骤(1)中载体上突出端的6个碱基互补配对的碱基序列和拓扑异构酶I识别位点的互补序列“AAGGG”，且磷酸化；
(3)PCR扩增，获得插入片段DNA
使用步骤(2)的引物对模板DNA进行PCR扩增；
(4)反应
将载体，插入片段DNA，拓扑异构酶I混合，室温5分钟，获得环化产物。
在此步骤中，三个反应同时发生，(1)不包含额外序列，无磷酸基的插入片段一端与偶联TopoisomeraseI的载体的一端连接，包含额外碱基以及磷酸基的插入片段一端，由于其磷酸基的存在，无法和偶联了TopoisomeraseI载体的一端发生连接；(2)TopoisomeraseI识别插入片段TopoisomeraseI位点，发生切割反应产生6个碱基的粘性末端。(3)自我环化，6个碱基的粘性末端和载体的粘性末端互补配对，发生环化。如图2所示。
进一步地，步骤(1)中，载体的全长序列如序列表SEQIDNO.1所示。
进一步地，所述拓扑异构酶I识别位点为“CCCTT”。进一步地，上述方法还包括：将步骤(4)获得的环化后产物转入大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，然后鉴定阳性重组子。
鉴定阳性重组子的方法包括：
(1)PCR方法鉴定阳性重组子
挑选克隆置于10μl无菌水中，涡旋混合，取1μl混合液于25μl反应体系，用定向引物和非定向引物鉴定重组子。
PCR反应条件：94℃预变性10分钟(裂解细胞，失活核酸酶)，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸(根据片段的大小确定延伸时间)30个循环，72℃后延伸10分钟。
(2)限制性酶切分析阳性重组子
挑选阳性重组子，过夜培养。用试剂盒小量提取质粒，选择适宜的限制性内切酶，酶切鉴定重组子。
(3)测序：用定向引物和非定向引物测序，确定序列的正确性。本发明构建的载体及所提供的定向克隆技术能广泛用于PCR产物的直接定向克隆及表达，具有很高的应用价值，其优势在于：1、PCR产物无需酶切、纯化，以简单快捷的方法实现5分钟快速定向克隆。2、若该方法应用于表达载体上，如本实施例中(cloningVector)，定向克隆PCR产物于的T7lac启动子高效表达的载体中直接进行表达，操作简化，重组载体经鉴定后即可立即进行蛋白表达的等工作。3、经该方法得到的重组载体，测序的成功率提高很多，能保证100％准确。
附图说明
图1：载体cloningVector的图谱
图2：使用本发明方法实现高效率定向克隆示意图；
图3：实施例1中的PCR鉴定阳性克隆。分别插入3个目的片段1kb，2kb，3kb的PCR鉴定结果。其中：泳道M：Trans2KPlusIIDNAMarker，泳道1-20：插入基因片段
具体实施方式
本发明提供一种定向克隆方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所用的材料及来源分别为：载体cloningVector(北京全式金生物技术有限公司)、引物合成(北京英俊生物技术有限公司)，TopoisomeraseI(北京全式金生物技术有限公司)。T4polyneuclotidekinase、10×NEBDNALigaseBuffer(NewEnglandBiolabs)，FastPfuDNAPolymerase(北京全式金生物技术有限公司)，(Trans1-T1chemicallycompetentcell(北京全式金生物技术有限公司)，GenomicDNAKit(北京全式金生物技术有限公司)，PlusIIDNAMarker(北京全式金生物技术有限公司)
实施例1：
用FastPfuDNAPolymerase扩增3个不同长度的片段，分别进行定向克隆后，用PCR的方法验证定向克隆效果。
1.目的基因引物设计与合成
以人基因组DNA核酸序列为模板，选取三段目的基因，基因片段大小分别为以1kb、2kb、3kb。用primer5.0软件分别设计三对引物，将定向引物磷酸化后再进行PCR反应。引物见表1。
表1PCR扩增所用引物、DNA片段大小
定向引物磷酸化
37℃1小时。取1ul用于PCR(50μl反应体系)
2.PCR制备插入目的基因片段
PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃30秒，55℃30秒，2kb/分钟于72℃延伸，共30个循环；72℃10分钟；PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
3、连接体系：5μl
轻轻混匀，室温25℃，放置5分钟。
4、转化
将连接产物
分别转入大肠杆菌感受态细胞(Trans1-T1chemicallycompetentcell)中，过夜培养。
5、PCR鉴定插入片段
挑取平板中白色克隆各挑去20个于10ul无菌水中，涡旋震荡。取1μl作为模板，进行后续的菌落PCR鉴定。
PCR反应体系
PCR反应程序94℃10分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃X秒(取决于片段长度)。72℃5分钟。
Claims (3)
1.一种高效率基因定向克隆的方法，该方法包括以下步骤：
(1)载体准备：所述载体是一端为偶联拓扑异构酶I的平末端，另一端为由6个碱基组成的突出端的定向克隆或表达载体；
(2)引物设计
一条引物为常规引物，另一条引物为定向引物，其中，所述常规引物为无额外碱基和无磷酸化的与插入片段DNA互补的引物，所述定向引物的5’端依次为与步骤(1)中载体上突出端的6个碱基互补配对的碱基序列和拓扑异构酶I识别位点的互补序列“AAGGG”，且磷酸化；
(3)PCR扩增，获得插入片段DNA
使用步骤(2)的引物对模板DNA进行PCR扩增；
(4)反应
将载体，插入片段DNA，拓扑异构酶I混合，室温5分钟，获得环化产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拓扑异构酶I识别位点为“CCCTT”。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括：将步骤(4)获得的环化后产物转入大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，然后鉴定阳性重组子。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
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| Invitrogen.定向Topo？克隆技术.《www.invitrogen.com》.1997,全文. * |
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