CN105143252A - IL-22多肽和IL-22Fc融合蛋白及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂、包含其的组合物，制造方法和使用组合物治疗疾病的方法。本发明还涉及IL-22受体相关试剂及其使用方法。

Description

IL-22多肽和IL-22Fc融合蛋白及其使用方法
发明领域
本申请要求均于2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/800,148、61/800,795和61/801,144，于2013年5月8日提交的美国临时申请系列号61/821,062以及于2013年7月30日提交的美国临时申请系列号61/860,176的优先权权益，其内容均整体地并入本文以作参考。
序列表
本申请包含通过EFS-Web提交并整体地并入本文以作参考的序列表。所述ASCII拷贝创建于2014年3月14日，命名为P5580R1-WO_Seq_Listing.txt，大小为106,763字节。
发明领域
本发明涉及IL-22和IL-22Fc融合蛋白、IL-22激动剂、包含其的组合物以及其制造和使用方法。
发明背景
白介素-22(IL-22)是由Th22细胞、NK细胞、淋巴组织诱导(LTi)细胞、树突细胞和Th17细胞产生的细胞因子IL-10家族的成员。IL-22结合到IL-22R1/IL-10R2受体复合物，其在天然细胞诸如上皮细胞、肝细胞和角化细胞中并在若干种组织包括真皮、胰腺、肠和呼吸系统的屏障上皮组织中表达。
IL-22在黏膜免疫中起着重要作用，介导对于黏附和脱落细菌病原体的早期宿主防御。参见Zheng等,2008,Nat.Med.14:282-89。IL-22促进抗微生物肽和促炎细胞因子从上皮细胞产生并且刺激肠道中结肠上皮细胞的增殖和迁移。参见Kumar等,2013,J.Cancer,4:57-65。在细菌感染后，IL-22敲除小鼠表现出受损的肠道上皮再生、高细菌负荷和增加的死亡率。Kumar等,同上。同样地，用流感病毒感染IL-22敲除小鼠导致严重的体重减轻和受损的气管和支气管上皮细胞再生。因此，IL-22在抑制微生物感染中起着促炎性作用并在炎症反应中在上皮再生中起着抗炎性保护作用。许多的IL-22促进病理学炎症和组织修复的生物学作用仍有待确定。关于IL-22对上皮细胞的效应的看似矛盾的报道尚未得到彻底理解。Kumar等,同上。
限制细菌复制和传播的抗微生物防卫素的调节将通过减少随后的LPS产生并维持黏膜完整性而帮助使肠道微生物群稳定。IL-22上调急性期蛋白包括SAA的表达，并且有助于一系列与急性炎症反应相关联的基因包括IL-6、G-CSF和IL-1a的表达。对健康小鼠全身性施用IL-22还使LPS结合蛋白上调至生理学相关的浓度用以响应于细菌感染中和LPS。
在炎性肠病(IBD)患者中检测到增加的IL-22表达。参见例如，Wolk等,2007,J.Immunology,178:5973；Andoh等,2005,Gastroenterology,129:969。IBD诸如克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)被认为起因于对肠道中存在的共生微生物群落的失调的免疫反应。Cox等,2012,MucosalImmunol.5:99-109。UC和CD都是在暴露于至今仍定义不明的环境刺激的遗传易感的个体中出现的复杂疾病。CD和UC由共同的和不同的机制介导并且表现出不同的临床特征。参见Sugimoto等.2008,J.ClinicalInvestigation,118:534-544。
在UC中，炎症主要在结肠和直肠的黏膜中出现，引起致衰弱的病况包括腹泻、直肠出血和体重减轻。认为UC很大程度上是由宿主对穿透受损上皮屏障的肠微生物的不恰当炎症反应而引起的(Xavier和Podolsky,2007,Nature448:427-434)。克罗恩氏病以活化免疫细胞的肠浸润和肠结构的变形为特征。参见Wolk等,同上。
近年来，已经测试了许多种基于多种调节免疫反应的策略的药物来治疗IBD，包括类固醇、免疫调节剂和针对炎性细胞因子的抗体，成功率不定(Pastorelli等,Expertopiniononemergingdrugs,2009,14:505-521)。肠道菌群的复杂多样性促成了疾病的异质性。因此，对于IBD的更佳疗法存在需求。
心血管疾病(CVD)是死亡率的主要原因，其部分起因于大血管动脉的粥样硬化病。动脉粥样硬化是CVD事件中的主要罪魁祸首并且是起因于高胆固醇血症和慢性发炎血管的缓慢并且进行性疾病。动脉粥样硬化病变以充满脂质且具有免疫细胞特别是巨噬细胞和T细胞的浸润为特征。现在确认先天和适应性免疫机制都促成致动脉粥样化性斑块的进展和最终血栓形成。(Ross,AmHeartJ.1999Nov；138(5Pt2):S419-20；Hansson2005NEnglJMed352(16):1685-95；Hansson和Hermansson2011NatureImmunology12(3):204-12)。
急性胰腺炎(AP)是胰腺的急性炎症过程。急性肾损伤(AKI)是肾功能的突然损失，导致尿素和其他含氮废产物的滞留以及细胞外容积和电解质的失调。AKI以前被称为急性肾衰竭。该变化反映了进来的认知：即使不导致明显的器官衰竭的较小肾功能降低也具有实质性临床相关性并且与增加的发病率和死亡率相关联。对于AP和AKI的更佳治疗仍有需求。
代谢综合征是以一系列促成血栓形成、高血压、血脂异常和炎症的风险因素为特征的复杂状态。胰岛素抗性和肥胖是作为代谢综合征基础的主要发病机制。
胰岛素抗性增加CVD风险，因为它引发内皮功能紊乱，其与致动脉粥样硬化性血脂异常、炎症和高血压结合促成冠状动脉疾病(CAD)的死亡率。持续的胰岛素抗性还增加发展出2型糖尿病(T2DM)的几率，尽管致动脉粥样化的状态在T2DM发作前许多年出现。因此有可能CAD的自然史处于与T2DM相同的通路，但在生命中以亚临床的形式更早开始，临床表现需时更久，在有或没有糖尿病的存在。
创造术语代谢内毒素血症用以描述由例如高脂肪高热量饮食(HFD)引起的血浆LPS增加的病况(Cani等.2007.Diabetes56(7):1761-72)。用HFD饲养的小鼠具有增加的细菌(LPS)脂多糖血浆水平，并且该升高看起来是增加的饮食脂肪的直接结果(Cani等.2007同上；Cani等.2008Diabetes57(6):1470-81；Ghoshal等.2009,JLipidRes50(1):90-7)。存在有令人信服的证据，肠道微生物群落通过肠黏膜上皮细胞功能的调节在宿主的能量平衡和饮食营养物的摄取以及碳水化合物代谢中起不可缺少的部分(Turnbaugh等.2009,JPhysiol(Lond)587(Pt17):4153-8；Manco等.2010,EndocrRev31(6):817-44)。经不成比例的膳食脂肪构成或过量的膳食热量消耗而出现的肠道微生物群落的改变被认为是肥胖和胰岛素抗性——心血管疾病的确立后遗症的引发剂。脂多糖被发现于革兰氏阴性细菌的外膜中，并作为可引发强免疫反应的内毒素的来源(Barcia等.ClinInfectDis41Suppl7:S498-503)。肠微生物群落的群体、物种和区域分布的改变可导致LPS分解代谢的改变且高脂肪饮食将促进LPS穿过肠道屏障的吸收。在这些条件下，体循环中增加的LPS将引发低度慢性炎症，激活内源性保护宿主反应以升高血浆脂质，血浆脂质在慢性病况下促成饮食诱导的肥胖、胰岛素抗性和动脉粥样硬化以及最终CVD事件。
糖尿病是一种严重的代谢疾病，其定义为存在长期的高水平血糖(高血糖症)。这种高血糖症状态是肽激素，胰岛素活性相对或绝对缺乏的结果。胰岛素由胰腺的β细胞产生和分泌。据报道，胰岛素促进葡萄糖利用、蛋白质合成和碳水化合物能量作为糖原的形成和储存。葡萄糖作为糖原储存在机体中，所述糖原是一种聚合葡萄糖的形式，可转化回到葡萄糖以满足代谢需求。在正常条件下，胰岛素以基础速率和在葡萄糖刺激后以升高的速率两者分泌，均通过葡萄糖转化成糖原以保持代谢稳态。对于动脉粥样硬化的新治疗范例和CVD事件、代谢综合征、急性内毒素血症和败血病以及胰岛素相关障碍的预防仍有需求。
创伤愈合是复杂的过程，包括发炎期、肉芽组织形成期和组织重塑期(参见，例如Singer和Clark,CutaneousWoundHealing,N.Engl.J.Med.341:738-46(1999))。这些事件由在受伤部位释放出的细胞因子和生长因子触发。许多因素可使正常的适当创伤愈合复杂化或受干扰。例如，这样的因素包括年龄、感染、营养不良、免疫抑制、药物、放射、糖尿病、外周血管疾病、全身性疾病、吸烟和压力。
对于糖尿病这种慢性致衰弱疾病的对象，发展出糖尿病足部溃疡(也称为创伤)是常见的并发症。慢性溃疡定义为不通过有序且及时的修复过程以产生解剖学和功能上的完整性而进展的创伤(参见，例如Lazarus等,Definitionsandguidelinesforassessmentofwoundsandevaluationofhealing,Arch.Dermatol.130:489-93(1994))。就其性质而言，糖尿病足部溃疡是慢性溃疡(AmericanDiabetesAssociation,Consensusdevelopmentconferenceondiabeticfootwoundcare,DiabetesCare,22(8):1354-60(1999))。由于皮肤充当针对环境的一级屏障，开放的难愈性创伤可以是灾难性的；可以导致重大失能(包括肢缺损)和最终的死亡。足部溃疡是糖尿病人群中大约85％下肢截肢的先兆(参见，例如Apelqvist,等,Whatisthemosteffectivewaytoreduceincidenceofamputationinthediabeticfoot？DiabetesMetabRes.Rev.,16(1Suppl.):S75-S83(2000))。因此，对于加速或改善创伤愈合包括糖尿病创伤愈合存在需求。
发明概述
在一方面，本发明提供IL-22Fc融合蛋白、包含其的组合物以及其使用方法。
在一方面，本发明提供结合IL-22受体的IL-22Fc融合蛋白，所述IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽，其中Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，其中IL-22Fc融合蛋白包含与选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，优选至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，CH2结构域的N297残基改变为甘氨酸或丙氨酸。在某些其他实施方案中，N297残基改变为Gly；而在其他实施方案中，N297残基改变为Ala。在某些实施方案中，与IL-22受体结合触发IL-22受体下游信号传导，包括激活STAT3。
在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含与SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含与SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含与SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的功能和/或活性可以通过体外或体内方法测定，例如IL-22受体结合测定法、Stat3荧光素酶报告基因活性测定法等。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供通过以下方法生产的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括培养能够在适合IL-22Fc融合蛋白表达的条件下表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞的步骤。在某些实施方案中，该方法还包括从细胞培养物或培养基中获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；而在其他实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
在另一方面，本发明提供IL-22Fc融合蛋白，其包含通过接头与IgGFc区连接的IL-22多肽，其中该Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，并且其中该Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，铰链区包含CPPCP(SEQIDNO:31)的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，Fc区中的N297残基改变和/或Fc区中的T299残基改变。在某些实施方案中，CH2结构域中的N297残基改变，优选改变成甘氨酸或丙氨酸。在某些特定实施方案中，N297残基改变为甘氨酸。在某些其他实施方案中，N297残基改变为丙氨酸。在另外其他实施方案中，T299残基改变为Ala、Gly或Val。在某些其他实施方案中，接头为8-20个氨基酸长、8-16个氨基酸长或10-16个氨基酸长。
在某些实施方案中，Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。在某些特定实施方案中，接头包含氨基酸序列DKTHT(SEQIDNO:32)。在某些实施方案中，接头包含氨基酸序列GGGDKTHT(SEQIDNO:41)。在某些实施方案中，接头为至少11个氨基酸长且包含氨基酸序列EPKSCDKTHT(SEQIDNO:33)。在某些其他实施方案中，接头包含氨基酸序列VEPKSCDKTHT(SEQIDNO:34)、KVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:35)、KKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:36)、DKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:37)、VDKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:38)或KVDKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:39)。在某些特定实施方案中，接头包含氨基酸序列EPKSSDKTHT(SEQIDNO:40)。在某些实施方案中，接头包含氨基酸序列VEPKSSDKTHT(SEQIDNO:67)、KVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:68)、KKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:66)、DKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:64)、VDKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:69),或KVDKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:65)。在某些特定实施方案中，接头不包含GGS(SEQIDNO:45)、GGGS(SEQIDNO:46)或GGGGS(SEQIDNO:47)的氨基酸序列。在单独的实施方案中，IL-22IgG1Fc融合蛋白包含GGGSTHT(SEQIDNO:63)的接头序列。在其他特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:12或SEIDNO:14的氨基酸序列。在某些其他特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。
在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含IgG4的CH2和CH3结构域。在某些其他实施方案中，接头包含氨基酸序列SKYGPP(SEQIDNO:43)。在某些特定实施方案中，接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQIDNO:44)。在某些实施方案中，接头无一包含氨基酸序列GGS(SEQIDNO:45)、GGGS(SEQIDNO:46)或GGGGS(SEQIDNO:47)。在其他特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8或SEIDNO:10的氨基酸序列。在特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一实施方案中，IL-22Fc融合蛋白通过以下方法生产，所述方法包括培养能够在适合IL-22Fc融合蛋白表达的条件下表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞的步骤。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白通过以下方法生产，所述方法还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在某些其他实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。
在再一方面，本发明提供包含IL-22Fc融合蛋白的组合物，所述IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽，其中该Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，并且其中该组合物在CH2结构域中具有不多于5％的无岩藻糖基化(afucosylation)水平。在某些实施方案中，无岩藻糖基化水平不多于2％，更优选低于1％。在某些实施方案中，无岩藻糖基化水平通过质谱测量。在某些实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。在某些其他实施方案中，铰链区包含CPPCP(SEQIDNO:31)的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物通过以下方法生产，所述方法包括培养能够在适合IL-22Fc融合蛋白表达的条件下表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞，以及从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤，其中该组合物在Fc区的CH2结构域中具有不多于5％的无岩藻糖基化水平。在某些实施方案中，无岩藻糖基化水平不多于2％，更优选低于1％。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白通过纯化获得，优选从无岩藻糖基化的种类中纯化岩藻糖基化的种类。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白通过亲和层析纯化。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
在再一方面，本发明提供IL-22Fc融合蛋白，或包含IL-22Fc融合蛋白的组合物，所述IL-22Fc融合蛋白通过以下方法生产，所述方法包含培养能够在适合IL-22Fc融合蛋白表达的条件下表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞的步骤。在某些实施方案中，该方法还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞；而在其他实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。
在再一方面，本发明提供包含本文描述的IL-22Fc融合蛋白的组合物。在又一方面，本发明提供包含本文描述的IL-22Fc融合蛋白和至少一种可药用的载体的药物组合物。在某些实施方案中，该组合物或药物组合物包含含有SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。在某些特定实施方案中，该组合物或药物组合物包含含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白由大肠杆菌生产。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些另外的实施方案中，IL-22Fc融合蛋白不诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。在某些实施方案中，该药物组合物还包含次最优量的治疗剂诸如地塞米松。在某些实施方案中，IL-22多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。
另外，根据本发明的各个和每一方面，在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白可以是二聚体IL-22Fc融合蛋白(关于IL-22)；而在其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白可以是单体Fc融合蛋白(关于IL22)。
在再一方面，本发明提供单体IL-22Fc融合蛋白。在某些特定实施方案中，单体融合蛋白包含IL-22Fc融合臂和Fc臂。在某些实施方案中，IL-22Fc融合臂和Fc臂在Fc区中包含结(knob)或孔。在某些实施方案中，IL-22Fc融合臂(单体IL-22Fc融合)的Fc区包含结且Fc臂(未与IL-22连接的单体Fc)的Fc区包含孔。在某些实施方案中，IL-22Fc融合臂(单体IL-22Fc融合)的Fc区包含孔且Fc臂(未与IL-22连接的单体Fc)的Fc区包含结。在某些其他实施方案中，单体IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:61和SEQIDNO:62的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，两臂的Fc区均还包含N297G突变。在某些实施方案中，单体IL-22Fc通过以下方法生产，所述方法包括培养包含一种或多种核酸分子的一种或多种宿主细胞的步骤，所述宿主细胞能够表达包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的第二多肽。在某些其他实施方案中，该方法还包括从细胞培养物或培养基获得单体IL-22Fc融合蛋白的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在相关方面，本发明提供包含单体IL-22Fc融合蛋白的组合物或药物组合物。
在又一方面，本发明提供编码本文描述的IL-22Fc融合蛋白的分离的核酸。在某些实施方案中，该核酸编码包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26，优选SEQIDNO:8或SEQIDNO:12，更优选SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。在某些其他实施方案中，核酸包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的多核苷酸序列。在某些特定实施方案中，核酸包含SEQIDNO:7或SEQIDNO:11，优选SEQIDNO:7的多核苷酸序列。在某些实施方案中，分离的核酸包含与SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13；SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的多核苷酸序列序列同一性为至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸序列。在某些实施方案中，分离的核酸包含与SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13；SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的多核苷酸序列序列同一性为至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸序列，其中分离的核酸能够编码以下IL-22Fc融合蛋白，所述IL-22Fc融合蛋白能够结合IL-22R和/或触发IL-22R活性并且其中IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，分离的核酸包含与SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13；SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的多核苷酸序列序列同一性为至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸序列，其中分离的核酸能够编码包含SEQIDNO:8、10、12或14的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。在相关方面，本发明提供包含上述核酸的载体，以及包含载体的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在某些特定实施方案中，宿主细胞是原核细胞，包括且不限于，大肠杆菌细胞。在某些其他实施方案中，宿主细胞是真核细胞，包括且不限于，CHO细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包含含有核酸的载体，所述核酸编码包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
在另外的相关方面，本发明提供制造IL-22Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在适合IL-22Fc融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞的步骤。在某些实施方案中，方法还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。IL-22Fc融合蛋白可通过领域内已知的任何蛋白质分离或纯化方法从细胞培养物或培养基获得，包括且不限于，收集培养基、冷冻/解冻、离心、细胞裂解、均质化、硫酸铵沉淀、HPLC以及亲和、凝胶过滤和离子交换柱层析。在某些实施方案中，方法还包括去除无岩藻糖基化的IL-22Fc融合蛋白的步骤。在某些其他实施方案中，无岩藻糖基化的IL-22Fc融合蛋白通过亲和柱层析被去除。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。
在又一方面，本发明提供包含本发明的IL-22Fc融合蛋白和至少一种可药用的载体的组合物或药物组合物。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的氨基酸序列。在其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的而IL-22多肽是糖基化的。在某些这样的实施方案中，IL-22Fc融合蛋白在CHO细胞中生产。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白不诱导抗体依赖的细胞毒性。在另外其他的实施方案中，药物组合物还包含地塞米松或TNF拮抗剂。在某些特定实施方案中，地塞米松或TNF拮抗剂以次最优的量存在。
在某些其他实施方案中，包含IL-22Fc融合蛋白的药物组合物在CH2结构域中具有不多于5％，优选不多于2％，更优选低于1％的无岩藻糖基化水平。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:26，优选SEQIDNO:24的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白在CHO细胞中生产。在某些特定实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，全身性或局部施用药物组合物。在某些其他实施方案中，静脉内、皮下、腹膜内或局部施用药物组合物。
在再一方面，本发明提供包含本文描述的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白和至少一种可药用的载体的药物组合物。在某些实施方案中，可药用的载体是胶凝剂。在某些实施方案中，胶凝剂是多糖。在一些实施方案中，胶凝剂是而不限于，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、POE-POP嵌段聚合物、海藻酸盐、透明质酸、聚丙烯酸、羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，多糖是纤维素制剂，诸如而不限于，羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。在某些实施方案中，胶凝剂是羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，药物组合物用于局部施用。在某些实施方案中，用于局部施用的药物组合物包含IL-22多肽。在一些实施方案中，用于局部施用的药物组合物包含IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方案中，用于局部施用的药物组合物包含无Fc融合物的IL-22多肽。
在另一方面，本发明提供治疗有需要的对象中的IBD的方法，其包括向对象施用包含本发明的IL-22Fc融合蛋白的药物组合物。在某些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎。在某些其他实施方案中，IBD是克罗恩氏病。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，Fc区的N297残基和/或T299残基改变。在某些实施方案中，Fc区的N297残基改变。在某些其他实施方案中，N297残基改变为Gly或Ala，优选Gly。在某些其他实施方案中，T299残基改变，优选改变为Val、Gly或Ala。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或EQIDNO:14，优选SEQIDNO:8的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白在大肠杆菌或CHO细胞中生产。在某些实施方案中，对象是人。在某些其他实施方案中，静脉内、皮下、腹膜内或局部施用药物组合物。
在另一方面，本发明提供使用本发明的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白治疗以下疾病的任一种或组合的方法：II型糖尿病，带有病态肥胖的II型糖尿病、创伤(包括糖尿病创伤和糖尿病溃疡)，烧伤，溃疡(包括压迫性溃疡和静脉性溃疡)，移植物抗宿主病(GVHD)，动脉粥样硬化，心血管疾病，代谢综合征，内毒素血症(急性和轻度)，败血病，急性冠心病，高血压，血脂异常，肥胖，高血糖，脂质代谢病症，肝炎，急性肝炎，肾衰竭，急性肾衰竭，急性肾损伤，肾移植失败，尸肾移植后移植物功能延迟，对比剂肾病，胰腺炎，急性胰腺炎，肝纤维化和肺纤维化。在某些实施方案中，急性胰腺炎可以是轻度至中度至重度疾病。在某些实施方案中，急性胰腺炎包括ERCP(内镜逆行胰胆管造影)后疾病。在一些其他的实施方案中，要治疗上述疾病的患者需要其HDL/LDL脂质谱的改变，而IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白可以在患者中改变以升高HDL并降低LDL。在相关方面，本发明提供IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白在制备用于治疗上述疾病中的任一种或组合的药物中的用途。
在再一方面，本发明提供在有需要的对象中抑制肠中微生物感染，或在微生物感染中保护肠中杯状细胞的方法，包括向对象施用包含本发明的IL-22Fc融合蛋白的药物组合物的步骤。在其他相关的方面，本发明提供增强有需要的对象的肠中上皮细胞完整性、黏膜愈合、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法，包括向对象施用包含本发明的IL-22Fc融合蛋白的药物组合物。在某些实施方案中，上皮细胞是肠上皮细胞。
在另一方面，提供用于预防或治疗心血管病况的方法，该病况包括动脉粥样硬化斑块形成的病理学。方法包括向向有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白。心血管病况包括，例如，冠状动脉疾病、冠状微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病和慢性肾病。方法可包括进一步减慢动脉粥样硬化斑块形成的进展。方法还可包括向对象施用一种或多种额外的治疗剂用于预防或治疗心血管病况。
在另一方面，提供用于治疗代谢综合征的方法。方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白。方法还可包括降低与代谢综合征关联的一种或多种危险因素，包括腹部肥胖、高血糖、血脂异常和高血压中的一种或多种。方法还可包括降低对象中细菌脂多糖(LPS)的水平。方法还可包括向对象施用一种或多种额外的制剂以预防或治疗代谢综合征。
在另一方面，提供用于推迟或减慢动脉粥样硬化的进展的方法。方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白。方法还可包括向对象施用一种或多种额外的制剂以推迟或减慢动脉粥样硬化的进展。
在另一方面，提供用于预防动脉粥样硬化的标志的方法。方法包括向处于动脉粥样硬化风险的对象施用治疗有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22Fc融合蛋白的IL-22多肽有效对抗动脉粥样硬化的标志的发展。在某些实施方案中，对象已经被鉴定为处于发展出心血管病况的风险。在某些实施方案中，对象在遗传上处于发展出心血管病况的风险。在一个或多个实施方案中，动脉粥样硬化的标志包括斑块积聚。在一些实施方案中，动脉粥样硬化的标志包括血管炎症。方法还可包括向对象施用一种或多种额外的制剂用于预防动脉粥样硬化的标志。
在又一方面，提供治疗急性内毒素血症和败血病的一种或多种的方法。方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白。方法还可包括向对象施用一种或多种额外的制剂用于治疗急性内毒素血症和败血病的一种或多种。
在一个其他方面，提供用于加速或改善对象中的创伤愈合或二者的方法。方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂。在某些实施方案中，创伤是慢性创伤。在某些其他实施方案中，创伤是感染的创伤。在某些实施方案中，对象是患糖尿病的，包括具有II型糖尿病的对象。在一个或多个实施方案中，创伤是糖尿病足部溃疡。在某些实施方案中，施用治疗有效量的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂直至创伤完全闭合。在一些实施方案中，施用是全身性的；在其他实施方案中，施用是局部的。在某些实施方案中，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂是在用于局部施用的制剂中。在某些实施方案中，局部制剂包含无Fc融合物的IL-22多肽。在某些实施方案中，IL22激动剂选自由IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、IL-22激动剂、IL-19多肽、IL-19Fc融合蛋白、IL-19激动剂、IL-20多肽、IL-20Fc融合蛋白、IL-20激动剂、IL-24多肽、IL-24Fc融合蛋白、IL-24激动剂、IL-26多肽、IL-26Fc融合蛋白、IL-26激动剂和IL-22R1激动剂组成的组。在某些其他实施方案中，IL-22激动剂选自由IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、IL-22激动剂、IL-20多肽、IL-20Fc融合蛋白、IL-20激动剂、IL-24多肽、IL-24Fc融合蛋白、IL-24激动剂和IL-22R1激动剂组成的组。在某些实施方案中，IL-22R1激动剂是抗IL22R1激动性抗体。
在再一方面，本发明提供治疗代谢综合征的方法，包括向有需要的对象施用治疗有效量的一种或多种IL-22激动剂的步骤。在某些实施方案中，IL22激动剂选自由IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、IL-22激动剂、IL-19多肽、IL-19Fc融合蛋白、IL-19激动剂、IL-20多肽、IL-20Fc融合蛋白、IL-20激动剂、IL-24多肽、IL-24Fc融合蛋白、IL-24激动剂、IL-26多肽、IL-26Fc融合蛋白、IL-26激动剂和IL-22R1激动剂组成的组。在某些其他实施方案中，IL-22激动剂选自由IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、IL-22激动剂、IL-20多肽、IL-20Fc融合蛋白、IL-20激动剂、IL-24多肽、IL-24Fc融合蛋白、IL-24激动剂和IL-22R1激动剂组成的组。在某些实施方案中，IL-22R1激动剂是抗IL22R1激动性抗体。在某些其他实施方案中，代谢综合征是糖尿病。在某些特定实施方案中，代谢综合征是II型糖尿病。
根据另一实施方案，向对象施用本发明的IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，静脉内、皮下、腹膜内、全身或局部施用IL-22多肽或IL22Fc融合蛋白。
在这些方面的某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区是未糖基化的。在某些实施方案中，Fc区的N297残基和/或T299残基改变。在某些实施方案中，Fc区的N297残基改变。在某些其他实施方案中，N297残基改变为Gly或Ala，优选Gly。在某些其他实施方案中，T299残基改变，优选改变为Val、Gly或Ala。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或EQIDNO:14，优选SEQIDNO:8的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白在大肠杆菌中生产。在某些实施方案中，对象是人。在某些其他实施方案中，静脉内、皮下或局部施用药物组合物。
在某些其他实施方案中，包含IL-22Fc融合蛋白的药物组合物在CH2结构域中具有不多于5％、优选不多于2％、更优选低于1％的无岩藻糖基化水平。在某些特定实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:26，优选SEQIDNO:24的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白在CHO细胞中生产。在某些特定实施方案中，对象是人。在某些其他实施方案中，静脉内、皮下或局部施用药物组合物。
在以上方面的另外其他实施方案中，附着于IL-22Fc融合蛋白的Fc区的N-聚糖通过糖解酶而酶促去除。在某些实施方案中，糖解酶是肽-N-糖苷酶(PNGase)。在某些特定实施方案中，对象是人。
在又一方面，本发明也提供本文描述的IL-22Fc融合蛋白在制备用于在有需要的对象中治疗IBD包括UC和CD的药物中的用途。在相关方面，本发明提供本文描述的IL-22Fc融合蛋白在制备用于在有需要的对象中抑制肠中微生物感染，或在微生物感染中保护肠中杯状细胞的药物中的用途。在又一方面，本发明提供本文描述的IL-22Fc融合蛋白在制备用于增强有需要的对象的肠中上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞移植或上皮创伤愈合的药物中的用途。在其他相关方面，本发明提供IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白在制备用于在有需要的对象中治疗心血管病况、代谢综合征、动脉粥样硬化、急性肾损伤、急性胰腺炎，加速、促进或改善创伤愈合(包括且不限于慢性创伤、糖尿病创伤、感染的创伤、压迫性溃疡或糖尿病足部溃疡的愈合)的药物中的用途。
除非上下文清楚地另外教导，否则可以组合各个和每一实施方案。除非上下文清楚地另外教导，否则各个和每一实施方案可以应用到本发明的各个和每一方面。
根据以下某些优选实施方案的更详细说明和权利要求，本发明的具体实施方案将变得显见。
附图简述
图1显示来自不同哺乳动物物种的成熟IL-22的氨基酸序列比对：人(GenBank登录号Q9GZX6，SEQIDNO:4，黑猩猩(GenBank登录号XP_003313906，SEQIDNO:48)，猩猩(GenBank登录号XP_002823544，SEQIDNO:49)，小鼠(GenBank登录号Q9JJY9，SEQIDNO:50)和狗(GenBank登录号XP_538274，SEQIDNO:51)。
图2显示典型的人单克隆IgG1Fc(板块A)，含有接头序列EPKSCDKTHT(SEQIDNO:33，板块B)、EPKSSDKTHT(SEQIDNO:40，板块C)和GGGDKTHT(SEQIDNO:41，板块D)的IL-22IgG1Fc融合，和不具有或具有N297G突变的含有接头序列RVESKYGPP的IL-22IgG4Fc融合(SEQIDNO:44，分别为板块E和F)以及具有N297G突变的含有接头序列EPKSSDKTHT(SEQIDNO:40)的IL-22IgG1Fc融合(板块G)的Fc区糖基化状态的质谱结果。
图3显示人IL-22IgG4Fc融合(N297G，全长Fc序列具有C-端Lys，SEQIDNO:16，无LysSEQIDNO:8)，IL-22IgG1Fc融合(N297G，全长Fc序列具有C-端Lys，SEQIDNO:20，无LysSEQIDNO:12)和IL-22(SEQIDNO:4)的序列比对。所显示的IL-22序列是无前导序列的成熟形式。铰链序列CPPCP(SEQIDNO:31)在方框中示出，随后是CH2和CH3结构域。标出了N297G替换和任选的C-端Lys残基。
图4呈现显示STAT3荧光素酶测定法结果的图。在表达人IL-22R的293细胞中测量由IL-22IgG4Fc融合或IL-22IgG1Fc融合刺激的荧光素酶活性。结果显示，IL-22IgG4和IL-22IgG1Fc融合表现出相似的体外活性。
图5显示小鼠IL-22Fc融合蛋白在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠IBD模型中的治疗效果。小鼠IL-22Fc融合蛋白改善DSS诱导的IBD小鼠中的结肠组织学(图5B)并且该改善转化成降低的结肠组织学评分(图5C)。相较于地塞米松——目前该模型中的最佳护理标准，IL-22Fc融合蛋白治疗导致小鼠在治疗期间降低的重量减轻(图5A)。
图6显示在以0.15mg/kg和1.5mg/kg在第0天和第7天给药的食蟹猴中人IL-22IgG4和IgG1Fc融合蛋白的血清清除率。
图7显示在以0.15mg/kg和1.5mg/kg在第1天和第8天(与图6中第0天和第7天相同的给药方案)给药之后的食蟹猴中三种IL-22R下游基因的血清水平。图7A显示血清淀粉样蛋白A(SAA)的剂量依赖性增加，图7B显示脂多糖结合蛋白(LPS-BP)的剂量依赖性增加，图7C显示RegIII/胰腺炎相关蛋白(PAP或PancrePAP)的剂量依赖性增加，在hIL-22Fc施用后。
图8显示高分辨率MicroCT，其展示出采用高脂肪饮食的8月大Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠的主动脉弓和头臂动脉中的动脉粥样硬化斑块负荷。
图9显示，Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠对饮食挑战敏感并且根据microCT测量显示出实质上升高的动脉粥样硬化水平(A)，但具有仅中度增加的血清LDL水平(B)。
图10显示Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠对急性低度炎性刺激的响应，展示出高于wtC57小鼠中观察结果的血清MCP-1(A)和IL-6(B)的增加，并伴有血管功能损失如通过血流介导的扩张和输注硝化甘油所测定(C)。
图11显示，慢性内毒素暴露引起血脂异常(A)和更大的斑块负荷(B)和不稳定性(C)。
图12显示IL-22-Fc处理组中的空腹血糖相较于对照降低(A)且使用IL-22-Fc治疗使葡萄糖清除改善，如从葡萄糖耐受测试中所见(B，C)。
图13显示用IL-22-Fc治疗后出现总胆固醇的降低。在Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠中在空腹和餐后条件下总胆固醇均升高，并且在IL-22-Fc组中总胆固醇较之对照降低，如在治疗期结束时测量的(A)。在IL-22-Fc治疗后血浆甘油三酯水平也降低，在餐后状态下有显著降低(B)。
图14显示在Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠中见到的高脂血症在IL-22-Fc治疗后降低。在空腹和餐后状态下LDL均降低(A)，HDL升高(B)，并且在空腹和餐后状态下LDL/HDL比率均降低(C)。在餐后状态下vLDL降低(D)。对小鼠给予两次剂量5天后描绘HDL(E)、LDL(F)和LDL/HDL比率(G)的结果。
图15显示，在IL-22-Fc治疗后血浆LPS水平降低。
图16显示在IL-22-Fc治疗后通过血管反应性测量的改善的内皮功能。
图17描绘使用对比增强的microCT对解剖的主动脉弓，升主动脉和降主动脉(A)、头臂动脉(B)和主动脉瓣(C)的尸检样品进行的斑块负荷的定量分析。
图18显示IL-22-Fc治疗后的体重(A)和食物摄取(B)。
图19描绘糖尿病小鼠模型治疗方案的示意图。
图20A-C显示db/db小鼠中的体重和血清葡萄糖水平，展示出IL-22-Fc使肥胖小鼠中的葡萄糖显著降低。
图21显示基于葡萄糖耐受测试(GTT)，IL-22Fc治疗改善葡糖耐受和胰岛素敏感度。p<0.05
图22A-B显示基于胰岛素耐受测试(ITT)，IL-22Fc治疗改善胰岛素敏感度，如通过mg/dL葡萄糖水平(A)和％葡萄糖降低(B)所测量的。
图23显示IL-22Fc增加胰岛中的胰岛素表达。(A)绿色显示胰高血糖素，红色显示胰岛素。红线包围的画圈区域显示胰岛区域。Bar，50μm。(B)平均胰岛素染色强度。(C)平均胰高血糖素染色强度。(D)HFD-饲养小鼠中的餐后胰岛素水平。(E)HFD-饲养小鼠中的空腹胰岛素水平。(F)IL-22Fc逆转HFD-饲养小鼠中的胰岛素不敏感性。**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图24A-B描绘IL-22-Fc治疗的动物中的胰岛素信号强度的定量分析。
图25A-B显示与对照相比，在IL-22-Fc治疗的动物中胰岛素阳性区域增加。
图26显示组织学切片，其展示出与对照相比(A)用IL-22-Fc治疗(B)的肝脏门静脉周脂肪变性的降低。
图27A-B显示HFD诱导的葡萄糖耐受性中的IL-22R评估。(A)葡萄糖ip注射后随时间的葡萄糖水平(mg/dL)。(B)计算曲线下总面积(AUC)。
图28显示与同窝对照相较的IL-22受体KO小鼠的重量。
图29A-DLdlr-/-，Apobec1-/-(dko)小鼠用50ugIL-22Fc或50ug抗豚草抗体(n＝6只/组)处理48小时。在IL-22Fc处理的小鼠中，血清LPS降低50％(p＝0.0052)且血清LDL/HDL降低30％(p＝0.049)。
图30显示编码天然人IL-22的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO:70)。
图31显示衍生自图30所示的编码序列的氨基酸序列(SEQIDNO:71)。
图32A显示小鼠IL-22-小鼠-IgG2a融合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:73)。图32B显示编码小鼠IL-22-小鼠IgG2a融合蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO:72)。
图33显示缺少经由IL-22R的信号传导引起延迟的创伤愈合。IL-22RKO小鼠创伤的愈合与WT同窝对照小鼠相比显著延迟(在第10天p＝0.0018&在第12天p＝0.005)。
图34A-C展现在第10、12和15天的单独小鼠(n＝10)伤口。示出了在第14天IL-22RKO小鼠和WT的创伤的代表性照片图像(D)。
图35图示了对照WT小鼠(BKS)和糖尿病db/db小鼠之间的创伤愈合比较。(A)在整个研究过程中db/db小鼠中的创伤愈合大大推迟并且甚至在第28天也没有完全愈合。(B)中的条形图显示创伤切除后数天野生型或db/db小鼠中作为倍率变化的IL-22表达水平。
图36是用于测试总共3组(n＝7)的db/db小鼠中的IL-22-Fc的研究设计的示意性表示。将抗豚草抗体用于对照Fc蛋白质并将抗-FGFR1抗体用作阳性对照用于葡萄糖调节。
图37显示从第4至第27天经处理小鼠与对照相比的IL-22Fc标准化的餐后葡萄糖水平。使用血糖仪记录葡萄糖水平。
图38以图表显示IL-22-Fc较之2种对照抗体：抗豚草抗体和抗-FGFR1的伤口测量比较。每个数据点表示7只小鼠/组的平均值。
图39A-D显示在第15、19、21和第27天的单独伤口测量。示出了在第27天的代表性小鼠的照片(E)。
图40是用于测试在db/db小鼠中与对照抗体治疗相比的IL-22-Fc的局部vs.全身给药的研究设计的示意性表示；总共3组(n＝7)。
图41A-B以图表显示IL-22-Fc局部vs.全身给药与对照Fc局部治疗的伤口测量比较。将抗豚草抗体用作Fc对照抗体。每个数据点表示7只小鼠/组的平均值。
图42以照片显示来自代表性小鼠的手术去除的创伤组织，示出了在第22天IL-22-Fc(B)和对照抗体(A)的俯视图以及后视图。
图43A显示产生IL-22RKO小鼠的策略。图43B显示在来自IL-22RKO和WT小鼠的结肠中IL-22Ra1mRNA表达的RT-PCR结果。图43C显示在单剂量注射IL-22Fc或对照IgG后2天在来自IL-22RKO和WT小鼠的结肠中Reg3bmRNA表达的RT-PCR结果。***P<0.001.误差条，s.e.m。
图44显示展现出肥胖小鼠发起缺陷IL-22反应的结果。(A-D)在第7天通过流式细胞术对用OVA/CFA免疫的db/db(A-B)、DIO(C-D)和对照小鼠的引流淋巴结中的淋巴细胞来分析IL-22表达。在(A，C)中FACS图上的数值为在CD4+T细胞内IL-22+细胞的百分比。(E-F)用鞭毛蛋白或PBS注射db/db、瘦弱对照、HFD和饲料饲养的正常小鼠。在2h后收集血清。来自db/db和瘦弱对照(E)，以及HFD和饲料饲养的小鼠(F)的IL-22的ELISA。所示数据代表三个(A-B)或两个(C-F)独立实验。在所有实验中N＝4。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图45显示在瘦素信号缺陷小鼠中IL-17和IL-22生产中的缺陷。(A-B)在第7天分析IL-17A和IL-22表达，作为在用OVA/CFA免疫的db/db和ob/ob小鼠中CD4+细胞内的百分比。(C)来自在有或没有重组小鼠瘦素(1μg/ml)的IL-22生产条件下刺激的纯化的幼稚WTCD4+T细胞的培养上清的IL-22ELISA。(D)来自在有或没有重组小鼠瘦素(1μg/ml)下用IL-23刺激的Rag2KO脾细胞的培养上清的IL-22ELISA。(E)在鞭毛蛋白刺激后2小时来自ob/ob或瘦弱对照的血清IL-22的ELISA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图46显示展现出db/db(ob/ob)小鼠对啮齿类柠檬酸杆菌(C.rodentium)感染的易感性与有缺陷的IL-22生产相关联并通过外源IL-22-Fc而挽救的结果。(A)在啮齿类柠檬酸杆菌感染后来自WT、db/db和ob/ob小鼠(n＝5)的结肠中的IL-22mRNA表达。用啮齿类柠檬酸杆菌感染的db/db和瘦弱对照小鼠(n＝10)的(B)体重和(C)存活。(D-E)在第10天瘦弱对照(D)和db/db(E)小鼠的结肠组织学，显示出上皮增生，肠上皮细胞脱落到肠腔中，细菌菌落(箭头)和黏膜下水肿(竖线)。横线，200μm。(F)通过结肠组织学确定的临床评分(n＝5)。(G-H)db/db和瘦弱对照小鼠(n＝5)在第10天在肝脏(G)和脾脏(H)中的细菌负荷。(I)在第10天在瘦弱对照和db/db小鼠(n＝5)中的抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG的ELISA。(J)感染后用IL-22–Fc或对照IgG处理的瘦弱对照或db/db小鼠(n＝10)的存活。所示数据代表三个独立实验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图47显示展现出糖尿病病症通过IL-22–Fc处理而减少的结果。(A-D)每周两次用IL-22–Fc处理HFD-饲养小鼠(n＝10)。(A)第20天(餐后)和第21天(16小时空腹)的血糖。(B)第30天的体重。(C)第21天的葡萄糖耐受测试。(D)第28天的胰岛素耐受测试。所示数据代表两个独立实验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图48显示展现出IL-22预防用HFD饲养的小鼠的糖尿病病症的结果。(A)体重，(B)血糖，(C)第23天的葡萄糖耐受测试，(D)16h空腹后第23天的血糖，以及(E)第25天的腹脂垫。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图49显示展现出IL-22通过多种机制调节代谢综合征的结果。(A-C)对两组db/db小鼠(n＝8)以自由采食饲养并用对照IgG或IL-22–Fc处理，每周两次。一组db/db小鼠(n＝8)用与IL-22–Fc处理组的食物摄入相配的限制食物饲养，并用对照IgG处理。自由采食饲养的小鼠前八天的累计食物摄入示于(A)中，血糖示于(B)中，第25天的葡萄糖耐受测试示于(C)中。(D-E)显示在第0天和第2天用IL-22–Fc或对照IgG处理的db/db(D)和HFD(E)小鼠中的PYY水平。在第2天第二次处理之前和在第5天收集血清，并分析PYY。(F)显示用IL-22–Fc或对照IgG处理3周的db/db小鼠的血清LPS。(G-I)用HFD饲养IL-22RKO(n＝9)和WT小鼠(n＝6)，在6周龄时开始。体重结果示于(G)中，采用HFD3月时的葡萄糖耐受测试结果示于(H)中且采用HFD4月时胰岛素耐受测试结果示于(I)中。所示数据代表两个(A-C)或三个(D-I)独立实验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。
图50显示配对饲养限制的食物摄入的结果。对三组db/db小鼠如图49A中那样进行饲养和处理。测量累计食物摄入。
图51显示展现出IL-22改善肝功能并减少脂垫的结果。(A)如图20A中用IL-22Fc或对照IgG处理的db/db小鼠。一个月时测量肝酶。(B-C)如图47A中用IL-22Fc或对照IgG处理HFD-饲养小鼠。一个月时测量肝酶(B)和腹脂垫(C)。**P<0.01，***P<0.001，误差条，s.e.m。(D-H)用HFD饲养小鼠10周，然后用IL-22Fc或对照处理，每周两次持续6周。(D)来自白色脂肪组织的脂质代谢基因表达。(E)血清甘油三酯，甘油和游离脂肪酸。(F)肝脏甘油三酯。(G)肝脏胆固醇。(H)白色脂肪组织甘油三酯。(I-J)用IL-22Fc或对照IgG处理db/db小鼠4周。(I)肝脏甘油三酯。(J)白色脂肪组织甘油三酯。*P<0.05.误差条，s.e.m。
图52显示展现出IL-22增加β细胞的胰岛素分泌的结果。如图20A中用IL-22Fc处理db/db小鼠，在第30天收获胰腺并对胰岛素和胰高血糖素染色。(A)总胰腺面积内的胰岛面积百分比。(B)总胰岛面积内的β细胞面积百分比。(C)总胰岛面积内的α细胞面积百分比。
图53使用HFD，IL-22KO小鼠未发展出葡萄糖不耐受性。用HFD饲养IL-22KO小鼠，在6周龄时开始。在HFD后3个月进行葡萄糖耐受测试。误差条，s.e.m。
图54显示展现出ob/ob小鼠对啮齿类柠檬酸杆菌感染的易感性的结果：被啮齿类柠檬酸杆菌感染的ob/ob和瘦弱小鼠(n＝10)的(A)体重和(B)存活；(C-D)瘦弱对照(C)和ob/ob小鼠(D)在第8天的结肠组织学，显示出上皮增生，肠上皮细胞脱落到肠腔中，细菌菌落(箭头)和黏膜下水肿(竖线)(横线，200μm)；(E)通过结肠组织学(n＝5)确定的临床评分；和(F-G)ob/ob和瘦弱对照小鼠(n＝5)在第8天在肝脏(F)和脾脏(G)中的细菌负荷。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.误差条，s.e.m。
图55显示用IL-22Fc、IL-20Fc或IL-24Fc处理的db/db小鼠在(A)体重、(B)血糖和(C)处理第20天的葡萄糖耐受测试中的结果。
图56A和B显示比较在用VEGF或IL-22Fc处理的db/db小鼠中的创伤愈合功效的结果。
图57A-E显示在重建的表皮中IL-22Fc的细胞因子或趋化因子诱导。
图58显示比较在有或没有金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的野生型小鼠和db/db小鼠中使用夹板创伤模型的创伤闭合的结果。
图59A和B显示比较在夹板感染的创伤模型中VEGF和IL-22Fc之间的创伤愈合功效的结果。
图60显示比较在夹板感染的创伤模型中不同浓度下的VEGF和IL-22Fcv之间的创伤愈合功效的结果。
图61显示比较在夹板感染的创伤模型中不同浓度下的VEGF、PDGF和IL-22Fc之间的创伤愈合功效的结果。
图62显示在夹板创伤模型中溶液以及凝胶制剂中的IL-22Fc加速创伤愈合。
发明详述
本文引用的所有出版物、专利和专利申请都明确地引入本文用于所有目的。
在一方面，本发明涉及IL-22蛋白质或IL-22Fc融合蛋白、包含其的组合物以及其使用方法。具体而言，本发明涉及在IBD、动脉粥样硬化、心血管疾病和以动脉粥样硬化斑块形成为特征的病况、代谢综合征、轻度和急性内毒素血症以及败血病、急性肾损伤、急性胰腺炎、中度急性胰腺炎以及胰岛素相关病症的预防和治疗中使用IL-22Fc融合蛋白或IL-22多肽。此外，本发明涉及在糖尿病足部溃疡的预防和治疗、加速创伤愈合并且特别是糖尿病创伤愈合中使用IL-22Fc融合蛋白或IL-22多肽。
在一方面，相信这是显示IL-22多肽本身治疗心血管疾病的首次公开。本文的数据支持IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白可降低动脉粥样硬化斑块的生长、降低动脉粥样硬化斑块的破裂频率并降低内毒素血症的观念。本发明在治疗罹患代谢综合征、轻度或急性内毒素血症、败血病和胰岛素相关病症诸如胰岛素抗性(对胰岛素无响应)的、需要其HDL/LDL脂质谱改变(这可以由医生或临床医师确定)的对象中特别有用。本申请显示的数据表明，IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白可以增加罹患代谢综合征的那些对象中的高密度脂蛋白(HDL)并降低密度脂蛋白(LDL)。不受理论束缚，该数据还表明肠源性LPS是内毒素血症和动脉粥样硬化的推动因子。用mIL-22Fc融合蛋白处理的小鼠具有降低的高脂血症，改善的葡萄糖耐受性以及恢复的血管功能，并且这些变化最终减少动脉粥样硬化斑块。IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白可使心血管疾病的进展减弱。
此外，糖尿病是影响动物中的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的慢性障碍。糖尿病是成人中失明、肾衰竭和下肢截肢的主因并且是心血管疾病和中风的主要风险因素。I型糖尿病(或胰岛素依赖型糖尿病(“IDDM”)或幼年发病性糖尿病)包括所有糖尿病病例的近10％。该疾病以胰腺的β细胞的胰岛素分泌功能逐步丧失为特征。该特征也为源于胰腺疾病的非自发性或“继发性”糖尿病所共有。I型糖尿病与以下临床病征或症状相关联，例如持续升高的血浆葡萄糖浓度或高血糖症；多尿症；烦渴和/或饮食过量；慢性微血管并发症诸如视网膜病、肾病和神经病；及大血管并发症诸如可导致失明、肾终末期疾病、截肢和心肌梗死的高脂血症和高血压。
II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM)是涉及到葡萄糖代谢调节异常和胰岛素敏感度受损的代谢失调(或代谢综合征)。II型糖尿病通常在成人期形成，与身体无法利用或产生足够的胰岛素有关。除在靶组织中观察到的胰岛素抗性外，罹患II型糖尿病的患者还存在相对的胰岛素缺陷——即，对于给定的血浆葡萄糖浓度，患者具有低于预测的胰岛素水平。II型糖尿病以下列临床病征或症状为特征，例如持续升高的血浆葡萄糖浓度或高血糖症；多尿症；烦渴和/或饮食过量；慢性微血管并发症诸如视网膜病、肾病和神经病；及大血管并发症诸如可导致失明、肾终末期疾病、截肢和心肌梗死的高脂血症和高血压。
定义
除非另外限定，否则本文所用的全部本领域术语、符号和其他科学术语意在具有本发明所属的领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清晰和/或为了便利参考，本文中定义具有通常理解含义的术语，并且本文中纳入这类定义不应当必然地解释为代表相对于本领域通常所理解而言巨大的差异。
在本申请范围内，除非另外声明，否则所用的技术可以在几种熟知参考文献的任一者中找到，如：MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等人,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)、PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等人,1990.AcademicPress,SanDiego,CA)及Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
如果适宜，除非另外指出，否则通常根据制造商限定的方案和/或参数，实施涉及使用市售试剂盒和试剂的方法。在因此本发明的方法和用途之前，应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体和试剂，它们当然可以变动。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。
如本文中所用，除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数称谓。例如，对“一种分离的肽”的提及意指一种或多种分离的肽。
遍及本说明书，词汇“包含”或其变异形式如“包括了”或“包含有”应理解为表示纳入所陈述的整数或整数群，但不排除任何其它整数或整数群。
如本文所用，术语“IL-22Fc融合蛋白”或“IL-22融合蛋白”或“IL-22Ig融合蛋白”指其中IL-22蛋白或多肽直接或间接与IgGFc区连接的融合蛋白。在某些优选的实施方案中，本发明的IL-22Fc融合蛋白包含与人IgGFc区连接的人IL-22蛋白或多肽。在某些实施方案中，人IL-22蛋白包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。然而，可以理解，本发明还构思了不影响IL-22或IL-22Fc融合蛋白的功能和/或活性的IL-22或Fc的微小序列变异如插入、缺失、置换、尤其保守性氨基酸置换。本发明的IL-22Fc融合蛋白可以与IL-22受体结合，这可以导致IL-22受体下游信号传导。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白能够与IL-22受体结合，和/或能够导致IL-22受体下游信号传导。可以通过本领域已知的方法测定IL-22Fc融合蛋白功能和/或活性，所述方法包括而不限于ELISA、配体-受体结合测定法和Stat3萤光素酶测定法。在某些实施方案中，本发明提供与IL-22受体结合的IL-22Fc融合蛋白，所述结合作用可以导致IL-22受体下游信号传导，所述IL-22Fc融合蛋白包含与选自SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中Fc区没有糖基化。在某些具体实施方案中，IL-22融合蛋白的Fc区没有效应子活性(例如，不与FcγIIIR结合)或显示比完整(例如，野生型)IgG抗体实质更低的效应子活性。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白的Fc区不触发细胞毒性，如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)。除非另外说明，“IL-22融合蛋白”、“IL-22Fc融合物”、“IL-22Ig融合蛋白”、“IL-22Fc融合蛋白”或“IL-22Fc”在本申请期间自始至终可互换使用。
除非另外说明，否则如本文所用，术语“IL-22”或“IL-22多肽”或“IL-22蛋白”广义地指来自任何哺乳动物来源的任何天然IL-22，所述哺乳动物来源包括灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖“全长”、未加工的IL-22以及因细胞中加工而产生的任何形式的IL-22。例如，本发明涵盖含有N端前导序列的全长IL-22和成熟形式的IL-22。前导序列(或信号肽)可以是内源IL-22前导序列或另一种哺乳动物分泌型蛋白的外源前导序列。在某些实施方案中，前导序列可以来自真核或原核分泌型蛋白。本术语还涵盖天然存在的IL-22变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人IL-22的氨基酸序列在SEQIDNO:4(成熟形式，无信号肽)中显示。在某些实施方案中，带内源前导序列的全长IL-22蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:71中提供；而在其他实施方案中，带外源前导序列的成熟IL-22蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:2中提供。本发明还构思了不影响IL-22的功能和/或活性(例如，与IL-22受体结合)的IL-22微小序列变异、尤其保守性氨基酸置换。图1显示来自几种示例性哺乳动物物种的成熟IL-22的氨基酸序列比对结果。星号表示各物种间高度保守的氨基酸残基，这些残基对IL-22的功能和/或活性可能重要。因此，在某些实施方案中，本发明的IL-22Fc融合蛋白包含IL-22多肽，所述IL-22多肽包含与SEQIDNO:4具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，IL-22蛋白与SEQIDNO:71具有95％或更大的序列同一性、具有96％或更大的序列同一性，具有97％或更大的序列同一性；与SEQIDNO:71具有98％或更大的序列同一性；与SEQIDNO:71具有99％或更大的序列同一性。本文所述的IL-22多肽可以从多种来源分离，如从人组织或从另一个来源分离，或通过重组或合成方法制备。
术语“IL-22受体”或“IL-22R”指由IL-22R1和IL-10R2或其天然存在的等位变体组成的异二聚体。参见Ouyang等人,2011,Annu.Rev.Immunol.29:159-63。IL-10R2由许多细胞类型普遍表达，并且IL-22R1仅在固有细胞如上皮细胞、肝细胞和角质形成细胞中表达。IL-22R1也称作IL-22Ra1或IL-22Rα1。IL-22R1可以与其他多肽配对以形成其他IL-10家族成员(例如IL-20或IL-24)的异二聚受体。参见例如，Ouyang等人，2011，上文。
“天然序列IL-22多肽”或“天然序列IL-22R多肽”指包含与衍生于自然界的相应IL-22或IL-22R多肽相同的氨基酸序列的多肽。这种天然序列IL-22或IL-22R多肽可以从自然界分离或可以通过重组或合成手段产生。这些术语特别涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定IL-22或IL-22R多肽(例如，缺少其相关信号肽的IL-22)、该多肽的天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和天然存在的等位变体。在本发明的多种实施方案中，本文中公开的天然序列IL-22或IL-22R多肽是成熟或全长的天然序列多肽。示例性全长天然人IL-22在图30(DNA，SEQIDNO:70)和图31(蛋白质、SEQIDNO:71)中显示。在图30中，起始密码子和终止密码子以粗体显示并加下划线。尽管附图中公开的IL-22多肽和IL-22R多肽序列显示始于本文中命名为氨基酸位置1的甲硫氨酸残基，但是可构思并可能的是，可以使用位于本图中氨基酸位置1上游或下游的其他甲硫氨酸残基作为IL-22多肽或IL-22R多肽的起始氨基酸残基。
“IL-22变体”、“IL-22R变体”、“IL-22变体多肽”、或“IL-22R变体多肽”意指如上文定义的与全长天然序列IL-22或IL-22R多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的有活性的IL-22或IL-22R多肽。通常，IL-22或IL-22R多肽变体将与全长或成熟的天然序列IL-22或IL-22R多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性、备选地至少约81％氨基酸序列同一性、备选地至少约82％氨基酸序列同一性、备选地至少约83％氨基酸序列同一性、备选地至少约84％氨基酸序列同一性、备选地至少约85％氨基酸序列同一性、备选地至少约86％氨基酸序列同一性、备选地至少约87％氨基酸序列同一性、备选地至少约88％氨基酸序列同一性、备选地至少约89％氨基酸序列同一性、备选地至少约90％氨基酸序列同一性、备选地至少约91％氨基酸序列同一性、备选地至少约92％氨基酸序列同一性、备选地至少约93％氨基酸序列同一性、备选地至少约94％氨基酸序列同一性、备选地至少约95％氨基酸序列同一性、备选地至少约96％氨基酸序列同一性、备选地至少约97％氨基酸序列同一性、备选地至少约98％氨基酸序列同一性和备选地至少约99％氨基酸序列同一性。
术语“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”指免疫球蛋白重链的C端非抗原结合区，其含有至少一部分恒定区。该术语包括天然Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。除非本文中另外说明，否则IgG或Fc区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的用于抗体的EU编号体系，也称作EUindex。
在某些实施方案中，Fc区指包含铰链区(始于Cys226)、IgGCH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白IgG重链恒定区。如本文所用，术语“铰链区”或“铰链序列”指位于接头和CH2结构域之间的氨基酸序列。在某些实施方案中，铰链区包含氨基酸序列CPPCP(SEQIDNO:31)。在某些实施方案中，IL-22IgG4Fc融合蛋白的铰链区包含CPPCP序列(SEQIDNO:31)，天然IgG1铰链区中存在的序列，以促进二聚化。在某些其他实施方案中，Fc区始于铰链区并且延伸到IgG重链的C末端。在某些具体实施方案中，Fc区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。在某些具体实施方案中，Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。在某些其他的具体实施方案中，Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。如实施例部分中所述，申请人出乎意料地发现，IL-22IgG4Fc融合蛋白显示出甚至优于IL-22IgG1Fc融合蛋白的药代动力学特性。
在某些实施方案中，IgGCH2结构域始于Ala231。在某些其他实施方案中，CH3结构域始于Gly341。可以理解，人IgG的C端Lys残基可以任选地不存在。还应当理解，本发明的范围内构思了Fc区的保守性氨基酸置换而不影响Fc的所需结构和/或稳定性。
在某些实施方案中，IL-22经接头与Fc区连接。在某些具体实施方案中，接头是将IL-22的C末端与如本文所述的Fc区连接的肽。在某些实施方案中，天然IgG序列存在于接头和/或铰链区中以使免疫原性风险最小化和/或避免免疫原性风险。在其他实施方案中，可以将微小序列变异引入天然序列以协助制造。包含显示高活性(如例如，通过萤光素酶测定法测量)的外源接头或铰链序列的IL-22Fc融合构建体也处于本发明的范围内。在某些实施方案中，接头包含长8-20个氨基酸、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、11-16、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，接头包含氨基酸序列DKTHT(SEQIDNO:32)。
在某些具体实施方案中，接头不包含序列Gly-Gly-Ser(SEQIDNO:45)、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO:46)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO:47)。
在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽。术语“与连接”或“与融合”指在两个部分之间形成的共价键，例如，肽键。
术语“无岩藻糖化”、“无岩藻糖化的”、“去岩藻糖化”或“去岩藻糖化的”指不存在核岩藻糖或从与Fc的CH2结构域附着的N-聚糖移除核岩藻糖。
申请人出乎意料地发现，不同于包含Fc的其他Fc融合蛋白或抗体，IL-22IgG1Fc融合蛋白在与Fc区附着的N-聚糖中显示出高水平(例如，30％)的无岩藻糖化。与Fc的CH2结构域附着的N-聚糖是异质的。CHO细胞中生成的抗体或Fc融合蛋白由岩藻糖基转移酶活性而岩藻糖化。参见Shoji-Hosaka等人,J.Biochem.2006,140:777-83。通常，可以在人血清中检测到小百分数的天然存在的无岩藻糖化的IgG。Fc的N-糖基化对与FcγR结合重要；并且N-聚糖的无岩藻糖化增加Fc对FcγRIIIa的结合能力。增加的FcγRIIIa结合作用可以增强抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，这可能在其中细胞毒性是理想的某些抗体治疗性应用中有利。参见Shoji-Hosaka等人，上文。然而，当Fc-介导的细胞毒性是不理想的时如在IL-22Fc融合物情况下，这种增强的效应子功能可能有害。
已知IgG4Fc显示出比IgG1Fc更小的效应子活性。申请人出乎意料地发现，IL-22IgG4Fc融合蛋白还在Fc区内显示高水平的无岩藻糖化。高水平的与IgG4的Fc附着的无岩藻糖化的N-聚糖可能增加不理想的效应子活性。
因此，在一个方面，本发明提供其中Fc区或CH2结构域未糖基化的IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方案中，将CH2结构域中的N-糖基化位点突变以防止糖基化。
在某些其他实施方案中，可以通过改变糖基化共有位点，即，在位置297处的Asn，后接任何氨基酸残基(在人IgG的情况下，Ser)和Thr(参见图3)，消除Fc区的CH2结构域中的糖基化。可以通过氨基酸插入、缺失和/或置换，改变糖基化位点。例如，可以将一个或多个氨基酸残基插在Asn和Ser之间或Ser和Thr之间以改变原始糖基化位点，其中插入未再生N-糖基化位点。在某些具体实施方案中，将人IgGFc的CH2结构域内部的N297残基(例如Fc中的N-糖基化点，参见图3)突变以废除该糖基化位点。在某些具体实施方案中，将N297残基变成Gly、Ala、Gln、Asp或Glu。在一些具体实施方案中，将N297残基变成Gly或Ala。在其他具体实施方案中，将N297残基变成Gly。在某些其他实施方案中，可以将T299残基置换为另一种氨基酸，例如Ala、Val或Gly。在某些具体实施方案中，导致无糖基化的Fc的突变不影响IL-22Fc融合蛋白的结构和/或稳定性。
在一个相关方面，本发明提供在有需要的患者中治疗IBD(包括UC和CD)的方法、抑制肠中细菌性感染的方法和改善肠中上皮完整性、上皮增殖、分化和/或迁移的方法，和治疗代谢病症或代谢综合征、II型糖尿病、动脉粥样硬化和糖尿病性创伤愈合的方法，所述方法包含向该患者施用包含IL-22Fc融合蛋白的药物组合物，其中Fc区未糖基化。
在又一个方面，本发明提供组合物，所述组合物包含在Fc区内具有低水平无岩藻糖化或没有无岩藻糖化的IL-22Fc融合蛋白。具体而言，本发明提供一种组合物，所述组合物包含在Fc区内具有不多于10％、优选地不多于5％、更优选地不多于2％和最优选地小于1％的总无岩藻糖化水平的IL-22Fc融合蛋白。在另一个方面，本发明提供在有需要的患者治疗IBD(包括UC和CD)的方法、抑制肠中细菌性感染的方法和改善肠中上皮完整性、上皮增殖、分化和/或迁移的方法和治疗代谢病症、II型糖尿病、II型糖尿病伴病态肥胖症、移植物抗宿主病(GVHD)、动脉粥样硬化、心血管疾病、代谢综合征、内毒素血症(急性和轻微)、败血病、急性冠状动脉心脏病、高血压、血脂异常、肥胖症、高血糖、脂质代谢病症、肝炎、急性肝炎、肾衰竭、急性肾衰竭、急性肾损伤、肾移植失败、胰腺炎、急性胰腺炎、肝纤维化和肺纤维化、创伤、感染的创伤、加速创伤愈合(包括糖尿病性创伤愈合)的方法，所述方法中包含向该患者施用一种药物组合物，所述药物组合物包含在Fc区内具有不多于10％、优选地不多于5％、更优选地不多于2％和最优选地小于1％的无岩藻糖化水平的IL-22Fc融合蛋白。
术语“％无岩藻糖化”指在IL-22Fc融合蛋白的组合物中Fc区内无岩藻糖化水平。％无岩藻糖化可以通过质谱法(MS)测量并且展示为无岩藻糖化的聚糖种类(在一个Fc结构域(-1)和在上合计两个Fc结构域(-2)上无岩藻糖的种类)相对于整个IL-22Fc融合蛋白群体的百分数。例如，可以将％无岩藻糖化计算为-1岩藻糖峰和-2岩藻糖峰下的合计面积相对于通过MS分析的全部聚糖种类的总面积的百分数，通过如图2中所述的和在下文所示实施例中的Agilent6520BTOF质谱仪确定。可以通过本领域已知的任何其他合适方法测量无岩藻糖化的水平，所述方法包括而不限于HPLC-ChipCubeMS(Agilent)和反相-HPLC。IL-22Fc组合物的％无岩藻糖化可以用作确定该组合物是否将可能触发不可接受水平ADCC(不适于预期目的)的指标。因此，在某些具体实施方案中，组合物包含具有不多于10％、优选地不多于5％、更优选地不多于3％和最优选地不多于1的％无岩藻糖化水平的IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方案中，组合物包含具有不多于10％、不多于9％、不多于8％、不多于7％、不多于6％、不多于5％、不多于4％、不多于3％、不多于2％或不多于1％的无岩藻糖化水平的IL-22Fc融合蛋白。
在某些实施方案中，可以通过本领域已知的方法实现IL-22Fc组合物理想的无岩藻糖化水平，这包括而不限于，通过纯化。例如，可以通过具有树脂的亲和层析，富集组合物中的岩藻糖化的种类，其中所述树脂与岩藻糖结合部分如对岩藻糖、尤其以1-6连接存在的岩藻糖特异性的抗体或凝集素缀合。参见例如，Kobayashi等人,2012,J.Biol.Chem.287:33973-82。在某些其他实施方案中，可以在亲和柱中使用抗岩藻糖特异性抗体，将岩藻糖化的种类富集并与无岩藻糖化的种类分离。备选地或额外地，可以使用亲和层析，基于对FcγRIIIa的差异性结合亲和力将无岩藻糖化的种类与岩藻糖化的种类分离。
在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含其中CH2结构域中的N297残基突变的Fc区。在某些实施方案中，将N297残基变成Gly或Ala，优选地突变成Gly。在某些其他实施方案中，缺失N297残基。在某些实施方案中，包含在N297处具有氨基酸置换的Fc的IL-22Fc融合蛋白是无糖基化的或未糖基化的。术语“无糖基化的”如本文所用，指未糖基化的蛋白质或目的蛋白的一部分。例如，可以通过诱变Fc区CH2结构域中的N297残基，产生具有无糖基化的Fc区的IL-22Fc融合蛋白。
在其他实施方案中，可以酶促地(例如，通过去糖基化作用)移除附着于野生型N297残基的N-聚糖。合适的糖解酶包括而不限于肽-N-糖苷酶(PNGase)。
术语“二聚体IL-22Fc融合蛋白”指其中每个单体包含IL-22Fc融合蛋白的二聚体。术语“单体IL-22Fc融合蛋白”指这样的二聚体，其中一个单体包含IL-22Fc融合蛋白(IL-22Fc臂)，而另一个单体包含无IL-22多肽的Fc区(Fc臂)。因此，二聚体IL-22Fc融合蛋白在IL-22R结合方面是双价的，而单体IL-22Fc融合蛋白在IL-22R结合方面是单价的。可以通过本领域已知的方法协助单体IL-22Fc融合蛋白的异二聚化，所述方法包括而不限于借助结入孔(knob-into-hole)技术的异二聚化。结入孔技术的结构和装配方法可以在，例如US5,821,333、US7,642,228、US2011/0287009和PCT/US2012/059810中找到，所述文献因而通过引用的方式完整并入。通过以下方式形成这项技术：在一个Fc的CH3结构域中通过将小氨基酸残基替换为一个大氨基酸残基而引入“结”(或突出部分)，并且在另一个Fc的CH3结构域中通过将一个或多个大氨基酸残基替换为更小的氨基酸残基而引入“孔”(或空孔)。在某些实施方案中，IL-22Fc融合物臂包含结，并且仅有Fc臂包含孔。
用于形成结的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成结的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺，天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH3结构域中用于形成结的示例性氨基酸置换包括而不限于T366W、T366Y或F405W置换。
用于形成孔的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个实施方案中，用于形成孔的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。CH3结构域中用于产生孔的示例性氨基酸置换包括而不限于T366S、L368A、F405A、Y407A、Y407T和Y407V置换。在某些实施方案中，结包含T366W置换，并且孔包含T366S/L368A/Y407V置换。在某些具体实施方案中，单体IL-22Fc融合蛋白的Fc区包含IgG1Fc区。在某些具体实施方案中，单体IL-22IgG1Fc融合物包含IL-22Fc结臂和Fc孔臂。在某些实施方案中，IL-22Fc结臂包含T366W置换(SEQIDNO:61)，并且Fc孔臂包含T366S、L368A和Y407V(SEQIDNO:62)。在某些其他实施方案中，两个臂的Fc区还包含N297G或N297A突变。在某些实施方案中，单体IL-22Fc融合蛋白在大肠杆菌细胞中表达。可以理解，本申请还构思并涵盖了本领域已知的促进异二聚化的Fc区的其他修饰。
术语“创伤”指损伤，特别是其中皮肤或另一个外表面被撕裂、刺穿、切割或否则破坏的损伤。
术语“溃疡”是皮肤或粘膜的损伤位点，经常以形成脓、组织死亡为特征并是经常伴发炎症反应。
如本文所用的术语“肠”或“消化道”广义地涵盖小肠和大肠。
术语“加速创伤愈合”或“创伤愈合加速”指愈合速率的增加，例如，直至完整创伤闭合发生的时间减少或直至创伤面积减少％发生的时间减少。
“糖尿病性创伤”是与糖尿病相关的创伤。
“糖尿病性溃疡”是与糖尿病相关的溃疡。
“慢性创伤”指不痊愈的创伤。参见，例如，Lazarus等人,Definitionsandguidelinesforassessmentofwoundsandevaluationofhealing,Arch.Dermatol.130:489-93(1994)。慢性创伤例如包括但不限于动脉溃疡、糖尿病性溃疡、压迫溃疡或褥疮、静脉溃疡等。急性创伤可以发展成慢性创伤。急性创伤包括但不限于例如由热损伤(例如，烧伤)、创伤、手术、切除大范围皮肤癌、深部真菌性感染和细菌性感染，血管炎、硬皮病、天疱疮、中毒性表皮坏死松解等引起的创伤参见，例如，Buford2001年10月24日公开的WoundHealingandPressureSores,HealingWell.com。因此，在某些实施方案中，慢性创伤是感染的创伤。“正常创伤”指经历正常创伤愈合修复的创伤。
出于本文目的，“受体人类框架”是这样的框架，它包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列，如下文所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人类框架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL受体人类框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人类共有框架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，配体或抗体)的单一结合位点与其结合伙伴(例如，受体或抗原)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，IL-22Fc融合蛋白和IL-22受体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伙伴Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不是完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供示例性竞争测定法。
术语“嵌合”抗体指抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗药或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”或“效应子活性”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白不显示出任何效应子功能或任何可检测的效应子功能。在某些其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白显示出实质降低的效应子功能，例如，降低约50％、60％、70％、80％或90％的效应子功能。
活性剂(例如，药物制剂)的“有效量”或“治疗有效量”，指以必要的剂量和时间段有效实现所需治疗性或预防性结果的剂量。
例如，在心血管疾病或病况的情况下，治疗有效量的IL-22多肽、融合蛋白或激动剂可以减少动脉粥样硬化斑块形成的程度；减小动脉粥样硬化斑块的尺寸)；抑制(即，某种程度地减慢并且优选地制止)动脉粥样硬化斑块；抑制(即，某种程度地减慢并且优选地制止)血栓形成或动脉粥样硬化斑块破裂；和/或某种程度地缓解一种或多种与该疾病或病况相关的症状。
“减少或抑制”意指引起总体减少优选地20％或更多、更优选地50％或更多、并且最优选地75％、85％、90％、95％或更多的能力。减少或抑制可以指正在治疗的病症的症状、动脉粥样硬化斑块的存在或大小或动脉粥样硬化斑块数目。
“次优量”指比通常用于某种治疗的治疗剂最佳量更少的量。当两种治疗剂同时或依次给予对象时，与单独给予每种治疗剂时的治疗相比，每种治疗剂可以按次优量给予。例如，在某些实施方案中，对有需要IBD治疗的对象施用次优量的包含本发明的IL-22Fc融合蛋白和地塞米松的药物组合物。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用来指具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。转化的细胞包括瞬时或稳定转化的细胞。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。在某些实施方案中，宿主细胞用外源核酸瞬时转染。在某些实施方案中，宿主细胞用外源核酸稳定转染。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有框架”是这样的框架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)，第5版，NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化的”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应，并且全部或基本上全部的FR与人抗体的那些FR对应。人源化的抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化的形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)，和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体或抗体的片段。
“个体”、“对象”或“患者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体、对象或患者是人。
“分离的”IL-22融合蛋白是这样的融合蛋白，所述融合蛋白已经从重组产生该融合蛋白的宿主细胞的环境分离。在一些实施方案中，将IL-22融合蛋白纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码IL-22Fc融合蛋白的分离的核酸”指编码IL-22Fc融合蛋白的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或独立载体中的这类核酸分子、瞬时或稳定转染到宿主细胞中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列必需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷化信号和增强子。
当一种核酸与另一个核酸序列处于功能性关系时，该核酸是“有效连接的”。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA与编码多肽的DNA有效连接若前者表达为参与所述多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列有效连接若它影响该序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列有效连接若该结合位点如此安置从而促进翻译。通常，“有效连接的”意指连接的DNA序列是连续的，并且，在分泌性前导序列情况下，是连续的并处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。连接通过在便利的限制性位点处连接而完成。如此类位点不存在，则根据常规实践使用合成性寡核苷酸衔接头或接头。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，例外在于例如含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能的变体抗体，这类变体通常以微量存在。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射标签缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括而不限于，天然序列人IgG1Fc区(非A同种型和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰、优选地一个或多个氨基酸置换而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如约1个至约10个氨基酸置换，和优选地约1个至约5个氨基酸置换。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并最优选地与之具有至少约90％同源性，更优选地与之具有至少约95％同源性。在某些实施方案中，变体Fc区未糖基化。
术语“炎性肠病症”、“炎性肠病”或IBD在本文中以最广含义使用并且包括其发病机制涉及肠(包括小肠和结肠)中复发性炎症的全部疾病和病理状况。常见的IBD包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD不限于UC和CD。疾病的表现包括但不限于肠中炎症和上皮完整性下降。
术语“心血管疾病”或“心血管病症”在本文中以最广含义使用并且包括其发病机制涉及血管异常，诸如，例如，动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高的全部疾病和病理状况。本术语额外地包括从抑制动脉粥样硬化斑块形成获益的疾病和病理状况。心血管疾病包括而不限于冠状动脉动脉粥样硬化、冠脉微血管疾病、中风、颈动脉病、外周动脉病、局部缺血、冠状动脉病(CAD)、急性冠状动脉综合征(ACS)、冠状动脉心脏病(CHD)、与CAD和CHD相关的病况、脑血管病、外周血管病、动脉瘤、血管炎、静脉血栓形成、糖尿病及代谢综合征、慢性肾脏疾病、在局部缺血和再灌注后的远端组织损伤、心肺转流术。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病。
术语“心血管病况”在本文中以最广含义使用并且包括其病理学涉及动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高的全部心血管病和疾病。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病和病况。本术语特别地包括从抑制动脉粥样硬化斑块形成获益的疾病和病理状况。心血管病包括而不限于冠状动脉动脉粥样硬化、冠脉微血管疾病、中风、颈动脉病、外周动脉病、局部缺血、冠状动脉病(CAD)、冠状动脉心脏病(CHD)、与CAD和CHD相关的病况、脑血管病和与脑血管病相关的病况、外周血管疾病和与外周血管疾病相关的病况、动脉瘤、血管炎、静脉血栓形成、糖尿病及代谢综合征、慢性肾脏疾病、在局部缺血和再灌注后的远端组织损伤和心肺转流术。如本文所用的“与脑血管病相关的病况”包括例如短暂性脑缺血发作(TIA)和中风。如本文所用的“与外周血管疾病相关的病况”例如包括跛行。具体而言，这个类别内部包括与可以通过抑制动脉粥样硬化斑块形成而控制其出现、形成或进展相关的全部心血管疾病和病况。
动脉粥样硬化斑块形成可以因针对代谢性内毒素血症的先天免疫反应而出现，所述先天免疫反应以源自消化道微生物群和消化道粘膜屏障的功能完整性丧失的全身性脂多糖(LPS)的升高的水平为特征。针对内毒素血症的先天免疫反应导致造成斑块形成的低等级慢性炎症。
术语“代谢综合征”在本文中以最广含义使用。代谢综合征包括在成年对象中共同出现几种代谢风险因子，包括以下五种性状中的至少三种：可以例如是男性中腰围大于或等于90cm和女性中腰围大于或等于80cm的腹部肥胖；可以例如是大于或等于150mg/dL的血清甘油三酯升高或用于甘油三酯升高的药物治疗；可以例如是男性中低于40mg/dL和女性中低于50mg/dL的血清HDL胆固醇水平降低或用于低HDL胆固醇的药物治疗；可以例如是收缩血压大于130mmHg和舒张压大于85mmHg的高血压或用于高血压的药物治疗；和可以例如是大于或等于100mg/dL的空腹血糖升高、用于葡萄糖升高的药物治疗或先前诊断的2型糖尿病。还参见Meigs，theMetabolicSyndrome(InsulinResistanceSyndromeorSyndromeX),http://www.uptodate.com/contents/the-metabolic-syndrome-insulin-resistance-syndrome-or-syndrome-x，其公开内容因而通过引用的方式并入本文。
对于超过16岁的儿童，可以使用以上成年标准。对于10-16岁之间的儿童，代谢综合征包括在对象中共同出现几种代谢风险因子，包括以下五种性状中的至少三种：可以例如是腰围大于第90百分位数的腹部肥胖；可以例如是大于或等于110mg/dL、大于第95百分位数的血清甘油三酯升高或用于甘油三酯升高的药物治疗；可以例如是低于40mg/dL、小于第5百分位数的血清HDL胆固醇水平降低或用于低HDL胆固醇的药物治疗；可以例如是收缩血压大于130mmHg和舒张压大于85mmHg、大于第90百分位数的高血压或用于高血压的药物治疗；和可以例如是大于或等于100mg/dL的空腹血糖升高、糖耐受受损、用于葡萄糖升高的药物治疗或先前诊断的2型糖尿病。
通常而言，在代谢综合征中共同出现的风险因子包括肥胖症(如腹部的肥胖症)、高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗和/或高血压。全部这些风险因子均促进动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病或二者的形成。代谢综合征还可以以慢性脂肪组织炎症为特征。
代谢综合征可以视作促炎、凝血前状态，并且可能与升高水平的一种或多种C-反应蛋白、IL-6，LPS和纤维蛋白溶酶原激活物抑制物1相关；这类标志物可以与后续形成动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病或这二者的风险增加相关。
代谢综合征可以与几种肥胖相关病症相关，所述肥胖相关病症包括以下一种或多种：脂肪肝疾病伴脂肪变性、纤维化和肝硬化，肝细胞性和肝内胆管癌、慢性肾脏疾病、多囊性卵巢综合征、睡眠障碍性呼吸(包括阻塞性睡眠呼吸暂停)和高尿酸血症及痛风。
术语“胰岛素相关的病症”涵盖以糖耐受受损为特征的疾病或病况。在一个实施方案中，胰岛素相关的病症是包括而不限于以下的糖尿病：I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)、II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)糖尿病、妊娠糖尿病和将由刺激胰岛素分泌的活性剂受益的任何其他病症。在另一个实施方案中，胰岛素相关的病症以胰岛素抵抗为特征。
术语“败血病”以其最广意义使用并且可以涵盖由严重感染造成的全身性炎症状态。败血病可以由免疫系统对严重感染的反应造成，最常见地对血、尿道、肺、皮肤或其他组织中细菌、还对真菌、病毒和寄生虫的反应造成。
术语“急性内毒素血症”以其最广意义使用并且可以涵盖血浆细菌脂多糖(LPS)升高的病况。急性内毒素血症转而可能导致败血病。全身循环中增加的LPS将诱导低等级慢性炎症，这激活内源保护性宿主反应以升高血浆脂质，所述血浆脂质在慢性病况中促成膳食引起的肥胖症、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化及最终CVD事件。
如本文所用，“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。理想的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病况态，以及缓解或预后改善。
例如，就IBD而言，“治疗”可以指形成IBD的可能性降低、形成IBD的速率降低和疾病严重程度降低。作为另一个例子，就动脉粥样硬化斑块形成而言，“治疗”可以指形成动脉粥样硬化斑块沉积物的可能性降低、形成沉积物的速率降低、现有沉积物的数量和尺寸减小或斑块稳定性改善。需要治疗的那些对象包括已经患有病症的那些以及其中待预防该病症的那些。理想的治疗效果包括，但不限于防止疾病的出现或复发、缓和症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、预防疾病、降低病情进展速率、缓解或缓和疾病状态，以及造成缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
在某些实施方案中，“有需求的对象”在预防或治疗心血管病的语境下指以下对象：经诊断患有心血管疾病或心血管病况(CVD)或代谢综合征或显示与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的对象、过去已经诊断患有CVD或代谢综合征或显示与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的对象、或已经被认定在未来因遗传性或环境因素而处于形成CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的一种或多种病况的风险的对象。因此，在某些实施方案中，有需求的对象可以是正在显示CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况的对象或这样的对象，所述对象已经在过去显示CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况或已经被认定在未来处于形成CVD或代谢综合征或与CVD或代谢综合征相关的病况的风险。
在治疗心血管疾病或病况中，治疗药可以直接改变免疫反应的组分的反应的幅度，或使得疾病更易受其他治疗药(例如，抗生素、抗真菌药、抗炎要、化疗药等)治疗影响。在治疗动脉病中，治疗可能例如阻止或减缓疾病进展。因此，治疗动脉病特别地包括阻止、抑制或减慢病况的形成或该病况从一个阶段向另一个更晚期阶段进展，或进展成更严重的相关病况。
疾病或病况的“病理学”包括损害对象福祉的全部现象。在心血管疾病或病况情况下，这包括而不限于动脉粥样硬化斑块形成(包括稳定或不稳定/脆弱斑块)、动脉粥样硬化、动脉硬化、小动脉硬化和全身性脂多糖(LPS)暴露升高。
“缓和”、“缓和的”或其等同物指治疗性疗法以及预防性或防止性措施，其中目的在于改善、防止、减缓(减轻)、减少或抑制疾病或病况，例如，动脉粥样硬化斑块形成。需要治疗的那些对象括已经患有该疾病或病况的那些以及倾向于患有该疾病或病况的那些或其中待预防该疾病或病况的那些。
“长期”施用指以与急性模式相反，以连续模式施用所述药物，从而将初始治疗作用维持延长的时间段。
“间歇”施用是在不中断的情况下不以连续方式进行、而在本质上为循环性的治疗。
术语“包装说明书”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
将相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
作为使用这种方法计算氨基酸序列同一性％的其他例子，下文展示如何相对于命名为“IL-22”的氨基酸序列计算命名为“对比蛋白”或“参照蛋白”的氨基酸序列的氨基酸序列同一性％，其中“IL-22”表示IL-22目的多肽的氨基酸序列，“对比蛋白”表示正在与“IL-22”目的多肽比较的多肽的氨基酸序列，并且“X”、“Y”和“Z”各自表示不同氨基酸残基。
作为使用这种方法计算氨基酸序列同一性％的例子，表1和表2展示如何相对于命名为“IL-22”的氨基酸序列计算命名为“对比蛋白”的氨基酸序列的氨基酸序列同一性％，其中“IL-22”表示IL-22目的多肽的氨基酸序列，“对比蛋白”表示正在与“IL-22”目的多肽比较的多肽的氨基酸序列，并且“X”、“Y”和“Z”各自表示不同氨基酸残基。
IL-22XXXXXXXXXXXXXXX(长度＝15个氨基酸)
参照蛋白XXXXXYYYYYYY(长度＝12个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(两条多肽序列之间的相同匹配的氨基酸残基数)除以(IL-22多肽的氨基酸残基的总数)＝5除以15＝33.3％
IL-22XXXXXXXXXX(长度＝10个氨基酸)
参照蛋白XXXXXYYYYYYZZYZ(长度＝15个氨基酸)
％氨基酸序列同一性＝
(两条多肽序列之间的相同匹配的氨基酸残基数)除以(IL-22多肽的氨基酸残基的总数)＝5除以10＝50％
杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员轻易地确定，并且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算值。通常，较长的探针需要较高的温度以正确复性，而较短的探针需要较低的温度。当互补链在低于其解链温度的环境中存在时，杂交通常依赖于变性的DNA再复性的能力。在探针和可杂交序列之间所需同源性的程度越高，可以使用的相对温度越高。因此，随之而来，较高的相对温度将倾向于使反应条件更严格，而较低的温度将倾向于使反应条件的严格性较低。关于杂交反应严格性的额外详述和解释，参见Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。
如本文定义，“严格条件”或“高严格性条件”可以由以下这些确定：(1)将低离子强度和高温度用于洗涤，例如在50℃，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在42℃在杂交期间使用变性剂，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺，与pH6.5，0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃在利用50％甲酰胺、5xSSC(0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xDenhardt溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中过夜杂交，和在42℃于0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，随后在55℃在由含有EDTA的0.1xSSC组成的高严格性洗液中洗涤10分钟。
“中等严格的条件”可以如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual.NewYork:ColdSpringHarborPress,1989所述那样确定，并且包括使用严格性比上文所述那些更低的洗涤液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的例子是在37℃于包含20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中孵育过夜，随后在约37-50℃于1×SSC中洗涤滤膜。技术人员将认识到如何按照需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“激动剂”以最广意义使用并且包括部分或完全模拟IL-22多肽的生物活性的任何分子。还由“激动剂”涵盖的是刺激编码该多肽的mRNA转录或翻译的分子。
合适的激动剂分子例如包括激动剂抗体或抗体片段；天然多肽；天然多肽的片段或氨基酸序列变体；肽；反义寡核苷酸；有机小分子；和编码多肽激动剂或抗体的核酸。对“激动剂”的提及涵盖单一激动剂或两种或更多种不同激动剂的组合。
术语“IL-22激动剂”以最广意义使用并且包括模拟天然序列IL-22多肽的定性生物活性(如上文限定)的任何分子。IL-22激动剂特别地包括IL-22-Fc或IL-22Ig多肽(免疫黏附素)，还包括模拟至少一种IL-22生物活性的小分子。优选地，生物活性是对IL-22受体的结合、与IL-22BP相互作用、促进先天免疫反应途径，或在心血管疾病或病况情况下，影响动脉粥样硬化斑块形成，尤其抑制动脉粥样硬化斑块形成。可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适成像方法，评估对斑块形成的抑制作用。
IL-22R1与其他蛋白质配对以形成异二聚体作为针对某些IL-10家族成员的受体。参见Quyang等人，2011，上文。因此，在某些实施方案中，IL-22激动剂可以包括IL-22受体激动剂，包括与IL-22R1结合并触发其下游信号传导的细胞因子(或其融合蛋白或激动剂)。在某些实施方案中，IL-22激动剂包括IL-22R1激动剂，包括而不限于抗-IL-22R1激动剂抗体；IL-20激动剂，包括而不限于IL-20多肽或IL-20Fc融合蛋白；和IL-24激动剂，包括而不限于IL-24多肽或IL-24融合蛋白。在某些其他实施方案中，IL-22R1激动剂包括IL-19激动剂，包括而不限于IL-19多肽或IL-19Fc融合蛋白；和IL-26激动剂，包括而不限于IL-26多肽或IL-26Fc融合蛋白。本文提供了IL-19的示例性序列(GenBank登录号AAG16755.1，SEQIDNO:77)、IL-20的示例性序列(GenBank登录号AAH69311.1，SEQIDNO:78)、IL-24的示例性序列(GenBank登录号AAH09681.1，SEQIDNO:79)和IL-26的示例性序列(GenBank登录号NP_060872.1，SEQIDNO:80)。在某些实施方案中，IL-19多肽包含SEQIDNO:77的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在某些其他实施方案中，IL-20多肽包含SEQIDNO:78的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在另外的其他实施方案中，IL-24多肽包含SEQIDNO:79的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。在某些其他实施方案中，IL-26多肽包含SEQIDNO:80的氨基酸序列或无信号肽的成熟蛋白。
“小分子”在本文中定义为具有低于约600道尔顿、优选地低于约1000道尔顿的分子量。
如本文所用“激动剂抗体”是部分或完全模拟IL-22多肽的生物活性的抗体。
术语“药物制剂”或“药物组合物”指这样的制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的对象不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稀释剂、稳定剂或防腐剂。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.FreemanandCo.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明是部分地基于包含下述治疗剂的组合物，所述治疗剂通过增加IL-22活性或信号传导，减轻IL-22相关的疾病或病症。在某些实施方案中，提供结合于并激活IL-22受体的IL-22多肽和IL-22Fc融合蛋白。本发明的IL-22Fc融合蛋白例如可用于诊断或治疗IL-22相关的疾病如炎性肠病和加速创伤愈合。此外，还提供用于治疗其他IL-22相关的疾病例如心血管病、代谢综合征和加速糖尿病性创伤愈合的IL-22多肽和IL-22Fc融合蛋白。
A.示例性IL-22多肽
如本文所用的IL-22多肽包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQIDNO:71(具有内源IL-22前导序列的人IL-22)(参见图31)，或包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQIDNO:71具有至少95％序列同一性。在某些实施方案中，IL-22多肽包含了包含SEQIDNO:4的氨基酸序列(无前导序列的人IL-22)或包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在某些实施方案中，IL-22多肽包含了包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-22多肽不包含Fc融合物。
可以通过本领域普通技术人员已知的方法实现天然IL-22分子连同其核酸和多肽序列的制备。例如，可以通过培养用含有IL-22核酸的载体转化或转染的细胞，产生IL-22多肽。当然，构思了本领域熟知的替代性方法可以用来制备IL-22。例如，可以通过使用固相技术直接进行肽合成，产生IL-22序列或其部分(参见，例如，Stewart等人,1969,Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,1963,85:2149-2154)。可以使用手工技术或通过自动化法，进行体外蛋白质合成。可以例如使用AppliedBiosystems肽合成仪(FosterCity，Calif.)，使用制造商的说明，完成自动合成。可以单独化学合成IL-22的多个部分并利用化学或酶促方法将其合并，以产生全长IL-22。
可以通过引入被变成编码天然序列IL-22多肽的DNA的适宜核苷酸或通过合成所需的IL-22多肽，制备IL-22变体。本领域技术人员将理解，氨基酸变化可以改变IL-22的翻译后处理，如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特征。
例如，使用例如在美国专利号5,364,934中所述的用于保守突变和非保守突变的任何技术和指南，可以在本文所述的天然序列IL-22多肽中产生变异。变异可以是置换、缺失或插入一个或多个编码天然序列或变体IL-22的密码子，所述置换、缺失或插入导致与相应的天然序列或变体IL-22相比其氨基酸序列的变化。任选地，变异是通过在天然序列IL-22多肽的一个或多个结构域中将至少一种氨基酸置换为任何其他氨基酸。可以通过比较IL-22的序列与已知同源蛋白质分子的序列并最小化在高度同源性区域内所做的氨基酸序列变化的数目，找到确定可以插入、置换或缺失哪个氨基酸残基而并未不利影响所需活性中的指导原则。氨基酸置换可以是将一个氨基酸替换为具有相似结构的和/或化学特性的另一种氨基酸结果，如将亮氨酸替换为丝氨酸，即，保守性氨基酸替换。插入或缺失可以任选地处于1至5个氨基酸的范围内。可以通过在序列中系统地产生氨基酸插入、缺失或置换并在以下实施例中描述的体外测定法中检验所得变体的活性，确定允许的变异。
在具体的实施方案中，表1中优选置换的标题下显示感兴趣的保守性置换。如果此类置换导致生物活性改变，则引入表1中名为“示例性置换”或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更明显改变，并且筛选产物。
可以使用本领域已知的方法如寡核苷酸介导的(位点定向)诱变、丙氨酸扫描法和PCR诱变产生变异。可以在克隆的DNA上实施位点定向诱变(Carter等人,1986,Nucl.AcidsRes,13:4331；Zoller等人,1987,Nucl.AcidsRes.,10:6487),盒诱变(Wells等人,1985,Gene,34:315)、限制性选择诱变(Wells等人,1986,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317:415)或其他已知技术以产生IL-22变体DNA。
本文还提供本发明的IL-22多肽的片段。这类片段可以在N末端或C末端截短，或可以缺少内部的残基，例如，与全长天然蛋白比较时。某些片段缺少对本发明IL-22多肽的所需生物活性而言并非必需的氨基酸残基。因此，在某些实施方案中，IL-22多肽的片段是有生物活性的。在某些实施方案中，全长IL-22的片段缺少N端信号肽序列。
本发明的范围内包括对天然序列和变体IL-22多肽的共价修饰。一种类型的共价修饰包括所靶向的IL-22的氨基酸残基与能够与选择的IL-22多肽侧链或N端残基或C端残基反应的有机衍生剂反应。用双官能试剂衍生化可用于例如将IL-22交联至水不溶性支持物基质或表面，例如，用于纯化抗IL-22抗体的方法。常使用的交联剂例如包括1,1-双(二唑乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯、同双官能酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺基酯如3,3'-二硫代双(珀酰亚胺丙酸酯)、双官能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷和活性剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚氨酸酯。
其他修饰包括谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺化成为相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基、脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,1983,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,第79-86i页)、N末端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
本发明范围内包括的IL-22多肽的另一类型的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。出于本发明的目的，“改变天然糖基化模式”意指删除一个或多个存在于天然序列IL-22中的糖部分，和/或添加一种或多种在天然序列IL-22中不存在的糖基化位点，和/或改变附着于糖基化位点的糖残基的比率和/或组成。
多肽的糖基化一般是N联接的或O联接的。N-联接的糖基化指糖部分附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸，是糖部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。O-联接的糖基化指以下糖：N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸、最常见丝氨酸或苏氨酸，不过5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可以参与O联接的糖基化。可以通过改变氨基酸序列，完成向IL-22多肽添加糖基化位点。可以例如通过向天然序列IL-22添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由前述残基置换(对N-联接的糖基化位点而言)，或添加用于O联接的糖基化的识别序列，作出改变。可以任选通过以下方式改变IL-22氨基酸序列：在DNA水平的变化，特别地通过在预选择的碱基处突变编码IL-22多肽的DNA，从而生成将翻译成所需氨基酸的密码子。
在IL-22多肽上增加糖部分数目的另一种手段是通过糖苷与多肽的化学偶联或酶促偶联。本领域中描述了这类方法，例如，在1987年9月11日公开的WO87/05330中和在Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,第259-306页(1981)中描述。
可以按化学或酶促方式或通过突变性置换密码子，实现IL-22多肽上存在的糖部分的移除，其中所述密码子编码充当糖基化的靶的氨基酸残基。化学去糖基化技术是本领域已知的并且例如由Hakimuddin等人,Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)并由Edge等人,Anal.Biochem.,118:131(1981)描述。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现多肽上糖部分的酶促切除，如Thotakura等人,Meth.Enzymol.,138:350(1987)。
另一类型的IL-22共价修饰包括将IL-22多肽连接至多种非蛋白质聚合物的之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，例如按美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式连接。天然序列和变体IL-22也可以按形成包含与另一个异源多肽或氨基酸序列融合的IL-22(包括IL-22片段)的嵌合分子的方式修饰。
在一个实施方案中，这种嵌合分子包含IL-22与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供抗标签抗体可以选择性与之结合的表位。表位标签通常置于IL-22多肽的氨基端或羧基端。可以使用针对标签多肽的抗体，检测到IL-22多肽的这类加表位标签形式的存在。也提供表位标签使得能够利用抗标签抗体或另一个类型的与该表位标签结合的亲和基质，通过亲和纯化法轻易纯化IL-22多肽。多种标签多肽及其相应的抗体是本领域熟知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；fluHA标签多肽和其抗体12CA5(Field等人,1988,Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165)；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、和9E10抗体(Evan等人,1985,MolecularandCellularBiology,5:3610-3616)；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人,1990,ProteinEngineering,3(6):547-553)。其他标签多肽包括Flag-肽(Hopp等人,1988,BioTechnology,6:1204-1210)；KT3表位肽(Martin等人.,1992,Science,255:192-194)；正交-微管蛋白表位肽(Skinner等人,1991,J.Biol.Chem.,266:15163-15166)；和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397)。
在另一个实施方案中，嵌合分子可以包含IL-22多肽或其片段与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于双价形式的嵌合分子，这种融合物可以是IgG分子的Fc区。这些融合多肽是抗体样分子，这些抗体样分子将异源蛋白(“黏附蛋白”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合，并经常叫做免疫黏附素。在结构上，免疫黏附素包含IL-22或其变体的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物。免疫黏附素分子的黏附蛋白部分一般是至少包含受体或配体结合位点的连续氨基酸序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白显示改性的效应子活性。
IL-22多肽或其片段可以例如与免疫球蛋白重链恒定区序列融合以产生IL-22-Ig融合蛋白(例如，IL-22Fc融合蛋白)。IL-22多肽可以是人或鼠IL-22。免疫球蛋白重链恒定区序列可以是人或鼠免疫球蛋白重链恒定区序列。
B.示例性IL-22Fc融合蛋白
在一个方面，本发明提供分离的IL-22融合蛋白。在某些实施方案中，IL-22融合蛋白与IL-22受体结合并且诱导IL-22受体活性或信号传导和/或是IL-22受体活性的激动剂。
在另一个方面，IL-22Fc融合蛋白包含与SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的多肽。在其他实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含了具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，并相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的IL-22Fc融合蛋白保留与IL-22受体结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQIDNO:8、10、12、14、24或26中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在IL22外部的区域内(即，在Fc中)。在某些具体实施方案中，Fc的C末端Lys残基缺失。在某些其他实施方案中，Fc的C末端Gly残基和Lys残基同时缺失。
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的IL-22Fc融合蛋白变体。表1中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更实质的变化。可以将氨基酸置换引入IL-22Fc融合蛋白中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的IL-22受体结合作用、免疫原性降低或改善的IL-22受体信号传导。
表1
氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的蛋白质残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该蛋白质与其结合伙伴的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，蛋白质复合物(例如，细胞因子-受体复合物)的晶体结构可以用来确定蛋白质和其结合伙伴之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间范围的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。
a)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的Fc融合蛋白以升高或降低融合蛋白、尤其融合蛋白的Fc部分糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对蛋白质添加或删除糖基化位点。
在融合蛋白包含Fc区的情况下，可以改变附着于其的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状寡糖，所述寡糖通常借助N联接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。例如见，Wright等人,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双天线状寡糖结构的“茎部”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰的抗体或抗体Fc区中的寡糖以产生具有某些改善特性的Fc变体。
通过以下方式确定附着于Fc区的CH2结构域的岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的附着于Asn297或N297的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处糖链内部岩藻糖的平均量，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的约上游或下游±3个氨基酸，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta,L；和WO2004/056312A1，Adams等人，特别地在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还可以为抗体变体提供双分寡糖，例如，其中附着于抗体Fc区的双天线状寡糖由GlcNAc平分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S)中描述。
b)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的Fc融合蛋白的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的Fc变体，这使所述Fc变体成为下述应用的理想候选物，其中包含Fc区的抗体或融合蛋白的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体或Fc缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性测定法(见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体或Fc不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体包括置换了Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或削弱的与FcR结合的某些抗体或Fc变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，IL-22Fc融合蛋白包含这样的Fc变体，所述Fc变体具有一个或多个减少ADCC的氨基酸置换，例如，在Fc区的位置297处移除N-糖基化位点并仍保留FcRn结合活性的置换(EU残基编号)。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致削弱的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了具有增加的半寿期和改善的与新生Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子也参见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
c.)半胱氨酸改造的变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸改造的Fc融合蛋白，其中将抗体Fc区的一个或多个残基置换为半胱氨酸残基。在具体的实施方案中，置换的残基出现在Fc的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在Fc的可及位点处并且可以用来使Fc缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。例如，可以将重链Fc区的S400(EU编号)置换为半胱氨酸。参见例如，美国专利号7,521,541。
C.重组方法和组合物
IL-22多肽可以通过例行重组方法制备，例如，培养用含有核酸的载体转化或转染的细胞，其中所述核酸编码IL-22多肽、其片段或变体或包含前者的融合蛋白。还提供包含任何这类载体的宿主细胞。以举例方式，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌或酵母。还提供用于产生本文中所述的任何多肽的方法并且所述方法包括在适于表达所需多肽的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物回收所需多肽。
将宿主细胞用产生IL-22多肽的本文所述表达载体或克隆载体转染或转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。培养条件，如培养基、温度、pH等，可以由技术人员在无需过多实验的情况下选择。通常，可以在MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler,编著(IRLPress,1991)和上文Sambrook等人中找到用于最大化动物细胞培养物生产率的原理、操作方案和实用技术。
转染方法是普通技术人员已知的，例如，借助CaPO4和电穿孔转染。取决于所用的宿主细胞，使用适于这类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理法，如Sambrook等人，上文中所述，或电穿孔法通常用于含有牢固细胞壁屏障的原核生物或其他细胞。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染法用于转化某些植物细胞，如Shaw等人,Gene,23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859所描述。对于没有这类细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。已经在美国专利号4,399,216中描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。向酵母中转化一般根据VanSolingen等人,J.Bact,130:946(1977)和Hsiao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法实施。但是，也可以使用向细胞引入DNA的其他方法，如通过核微量注射、电穿孔、细菌原生质体与完好细胞融合、或聚阳离子(例如，聚凝胺、聚鸟氨酸)引入。关于转化哺乳动物细胞的多种技术，参见Keown等人,MethodsinEnzymology,185:527-537(1990)和Mansour等人,Nature,336:348-352(1988)。
重组表达的本发明多肽可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收。以下程序是合适纯化程序的示例：在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶或在阳离子交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如SephadexG-75的凝胶过滤；移除污染物如IgG的蛋白A琼脂糖凝胶柱；和结合加表位标签形式的本发明多肽的金属螯合柱。可以使用多种蛋白质纯化方法并且这类方法是本领域已知的并例如在Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990)；Scopes,Protein Purification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)中描述。选择的纯化步骤将例如取决于所用生产方法和产生的具体多肽的性质。
本领域熟知的替代性方法可以用来制备本发明的多肽。例如，可以使用固相技术(参见，例如，Stewart等人,1969,Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA；Merrifield,J.1963,Am.Chem.Soc.,85:2149-2154)，通过直接肽合成法产生编码多肽或其部分的序列。可以使用手工技术或通过自动化法，进行体外蛋白质合成。可以例如使用AppliedBiosystems肽合成仪(FosterCity，CA)，使用制造商的说明，完成自动合成。本发明多肽或其部分的多个部分可以分别化学合成并使用化学或酶促方法合并以产生全长多肽或其部分。
在其他实施方案中，本发明提供嵌合分子，其包含与异源多肽或氨基酸序列融合的本文所述的任何多肽。这类嵌合分子的例子包括但不限于与表位标签序列或免疫球蛋白Fc区融合的本文所述的任何多肽。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞包括原核生物细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌属(Enterobacter)如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是可公开获得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码IL-22的载体的合适克隆宿主或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。
用于表达糖基化-IL-22的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9，以及植物细胞。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更具体的例子包括SV40转化的猴肾CV1细胞(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞(经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞，Graham等人,J.GenVirol.,36:59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980)))；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；和小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562，ATCCCCL51)。认为对适宜宿主细胞的选择处于本领域能力范围内。
可以将编码IL-22的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入复制型载体中用于克隆(扩增DNA)或用于表达。多种载体是可公开获得的。载体可以例如处于质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体形式。可以通过多种方法，将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术，将DNA插入适宜限制性核酸内切酶位点中。载体组件通常包括但不限于，一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些组件中一个或多个组件的合适载体的构建利用了技术人员已知的标准连接技术。
IL-22多肽可以不仅直接重组地产生，还作为与异源多肽的融合多肽重组地产生，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽N末端具有特定切割位点的其他多肽，以及作为IL-22Fc融合蛋白重组地产生。通常，信号序列可以是载体的组件，或它可以是插入载体的IL-22DNA的部分。信号序列可以是例如选择自碱性磷酸酶前导序列、青霉素酶前导序列、1pp、或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以例如是酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)”-因子前导序列，后者在美国专利号5,010,182中描述)、或酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP362,179)，或在1990年11月15日公开的WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达时，哺乳动物信号序列可以用来指导蛋白质分泌，如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌性前导序列。
表达载体和克隆载体均含有能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。这类序列对多种细菌、酵母和病毒而言是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌、2:质粒复制起点适用于酵母，并且多个病毒复制起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体将一般含有选择基因，又称作选择标记物。常见的选择基因编码这样的蛋白质，这些蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)补充营养缺陷，或(c)供应从复合培养基不可获得的关键养分，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
用于哺乳动物细胞的合适选择标记的例子是能够确定有能力摄取IL-22核酸的细胞的一种选择标记，如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适宜宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，如Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所描述那样制备和增殖。用于酵母中的合适选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因[参见，例如，Stinchcomb等人,Nature,282:39(1979)；Kingsman等人,Gene,7:141(1979)；Tschemper等人,Gene,10:157(1980)]。trp1基因为缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株(例如，ATCCNo.10231或PEP4-1)提供选择标记[Jones,Genetics,85:12(1977)]。
表达载体和克隆载体通常含有与IL-22核酸序列有效连接的启动子以指导mRNA合成。由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。随原核宿主一起使用的适合启动子包括正交-内酰胺酶和乳糖启动子系统[参见，例如，Chang等人,Nature,275:615(1978)；Goeddel等人,Nature,281:544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[参见，例如，Goeddel,NucleicAcidsRes.,8:4057(1980)；EP36,776]，和杂合启动子如tac启动子[参见，例如，deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]。用于细菌系统中的启动子还将含有与编码IL-22的DNA有效连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
随酵母宿主一起使用的合适启动子序列的例子包括以下酶的启动子：3-磷酸甘油酸激酶[参见，例如，Hitzeman等人,J.Biol.Chem,255:2073(1980)]或其他糖酵解酶[参见，例如，Hess等人,J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968)；Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
作为具有额外优点即转录受生长条件控制的诱导型启动子的其他酵母启动子是下述的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。用于酵母表达的合适载体和启动子进一步在EP73,657中描述。
哺乳动物宿主细胞中来自载体的IL-22转录受例如下述启动子控制，所述启动子从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒病毒(1989年7月5公开的UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的基因组获得、从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得，并从热休克启动子获得，条件是这类启动子与宿主细胞系统相容。
可以通过将增强子序列插入载体，增加高等真核生物转录编码IL-22多肽的DNA。增强子是作用于启动子以增加其转录的顺式作用DNA元件，通常约10至约300bp。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。一般，然而，将采用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点晚期侧(bp100-270)的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在IL-22编码序列的位置5'或3'被剪接进入载体，但优选地位于启动子5'的位点。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体也将含有为终止转录和为稳定mRNA必需的序列。这类序列常从真核DNA或者病毒DNA或cDNA的5'非翻译区和偶尔从其3'非翻译区可获得。这些区域含有转录为编码IL-22的mRNA的非翻译部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
另外，适于在重组脊椎动物细胞培养物中合成IL-22的其他方法、载体和宿主细胞在Gething等人,Nature,293:620-625(1981)；Mantei等人,Nature,281:40-46(1979)；EP117,060；和EP117,058中描述。
可以在样品中直接测量基因扩增和/或表达，例如，基于本文提供的序列，使用适当标记的探针，通过常规DNA印迹法、定量mRNA转录的RNA印迹法[参见例如，Thomas,ProcNatlAcadSciUSA,77:5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交测量。可选地，可以使用这样的抗体，所述抗体可以识别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。抗体转而可以被标记并且可以实施这样的测定法，其中双链体与表面结合，从而当双链体在表面上形成时，可以检测到结合于双链体的抗体的存在。
可选地，可以通过免疫学方法如细胞切片或组织切片的免疫组织化学染色法和细胞培养物或体液测定法测量基因表达以直接定量基因产物的表达。用于免疫组织化学染色和/或样品流体测定法的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。便利地，可以针对天然序列IL-22多肽或针对基于本文所提供DNA序列的合成肽或针对与IL-22DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列，制备抗体。
IL-22的形式可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收。如果是膜结合型，可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促切割，从膜释放它。可以通过多种物理或化学手段、如冻融循环、超声处理、机械破裂或细胞溶解剂，破坏在表达IL-22时使用的细胞。
可能需要从重组细胞蛋白或多肽中纯化IL-22。以下程序是合适的纯化程序的示例：通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶或在阳离子交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如SephadexG-75的凝胶过滤；移除污染物如IgG的蛋白A琼脂糖凝胶柱；和结合加表位标签形式的IL-22多肽的金属螯合柱。可以使用多种蛋白质纯化方法并且这类方法是本领域已知的并例如在Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990)；Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)中描述。选择的纯化步骤将例如取决于所用生产方法和产生的具体IL-22的性质。上述的一般方法也可以适用于IL-2Fc融合蛋白的制备。
类似地，可以使用重组方法和组合物产生IL-22Fc融合蛋白，例如，如MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等人,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)和PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等人1990.AcademicPress,SanDiego,CA)中所述。在一个实施方案中，提供编码本文所述的IL-22Fc融合蛋白的分离核酸。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含包含核酸的载体(例如，已经用该载体转化)，所述核酸编码包含IL-22Fc融合蛋白的氨基酸序列。在某些实施方案中，该载体是表达载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供产生IL-22Fc融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适于表达Fc融合蛋白的条件下培养如上文提供的包含编码IL-22Fc融合蛋的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述Fc融合蛋白。
为了重组产生IL-22Fc融合蛋白，将编码(例如，如本文所述的)Fc融合蛋白的核酸分离并插入用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一种或多种载体中。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码融合蛋白的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。在某些实施方案中，当制备IL-22Fc融合蛋白时，编码IL-22的多肽或其片段的核酸可以与编码免疫球蛋白恒定结构域序列的核酸在恒定结构域上的指定位置处连接，以在IL-22的C端处产生Fc融合物；然而N端融合物也是可能的。
作为构建IL-22Fc融合蛋白的例子，通过限制性酶在编码IL-22的DNA的3’末端或靠近其3’末端并且在编码成熟多肽N末端处或其附近(其中构思使用不同前导序列)或在IL-22全长蛋白的N末端编码区处或临近于该区域(其中使用天然信号)切割编码IL-22的DNA。随后将这个DNA片段轻易地插入中编码免疫球蛋白轻链或重链恒定区的DNA并且，如果需要，通过缺失诱变调整。优选地，当融合蛋白意在用于人类的体内治疗时，这是人免疫球蛋白。
在一些实施方案中，将IL-22-免疫球蛋白嵌合体作为单体、异多聚体或同源多聚体，或作为二聚体或四聚体装配。通常，这些装配的免疫球蛋白将具有如以下简图所代表的已知单元结构。基本的四链结构单元是其中IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM通常作为由二硫键聚拢在一起的基本四链单元的五聚物存在。IgA球蛋白，和偶尔IgG球蛋白也可以在血清中以多聚体形式存在。在多聚体的情况下，每个四链单元可以是相同或不同的。还参见Capon等人，美国专利号5,116,964，所述专利通过引用方式完整并入本文。
在本文的图中，“A”意指结合伙伴(如IL-22)的至少一部分，其含有能够结合其配体或受体(如IL-22R)的结合位点；X是额外的活性剂，它可以是另一种有功能的结合伙伴(与A相同或不同)、如上文定义的多亚基(链)多肽(例如，整联蛋白)、免疫球蛋白超家族成员的一部分如可变区或可变区样结构域(包括天然或嵌合免疫球蛋白可变区)、正常情况下本来不与恒定结构域结合的毒素如假单胞菌外毒素或蓖麻毒蛋白，或多肽治疗药；并且VL、VH、CL和CH代表免疫球蛋白的轻链或重链可变结构域或恒定结构域。这些简图理解仅是装配的一般免疫球蛋白结构的示例，并且不涵盖全部可能性。例如，将理解的是在这些构建体的任一者中可能合乎需要地存在几种不同的“A”或“X”。
应当理解这些简图仅是示意性的，并且认为多聚体的链按照与天然免疫球蛋白相同的方式二硫键结合。根据本发明，杂合免疫球蛋白轻易地从用适宜核酸转化的哺乳动物细胞分泌。分泌的形式包括其中结合伙伴表位在重链二聚体、轻链单体或二聚体，和重链和轻链异四聚体中存在的那些，其中存在与一条或多条轻链或重链融合的结合伙伴表位，包括其中置换至多并包括置换全部四个可变区类似物的异四聚体。在轻链-重链非结合伙伴可变样结构域存在的情况，因此提供杂功能性抗体。
不同结构的链或基本单元可以用来装配本发明的单体和异多聚体和同源多聚体及免疫球蛋白。下文图示这些基本单元的具体例子并且显示它们的等同物(出于简化的下式的目的)。
下文示意性图示根据本发明产生的多种示例性的装配的新免疫球蛋白。除还上文定义的符号之外，n是整数，并Y指共价交联部分。
A、X、V或C可以是用共价交联部分(Y)修饰，从而是(A-Y)n、(X-Y)n等。
结合伙伴A(如IL-22)也可以是多链分子，例如具有任意称作Aα和Aβ的链。这些链作为单位位于上文对“A”所指的位点。多条链之一与一条免疫球蛋白链融合(剩余链以正常方式共价或非共价地与融合的链缔合)或，当配体结合伙伴含有两条链时，一条链独自与免疫球蛋白轻链融合并且另一条链与免疫球蛋白重链融合。
具有如下文图示结构的基本单位是用来与多链配体结合伙伴产生单体和异多聚体和同源多聚体、尤其二聚体和三聚体的那些基本单位的例子：
下文示意性图示在如上文的单位结构中所用的多种示例性的新的装配的抗体，其具有双链配体结合伙伴(“Aα和Aβ”)。
上表中所示的结构仅显示关键特征，例如它们没有显示免疫球蛋白的接合(J)或其他结构域，也没有显示二硫键。出于简略目的，省略这些特征。但是，在结合活性需要这类结构域的情况下，应当将它们构建作为存在于根据具体情况而定它们在结合伙伴或免疫球蛋白分子中占据的普通位置内。
编码免疫球蛋白轻链恒定区或重链恒定区的DNA是已知的或从cDNA文库轻易可获得或被合成。参见例如，Adams等人,Biochemistry19:2711-2719(1980)；Gough等人,Biochemistry19:2702-2710(1980)；Dolby等人；P.N.A.S.USA,77:6027-6031(1980)；Rice等人P.N.A.SUSA79:7862-7865(1982)；Falkner等人；Nature298:286-288(1982)；和Morrison等人；Ann.Rev.Immunol.2:239-256(1984)。本文提供编码具有内源前导序列的人IL-22的DNA序列(SEQIDNO:70)。已知或从cDNA文库轻易可获得的编码其他所需结合伙伴的DNA序列适于实施本发明。
将编码本发明IL-22Fc融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中用于表达。如果需要多聚体，则将宿主细胞用编码将构成多聚体的每条链的DNA转化，最佳地选择宿主细胞以能够按所需方式装配多聚体的链。如果宿主细胞在转染之前就产生免疫球蛋白，则仅需要用与轻链或与重链融合的结合伙伴转染以产生异种抗体。具有一个或多个携带结合配偶体结构域的臂和一个或多个携带陪伴可变区的臂的前述免疫球蛋白产生针对结合伙伴配体和针对抗原或治疗性部分的双特异性。随上述的重组方法使用多重共转化的细胞以产生具有多种特异性的多肽如上文讨论的异四聚体免疫球蛋白。
尽管在本发明的免疫黏附素中不要求免疫球蛋白轻链的存在，但是免疫球蛋白轻链可能存在，或与IL-22-免疫球蛋白重链融合多肽共价缔合。在这种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA一般与编码IL-22-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。分泌时，杂合重链和轻链将共价地缔合以提供包含二硫键连接的两个免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于制备这类结构物的方法物例如在1989年3月28日授权的美国专利号4,816,567中公开。用于克隆或表达编码靶蛋白的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，可以在细菌中产生IL-22融合蛋白，尤其当糖基化和Fc效应子功能是不需要的或有害时。对于在细菌中表达多肽，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编著,HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将Fc融合蛋白从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。如实施例部分中所例举，其他纯化方法包括而不限于使用蛋白A柱纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
表达糖基化蛋白质的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
D.IL-22激动剂
在一个方面，本发明提供了用于方法实施方式的IL-22激动剂。IL-22激动剂具有如本文定义的生物学活性。在一个实施方式中，IL-22激动剂是抗体。在某些实施方式中，抗IL-22抗体是促进IL-22与IL-22R相互作用的激动性抗体。在特别的实施方式中，IL-22激动剂是这样的抗体，其结合IL-22BP并阻断或抑制IL-22BP与IL-22的结合，并从而诱导或增加IL-22活性(例如，与IL-22R结合)。在另一个实施方式中，IL-22激动剂是结合IL-22的寡肽。寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成或可以使用重组技术制备和纯化。此类寡肽通常至少约5个氨基酸长，备选地至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100个氨基酸长。使用公知技术可以无需过度实验而鉴定此类寡肽。在此方面，注意到用于就能够特异性结合多肽靶的寡肽筛选寡肽文库的技术是本领域公知的(参见，例如，美国专利号5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公开号WO84/03506和WO84/03564；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:178-182(1985)；Geysen等人，inSyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986)；Geysen等人，J.Immunol.Meth.,102:259-274(1987)；Schoofs等人，J.Immunol.,140:611-616(1988),Cwirla,S.E.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378；Lowman,H.B.等人(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等人(1991)Nature,352:624；Marks,J.D.等人(1991),J.Mol.Biol.,222:581；Kang,A.S.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363,和Smith,G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。
还在另一个实施方式中，本发明的IL-22激动剂是结合IL-22的有机分子，而非如本文所述的寡肽或抗体。有机分子可以是，例如，小分子。可以使用已知的方法学鉴定和化学合成结合IL-22的有机分子(参见，例如，PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。此类有机分子大小通常少于约2000道尔顿，备选地大小少于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中使用公知技术可以无需过度实验而鉴定能够结合本发明的IL-22的此类有机分子。在此方面，注意到用于就能够结合多肽靶的分子筛选有机分子文库的技术是本领域公知的(参见，例如，PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。在特别的实施方式中，IL-22激动剂是这样的有机分子，其结合IL-22BP并阻断或抑制IL-22BP与IL-22的结合，并从而诱导或增加IL-22活性(例如，与IL-22R结合)。还在另一个实施方式中，提供了IL-22的激动剂。示例性的激动剂包括，但不限于，天然IL-22或IL-22R；保留天然多肽的至少一种活性的IL-22或IL-22R的片段，变体，或修饰的形式；能够结合并激活IL-22R的活性剂；和诱导IL-22或IL-22R或编码IL-22或IL-22R的核酸的过表达的活性剂。
E.测定法
通过本领域已知的多种测定法可以就其物理/化学性质和/或生物活性鉴定，筛选，或表征本文提供的IL-22Fc融合蛋白。
1.结合测定法和其他测定法
在一个方面，就其受体结合活性测试本发明的IL-22Fc融合蛋白，例如通过已知的方法诸如ELISA、western印迹分析、通过Scatchard的细胞表面结合、表面等离子体共振。在另一方面，可以使用竞争测定法以鉴定与IL-22Fc融合蛋白竞争结合IL-22受体的抗体。在其他方面，本发明的IL-22Fc融合蛋白可以用于检测生物样品中存在的IL-22受体或IL-22结合蛋白(可溶受体)的存在或量。在其他方面，本发明的IL-22Fc融合蛋白可以用于检测生物样品中存在的IL-22受体的存在或量。在某些实施方式中，生物样品首先用非特异性同种型对照抗体封闭以饱和样品中的任何Fc受体。
2.活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定IL-22Fc融合蛋白的生物活性的测定法。IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白的生物活性可以包括，例如，结合IL-22受体，刺激IL-22信号传递，和诱导STAT3、RegIII和/或PancrePAP表达。此外，在心血管疾病或病况的情况下，生物活性可以包括影响动脉粥样硬化斑块的形成、特别地抑制动脉粥样硬化斑块形成的形成。可以通过本领域普通技术人员已知的任何适当的成像方法评价斑块形成的抑制。
F.缀合物
本发明也提供了缀合物，其包含与一种或多种用于检测、制剂、半寿期延长、减轻免疫原性或组织穿透的活性剂缀合的本文描述的IL-22Fc融合蛋白。示例性缀合包括而不限于PEG化和附着至放射性同位素。
在另一个实施方式中，缀合物包含缀合至放射性原子的如本文描述的IL-22Fc融合蛋白以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32,Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如再次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
G.用于检测的方法和组合物
在某些实施方式中，本文提供的任何IL-22Fc融合物可用于检测生物样品中IL-22受体的存在。在某些实施方式中，方法还包括用非特异性同种型对照抗体阻断样品中的任何Fc受体的步骤。术语“检测”如本文所用涵盖定量或定性检测。在某些实施方式中，生物样品包含细胞或组织，例如上皮组织。
在一个实施方式中，提供了用于检测方法中的IL-22Fc融合蛋白。在其他方面，提供了检测生物样品中IL-22受体存在的方法。在某些实施方式中，方法包括在允许IL-22Fc融合蛋白与IL-22受体结合的条件下接触生物样品与如本文所述的IL-22Fc融合蛋白，并且检测在IL-22Fc融合蛋白和IL-22受体之间是否形成复合物。在某些实施方式中，方法还包括用非特异性同种型对照抗体阻断样品中的任何Fc受体的步骤。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方式中，使用IL-22Fc融合蛋白以选择有资格用IL-22Fc融合蛋白治疗的对象，例如其中IL-22受体是用于患者选择的生物标志物。
在某些实施方式中，提供带标签的IL-22Fc融合蛋白。标签包括，但不限于，直接检测的标签或部分(诸如荧光、生色、高电子密度、化学发光，和放射性标签)，以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子反应)的部分，诸如酶或配体。示例性标签包括，但不限于，放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形花内酯，荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，双酮酞嗪，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与这样的酶偶联，所述酶利用过氧化氢以氧化染料前体诸如HRP、乳过氧化物酶、或微过氧化酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标签、细菌噬菌体标签、稳定的游离自由基等。
H.药物制剂
将以符合良好医学实践的方式配制、给药，和施用本文的基于IL-22的组合物(其在某些实施方式中，包括IL-22Fc融合蛋白，和IL-22多肽或激动剂)。在本文上下文中考虑的因素包括受治疗的特别病症、受治疗的特别哺乳动物、个体对象的临床病况、病症的起因、活性剂的递送位点、施用方法、施药的时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。在一个实施方式中，组合物可以用于增加易受或诊断患有疾病或病况疾病的人类对象的存活持续时间。存活的持续时间定义为从第一次施药到死亡的时间。
通过以下方式使用本领域中已知的标准方法制备冻干制剂或水溶液剂形式的药物制剂：将具有所需纯度的活性成分与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编辑(1980)和Remington'sPharmaceuticalSciences第20版,编者A.FGennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa)。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(BaxterInternational,Inc.)。在US专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖如软骨素酶组合。
任选地，但优选地，制剂含有可药用的盐，优选地氯化钠，并且更优选地为约生理浓度。
任选地，本发明的制剂可以含有可药用的防腐剂。在一些实施方式中防腐剂浓度范围从0.1至2.0％，通常为v/v。适当的防腐剂包括药物领域内已知的那些。苯甲醇、苯酚、m-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、苯扎氯铵和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以包括浓度为0.005至0.02％的可药用的表面活性剂。
本文的制剂还可以含有正在治疗的特别适应征所需要的多于一种活性化合物，特别地是具有并非不利地彼此影响的互补活性的那些。此类分子以有效用于预期的目的的量适当地组合存在。
在美国专利号6,267,958中描述了示例性冻干制剂。水性制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以含有正在治疗的特定适应征所需要的多于一种活性成分，优选地是具有并未不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供类固醇、TNF拮抗剂或其他抗炎性治疗剂。这种活性成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
活性成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有IL-22Fc融合蛋白的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯))、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L谷氨酸γ乙基酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够在多于100天中释放分子，某些水凝胶以较短的时间释放蛋白质。当囊封的抗体在体中长时间保持时，其可能由于在37℃暴露于湿度而变性或聚集，导致损失生物活性和免疫原性的可能改变。取决于涉及的机制，可以设计合理的策略用于稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换的分子间S-S键形成，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制湿度含量、使用适当的添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定化。
可以配制用于局部施用的药物组合物，例如，以局部凝胶的形式。参见例如，US4,717,717、US5,130,298、US5,427,778、US5,457,093、US5,705,485、US6,331,309和WO2006/138,468。在某些实施方式中，可以在存在纤维素衍生物的条件下配制组合物。在某些其他实施方式中，可以在施用前用充足的缓冲剂或稀释剂从冻干的制剂重构局部制剂。在某些实施方式中，配制IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白用于对具有上皮创伤愈合缺陷的对象局部施用。在某些特别的实施方式中，上皮创伤愈合发生在皮肤中。在某些其他特别的实施方式中，对象是具有创伤愈合缺陷的人。在某些其他实施方式中，包含本发明的IL-22Fc融合蛋白的局部制剂可用于改善内部或外部手术切口后的创伤愈合。
在本发明的一个实施方式中，用于加速、促进或改善创伤愈合的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白在局部凝胶的制剂中，例如，在预填充的注射器或容器中，或备选地，本发明的化合物可以在马上对患者局部施用前与凝胶基质混合。在某些实施方式中，也同时或顺序地局部施用额外的治疗剂。也可以任选地使用施用的其他途径，例如通过任何适当的方式施用，包括但不限于，肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔，和鼻内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内，或皮下施用。
通常对于创伤愈合，配制IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白用于位点特异性递送。当局部应用时，IL-22多肽或IL-22Fc融合物适当地与其他成分组合，例如载体和/或佐剂。此类其他成分的性质没有限制，除了它们必须是可药用的并且对于其预期的施用是有效的，并且不能降低组合物的活性成分的活性之外。适当的载体的实例包括油膏、乳脂、凝胶、喷雾或悬液，具有或没有纯化的胶原。组合物还可以灌输到无菌敷料、皮肤药贴、石膏和绷带中，任选地为液体或半液体形式。也可以使用经氧化的再生的纤维素/胶原基质，例如，PromogranMatrixWoundDressing或PromogranPrismaMatrix。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有本发明多肽的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L谷氨酸γ乙基酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)，乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够在多于100天中释放分子，某些水凝胶以较短的时间释放蛋白质。当囊封的多肽在体中长时间保持时，其可能由于在37℃暴露于湿度而变性或聚集，导致损失生物活性和免疫原性的可能改变。取决于涉及的机制，可以设计合理的策略用于稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换的分子间S-S键形成，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制湿度含量、使用适当添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定化。
为了获得凝胶制剂，在液体组合物中配制的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白可以与有效量的水溶性多糖或合成的聚合物混合以形成凝胶(例如，胶凝剂)诸如聚乙二醇以形成待局部应用的适当粘度的制剂。可使用的多糖或胶凝剂包括，例如，纤维素衍生物诸如醚化的纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素，和烷基羟烷基纤维素，例如，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和羟丙基纤维素；羧甲基纤维素钠；POE-POP嵌段聚合物：多种级别的泊咯沙姆(poloxamer)USP；透明质酸；聚丙烯酸诸如卡波姆(carbopol)940；淀粉和分级的淀粉；琼脂；海藻酸和海藻酸盐；阿拉伯树胶；普鲁兰糖(pullullan)；琼脂糖；卡拉胶；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖；和合成的生物聚合物；以及胶诸如黄原胶；瓜尔胶；刺槐豆胶；阿拉伯树胶；黄芪胶；和刺梧桐胶；和其衍生物、组合物和混合物。在本发明的一个实施方式中，本文的胶凝剂是这样的胶凝剂，其例如对于生物系统是惰性的、非毒性的、易于制备、和/或并非太稀或太粘，并且将不使得其中保有的IL-22多肽或IL-22Fc融合物不稳定。
在本发明的某些实施方式中，多糖是醚化的纤维素衍生物，在另一实施方式中是良好定义的、纯化的，和在USP中列出的，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，诸如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，和羟丙基甲基纤维素(全部称为纤维素剂)。在一些实施方式中，多糖是羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。
可用于凝胶作用的聚乙二醇通常是低和高分子量聚乙二醇的混合物以获得适当的粘度。例如，当以适当比例混合以获得糊剂时，分子量400-600的聚乙二醇与分子量1500的聚乙二醇的混合物将有效用于此目的。
应用于多糖和聚乙二醇的术语“水可溶”意为包括胶体溶液和分散剂。一般而言，纤维素衍生物的溶解性由醚基团的取代程度确定，并且本文可用的稳定性衍生物应当在纤维素链中具有充分量的此类醚基团每脱水葡萄糖单元以使得衍生物水可溶。至少0.35个醚基团每脱水葡萄糖单元的醚取代的程度一般是足够的。额外地，纤维素衍生物可以为碱金属盐的形式，例如，Li、Na、K、或Cs盐。
在某些实施方式中，在凝胶中使用甲基纤维素，例如，其包含约1-5％，或约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的凝胶并且IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白以约50-2000μg、100-2000μg，或100-1000μg每ml凝胶的量存在。在某些实施方式中，局部施用的创伤愈合的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白的有效量可以为25μg至约500μg、约50μg至约300μg、约100μg至约250μg、约50μg至约250μg、约50μg至约150μg、约75μg、约100μg、约125μg、约150μg、约175μg、约200μg、约225μg、约250μg、约300μg，或约350μg，每cm2创伤面积。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如用通过无菌滤膜过滤轻易地实现无菌。
本发明提供了基于IL-22的治疗剂的剂量。例如，取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的多肽是对对象施用的初始候选剂量，无论，例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。典型的每日剂量可能范围为从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。对于在若干天中或更长的重复施用，取决于病况，持续治疗直到疾病症状的理想的抑制发生。然而，其他剂量方案是可用的。通过常规技术和测定法容易地监测此疗法的进展。
对于疾病的预防或治疗，本发明的多肽的适当剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，多肽的类型，疾病的严重性和进程，多肽是否是出于预防性或治疗性目的施用的，先前的疗法，对象的临床史和对多肽的响应，和主治医师的裁量。在一个时间或在一系列的治疗中将多肽适当地施用于对象。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)的多肽可以是对对象施用的初始候选剂量，无论，例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。一种典型的每日剂量可能范围为从约1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。对于在若干天中或更长的重复施用，取决于病况，持续治疗直到疾病症状的理想的抑制发生。多肽的一种示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围内。因此，可以对对象施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、或20mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。在某些实施方式中，可以对对象施用约0.5mg/kg、1.0mg.kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、或20mg/kg(或其组合)。此类剂量可以间歇地施用，例如，每周、每两周、每三周(例如，使得对象接受从约2至约20次，例如约6次剂量的多肽)。可以施用初始较高的负载剂量，随后为一次或多次较低剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始负载剂量，随后为约2mg/kg的抗体的每周维持剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测此疗法的进展。
通常通过静脉注射施用本发明的化合物用于预防或治疗心血管疾病或病况、代谢综合征、急性内毒素血症或败血病、或糖尿病。
也可以使用其他施用方法，包括但不限于，局部、肠胃外、静脉内、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、眼睛、眼内、玻璃体内、病灶内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、口腔，或吸入施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内，或皮下施用。此外，根据已知的方法，本文描述的化合物施用于人类对象，诸如作为推注或通过在一段时间中连续输注静脉施用。
I.治疗方法和组合物
本文提供的任何IL-22Fc融合蛋白或IL-22多肽或IL-22激动剂可以用于治疗方法中。
a)炎性肠病
在一个方面，提供了作为药物使用的IL-22Fc融合蛋白。在其他方面，提供了用于治疗IBD，包括UC和CD的IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方式中，提供了用于治疗具有UC或CD的个体的方法中的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22Fc融合蛋白。在一个这种实施方式中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在其他实施方式中，本发明提供用于增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的IL-22Fc融合蛋白。在某些特别的实施方式中，上皮细胞组织是肠上皮细胞组织。在某些实施方式中，本发明提供用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22Fc融合蛋白以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。还在其他实施方式中，本发明提供用于治疗糖尿病、特别是II型糖尿病、糖尿病创伤愈合、代谢综合征和动脉粥样硬化的IL-22Fc融合蛋白。在某些实施方式中，本发明提供用于在个体中治疗糖尿病、特别是II型糖尿病、糖尿病创伤愈合、代谢综合征和动脉粥样硬化的方法的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括向个体施用有效量的IL-22Fc融合蛋白。参见Genentech申请文件号PR5586，申请系列号61/800795，名称为“UsinganIL-22polypeptideforwoundhealing”和PR5590，申请系列号61/801144，名称为“MethodsoftreatingcardiovascularconditionsandmetabolicsyndromeusinganIL-22polypeptide”，二者均于2013年3月15日提交。两个申请的公开内容均通过引用以其整体并入本文。根据以上实施方式中任一个的“个体”或“对象”或“患者”优选是人。
在其他方面，本发明提供IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白在制造或制备药物中的用途。在一个实施方式中，该药物用于治疗IBD和创伤愈合。在其他实施方式中，该药物用于治疗IBD和创伤愈合的方法中，所述方法包括向患有IBD的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方式中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。在其他实施方式中，药物用于抑制肠上皮细胞中的炎性反应。在其他实施方式中，药物用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。根据以上实施方式中任一个的“个体”可以是人。
在其他方面，本发明提供了用于治疗IBD，包括UC和CD的方法。在一个实施方式中，方法包括向具有IBD的个体施用有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白。在一个这种实施方式中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如下文描述。根据以上实施方式中任一个的“个体”可以是人。
在其他方面，本发明提供了用于在个体中增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移的方法。在一个实施方式中，方法包括向个体施用有效量的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白以增强上皮细胞增殖、分化和/或迁移。在一个实施方式中，“个体”是人。
b)其他治疗适应征
本发明提供了用于心血管疾病和病况、代谢综合征、急性内毒素血症和败血病、和糖尿病的基于IL-22的治疗剂。对于预防，治疗或降低给定疾病或病况的严重性，本发明的化合物的适当剂量将取决于如上所定义的待治疗的疾病或病况的类型，疾病或病况的严重性和进程，活性剂是否出于预防性或治疗性目的施用，先前的疗法，对象的临床史和对化合物的反应，和主治医师的裁量。在一个时间或在一系列的治疗中将化合物适当地施用于对象。优选地，理想的是先于在人中测试前，首先在体外，并然后在有用的动物模型中，测定本发明的剂量响应曲线和药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了用于治疗心血管疾病或病症、代谢综合征、急性内毒素血症和败血病、和胰岛素相关的病症的方法。在一个实施方式中，方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、或IL-22激动剂。在另一方面，本发明提供了延迟或减缓心血管疾病或病症、代谢综合征、和胰岛素相关的病症的进展的方法。在一个实施方式中，方法包括对诊断有疾病、病况、或病症的对象施用有效量的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、或IL-22激动剂。在另一方面，本发明提供了用于预防心血管疾病或病症、和胰岛素相关的病症的标志的方法。在一个实施方式中，方法包括对处于疾病、病况、或病症的风险的对象施用有效量的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、或IL-22激动剂，其中IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白、或IL-22激动剂有效针对疾病、病况、或病症的标志的发展。
心血管疾病和病况
在一个方面，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂提供了针对对象中的心血管疾病或病况的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的预防性的或预防的作用。在一个实施方式中，疾病或病况是动脉粥样硬化。在一个实施方式中，标志包括动脉粥样硬化斑块形成和/或血管炎症。在另一个实施方式中，对象处于心血管疾病的风险。一般地，处于风险的对象先前已经患有如本文所述的心血管疾病或病况，或将具有心血管疾病或病况的遗传素质。
可以通过评价心血管疾病中通常使用的多种评估来测量心血管疾病和病况的治疗的功效。例如，可以评估心血管健康。心血管健康可以通过，但不限于，例如血液测试(例如，总胆固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯、C-反应性蛋白、纤维蛋白原、高半胱氨酸、空腹胰岛素、铁蛋白、脂蛋白、LPS)、血压、听诊、心电图、心脏压力测试、心脏成像(例如，冠脉插管术、超声心动图、血管内超声、正电子发射断层扫描、计算机断层扫描血管造影术，和磁共振成象)评价。
代谢综合征
在一个方面，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂提供了针对对象中的代谢综合征(或代谢病症或疾病)的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的治疗性，预防性的或预防的作用。在一个或多个实施方式中，对象处于代谢综合征的风险。
可以通过评价代谢综合征中通常使用的多种评估来测量代谢综合征的治疗的功效。例如，可以测量肥胖。作为另外的实例，可以测量高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗、慢性脂肪组织炎症，和/或高血压。可以测量C-反应性蛋白、IL-6、LPS、和纤溶酶原激活物抑制剂1中的一种或多种的水平的降低。这些测量可以通过本领域公知的任何方法进行。
胰岛素相关病症
对于胰岛素相关病症，术语“治疗”指病症的治疗性治疗和预防的或预防性的措施，其中目的是预防或减慢(减轻)靶向的病理病况或病症。需要治疗的那些包括已经具有胰岛素相关病症的那些以及倾向于具有此类病症的那些或待在其中预防病症的那些。
在一个方面，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂提供了针对对象中的胰岛素相关病症的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的预防性的或预防的作用。在一个实施方式中，病症是I型糖尿病、II型糖尿病、或妊娠糖尿病。在一个实施方式中，病理学或病理性标志包括以下中的一种或多种：胰腺(例如胰岛细胞)生产极少或不生产胰岛素、胰岛素抗性、和高血糖。在另一个实施方式中，对象处于胰岛素相关病症的风险。一般地，处于风险的对象具有胰岛素相关病症的遗传素质的风险，已经暴露于引发胰岛细胞的自身免疫破坏的病毒(例如，Epstein-Barr病毒、柯萨基病毒、腮腺炎病毒或巨细胞病毒)，是肥胖、糖尿病前期的(pre-diabetic)(高于正常血糖水平)，或具有妊娠糖尿病。
可以通过评价此类病症中通常使用的多种评估来测量胰岛素相关病症的治疗的功效。例如，可以使用以下中的一种或多种评价I型和II型糖尿病：糖化血红蛋白测试(A1C)，常规血糖测试，和空腹血糖测试。也可以通过测试血液中的自身抗体和/或尿中的酮类评价I型糖尿病。也可以通过测试口腔葡萄糖耐受评价II型糖尿病。
急性内毒素血症和败血病
在一个方面，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂提供了针对对象中的急性内毒素血症、败血病，或二者的临床和/或组织学和/或生物化学和/或病理学标志(包括症状和病征)的发展，或进展的治疗性，预防性的或预防的作用。在一个或多个实施方式中，对象处于急性内毒素血症、败血病，或二者的风险。
可以通过评价急性内毒素血症、败血病，或二者中通常使用的多种评估来测量急性内毒素血症、败血病，或二者的治疗的功效。例如，可以测量LPS或炎性标志物的水平的降低。可以通过本领域中公知的任何方法进行这些测量。
创伤愈合
有多种方式测量创伤愈合。通常取得图像以计算线性尺寸、周长和面积。NIH具有免费的程序，ImageJ，其允许从图像测量创伤面积。可以基于外周朝向中心的迁移从初始愈合速率外推最终愈合预后。这是使用多种数学等式完成的，其中最通常的是修改的Gilman等式。除了目视检查以外，创伤愈合测量也可以通过光谱方法或MRI辅助。参见，Dargaville等人，BiosensorsBioelectronics,2013,41:30-42,Tan等人，2007,BritishJ.Radiol.80:939-48。如果愈合缓慢/不足，可以取得创伤边缘的生物活检样品以排除或决定感染和恶性。在某些实施方式中，创伤愈合的加速或改善可以通过比较IL-22处理的和对照创伤中的创伤闭合来评价。在某些实施方式中，创伤愈合的加速或改善是快于或优于对照至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在某些方面，本发明提供了促进/加速/改善在创伤中具有或不具有活动性感染、微生物污染或建群的创伤的愈合的方法。IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂可以用于治疗感染的创伤或促进/加速/改善感染的创伤愈合。在某些实施方式中，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂可以用于治疗创伤、或促进/加速/改善创伤愈合，在感染存在的条件下。在一些实施方式中，IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂可用于治疗创伤或促进/加速/改善感染的创伤愈合，在存在具有感染风险的微生物污染或建群的条件下。在其他实施方式中，需要创伤愈合治疗的患者可以是糖尿病患者。因此，在一些实施方式中，创伤是糖尿病创伤，例如糖尿病足部溃疡。在一些其他实施方式中，创伤是感染的糖尿病创伤，例如感染的糖尿病足部溃疡。
在其他方面，本发明提供了包含本文提供的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂的药物制剂，例如，用于上述治疗方法中的任一种中。在一个实施方式中，药物制剂包含本文提供的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂和可药用的载体。在另一个实施方式中，药物制剂包含本文提供的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂和至少一种额外的治疗剂，例如，如下所述。
本发明的IL-22Fc融合蛋白可以单独使用或与疗法中的其他活性剂组合使用。例如，本发明的IL-22多肽、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。在某些实施方式中，额外的治疗剂是降低炎性反应的免疫抑制剂，包括但不限于氨甲喋呤、TNF抑制剂、TNF拮抗剂、美沙拉嗪、类固醇、地塞米松，和咪唑硫嘌呤，及其组合。降低炎性反应的适当的额外的治疗剂包括但不限于5-氨基水杨酸(5-ASA)，巯嘌呤(也称为6-巯嘌呤或6-MP)或其组合。在某些实施方式中，IL22多肽或IL-22Fc融合物可以与降低炎性反应的一种或多种额外的治疗剂(例如，5-ASA、6-MP、或TNF拮抗剂)共同施用用于治疗IBD。在某些其他实施方式中，IL22多肽或IL22Fc融合物可以与整联蛋白拮抗剂诸如etrolizumab共同施用用于治疗IBD。在一个实施方式中，IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白与IL-22激动剂组合使用。
为了加速慢性创伤愈合，诸如为了治疗糖尿病足溃疡，可以组合施用IL-22多肽或其片段或变体、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂与一种或多种额外的创伤愈合剂。适当的额外的创伤愈合剂包括但不限于生长因子(例如，EGF、FGF、IGF、PDGF、TGF和VEGF)、神经生长因子(NGF)、血管生成因子(例如，HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8、促血管生成素1和2、Tie-2、整联蛋白α5、基质金属蛋白酶类、一氧化氮、COX-2)、血小板衍化生长因子(PDGF)家族的成员(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C，和PDGF-D)、胰岛素生长因子(IGF)家族的成员(例如，IGF-I、IGF-II)、转化生长因子(TGF)家族的成员(例如，TGF-αTGF-β)和合成代谢氧(真空疗法)。在某些实施方式中，IL-22多肽或IL-22Fc融合物可以与如本文所述的一种或多种额外的创伤愈合剂和/或适于局部施用的一种或多种抗菌剂或抗生素共同施用。参见WO2006/138468，通过引用以其整体并入。在此类实施方式中，抗生素可以是硫抗生素包括但不限于磺胺嘧啶银盐，例如，silvadeen。共同施用的一种或多种额外活性剂可以与IL-22多肽、IL-22融合蛋白或IL-22激动剂共同施用，备选地或与之顺序施用。
在其他示例性实施方式中，如果目标是预防或治疗心血管疾病或病况或代谢综合征，IL-22多肽或其片段或变体、IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂的施用可以与以下的施用组合或用其补充：降胆固醇剂诸如他汀类(例如，洛伐他丁、瑞舒伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀，和辛伐他汀)、胆汁酸结合树脂(考来替泊、考来烯胺蔗糖、和考来维纶)、依泽替米贝、或依泽替米贝-辛伐他汀组合；抗血小板剂诸如环氧合酶抑制剂(阿司匹林)、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(西洛他唑)、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂(阿昔单抗、埃替非巴肽、替罗非班)、腺苷再摄取抑制剂(双嘧达莫)、凝血恶烷抑制剂(凝血恶烷合酶抑制剂、凝血恶烷受体拮抗剂、terutroban)；β阻断剂诸如阿普洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、杜仲(eucommiabark)、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、塞利洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、奈比洛尔、布他沙明、ICI-118,551、和SR59230A；血管生成素转化酶(ACE)抑制剂诸如卡托普利、佐芬普利、含有二羧酸盐的活性剂(依那普利、雷米普利、喹那普利、哌林多普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、佐芬普利),含有磷酸盐的活性剂(福辛普利)、casokinins、lactokinins、乳三肽(由益生素瑞士乳杆菌生产的或源自酪蛋白的Val-Pro-Pro，和Ile-Pro-Pro)；钙通道抑制剂诸如二氢吡啶(例如，氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、和普拉地平)、苯基烷胺(例如，维拉帕米)、苯并噻氮卓类(例如，地尔硫卓)、米贝拉地尔、苄普地尔、氟司必林、和芬地林；利尿剂诸如高效能髓袢利尿剂(例如，呋塞米、依他尼酸、托拉塞米和布美他尼)、噻嗪化物(例如，氢氯噻嗪酸),碳酸酐酶抑制剂(例如，乙酰唑胺和醋甲唑胺)、保钾利尿剂(例如，醛固酮拮抗剂：螺内酯，和上皮细胞钠通道阻断剂：阿米洛利和氨苯蝶啶)、和保钙利尿剂，和任意上述的可药用的盐、酸或衍生物。
对于胰岛素相关病症或代谢综合征，IL-22多肽或其片段或变体或IL-22Fc融合蛋白或IL-22激动剂的施用可以与多种治疗剂的施用组合或用其补充。在I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)的情况中，本文所述的IL-22多肽、Fc融合蛋白或激动剂与常规胰岛素替代疗法(包括快速作用和长时作用胰岛素)、免疫抑制治疗、胰岛移植和干细胞疗法中的一种或多种组合。在一个实施方式中，常规胰岛素替换疗法包括，但不限于，常规胰岛素(例如，优泌林R、诺和灵R),低精蛋白锌胰岛素(例如，优泌林N、诺和灵N)、赖脯胰岛素(例如，优泌乐)、门冬胰岛素(例如，门冬胰岛素),甘精胰岛素(例如，Lantus)和地特胰岛素(例如，Levemir)。在其他实施方式中，胰岛素替换疗法还包括普兰林(Symlin)。
在II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)或代谢综合征的情况中，本文所述的IL-22多肽、Fc融合蛋白和激动剂可以与一种或多种胰岛素替换疗法(如以上所讨论的)、降低肝脏的葡萄糖生产的活性剂、刺激胰腺生产和释放胰岛素的活性剂、阻断碳水化合物的酶促分解或增加胰岛素敏感性的活性剂组合。在一个实施方式中，降低葡萄糖生产的活性剂是二甲双胍(例如，Glucophage,Glumetza)。在另一个实施方式中，刺激胰腺生产和释放胰岛素的活性剂是格列吡嗪(例如，Glucotrol,GlucotrolXL)、格列本脲(例如，DiaBeta,Glynase)和格列美脲(例如，Amaryl)。在一个其他实施方式中，阻断碳水化合物的酶促分解或增加胰岛素敏感性的活性剂是吡格列酮(例如，Actos)。在另一个实施方式中，IL-22多肽、Fc融合蛋白和激动剂可以与二甲双胍的以下替代之一组合：西他列汀(例如，Januvia)、沙格列汀(例如，Onglyza)、瑞格列奈(例如，Prandin)和那格列奈(例如，Starlix)、艾塞那肽(例如，Byetta)和利拉鲁肽(例如，Victoza)。在另一个实施方式中，IL-22多肽、Fc融合蛋白和激动剂与口服低血糖剂，例如，磺酰脲类组合。
在妊娠糖尿病或代谢综合征的情况下，IL-22多肽、Fc融合物和激动剂与口服血糖控制药物组合。在一个实施方式中，药物是格列本脲。
组合疗法可以提供“协同作用”和证明是“协同的”，即当活性成分一起使用时所达到的效果比单独使用化合物获得的效果的总和大。当活性成分：(1)以组合的、单位剂量制剂同时共同配制和施用或递送时；(2)作为单独的制剂交替或平行递送时；或(3)通过一些其他方案时，可以实现协同作用。当以交替疗法递送时，当顺序施用或递送化合物时，例如通过单独的注射器中的不同的注射，可以实现协同作用。一般地，在交替疗法过程中，顺序地，即连续地施用每种活性成分的有效剂量，然而在组合疗法中，共同施用两种或多种活性成分的有效剂量。
上文所示的这类组合疗法涵盖组合的施用(其中在相同或单独的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和单独施用，在这种情况下，本发明IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白的施用可以在额外的一种或多种治疗剂的施用之前、同时和/或之后进行。在一个实施方式中，IL-22Fc融合蛋白的施用和额外的治疗剂的施用在彼此的约一个月内，或在约1、2或3周内、或在约1、2、3、4、5、6天内发生。
本发明的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内、局部和鼻内，以及，如果局部治疗需要，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药时间表，包括但不限于单次或在多个时间点中多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白将以符合良好医学规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特别的病症、正在治疗的特别的哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、递送活性剂的部位、施用方法、施用时间安排和医疗执业者已知的其他因素。IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白不需要，但任选地与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种活性剂一起配制。这类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的融合蛋白的量、疾病或疗法类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明IL-22Fc融合蛋白的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、Fc区的类型、疾病的严重性和过程，融合蛋白是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对IL-22Fc融合蛋白的反应，以及主治医师的决定。将IL-22Fc融合蛋白适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)或约0.1μg/kg至1.5mg/kg(例如，0.01mg/kg–1mg/kg)的IL-22Fc融合蛋白可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量范围可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病况，治疗通常将持续直至所需的疾病症状抑制出现。IL-22Fc融合蛋白的一个示例性剂量将处于从约0.05mg/kg至约10mg/kg范围。某些其他剂量包括从约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.02mg/kg至约10mg/kg，和约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围。因此，可以向患者施用约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。对于局部创伤愈合，可以对患者施用约0.001mg/cm2-约10mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约5mg/cm2创伤面积、约0.01mg/cm2-约1mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积、约0.01mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积、约0.05mg/cm2-约0.2mg/cm2创伤面积、或约0.1mg/cm2-约0.5mg/cm2创伤面积(或其任意组合)中的一种或多种剂量。在某些实施方式中，可以对患者施用约0.01mg/cm2、0.02mg/cm2、0.03mg/cm2、0.04mg/cm2、0.05mg/cm2、0.06mg/cm2、0.07mg/cm2、0.08mg/cm2、0.09mg/cm2、0.1mg/cm2、0.15mg/cm2、0.2mg/cm2、0.25mg/cm2、0.3mg/cm2、0.4mg/cm2、或0.5mg/cm2创伤面积中的一种或多种剂量。这类剂量可以间断地施用，例如，每周或每3周(例如，从而，患者接受从约2个至约20个，或例如约6个剂量的IL-22Fc融合蛋白)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。相似的剂量范围可以应用于IL-22多肽。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明的缀合物替代IL-22Fc融合蛋白或除IL-22Fc融合蛋白之外还使用本发明的缀合物来实施。
制造品
在本发明的另一个方面，提供制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的IL-22Fc融合蛋白。标签或包装说明书提示组合物用于治疗选择的病况。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的IL-22Fc融合蛋白；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性活性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病况的包装说明书。备选或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代IL-22Fc融合蛋白或除IL-22Fc融合蛋白之外，前述任一制造品可以包括本发明的缀合物。
K.筛选测定法和动物模型
如实施例章节中所示例的，可以在多种基于细胞的测定法和IBD、心血管疾病或病况和代谢综合征的动物模型中评价IL-22、IL-22Fc融合蛋白和IL-22激动剂。
可以通过使用生产转基因动物的标准技术，将目的基因的编码部分引入到目的动物的基因组中来改造重组(转基因)动物模型。可以充当转基因操作靶的动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪，和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和其他猴。本领域内已知的将转基因引入到此类动物中的技术包括原核显微注射(Hoppe和Wanger,美国专利号4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移到种系中(例如，VanderPutten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,6148-615[1985])；胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等人，Cell56,313-321[1989])；胚胎的电穿孔(Lo,Mol.Cell.Biol.3,1803-1814[1983])；精子介导的基因转移(Lavitrano等人，Cell57,717-73[1989])。综述参见，例如，美国专利号4,736,866。
用于本发明的目的，转基因动物包括仅在其部分细胞中携带转基因的那些(“嵌合动物”)。转基因可以作为单个转基因，或以串联体整合，例如，头接头或头接尾串联。也可以通过以下，例如，Lasko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,623-636(1992)的技术，将转基因选择性地引入到特别的细胞类型中。
可以通过标准技术监控转基因动物中转基因的表达。例如，可以使用Southern印迹分析或PCR扩增以鉴定转基因的整合。然后可以使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR、或免疫细胞化学的技术分析mRNA表达水平。
还可以检查动物的适当病理学，诸如心血管疾病病理学的病征，例如通过组织学检查和/或成像或超声分析以测定动脉粥样硬化斑块负荷和血管功能(见以下实施例)。也可以进行阻断实验，其中用IL-22、IL-22Fc融合蛋白或候选激动剂处理转基因动物以测定对动脉粥样硬化斑块形成，包括斑块形成的大小、数量和程度的作用的程度。在这些实验中，对动物施用结合本发明的多肽的阻断抗体并监控感兴趣的生物学作用。
备选地，可以构建“敲除的”动物，其具有缺陷的或改变的编码IL-22的基因，这是由于编码IL-22多肽的内源基因和引入到动物的胚胎细胞中的编码相同多肽的改变的基因组DNA之间的同源重组所导致的。例如，根据建立的技术可以使用编码IL-22的cDNA以克隆编码IL-22的基因组DNA。编码IL-22的基因组DNA的一部分可以缺失或用另一个基因取代，诸如编码可用于监控整合的可选择的标志物的基因。通常，在载体中包括未改变的侧翼DNA的几千个碱基(在5’和3’端)[同源重组载体的描述参见，例如，Thomas和Capecchi,Cell,51:503(1987)]。将载体引入到胚胎干细胞系中(例如，通过电穿孔)并且选择其中引入的DNA已经与内源DNA同源重组的细胞[参见例如，Li等人，Cell,69:915(1992)]。然后将选择的细胞注射到动物(例如，小鼠或大鼠)的囊胚中以形成聚集嵌合物[参见例如，Bradley,于TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach,E.J.Robertson,编辑(IRL,Oxford,1987),第113-152页]。然后可以将嵌合的胚胎植入到适当的假怀孕雌性培养动物中并且使胚胎足月生产以创造“敲除的”动物。在其种系细胞中具有同源重组的DNA的后代可以通过标准技术鉴定并且用于繁殖动物，其中动物的全部细胞含有同源重组的DNA。可以例如，就其防卫某些病理学病况的能力和就其由于缺乏IL-22多肽的病理学病况的发展表征敲除的动物。
因此，可以在鼠IL-22敲除的小鼠中进一步研究IL-22或其潜在激动剂的生物活性。
认为上述书面描述足以使得本领域技术人员实施本发明。以下实施例仅出于描述性的目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。事实上，通过上述描述，除了本文所示和描述的那些，本发明的多种修改对于本领域技术人员将是显而易见的并落入到所附权利要求书的范围之中。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解，考虑到以上提供的一般描述，可以实践多种其他实施方案，并且实施例并非意在限制权利要求的范围。
实施例1IL-22Fc融合蛋白的克隆、表达和纯化
在以下实验中可以应用一般的分子学克隆和蛋白纯化技术。
i.克隆
从人结肠cDNA文库(Genentech)中克隆全长人IL-22。采用以下引物：IL-22Fc融合IgG1正向引物：TTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGC(SEQIDNO:52)，IL-22Fc融合IgG1反向引物AGGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG(SEQIDNO:53)，IL-22Fc融合IgG4正向引物：TTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGCGCCCATCAGCTCCCACTGCAGGC(SEQIDNO:54)，IL-22Fc融合IgG4反向引物：AGGTCGACTTATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG(SEQIDNO:55)，使用重叠PCR技术生成用于此实验的表达人IgG1或IgG4IL-22Fc融合蛋白的构建体。将PCR产物克隆到表达载体pRK5.sm(Genentech)中。前导序列(或信号肽)在细胞中切割，且成熟IL-22Fc融合不含有前导序列。使用含有接头序列的引物来克隆携带人工接头的克隆。使用以下引物：IgG1N297G正向引物:GCGGGAGGAGCAGTACGGAAGCACGTACCGTGTGG(SEQIDNO:56)，IgG1N297G反向引物:CCACACGGTACGTGCTTCCGTACTGCTCCTCCCGC(SEQIDNO:57)，IgG4N297G正向引物:ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCGGAAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC(SEQIDNO:58)，和IgG4N297G反向引物:GACGCTGACCACACGGTACGTGCTTCCGAACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGT(SEQIDNO:59)，通过诱变PCR还引入N297G突变。所有IL-22Fc构建体的序列通过DNA测序加以确认。
ii.细胞培养
在设为37℃和5％CO2的孵育箱中，通过每周2次地分割培养物，将CHO细胞悬浮培养至0.3x106细胞/ml。
iii.IL-22Fc融合蛋白转染到CHO细胞中和蛋白质表达
将CHO细胞以1.23x106细胞/ml接种到720mL培养基中。在加至细胞之前，将转染复合物(1.6mLPEI+800ugDNA于80mL无血清培养基中)孵育10min。将培养物在33℃，5％CO2下孵育24小时。再培养14天之后，通过离心收集培养物上清。使用MabSelectSure(GEHealthcare)蛋白质A亲和柱来纯化瞬时CHO条件培养基(来自以上的上清液)。将低pH的洗脱物中和至pH5.0，并通过凝胶过滤柱(GEHealthcare)进一步纯化。汇集洗脱峰物质，配制并无菌过滤。如以下所讨论地通过质谱来分析融合蛋白的Fc区的糖基化状态。
iv.表达IL-22Fc融合蛋白的稳定克隆的确立
使用Lipofectamine2000CD(Invitrogen)通过转染将编码IL-22Fc融合蛋白的质粒引入到CHO细胞中。转染后，将细胞离心并再铺板到无血清的选择性培养基上。选择分泌IL-22Fc的分离株。然后汇集经ELISA鉴定具有最高滴度的克隆，并扩大生产。
v.IL-22Fc融合蛋白在大肠杆菌中的表达
将大肠杆菌发酵原料均质化并调节至0.4％w/wPEIpH6.7并且离心。使用MabSelectSure(GEHealthcare)蛋白质A亲和柱来纯化离心分离物(centrate)。将低pH的洗脱物中和至pH5.0，并通过离子交换层析进一步纯化。将级分汇集，配制并无菌过滤。
实施例2IL-22Fc融合蛋白在Fc区中表现出高百分比的无岩藻糖基化
在此研究中，检查了IL-22Fc融合蛋白的Fc部分的糖基化状态。将来自瞬时转染细胞的纯化IL-22Fc融合蛋白的样品用胰蛋白酶(1:25胰蛋白酶:IL-22Fc，w/w)在37℃消化2hr。用三氟乙酸将样品酸化至0.1％的终浓度，并注射到用0.05％TFA的水溶液平衡的加热C18柱(PLRP-S，1000A8um，Agilent)上。通过线性乙腈梯度(5至60％)在20min时间内分离消化产物。将柱子直接连接到Agilent6520BTOF质谱仪的电喷射孔口并且在正离子模式下测定洗脱级分的质量。由于这些融合构建体的Fc部分在这些消化条件下在胰蛋白酶中稳定，可以作出多种IL-22融合物的碳水化合物状态的直接比较。
如图2所示，IL-22IgG1和IgG4Fc融合蛋白都显示出异常高水平的无岩藻糖基化。典型的单克隆IgG1抗体的糖基化的Fc的预期质量将是图2中板块A中标记为53296、53458和53620Da的那些。通常Fc各臂上的核心碳水化合物种类将各自由下列碳水化合物成分构成：4个N-乙酰葡糖胺，3个甘露糖和1个岩藻糖种类(如板块A中标记为53296的峰上)。添加一个或两个半乳糖将分别产生标记为53458和53620Da的峰(板块A)。检测到可忽略不计的量的含有这样的糖部分的分子，该糖部分在Fc一条臂上缺失岩藻糖(“-1岩藻糖”)。
令人惊讶的是，其中CH2结构域是糖基化的不同构建体的人IL-22IgG1Fc融合蛋白都表现出高水平的无岩藻糖基化，包括在Fc的一条臂(“-1岩藻糖”)和两条臂(“-2岩藻糖”)上缺失岩藻糖的糖部分。参见图2，板块B-D。这些无岩藻糖基化的分子构成高达约30％的全部观察到的种类。无岩藻糖基化可增加IL-22IgG1Fc融合物的不期望的效应子活性。
已知IgG4与IgG1相比具有更少的效应子功能。出人意料地，质谱分析结果也显示出人IL-22IgG4Fc融合蛋白的经胰蛋白酶消化的Fc区中的“-1岩藻糖”和“-2岩藻糖”糖基化的种类。这些无岩藻糖基化的分子构成超过50％的全部观察到的种类。图2，板块E。无岩藻糖基化的抗体具有大大增强的ADCC或CDC细胞毒性活性，其是对于这些IL-22Fc融合蛋白不期望的性质。
接着，构建了两个另外的IL-22Fc分子，一个含有IgG1Fc且另一个含有IgG4Fc，其中Fc中通常被糖基化的残基(N297)被突变成甘氨酸(N297G)，从而防止附着通常的核心糖。显示它们在其Fc部分上没有任何糖并且二者都有其基于其氨基酸序列的预期的Fc分子量(图2，板块F和G)。
总而言之，人IL-22Fc融合蛋白的Fc区(IgG1或IgG4Fc融合)显示出高水平的无岩藻糖基化，这可导致增加的ADCC或CDC活性——对于用作IL-22治疗剂而言不期望的性质。因此，在进一步的研究中测试非糖基化的变体。
实施例3IL-22IgG1和IgG4Fc融合蛋白体外活性测定
IL-22结合IL-22受体复合物并激活Jak-Stat信号传导通路。STAT3激活是IL-22介导的信号传导通路中的主导事件。在此实验中，使用荧光素酶报告基因测定法来测量IL-22Fc融合蛋白的体外活性。将HEK293细胞改造以过表达人IL-22受体复合物IL22R1和IL10R2。在第1天，将1x105293细胞接种到24孔板中0.4mlDulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)+10％肽牛血清(FBS)中。在第2天，使用在0.1ml减少的血清培养基(具有减少至少50％的减少的血清的GibcoPoti-MEM)中的Lipofectamine2000(Invitrogen)用STAT3-驱动的荧光素酶报告基因和Renilla荧光素酶对照来转染细胞。STAT3荧光素酶报告基因构建体含有STAT3响应的荧光素酶报告基因构建体，其含有sis可诱导元件(SIE)的串联重复和萤火虫荧光素酶报告基因。在第3天，将由瞬时或稳定CHO克隆产生的IL-22Fc融合蛋白在0.5ml培养基中滴定至不同浓度，并添加至转染细胞上方。在第4天，去除培养基并用100ul被动裂解缓冲液(由双荧光素酶报告基因1000测定体系提供)裂解细胞。将二十微升的细胞裂解物转染到96孔板中并用双荧光素酶报告基因1000测定体系在光度计(Promega)上进行分析。基于GraphPadPrism软件(LaJolla，CA)中的剂量依赖的活性计算EC50。不同IL-22Fc融合构建体的EC50值示于以下表2中。
表2
用不同长度和序列的接头构建了大量IL-22Fc融合蛋白以检查各设计的活性、稳定性和产量。优选具有天然IgG序列的接头以使免疫原性的潜在风险最小化；然而，本发明也考虑并包括显示出良好的体外活性的具有外源序列的接头。
在STAT3荧光素酶测定法中测试了含有DKTHT接头(SEQIDNO:32)的IL-22IgG1Fc融合蛋白。参见表2。为改善融合蛋白的EC50，将接头长度从5个增加到10个氨基酸，含有天然IgG1序列EPKSCDKTHT(SEQIDNO:33)。然而，所得的IL-22Fc融合蛋白表现出降低的体外活性。参见表2。令人惊讶的是，接头长度即使增加一个氨基酸VEPKSCDKTHT(SEQIDNO:34)也改善IL-22融合蛋白的活性。接头长度的进一步增加引起活性的进一步改善。参见表2。
在单独的实验中，将EPKSCDKTHT中的Cys改变成Ser以消除二硫键形成的可能。如表2所示，具有接头EPKSSDKTHT(SEQIDNO:40)的IL-22Fc融合物与具有Cys残基的亲本接头序列相比显示出改善的活性。并入上游序列(并入IgG1的CH1结构域中)的更长接头序列进一步改善活性。当与野生型对应物相比较时，具有N297G突变的构建体显示出相似的EC50值。选择IL-22IgG1(N297G)Fc融合蛋白(SQEIDNO:12)和IL-22IgG4(N297G)Fc融合蛋白(SEQIDNO:8)用于进一步研究。
在相同的测定中测试了从稳定克隆表达的人IL-22IgG1(N297G)Fc融合蛋白(SQEIDNO:12)或IL-22IgG4(N297G)Fc融合蛋白(SEQIDNO:8)的体外活性。图4中的数据显示代表性结果。IL-22IgG1和IgG4Fc融合蛋白均以剂量依赖的方式诱导STAT3活性。两种IL-22Fc融合蛋白显示出相似的效力。从瞬时转染的细胞表达的IL-22Fc融合蛋白显示出显示的结果(数据未示出)。作为对照，在相同的测定中测试在CHO细胞中产生的天然IL-22蛋白，其表现出比IL-22Fc融合蛋白高两到三倍的效力。
总而言之，IgG1和IgG4IL-22Fc融合蛋白都表现出经STAT3荧光素酶测定法证实的体外活性。此外显示具有不同长度和序列的接头的IL-22Fc融合蛋白激活IL-22R介导的荧光素酶活性。
实施例4IL-22Fc融合蛋白减轻小鼠中DSS诱导的结肠炎的症状
葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎是普遍认可的小鼠结肠炎模型。经口施用含DSS的水快速损害结肠上皮细胞并导致实质上的体重减轻以及由免疫组化(IHC)染色或病理学家的组织学临床评分表征的结肠上皮结构破坏。在此概念验证研究中，测试了IL-22Fc融合蛋白对DSS诱导的结肠炎的效果。
在C57BL/6小鼠中，从第0天开始用含3.5％DSS的饮用水诱导结肠炎五个连续日。通过腹膜内途径以5mg/Kg在第-1、1、4、和第6天给药小鼠IL-22IgG2aFc(SEQIDNO:60)——人IL-22Fc融合蛋白的替代品。每日测量动物体重。在第8天，将所有动物处死并通过IHC染色和人工组织学评分来研究结肠组织学。
如图5所示，DSS诱导的结肠炎与剧烈的体重减轻(图5A)、结肠上皮受损和结肠炎症(图5B)以及高组织学评分(图5C)相关联。IL-22Fc治疗显著防止体重减轻，恢复上皮完整性，减少炎症和降低组织学评分。参见图5。IL-22Fc的功效超过地塞米松的效果——在此研究中引起显著的体重减轻的类固醇护理标准(SOC)。
实施例5IL-22Fc融合蛋白药代动力学研究
在食蟹猴中的试验安全性和PKPD研究得到实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。该研究在查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories，CRL)PreclinicalServices(Reno，NV)进行。将来自CRL库存的总共15只雄性食蟹猴(4-5kg)随机分配到五组(n＝3/组)。在第1天和第8天，对第1组的动物给予静脉内(i.v.)剂量的对照载体。在第1天和第8天，分别以0.15和1.5mg/kg对第2和3组的动物给予单次i.v.推注剂量的IL22-FcIgG1。在第1天和第8天，分别以0.15和1.5mg/kg对第4和5组的动物给予单次i.v.推注剂量的IL22-FcIgG4。在多个时间点采集血清样品用于PK和PD分析至第43天，并通过ELISA测定IL22-Fc的浓度。
为分析食蟹猴血清中的人IL-22-Fc，在ELISA测定法中将小鼠抗人IL-22mAb(Genentech)用作捕获抗体。使用重组IL-22Fc融合蛋白以形成标准曲线。在与在测定缓冲液中稀释至500ng/mL的HRP缀合的抗人Fcγ-pan鼠mAb(Genentech)的1小时孵育期间检测到板结合的IL-22-Fc。最终洗涤后，添加四甲基联苯胺过氧化物酶底物(Moss，Inc.，Pasadena，MD)，显色15分钟，并用1M磷酸终止反应。使用酶标仪以620nm为参照在450nm下读板。从IL-22Fc融合物标准曲线的四参数拟合来计算IL-22Fc融合物的浓度。
对于PK数据计算，将研究第1天转变成PK第0天，以指示给药开始。生命中给药日后的所有时间点都计算为研究日减1。用版本5.2.1(Pharsight；MountainView，CA)使用2房室分析来分析各动物的血清浓度数据。
在i.v.给药(0.15mg/kg和1.5mg/kg)后，IL22-Fc的血浆浓度显示出双指数的下降，具有短的分布相和长的终末消除相。参见图6。具有来自中央室的IL-22Fc线性消除的两房室模型很好地描绘了两种剂量的药代动力学谱，提示了在这些剂量范围下微不足道的靶介导的布置。
通过两房室分析估计的最大血清浓度(Cmax)和血清浓度-时间曲线下面积(AUC)大致是线性的和与剂量成比例的。参见表3。与剂量成比例的动力学提示在所测剂量下IL-22R饱和。如图6所示，与IgG1Fc融合物相比，IL-22IgG4Fc融合物出人意料地显示出2倍更慢的CL和大于2倍的更高暴露。不局限于特定机制，IgG1融合物更快的清除(CL)可能是由于IgG1融合构建体更低的稳定性，因为IL-22IgG1Fc融合物的高于2倍的更快的CL看起来主要是由更大的分布体积驱动的。IgG1和IgG4融合物之间的4–5天的β半寿期是相似的。
表3
*β半寿期
实施例6在食蟹猴中的IL-22Fc体内活性评估
如所指示的，以0.15mg/kg或1.5mg/kg的剂量用同种型IgG1或IgG4的IL-22Fc融合物对食蟹猴(Macacafascicularis)静脉内给药。IL-22结合到IL-22受体触发包括血清淀粉样蛋白A(SAA)、RegIII/胰腺炎关联蛋白(PAP，也称为PancrePAP)和脂多糖结合蛋白(LPS-BP)的数种基因的表达。在此研究中，通过测量SAA、PancrePAP和LPS-BP的表达来分析IL-22Fc融合蛋白体内活性。如图中所示，在给药前和给药后的一段时间过程内获得血清样品。使用可得自LifeDiagnostics(WestChester，PA)的商业酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(目录#3400-2)定量血清中的猴SAA的循环水平。使用Dynabio(Marseille，法国)生产的商业ELISA试剂盒(目录PancrePAP)来定量血清中的RegIII/PAP的循环水平。
通过使用合格的ELISA确定血清样品中的脂蛋白结合蛋白(LBP)水平。将生物素化的脂蛋白(EnzoLifeSciences，Farmingdale，NY)涂布到链霉亲和素涂覆的微量滴定板上(Thermo；Rockland，IL)。在测定中使用重组人LBP(R&DSystems，Inc.，Minneapolis，MN)作为标准。使用抗LBP小鼠单克隆抗体(Thermo，Rockland，IL)检测结合的LBP分析物。将辣根过氧化物酶(HRP)缀合的F(ab’)2片段山羊抗小鼠IgG，Fc(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)用于检测。在添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)后将比色信号可视化。通过添加1M磷酸终止反应并用650nm作为参照在酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上测量450nm下的吸光度。所有ELISA样品根据制造商的说明书运行并以单次稀释一式两份或以四次系列稀释一式一份地进行制备，并从标准曲线插补出浓度。报告各样品的均值。
如图7所示，通过IL-22Fc体内诱导SAA、LPS-BP和RegIII/PAP血清蛋白质水平。在非人灵长类动物中体内观察到剂量依赖的反应，提示IL-22R结合并提示通过IL-22Fc而饱和。在大多数情况下，在第二剂量后24小时未观察到血清蛋白质水平的增加，提示血清SAA、LPS-BP和RegIII/PAP蛋白质已达到最大水平。在大多数动物中，所有三种蛋白质的血清水平在35天恢复期期间缓慢下降，回到基线。例外的是IgG4高剂量组中的RegIII/PAP水平，其看起来在整个42天期间保持升高。这可通过AUC反映出与IL-22IgG1Fc融合蛋白相比，对于IL-22IgG4Fc融合蛋白有改善的PK和增加的暴露。
实施例7致动脉粥样化倾向的小鼠(Ldlr-/-Apobec1-/-)的IL-22治疗
近来的研究已反映出IL-22在宿主针对病原微生物的防御中的作用。其对黏膜组织稳态和免疫的有益效果使我们推测，IL-22治疗可减轻内毒素血症以及其病理学后果包括致动脉粥样化的血脂异常、全身炎症并最终减缓动脉粥样硬化病和相关病症包括糖尿病的进展。
为测试该假设，用IL-22-Fc构建体对致动脉粥样化倾向的小鼠(Ldlr-/-Apobec1-/-)进行处理。这些小鼠缺乏LDL受体和apoB100专有合成。该模型的独特之处在于，其重现了大部分与人类家族性高胆固醇血症相关的病理生理学。具体地，基于饲料(chowdiet)，这些小鼠发展成升高的LDL胆固醇，具有与人相似的胆固醇分布的脂质谱，和进展性斑块形成。此外，Ldlr-/-Apobec-/-小鼠具有可测量的促成其心血管疾病的风险因素，包括胰岛素抗性、全身性炎症、进展性斑块负荷和内皮细胞功能病症。在此我们展示了3个月的IL-22-Fc融合蛋白治疗可以显著改善这些动物的心血管健康并降低动脉粥样硬化进展。
材料和方法
小鼠IL-22-Fc构建体。在此使用的IL-22-Fc构建体和多肽通常是小鼠IL-22-小鼠-Fc融合蛋白(SEQIDNO:73)，如图32A所示(且编码其的DNA序列示于图32B，SEQIDNO:72)。通过质粒DNA的瞬时转染在CHO细胞中产生蛋白质。通过将细胞上清过蛋白质A柱接着进行离子交换层析以消除聚集物来纯化融合蛋白。通过在C57B6小鼠中注射单剂量的10mg/kgIL-22-Fc接着以指定的时间间隔从小鼠获得血清来估测血清半寿期。使用抗IL-22mAb抗体通过夹心ELISA来确定IL-22-Fc的血清水平。将小鼠IL-22-Fc构建体用于使用Lrlr-/-Apobec1-/-双KO小鼠的体内研究。尽管呈现并已经在实施例中使用了小鼠序列，期望在多个实施方案中人序列可代替小鼠序列。
小鼠研究。在Genentech繁殖设施中繁殖Ldlr-/-Apobec1-/-双KO小鼠，WTC57BL/6小鼠购自Jackson实验室。在21℃在标准12hr光/12hr暗周期下将小鼠保持在无病原动物设施中，可接近饲料：标准啮齿动物饲料(Labdiet5010，12.7％热量来自脂肪)或高脂肪、高碳水化合物饮食(HarlanTekladTD.03584，58.4％热量来自脂肪)和自由饮水。在该研究中使用的C57BLKS/J背景的db/db小鼠是雌性，且其他小鼠都是雄性。在6月龄时开始以50μg/周通过腹膜内(ip)途径施用小鼠IL-22-Fc或对照IgG抗体三个月(总共12周剂量)。
动脉粥样硬化负荷的分析。使用高分辨率x射线微型计算机断层扫描对动脉粥样硬化病变体积和动脉粥样硬化斑块组成进行定量。通过吸入二氧化碳将动物安乐死，然后经由心脏左心室灌注10毫升磷酸盐缓冲盐水然后是10毫升的百分之十中性缓冲福尔马林。将主动脉切开并浸入到百分之十中性缓冲福尔马林中至少二十四小时，并转移到于百分之十中性缓冲福尔马林中的百分之二十的基于碘的x射线造影剂Isovue370(BraccoDiagnosticsInc.，Princeton，NJ)的溶液中至少十二小时。吸干后，将主动脉灌注并浸入到大豆油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)——一种低x射线强度背景成像介质中。以45kV的图像采集能量、160μA的电流、300毫秒的积分时间三次平均和十二微米的图像分辨率使用μCT40(SancoMedical，Basserdorf，Switzerland)获得微型计算机断层扫描图像。通过采用半自动形态滤波和用户定义区以Analyze(AnalyzeDirectInc.，Lenexa，KS)来分析所得图像，以确定目标体积和目标组成。
血管功能的评价。通过超声检查股动脉的血流介导扩张和硝酸甘油介导扩张来确定血管功能。用百分之二异氟烷将动物麻醉，并保持在三十七摄氏度下进行二十分钟的超声检查。使用Nair去除后肢的腹侧表面的毛发，并允许以五十五兆赫成像探针(VisualSonics，Toronto，Canada)使用Vevo770进行超声成像。对于血流介导的扩张，收集股动脉的基线图像然后将橡皮筋用作临时被膜以封闭股动脉血液流动四分钟。然后松开橡皮筋让股动脉重新流动，每分钟获取图像进行四分钟，并使用制造商提供的软件工具分析股动脉最大直径。对于硝酸甘油介导的扩张，收集股动脉的基线图像然后施以20微克硝酸甘油(Baxter，Deerfield，IL)的腹腔内注射，每分钟获取图像进行四分钟，并使用制造商提供的软件工具分析股动脉最大直径。
总胆固醇，甘油三酯和脂蛋白测定。使用CholestechLDX分析系统(InvernessMedical，Princeton，NJ)根据制造商说明使用新鲜血清样品来测定总胆固醇、甘油三酯和脂蛋白分布。
血清脂多糖测量。将冷冻血清样品解冻，在无内毒素的水中稀释一百倍，并在热水浴中在九十摄氏度下孵育十分钟。然后在Endosafe-PTS系统上根据制造商说明运行样品(CharlesRiverLaboratories，WilmingtonMA)。
GTT:葡萄糖耐受测试。在过夜空腹(14hr)后在以1g/kgi.p.葡萄糖注射的给药期结束时进行葡萄糖耐受测试(GTT)。使用OneTouchUltra血糖仪测量葡萄糖水平。通过单独圈养小鼠4天适应期然后进行为期一周的测量来计算研究中的食物消耗。
血清细胞因子水平的测量。使用Luminex23Multiplexpanel(BioRad)通过自动化方法来测量血清细胞因子水平。部分结果通过IndividualELISA试剂盒(R&D)来独立验证。通过使用酶促反应来确定总胆固醇和游离脂肪酸(FFA)(Roche)。
结果:
Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠准确地建模了致动脉粥样化血脂异常并且对炎性挑战敏感。Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠模型表现出人类中动脉粥样硬化疾病的脂蛋白水平和广泛的动脉粥样硬化病变特征(Powell-Braxton等.(1998)。NatMed4(8):934-8)。如对包括升主动脉、主动脉弓、降主动脉和部分头臂动脉的制备的样品使用自动的图像处理技术而确定的，对Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠的主动脉弓的MicroCT分析反映出动脉粥样硬化病的病征。该技术还显现出高度的异质性，反映了动脉粥样硬化负荷包括脂核、破裂的斑块区和钙化的严重度和进展的区域变异(图8)。CT信号的异质性反映了与人类疾病的复杂斑块病理学相一致的病变的深层病理学。为表征该模型并展示其对饮食诱导的动脉粥样化形成的敏感性，用高脂饮食处理小鼠同龄组或向其饮用水添加果糖(8％w/v)2月。与采用标准饲料的小鼠相较，Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠表现出对这些饮食改变的敏感性，其具有仅适度增加的血清LDL但在总动脉粥样硬化负荷中具有显著增加(图9)。这展示了动脉粥样硬化负荷的增加可能是由于炎症而不是LDL增加。此外，使用LPS挑战(0.025mg/Kg)的急性低度炎症刺激在Ldlr-/-Apobec1-/-中导致相较于wt对照促炎性标志物的明显升高(图10)。将Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠还暴露于长期LPS给药(750ng，ip)8周并评价血清脂谱和斑块负荷。如图11所示，长期内毒素暴露导致血脂异常和更高的斑块不稳定性。
在用IL-22-Fc治疗后，在Ldlr-/-Apobec1-/-小鼠中见到致动脉粥样化血脂异常和代谢综合征症状的改善。这些饲料喂养的小鼠发展出代谢综合征的特征，包括胰岛素抗性。使用IL-22-Fc治疗时，空腹血糖与对照相比降低，并且处理组中的葡萄糖清除与对照组相比改善(图12)。因此，葡萄糖稳态改善，具有正常化的葡萄糖耐受(GTT)和改善的空腹血糖(图12)。空腹和餐后高胆固醇血症与餐后TG水平(图13B)一样都降低(图13A)，并且脂谱改善(图14)。IL-22-Fc治疗后血浆LPS水平降低(图15)。除了血脂异常减少和胰岛素敏化外，还见到通过血管反应性测量的内皮功能的改善(图16)。与血脂异常的改善一致，斑块体积的CT分析显示出主动脉弓和头臂动脉中以及主动脉瓣中的总动脉粥样硬化负荷的降低(图17A-C)。脂谱和胰岛素抗性的改善不是由于热量摄取的降低，因为尽管在3个月的治疗期间出现适中但统计学显著的体重降低，在7天期间内测量的食物摄取增加(图18)。对照组的体重在3个月的治疗方案中没有变化并且IL-22-Fc处理组在研究起始和结束之间显示出显著的体重降低(图18A)。在IL-22-Fc处理组中，较之对照组，在治疗研究期间的过程中在7天期间内测量的平均每日食物摄入升高(图18B)。
实施例8-外周动脉疾病模型
通过IL-22-Fc刺激IL-22调节的通路而降低动脉粥样硬化进展是用于患有心血管疾病和相关病症包括糖尿病和慢性肾病的对象的潜在新治疗形式。由于心血管疾病通常不局限于对象的血管系统的一个区域，还认为被诊断为患有或处于患有冠状动脉疾病风险的对象处于发展出或患有其他形式的CVD诸如脑血管疾病、大动脉-髂动脉疾病和外周动脉疾病的风险中。可使用小鼠外周动脉疾病模型使用上述的同一策略对IL-22作为靶标进行验证。如上所述制备IL-22-Fc构建体并进行评估。还使用所有的必要对照。对IL-22激动剂/拮抗剂进行评估，结果将证实IL-22通路作为用于药物发现和开发的靶标。
使用基于股动脉结扎产生缺血性损伤的外周动脉疾病(PAD)模型。以与之前描述的步骤相似的方式评估IL-22-Fc构建体的功效(Couffinhal等，Am.J.Pathol.152:1667(1998)；Takeshita等，Lab.Invst.75:487(1996)；Isner等，HumanGeneTherapy7:959(1996))。为测试IL-22-Fc调节这样的外周动脉疾病的能力，使用以下实验方案：a)使用啮齿动物(如上述方法中那样)，将股动脉的一侧结扎以使后肢肌肉产生缺血性损伤(另一未损伤的后肢充当对照)；b)将一定范围的剂量的IL-22-Fc多肽(或其片段)静脉内和/或肌内递送至动物(在受损肢)，每周至少3x持续2-3周；以及c)在结扎后1、2和3周采集缺血性肌肉组织用于生物标志物和组织学分析。通常，(如上文)评估参数包括确定局部缺血周围组织的生存力和血管形成，然而更具体的评估参数可包括，例如测量皮肤血流量、皮肤温度、和因子VIII免疫组织化学和/或内皮碱性磷酸酶反应。使用任何领域内已知的原位杂交技术研究局部缺血期间的多肽表达。对对侧后肢的另一侧正常肌肉也进行活检作为对照用于分析。
备选地，使用其他小鼠模型(Pownall等.US2011/0118173A1)。存在有数种将用于测试动脉保护(atheroprotection)的动脉粥样硬化小鼠模型。这些包括apoA-IKO、apoEKO、胱硫醚β-合酶和载脂蛋白E以及apoA-I/SR-BI双KO。将通过注射、口服给药或离体(exvivo)处理用IL-22-Fc来处理这些动脉粥样硬化小鼠模型。在IL-22-Fc处理后测量血液胆固醇水平将显示出总血浆胆固醇的立即降低和增加量的neoHDL并且随后出现成熟形式的HDL，其含有在合适的时间段内自周围组织提取的胆固醇。
实施例9-重组IL-22Fc在糖尿病小鼠模型中的效果
在我们调查IL-22-Fc在代谢综合征中的效果的初始研究中，我们注意到IL-22RKO小鼠对饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性更易感。在后续实验中，我们观察到在使用重组IL-22-Fc的治疗之后体脂减少。鉴于这些数据，我们选择测试重组IL-22-Fc在糖尿病小鼠模型中的作用。在此研究中评估功效终点诸如餐后和空腹葡萄糖、体重以及葡萄糖和胰岛素耐受。
用重组IL-22-Fc或作为同种型IgG对照的抗豚草抗体处理小鼠(10只动物/组)，给予2剂量/周，为时3周(图19)：
组1：db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7(m)+/+Lepr(db)/JFAT)：抗豚草抗体抗体(50μg)
组2：db/db小鼠：重组IL-22-Fc(50μg)
组3：饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠：抗豚草抗体(50μg)
组4：饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠：重组IL-22-Fc(50μg)
12周龄雌性db/db购自Jackson实验室并用于实验中。在研究之前，使小鼠在到达后适应(日常处理)7-10天并在实验开始之前单独圈养。在第-5天至第-1天每日通过断尾采血(3-5μl)用于基线葡萄糖测量。在第0天，通过i.p.注射(150μl)施用PBS中的蛋白质，接着每周两次剂量为时3周。在第2、4、8、10、14、18和第21天再断尾采血(3-5ul)用于葡萄糖测量。为测定pK，在第2、7，13和第20天在麻醉下通过眼窝出血而采血30ul。
通过腹膜内途径每周两次地给药重组IL-22-Fc或同种型IgG对照抗体为时三周。每两天测量体重和餐后葡萄糖直至第23天研究结束，并通过断尾进行葡萄糖测量并使用血糖仪进行测量(图20A-B)。为获得餐后和空腹葡萄糖水平，在第10天清晨进行餐后葡萄糖测量，让两组的小鼠空腹4小时(hr)并使用血糖仪进行葡萄糖测量(图20C)。IL-22-Fc暴露在db/db小鼠中引起显著的降葡萄糖效果。
在以50μg/剂量每周两次地进行用IL-22-Fc或IgG对照处理2周之后进行葡萄糖耐受测试(GTT)。让小鼠空腹过夜(14hr)。在清晨测量空腹葡萄糖水平并作为基线。测量体重并通过断尾采血(3-5μl)用于葡萄糖测量。以1.5mg/Kg体重腹膜内施用葡萄糖溶液，每30min进行葡萄糖测量。在图中呈现30、120、180和220min的葡萄糖值。在第20天过夜空腹之后在第21天再进行一次GTT。每日对小鼠称重。在第23天将所有组都安乐死，并采集组织用于组织学。IL-22-Fc处理在葡萄糖耐受和胰岛素敏感度中展示出显著的改善(图21)。
在以50μg/剂量每周两次地用IL-22-Fc或IgG对照处理小鼠的第20天后进行胰岛素耐受测试(ITT)。使小鼠空腹4hr并获取基线葡萄糖水平。1mU/Kg体重经腹膜内施用，每30min通过断尾监测血糖水平。为计算葡萄糖降低百分比，将4hr空腹后的基线葡萄糖水平标准化至100％。显示IL-22-Fc处理显著改善经胰岛素耐受测试测量的胰岛素敏感度(图22A-B)。
IL-22R在胰腺中特别是腺泡细胞中高度表达，尽管其在β胰岛细胞中的表达状态还不清楚。检查了来自IL-22Fc或对照蛋白质处理的db/db小鼠的胰腺的胰岛素信号。还进行了糖尿病小鼠的组织学评估以评价经IL-22-Fc处理的动物中胰岛细胞中的胰岛素表达和肝脏门静脉周的脂肪变性的水平。如以前报道的那样，使用兔抗胰高血糖素(CellSignalingTechnologies#2760)连同AlexaFluor555-缀合的山羊抗兔二抗、或豚鼠抗胰岛素(DAKOA0564)连同AlexaFluor647-缀合的山羊抗豚鼠二抗，对福尔马林固定的石蜡包埋的胰腺组织进行胰岛素和胰高血糖素的免疫组织化学(Wu等.2011，Sciencetranslationalmedicine3，113ra126，doi:10.1126/scitranslmed.3002669)。通过将胰岛素阳性面积除以胰岛面积减核面积来计算胰岛素面积/胰岛面积的百分比。
IL-22-Fc似乎增加db/db小鼠中胰岛中的胰岛素表达(图23A)，定量分析反映出IL-22-Fc处理动物中胰岛素-信号强度(图23B和图24)和胰岛素阳性面积(图25)的显著增加，而IL-22Fc不使胰高血糖素-信号强度增加(图23C)。使用IL-22-Fc处理的胰岛素阳性面积显示出相较于用赫塞汀对照处理而言2.16倍的增加(95％置信区间1.25至3.72)。胰岛数量和面积不受IL-22Fc处理影响。但来自IL-22Fc处理的胰腺的每胰岛的β细胞面积和胰岛素染色的强度显著升高(图23和52)。
肥胖小鼠的胰腺β细胞显示出脱粒和变性的迹象(数据未示出)。与未经处理的肥胖小鼠相比，在用IL22处理的肥胖小鼠的β细胞中观察到统计学显著的更高的胰岛素染色(图23A，B)。该增加可能是由于IL22处理组中增加的胰岛素存储。尽管在IL22处理的肥胖小鼠中见到更高水平的胰腺胰岛素，在餐后或空腹条件下这些小鼠中的血清胰岛素水平与无IL22处理的肥胖小鼠相比实际上是降低的(图23D，E)。但与未处理的肥胖小鼠相比，IL22处理的肥胖小鼠通过以更类似于饲料饲养的野生型小鼠的模式释放出胰岛素而对葡萄糖作出反应(图23F)。因此，IL22潜在地通过在肥胖小鼠中增加成粒(granulation)并改善胰岛素释放的控制机制而改善肥胖小鼠中的葡萄糖稳态。
接着，检视了IL-22Fc对胰岛素稳态的效果。用IL-22Fc每周两次地处理HFD喂食小鼠8周。示出结果(图23D和E)。图23F中呈现的数据显示在葡萄糖注射后0或30min小鼠中的胰岛素水平。用IL-22Fc处理的HFD喂食小鼠，而非对照HFD小鼠，通过增加血清胰岛素水平(与饲料(正常饮食)饲养的野生型小鼠相似)对葡萄糖注射作出反应。参见图23F。因此，IL-22改善肥胖小鼠中的葡萄糖稳态并改善响应于葡萄糖的胰岛素分泌。
作为比较，我们调查了IL-22受体KO小鼠以及其对饮食诱导的肥胖(DIO)的易感性和胰岛素抗性。IL-22RKO小鼠描述于图43和下文。将IL-22受体KO小鼠和同窝对照小鼠从7周龄时置于60％高脂饮食，为时10周。为评价高脂饮食(HFD)诱导的葡萄糖耐受性，将小鼠空腹过夜并在第二天清晨进行葡萄糖耐受测试。对于此实验，将七周龄的IL-22RKO小鼠和年龄匹配的同窝对照动物(WT:充当野生型)置于60％HFD为时10周。对小鼠腹膜内注射1.5mg/kg体重的葡萄糖，并在2小时期间每30min监测血糖水平。计算个别小鼠的曲线下总面积并以图形方式表示。数据显示，基于曲线下总面积，IL-22RKO小鼠中的葡萄糖水平显著更高(图27A-B)，提示IL-22受体在HFD诱导的葡萄糖耐受性中起作用。与同窝WT对照小鼠相比，在HFD喂食之后IL-22受体KO小鼠实际上确实增重更多(图28)。
实施例10–致动脉粥样化倾向小鼠(Ldlr-/-Apobec1-/-)的IL-22治疗，导致血清LPS和血清LDL/HDL的降低
对九月龄Ldlr-/-，Apobec1-/-(dko)小鼠腹膜内注射50ug的融合蛋白IL-22Fc或50μg抗豚草对照抗体(n＝6/组)。四十八小时后，将动物安乐死并收获血清。使用CholestechLDX测定来分析脂谱，并使用鲎阿米巴样细胞溶解物测定来分析内毒素。与抗豚草Fc对照抗体相较，使用IL-22-Fc的血清LPS降低50％(p＝0.0052)且血清LDL/HDL降低30％(p＝0.049)(图29)。
概括而言，用IL-22Fc融合蛋白处理的小鼠在脂谱方面具有快速积极的变化和循环内毒素的降低。
实施例11通过全身性或局部施用，IL-22Fc加速鼠糖尿病创伤愈合模型中的创伤闭合
方案
IL-22-Fc构建体通常是小鼠IL-22-小鼠-IgG2a融合蛋白(SEQIDNO:72和73)，如图32A-B所示。
研究中使用的小鼠：在Genentech动物设施中繁殖IL-22RKO小鼠和同窝对照野生型(WT)小鼠。IL-22RKO小鼠描述于图43和下文中。使用9周龄糖尿病雌性小鼠BKS.Cg-Dock7(m)+/+Lepr(db)/JFAT(db/db)和BKS.Cg-Dock7(m)+/-Lepr(db)/Jlean(对照BKS)。在研究中基于体重和餐后葡萄糖水平将小鼠随机化。
创伤愈合方案严格遵循IACUC啮齿动物存活手术指南。在整个程序中使用无菌技术(包括无菌手套、口罩、长袍和布帘)。在诱导外科麻醉期后，将动物后背的背部(从肩胛区到腰椎区)剃毛，用脱毛乳液(Nair或等同物)去除发茬，接着用无菌水冲洗并用聚维酮碘擦洗做预备，接着用酒精冲洗。将动物腹侧躺卧放置，然后使用6mm打孔机标记要去除的皮肤区域(通过打孔机尖端的无菌标记，然后接触皮肤)。作出一个6mm直径的全厚皮肤创伤，中线左右1cm。用骨膜起子和精细剪刀去除下层的软骨膜。
在此之后用超强力胶水将10-12mm内径的0.5mm厚的硅胶框置于圆形创伤周围。然后将2平方厘米的TegadermTM(3M，St.Paul，MN)或(Smith&Nephew，Inc.，St.Petersburg，FL)粘合剂置于创伤和框的上方，并让动物从麻醉中恢复。
每隔一天去除敷料，检查伤口，局部施加处理(20uL的测试材料或盐水)，并施加新鲜的敷料。通过从第0天至研究结束测量伤口直径，计算伤口
在一些研究中，根据断尾法并使用商业血糖仪(lifeScan，Inc.，Milpitas，CA)记录餐后葡萄糖水平。
结果
IL-22R-/-小鼠在表皮创伤愈合反应中表现出缺陷
在IL-22RKO(缺少IL-22及其家族成员IL-20和IL-24的信号传导)中研究IL-22信号传导在表皮创伤愈合反应中的作用。图33显示IL-22RKO小鼠(n＝10)和IL-22RWT对照小鼠(n＝10)在14天期间的伤口曲线。在第0天产生6mm直径的创伤，并从第4天开始每2天测量伤口。在第8天直至第14天，与WT同窝对照相较，IL-22RKO小鼠的伤口显示出显著的闭合延迟。在研究结束时(第14天)，相较于IL-22RKO小鼠中仅30％的小鼠创伤闭合(p＝0.005)，100％的WT小鼠创伤闭合。IL-22RKO与WT对照小鼠之间的伤口差异被视为是统计学显著的，P≤0.05。
肥胖糖尿病小鼠中的创伤愈合缺陷
使用瘦素受体KO糖尿病小鼠(BKS.Cg-Dock7(m)+/+Lepr(db)/JFAT)(db/db)和WT对照瘦小鼠，在临床前研究中建模糖尿病条件下的表皮创伤愈合反应。在小鼠后部产生圆形创伤(6mm)，并从第4天开始每2天记录伤口闭合。图34显示从第0天至第27天测量的伤口闭合(mm)。在整个研究期间，与瘦小鼠相比，糖尿病肥胖db/db小鼠创伤在创伤闭合中表现出统计学显著的延迟(P≤0.0001)。到第14天，100％的WT小鼠创伤闭合，而db/db小鼠创伤即使在第27天也无一闭合(图35A)。如RNA水平所测量的，创伤切除后数天在野生型小鼠中诱导IL-22表达，而db/db小鼠中没有。参见图35B。
IL-22Fc加速糖尿病创伤愈合模型中的创伤闭合
由于IL-22R-/-小鼠展现出创伤闭合缺陷，提出假设IL-22可影响创伤闭合。图36显示研究设计的示意性图表。将9周龄的雌性肥胖db/db小鼠用于糖尿病创伤愈合建模。除了IL-22Fc(鼠)，还使用抗豚草抗体作为Fc对照蛋白质以及抗-FGFR1抗体作为阳性对照。由于已经证实在此临床前模型中抗-FGFR1抗体使血糖水平正常化，将其用作对照抗体。图36显示研究设计的示意性图表。处理组为：
·抗豚草抗体(腹膜内(i.p.)50μg/剂量，8次剂量)
·IL-22Fc(腹膜内(i.p.)50μg/剂量，8次剂量)
·抗-FGFR1抗体(在第0天和第14天，腹膜内(ip)0.5mg/kg)。
与抗豚草抗体处理相比，IL-22Fc和抗FGFR1都在降低糖尿病小鼠中的葡萄糖水平中显示出统计学显著的(P≤0.001)效果(图37)。数据(图38)显示与对照抗豚草抗体处理相比，IL-22Fc的全身性施用在创伤闭合速率中有惊人的效果。从第16天开始有显著的伤口差异(P≤0.05)，并且在第27天时IL-22Fc处理的小鼠中的创伤完全封闭。Fc对照抗体以及抗FGFR1抗体处理的小鼠的伤口即使在第27天也未能完全闭合。图39显示在第19、21和第27天个别小鼠的伤口测量，其中IL-22Fc处理组与其他2组相比之间的伤口差异是统计学极为显著的(P≤0.001)。
IL-22Fc局部vs.全身性治疗的比较
图40显示研究设计的示意性图表。在此研究中我们比较了2种治疗模型—局部vs.全身性治疗。组别为：
·抗豚草抗体(局部50μg/剂量，8次剂量)
·IL-22Fc(局部50ug/剂量，8次剂量)
·IL-22Fc(腹膜内(i.p.)50μg/剂量，8次剂量)。
图41中的图显示与对照抗体处理相比较，IL-22-Fc局部以及IL-22-Fc全身性施用均加速创伤闭合。从第16天直至第22天伤口测量在统计学上显著不同(P≤0.001)。在Il-22Fc局部和全身性处理组之间未观察到创伤闭合速率的显著差异。还参见图42。
实施例12肥胖小鼠表现出降低的IL-22诱导
在以下实验中，在肥胖小鼠中检查IL-22在免疫反应过程中的调节。IL-22的主要白细胞来源是先天淋巴样细胞(ILC)和T辅助细胞亚群，特别是Th17和Th22细胞。检查了在瘦素受体缺陷的db/db小鼠中抗原攻击时CD4+T细胞的IL-22产生。
方案
使用OVA和鞭毛蛋白的体内治疗.为激活体内CD4T细胞，在动物的下背部皮下注射100μg在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的OVA，并在第7天收获腹股沟淋巴结。为激活TLR5，静脉注射3μg超纯鞭毛蛋白(InvivoGen)，并在2h时收集血清样品。
小鼠。瘦素受体缺陷小鼠(db/db；BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J或B6.BKS(D)-Leprdb/J)、瘦素缺陷小鼠(ob/ob；B6.Cg-Lepob/J)及其各自的瘦对照小鼠、以及高脂饮食小鼠(C57BL/6J60％DIO)和饲料饮食对照小鼠购自Jackson实验室。IL-22缺陷小鼠(Zheng等，2007，Nature445，648-651)和IL-22Rα1缺陷小鼠(描述于图43和下文中)由LexiconPharmaceuticals生产并与C57BL/6品系回交超过10次。在指示出的情况下，从4–6周龄时开始用调节的热量饮食(HFD，含有60％脂肪，Harlan)饲养小鼠。对于代谢研究，使用12–18周龄的小鼠，而5–6周龄小鼠用于啮齿类柠檬酸杆菌感染研究。所有动物实验得到Genentech实验动物护理和使用委员会的批准。
幼稚CD4T细胞纯化和分化。按以前所记载的那样分选并刺激幼稚CD4T细胞(Rutz,等.2011，NatureImmunol.12:1238-45)，并且与以前描述的方式相似在各亚群的特定条件下进行培养.Id。对于IL-22诱导，使用抗IL-4(10μg/ml)，抗IFN-γ(10μg/ml)和重组IL-6(20ng/ml)；在指示出的情况下，添加重组小鼠瘦素(1μg/ml,R&Dsystems)。
细胞内染色和IL-22ELISA。使用藻红蛋白(PE)-抗-IL-22(1H8PWSR，eBioscience)和异硫氰酸荧光素(FITC)-抗-IL-17A(17B7，eBiosceince)，按以前描述的那样(Zheng等，同上)对从引流淋巴结纯化的淋巴细胞进行IL-22和IL-17A染色。使用单克隆抗IL-22抗体(20E5和14B7,Genentech)按以前描述的那样(Zheng等，同上)进行IL-22ELISA。
RNA分离和实时PCR。收获并处理克隆，用RNeasyminiplus试剂盒(Qiagen)分离mRNA。如以前报道的那样使用实时PCR分析评估Il22、Il22ra1和Reg3bmRNA水平(Ota等.2011,Natureimmunol.12,941-948)。将结果标准化到对照管家基因Rpl19(编码核糖体蛋白L19)的结果并报道为2ΔCT。用于Il22和Reg3b的引物和探针序列以前有报道.Id.对于Il22ra1，使用5’–AGGTCCATTCAGATGCTGGT–3’(SEQIDNO:74)，5’–TAGGTGTGGTTGACGTGGAG–3’(SEQIDNO:75)和5’–FAM–CCACCCCACACTCACACCGG–TAMRA–3’(SEQIDNO:76)。
统计学分析。所有统计学分析使用双尾非配对学生t-检验进行。P值低于0.05被视为是统计学显著的。
结果
在用完全弗氏佐剂(CFA)中的卵清蛋白(OVA)免疫小鼠之后，使用细胞内细胞因子染色离体检测表达IL-22的CD4T细胞。在db/db小鼠中IL-22+T细胞显著减少(图44A-B)。与先前报道一致，在db/db小鼠中IL-17+CD4T细胞也显著减少(图45A)。在瘦素缺陷ob/ob小鼠中也观察到相似的结果(图45B)。瘦素能够调节Th细胞，诸如Th1细胞和Treg细胞。然而，未观察到瘦素对来自体外分化的Th22细胞的IL-22生产的直接作用(图45C)。而且，在经免疫的DIO(饮食诱导的肥胖或HFD喂食)C57BL/6中也观察到相似的IL-22生产T细胞的减少(图44C和D)，提示肥胖而不是瘦素信号传导的缺乏可能对CD4+T细胞中降低的IL-22生产负有责任。通过鞭毛蛋白激活TLR5通路可刺激ILC的IL-22生产。
在用鞭毛蛋白的体内攻击时，在db/db小鼠(图44E)、ob/ob小鼠(图45E)和DIO小鼠(图44F)中血清IL-22水平显著低于WT小鼠中的水平。与T细胞的结果一致，瘦素自身并不增强ILC在体外的IL-22生产(图45D)。汇总言之，这些数据提示在肥胖小鼠中ILC和T细胞的IL-22诱导存在一般缺陷。
实施例13黏膜防御在瘦素缺陷小鼠中受损害并通过IL-22Fc融合蛋白恢复
由ILC和T细胞产生的IL-22对于针对结肠中啮齿类柠檬酸杆菌感染的宿主防御是必不可少的。分析了来自啮齿类柠檬酸杆菌感染的db/db和ob/ob小鼠的结肠中的IL-22诱导。如所记载的(Zheng等.2008,Naturemedicine14,282-289,doi:10.1038/nm1720)将啮齿类柠檬酸杆菌培养过夜并用2x109CFU细菌经口接种小鼠。如下分析细菌负荷：收获感染小鼠的脾脏和肝脏，称重并用gentleMACS(MiltenyiBiotec)在C-管中0.1％NP40/PBS中均质化。将系列稀释的匀浆铺板到MacConkey琼脂(Remel)上，在于37℃过夜孵育后鉴定粉红色菌落的啮齿类柠檬酸杆菌菌落。在指示出的情况下，对小鼠肌内注射IL-22–Fc(150μg/剂量)或等量的小鼠同种型对照，每周3次。如以前报道的，对来自啮齿类柠檬酸杆菌感染的小鼠的结肠进行组织学分析(Ota等.2011,Natureimmunology12,941-948,doi:10.1038/ni.2089)，并对上皮变化(增殖、出泡、肠上皮细胞脱落)、炎症和黏膜增厚评分。确定四个解剖区域——近、中、远端结肠和直肠的临床评分—基于0-5的标尺，0＝正常结肠且5＝严重疾病。将区域得分汇总得出各动物的最终结肠疾病严重度评分。
以上结果证实，在第4天在db/db和ob/ob小鼠中结肠中的IL-22峰值诱导也显著降低，而不是完全废止(图46A)。在db/db小鼠中，在用啮齿类柠檬酸杆菌经口接种后没有显著的体重减轻(图46B)。令人惊讶的是，在细菌接种后10天感染的db/db小鼠开始死亡，且大约60％～100％db/db小鼠在重复实验中在感染的第二周期间死亡(图46C)。db/db小鼠结肠切片的组织学分析反映出增加的炎性细胞浸润和严重的上皮细胞损伤，包括黏膜表面的上皮脱落(图46D-F)。此外，这些小鼠显示出斑块状黏膜下水肿和多灶性细菌菌落，其往往与局部坏死相关联。在db/db小鼠的肝脏和脾脏中也检测到显著升高的细菌负荷(图46G-H)。在ob/ob小鼠中也观察到了相似的黏膜防御缺陷(图54)。出人意料的是db/db小鼠在控制啮齿类柠檬酸杆菌感染中具有这样的显著缺陷；特别是考虑到由啮齿类柠檬酸杆菌感染的IL-22诱导在这些小鼠中仅部分有缺陷(参见图46A)。
已经报道过瘦素缺陷小鼠在B细胞功能中也有缺陷，并且在感染后期期间需要针对啮齿类柠檬酸杆菌的抗体用于从宿主最终消除细菌。因此检查了这些小鼠中抗啮齿类柠檬酸杆菌抗体的生产。在感染后第10天通过下颌下静脉出血而收获血清样品。ELISA板涂覆有热杀灭的啮齿类柠檬酸杆菌或山羊抗小鼠Ig捕获抗体。涂覆平板用洗涤缓冲液(0.05％Tween20于PBS中)洗涤，用封闭缓冲液(0.5％BSA,15ppmProclin于PBS中)封闭2h，并在添加系列稀释的标准小鼠单克隆IgG(SouthernBiotech)或血清样品之前进行洗涤。在室温下孵育2h后，洗涤平板，用与辣根过氧化物酶(HRP)(SouthernBiotech)缀合的山羊抗小鼠IgG检测Ig，在测定稀释液(0.5％BSA，0.05％Tween20，15ppmProclin于PBS中)中稀释1/4,000，并在室温下孵育2h。洗涤之后，向各孔添加TMB过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich)。在酶标仪中读取650nm下的吸光度(MolecularDevices)。
在感染后第14天，在存活的db/db小鼠中抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG抗体的滴度显著降低(图46I)。然而，降低的啮齿类抗柠檬酸杆菌IgG产生单独应当也不导致观察到的早期死亡，因为完全缺失B细胞和抗体产生的Rag2缺陷小鼠在感染后可以存活更久(Zheng等.2008,Naturemedicine14,282-289)。因此，db/db小鼠中失败的针对啮齿类柠檬酸杆菌的宿主防御可能是由适应性抗体反应和来自ILC的IL-22诱导二者的缺陷而引起的。接着，进行实验以检视IL-22是否能通过施用外源性IL-22–Fc而恢复啮齿类柠檬酸杆菌感染期间db/db小鼠中的黏膜免疫。如图46J所示，大多数对照IgG处理的db/db小鼠死亡，而几乎所有的IL-22Fc处理db/db小鼠在感染中存活(图46J)，支持了IL-22Fc能够治疗性地恢复db/db小鼠中的黏膜免疫缺陷。
实施例14IL-22Fc降低肥胖小鼠和高脂饮食喂食的正常小鼠中的葡萄糖水平
如以上实施例9中所述，IL-22Fc使已经发展出高血糖症的db/db小鼠中的葡萄糖水平降低(图20A)。该治疗益处在IL-22–Fc施用的期间持续。在处理3周后，这些小鼠中的葡萄糖水平下落低于200mg/dl，接近WT小鼠中的正常葡萄糖水平，而对照蛋白质处理的db/db小鼠维持高葡萄糖水平。当小鼠空腹时，IL-22Fc处理的小鼠中的葡萄糖降低更为明显(图20C)。与对照处理相较，IL-22Fc处理也导致体重减轻或体重增加延迟的趋势。然而，在此研究结束时，两组之间的体重差异并未在这些小鼠中达到统计学显著性(图20B)。这些数据证实，IL-22Fc处理在葡萄糖耐受测试和胰岛素耐受测试中引起显著改善的葡萄糖耐受和胰岛素敏感(分别见图21和图22)。
为证实外源IL-22在代谢病症的调节中的一般有益功能，对已经用HFD喂食至少8周的C57BL/6小鼠施用IL-22Fc4周，以诱导葡萄糖不耐受。对于葡萄糖耐受测试(GTT)，使小鼠空腹过夜，并以1.5mg/kgi.p.注射葡萄糖溶液。对于胰岛素耐受测试(ITT)，以1.0单位/kg对小鼠i.p.注射胰岛素溶液。在注射之前和之后测量血糖。通过Contour(Bayer)测量血糖。
与db/db小鼠的结果一致，IL-22-Fc处理显著降低血清葡萄糖水平，特别是在空腹后(图47A)。在研究结束时在IL-22Fc处理组中也有降低的体重(或延迟的体重增加)(图47B)。此外，IL-22Fc降低HFD喂食的C57BL/6小鼠中的葡萄糖不耐受和胰岛素抗性(图47C和D)。当在HFD喂食开始时同时对小鼠施用IL-22Fc，得到相似的结果(图48)。汇总言之，数据表明IL-22Fc是使肥胖小鼠中的血清葡萄糖浓度正常化、并使葡萄糖不耐受性和胰岛素抗性缓解的潜在疗法。
实施例15IL-22Fc使肥胖和HFD喂食的小鼠中的食物消耗降低并使PYY表达增加
食物消耗的降低可以逆转糖尿病小鼠中的高血糖症和胰岛素抗性。确实，与对照组相较，用IL-22Fc处理的db/db小鼠显示出食物摄入的显著降低(图49A)。进行成对饲养实验以确保IL-22Fc和对照处理的小鼠中相同的食物摄入(图50)。在研究过程中对自由喂食组每日测量食物消耗。配对喂食组的供应的食物限制为匹配自由喂食组的前日食物消耗。相应地，配对喂食组的处理和测量在自由喂食组之后一天进行。
即使在这样的条件下，尽管是在稍后的时间点，IL-22Fc显著降低血清葡萄糖(图49B)，并逆转db/db小鼠中的葡萄糖耐受性(图49C)，提示由IL-22调节食物消耗不是其在代谢疾病中的治疗效果的唯一机制。在HFD喂食的小鼠中观察到了相似的结果(数据未示出)。为进一步理解IL-22如何调节食物消耗和代谢，检查了已知为抑制食物摄入的肠激素PYY的表达。
在第0天和第2天对小鼠i.p.注射50μgIL-22–Fc。在第4天，将小鼠空腹过夜，并在第5天再喂食1h。在第2天处理前并在第5天喂食后采集血样。在采集后立即将所有血清样品与蛋白酶抑制剂(Sigma)、DPPIV抑制剂(Millipore)和Pefabloc(Roche)混合。根据制造商的说明用PYYELISA试剂盒(Abnova)测量PYY。结果显示IL-22Fc处理显著增加db/db和HFD喂食小鼠的血清中的PYY浓度(图49D和E)。为证实IL22对食物摄入的效果是通过促进PYY产生而介导的，检查了用PYY抑制剂BIIE0246处理的小鼠中的食物摄入。在第2天和第4天对饲料喂养的C57BL/6小鼠不作处理或用IL-22Fc处理。在过夜空腹之后，测量4小时喂食期间的食物摄入。结果显示IL-22Fc处理的小鼠中的食物摄入降低被BIIE0246逆转(数据未示出)，指示IL-22Fc对降低的食物摄入的效果是通过诱导PYY而介导的。
实施例16IL-22Fc使肥胖小鼠中血清LPS以及肝脏ALT和AST降低并使脂质代谢增加
由于IL-22受体在调节代谢的许多器官包括肝脏和胰腺中表达，IL-22在代谢疾病中的治疗益处可能是由多种机制介导。代谢内毒素血症促进炎性状态和胰岛素抗性并且肠道菌群的调节增强葡萄糖耐受性。遵循制造商的说明，通过鲎阿米巴样细胞溶解物测定试剂盒QCL-1000(Lonza)测量血清内毒素。通过CholestechLDX(Alere)测量ALT和AST。图49F所示结果证明，IL-22Fc处理引起来自db/db小鼠的血清中LPS量的显著降低。
IL-22可抑制脂肪生成中涉及的基因并改善肝脏脂肪变性。接着检查血清ALT和AST水平。通过Contour(Bayer)测量血糖。通过CholestechLDX(Alere)测量ALT和AST。如图51A和B所示，IL-22Fc处理降低db/db(图51A)和HFD喂食的(图51B)小鼠中的血清中的ALT和AST水平。使用IL-22Fc处理，在HFD喂食的小鼠中腹部脂肪也显著下降(图51C)。此外，在原代脂肪细胞中负责脂类代谢的基因被IL-22诱导(图51D)。接着检查IL-22对肝脏和脂肪组织中甘油三酯和胆固醇的效果。结果显示IL-22Fc降低HFD喂食的小鼠中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸(FFA)(图51E)、以及肝脏甘油三酯(图51F)、肝脏胆固醇(图51G)和白色脂肪组织中的甘油三酯(图51H)。相似地，IL-22降低db/db小鼠中的肝脏和白色脂肪组织中的甘油三酯(图51I和图51J)。进一步实验显示，肥胖小鼠中IL-22Fc处理较之无处理降低炎性细胞因子诸如TNFα和IL-1β(数据未示出)。肝脏切片的H&E染色反映出使用IL-22Fc融合蛋白处理肝脏门静脉周脂肪变性的下降(图26)。
IL-22经由IL-22R1和IL-10R2链信号传导。IL-22R1也可与IL-20R2链配对并为IL-20和IL-24所利用。已显示所有这些配体诱导来自皮肤表皮的极为相似的下游生物学效应(Sa等,2007,JImmunol178,2229-2240)。因此，检查IL-22和IL-22R1缺陷小鼠以避免HFD诱导的糖尿病中潜在的其他细胞因子的冗余。IL-22R基因敲除小鼠的产生示于图43A。KO小鼠中IL-22R1的缺失通过IL-22RKO小鼠中不存在IL-22R1mRNA以及IL-22RKO小鼠中缺少响应于IL-22Fc的RegIIIbmRNA表达而确证。参见图43B和C。此外，对IL-22RKO小鼠施用IL-22-Fc不诱导pStat3(数据未示出)。
未观察到IL-22缺陷小鼠中的葡萄糖耐受性和体重与WT同窝对照的差异(图53)。然而，当用高脂饮食处理IL-22R1缺陷小鼠三个月时，这些小鼠发展出显著更严重的葡萄糖耐受性并且增重更多(图49G、H和I)，支持IL-22R通路在控制代谢中的关键作用。检查了在减轻代谢综合征中IL-20和IL-24冗余的可能性。在此实验中，用IL-20Fc、IL-22Fc或IL-24Fc处理db/db小鼠。结果表明，在第20天在db/db小鼠中在GTT测定中仅IL-22Fc降低血清葡萄糖水平(图55B)并改善葡萄糖耐受性(图55C)，而用IL-20Fc或IL-24Fc处理db/db小鼠并不如此。体重减轻并非统计学显著的。进一步的实验显示，尽管IL-20Fc和IL-24在原代脂肪细胞中诱导pStat3，这些细胞因子未能诱导来自已变得对胰岛素不敏感的db/db小鼠的肝脏组织中的pStat3(数据未示出)。IL-22RKO小鼠中的IL-22Fc处理在葡萄糖耐受测试中没有效果，证实IL-22Fc的效果是通过IL-22R信号传导而发挥的(数据未示出)。
本文呈现的研究表明了IL-22在调节代谢过程中的关键功能。IL-22R1缺陷小鼠倾向于发展代谢综合征。外源IL-22不仅能在临床前糖尿病模型中恢复黏膜免疫缺陷，还帮助使葡萄糖和脂质代谢正常化。由此，IL-22可提供治疗人类代谢病症的新的治疗途径。
实施例17VGEF和IL-22在促进db/db小鼠创伤愈合中的比较
在此实验中，分析了IL-22对促进或改善创伤愈合的效果并将其与VEGF进行比较。11周龄的雌性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/Jdb/db小鼠购自Jackson实验室,BarHarbor,ME。所有实验动物研究在GenentechLabAnimalResearch的实验动物护理和使用委员会的批准下进行。在异氟烷麻醉下将背部皮肤剃毛，然后涂覆脱毛霜以去除剩余的发茬。在清洁皮肤并用聚维酮碘做预备接着用酒精擦拭片之后，使用一次性6mm活检打孔机(Miltex,Inc.)在各小鼠的背侧皮肤上产生圆形全厚创伤。在处理之前和之后用Tegaderm膜覆盖创伤。
图56的结果显示，VEGF看起来达到较之于IL-22更快的表面闭合；然而，当检查皮肤的真皮侧时，VEGF处理的创伤即使在第21天时也仍然未闭合(图56B)。还分析了VEGF和IL-22Fc促进创伤部位的血管生成的能力。在此实验中，在第0天在db/db小鼠中切出两个6mm的创伤。在第2、4、6、8、10和第12天，将对照抗豚草抗体抗体或IL-22Fc(50μg)或VEGF(20μg)在盐水中局部施用到创伤上。在第6和第12天，从每组取出三只小鼠用于组织学和免疫组化分析及BrdU染色。在第16天，取1只小鼠用于BrdU染色。在第18、20和第22天，各时间点从每组取出一只小鼠用于免疫组化染色和CD31全组织染色。结果表明，经CD31组织免疫染色分析，VEGF和IL22-Fc，而非对照抗豚草抗体抗体，促进创伤部位处的血管形成(数据未示出)。
接着，我们分析了在重建的表皮中IL-22诱导的和其他IL-10家族成员诱导的细胞因子和趋化因子表达。重建的表皮是EpiDermRHE组织模型，其被保持在购自MatTek的EPI-100-NMM介质中。参见Sa等.2007,J.Immunol.178:2229-2240。结果显示IL-22在重建的人表皮中显著地诱导IL-8、CXCL-1、MIP3a、DMC和MCP-1的表达，尽管也观察到由IL-19、IL-20或IL-24的诱导(图57)。鉴于本文所述的IL-22对创伤愈合的效果，IL-19、IL-20和IL-24在加速创伤愈合中也可能起作用。
实施例18在db/db小鼠中的夹板创伤模型中IL-22在感染的创伤的治疗中提供比VEGF和PDGF优异的效力
在小鼠创伤愈合模型中，收缩对于小鼠中的创伤闭合占大部分比重，因为小鼠皮肤可动。为了更紧密地模拟人类中的创伤愈合过程，建立小鼠夹板创伤模型，其中将硅环粘合到皮肤上并用缝合针固定到创伤周围以防止局部皮肤收缩(参见图59B中的代表性图像)。参见例如Zhao等,2012,WoundRep.Reg.20:342-352和Brubaker等,2013,J.Immunol.,190:1746-57。在此模型中，与人类中的创伤愈合过程相似，创伤通过肉芽和再上皮化过程而愈合。为用夹板固定创伤，对无菌硅酮夹板(GraceBio-Labs,Inc.)的一侧施用Krazy胶(Elmer’sProducts,Inc.)并将夹板小心地围绕创伤放置，粘合侧朝下，从而使创伤集中在夹板内。胶水粘合到接触的皮肤并在整个研究过程中作为夹板。用四根截断的6.0单丝尼龙缝合线(Ethicon,Inc.)将夹板进一步固定在皮肤上。在用Tegaderm透明膜覆盖创伤之前拍摄创伤的数字图像。此外，开放创伤的微生物感染可延迟创伤愈合，慢性创伤，诸如在糖尿病患者中见到的慢性创伤，通常是感染的创伤。
使用夹板创伤模型，在db/db小鼠中检查了IL-22Fc对感染的创伤的效果。在切出创伤后两天，对在野生型或db/db小鼠中如上所述切出的创伤局部接种0.5x106CFU、1x106CFU(斑块形成单位)或2x106CFU的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。如图58所示，db/db小鼠与野生型小鼠相较表现出延迟的创伤愈合，并且与对照相比，当在这些小鼠中创伤被细菌感染时创伤愈合进一步延迟。
在单独的实验中，在夹板感染创伤模型中将IL-22的创伤愈合效果与其它活性剂进行比较。在切出创伤后两天，以1x106CFU将30ul盐水中的甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌菌株USA300NRS384(NARSA)接种到创伤表面上，并再用Tegaderm覆盖。在金黄色葡萄球菌感染后48小时开始用30ug于30ul盐水中的IL22-Fc或VEGF(Lot#110308,Genentech)或PDGF(Lot#0507CY420,PeproTech,Inc.)进行局部处理，之后每周3次。在处理之前并在处理之后每周两次地记录创伤的数字图像，直至创伤闭合。使用ImageJ——在NIH开发的一种基于java的图像处理程序，从创伤图像计算创伤闭合的百分比。
如图59所示，当将相同量的化合物应用于夹板创伤模型中的感染的创伤时，IL-22Fc促进比VEGF更快的创伤愈合，所述夹板创伤模型更紧密地模拟人类中的创伤愈合。接着，对感染的创伤测试不同剂量的VEGF和IL-22Fc。在此实验中，在血糖>300mg/dl的db/db小鼠中产生一个6mm直径的夹板切伤。在各个创伤处接种1x106CFU的金黄色葡萄球菌USA300。局部施用盐水中不同剂量的VEGF或IL-22Fc，每周三次直至创伤闭合。盐水用作对照。在创伤闭合时，将小鼠处死并对样品进行组织学、免疫组化和PCR分析及CFU计数。图60中的结果显示，30μg的量的IL-22Fc比60μgVEGF表现出更好的感染的创伤愈合功效。因此，在非夹板创伤模型中观察到的VEGF的更快表面闭合可能是因为小鼠皮肤收缩，并且IL-22Fc对促进角化细胞增殖和再上皮化的效果可能被小鼠皮肤收缩掩盖。
相似的结果示于图61中，其中证实当对创伤应用相同量(30μg)的各化合物时IL-22Fc具有比VEGF和PDGF优异的效力。在第15天时见到IL-22Fc处理的感染夹板创伤中的完全创伤闭合。然而，在经VEGF或PDGF处理的小鼠中，与未经处理的未感染的创伤相同，直至第25天才见到感染夹板创伤中的完全闭合。直至第29天才见到对照组即未经处理的感染的创伤中的创伤闭合。不限于特定机制，IL-22Fc相较于VEGF或PDGF促进创伤愈合的优越性可以是因为其对再上皮化，促进角化细胞增殖、新血管形成的诱导、蛋白酶的诱导从而协助组织重建和修复以及抗微生物活性的效果。
接着，我们测试了是否可以以凝胶制剂施用IL-22Fc用于创伤愈合。此实验中使用的示例性凝胶制剂含有10mM磷酸钠，pH7.1，具有0.5mg/g甲氨酸和3％羟丙基甲基纤维素(HPMCE4Mpremium来自DowChemicals)，有或没有1mg/gIL-22Fc。将凝胶溶液与IL-22Fc溶液在局部涂覆于夹板创伤之前混合。含有IL-22Fc的制剂还含有从原始蛋白质制剂中携带的少量的蔗糖(<20mM)和P20(<0.002％)。图62所示的结果证明，溶液和凝胶制剂的IL-22Fc都促进非感染夹板创伤中的创伤愈合。
说明书被认为足以使本领域技术人员实践本发明。尽管已经出于清晰理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了上述发明，但说明和实例不应解读为限制本发明的范围。实际上，除了本文所示和所描述的那些外，根据上述说明本发明的多种变型对于本领域技术人员来说将是明显的，并且落入所附权利要求的范围内。

Claims (157)

1.结合IL-22受体的IL-22Fc融合蛋白，所述IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽，其中Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，其中IL-22Fc融合蛋白包含与选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中Fc区未糖基化。
2.权利要求1的IL-22Fc融合蛋白，其中氨基酸序列与选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
3.权利要求1或2的IL-22Fc融合蛋白，其中氨基酸序列与选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。
4.权利要求1-3中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中氨基酸序列与SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。
5.权利要求1-4中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中氨基酸序列与SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。
6.权利要求1-4中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
8.权利要求1-7中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22Fc融合蛋白是通过以下方法生产的，所述方法包括在适于表达IL-22Fc融合蛋白的条件下培养能够表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞的步骤。
9.权利要求8的IL-22Fc融合蛋白，其中方法还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。
10.权利要求8或9的IL-22Fc融合蛋白，其中宿主细胞是CHO细胞。
11.包含通过接头与IgGFc区连接的IL-22多肽的IL-22Fc融合蛋白，其中Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，并且其中Fc区未糖基化。
12.权利要求11的IL-22Fc融合蛋白，其中铰链区包含氨基酸序列CPPCP(SEQIDNO:31)。
13.权利要求11或12的IL-22Fc融合蛋白，其中在Fc区中N297残基改变和/或T299残基改变。
14.权利要求13的IL-22Fc融合蛋白，其中N297残基改变为Gly或Ala。
15.权利要求13或14的IL-22Fc融合蛋白，其中N297残基改变为Gly。
16.权利要求13-15中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中T299残基改变为Ala、Gly或Val。
17.权利要求11-16中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中接头为8-20个氨基酸长。
18.权利要求17的IL-22Fc融合蛋白，其中接头为8-16个氨基酸长。
19.权利要求17的IL-22Fc融合蛋白，其中接头为10-16个氨基酸长。
20.权利要求11-19中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。
21.权利要求20的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列DKTHT(SEQIDNO:32)。
22.权利要求21的IL-22Fc融合蛋白，其中接头为至少11个氨基酸长并且包含氨基酸序列EPKSCDKTHT(SEQIDNO:33)。
23.权利要求22的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列VEPKSCDKTHT(SEQIDNO:34)、KVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:35)、KKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:36)、DKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:37)、VDKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:38)、或KVDKKVEPKSCDKTHT(SEQIDNO:39)。
24.权利要求11-21中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列EPKSSDKTHT(SEQIDNO:40)。
25.权利要求24的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列VEPKSSDKTHT(SEQIDNO:67)、KVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:68)、KKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:66)、DKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:64)、VDKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:69)、或KVDKKVEPKSSDKTHT(SEQIDNO:65)。
26.权利要求11或21的IL-22Fc融合蛋白，其中接头不包含氨基酸序列GGS(SEQIDNO:45)。
27.权利要求11-21、24和26中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其包含SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的氨基酸序列。
28.权利要求27的IL-22Fc融合蛋白，其包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。
29.权利要求11-19中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
30.权利要求29的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列SKYGPP(SEQIDNO:43)。
31.权利要求30的IL-22Fc融合蛋白，其中接头包含氨基酸序列RVESKYGPP(SEQIDNO:44)。
32.权利要求11-19和29-31中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:10的氨基酸序列。
33.权利要求32的IL-22Fc融合蛋白，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
34.通过以下方法生产的权利要求11-33中任一项的IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括在适于表达IL-22Fc融合蛋白的条件下培养能够表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞的步骤。
35.权利要求34的IL-22Fc融合蛋白，其中方法还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。
36.权利要求34或35的IL-22Fc融合蛋白，其中宿主细胞是CHO细胞。
37.权利要求1-36中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22融合蛋白是二聚体IL-22Fc融合蛋白。
38.权利要求1-36中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22融合蛋白是单体IL-22Fc融合蛋白。
39.权利要求1-38中任一项的IL-22Fc融合蛋白，其中IL-22多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。
40.单体IL-22Fc融合蛋白，其包含含有SEQIDNO:61的氨基酸序列的IL-22Fc融合臂，和含有SEQIDNO:62的氨基酸序列的Fc臂。
41.通过以下方法生产的权利要求40的单体IL-22Fc融合蛋白，所述方法包括培养一种或多种宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包含能够表达含有SEQIDNO:61的氨基酸序列的IL-22Fc融合臂和含有SEQIDNO:62的氨基酸序列的Fc臂的一种或多种核酸分子。
42.权利要求41的单体IL-22Fc融合蛋白，其中方法还包括从细胞培养物或培养基获得单体IL-22Fc融合蛋白的步骤。
43.权利要求40或41的单体IL-22Fc融合蛋白，其中一种或多种宿主细胞是大肠杆菌细胞或CHO细胞。
44.制备权利要求40-43中任一项的单体IL-22Fc融合蛋白的方法，所述方法包括培养一种或多种宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包含能够表达含有SEQIDNO:61的氨基酸序列的IL-22Fc臂和含有SEQIDNO:62的氨基酸序列的Fc臂的一种或多种核酸分子。
45.权利要求44的方法，还包括从细胞培养物或培养基获得单体IL-22Fc融合蛋白的步骤。
46.权利要求47或48的方法，其中一种或多种宿主细胞是大肠杆菌细胞。
47.包含IL-22Fc融合蛋白的组合物，所述IL-22Fc融合蛋白包含通过接头与Fc区连接的IL-22多肽，其中Fc区包含铰链区、IgGCH2结构域和IgGCH3结构域，并且其中组合物在CH2结构域中具有不多于5％的无岩藻糖基化水平。
48.权利要求47的组合物，其中无岩藻糖基化水平不多于2％。
49.权利要求48的组合物，其中无岩藻糖基化水平少于1％。
50.权利要求47-49中任一项的组合物，其中无岩藻糖基化水平通过质谱测量。
51.权利要求47-50中任一项的组合物，其中Fc区包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。
52.权利要求51的组合物，其中Fc区包含IgG1的CH2和CH3结构域。
53.权利要求51的组合物，其中Fc区包含IgG4的CH2和CH3结构域。
54.权利要求47-53中任一项的组合物，其中铰链区包含氨基酸序列CPPCP(SEQIDNO:31)。
55.权利要求51的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的氨基酸序列。
56.权利要求55的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:24的氨基酸序列。
57.权利要求55的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:26的氨基酸序列。
58.权利要求47-57中任一项的组合物，其中组合物是通过以下方法生产的，所述方法包括步骤为：在适于表达IL-22Fc融合蛋白的条件下培养能够表达IL-22Fc融合蛋白的宿主细胞，和从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白，其中组合物在Fc区的CH2结构域中具有不多于5％的无岩藻糖基化水平。
59.权利要求58的组合物，其中无岩藻糖基化水平不多于2％。
60.权利要求59的组合物，其中无岩藻糖基化水平少于1％。
61.权利要求58-60中任一项的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白通过纯化获得。
62.权利要求61的组合物，其中IL-22Fc融合蛋白通过亲和层析纯化。
63.权利要求58-62中任一项的组合物，其中宿主细胞是CHO细胞。
64.权利要求47-63中任一项的组合物，其中IL-22多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。
65.编码权利要求1-43和47-64中任一项的IL-22Fc融合蛋白的分离的核酸。
66.权利要求65的分离的核酸，其中核酸编码包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:24或SEQIDNO:26的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
67.权利要求65或66的分离的核酸，其中核酸编码包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
68.权利要求67的分离的核酸，其中核酸编码包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
69.权利要求65-68中任一项的分离的核酸，其包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的多核苷酸序列。
70.权利要求69的分离的核酸，其包含SEQIDNO:7或SEQIDNO:11的多核苷酸序列。
71.权利要求70的分离的核酸，其包含SEQIDNO:7的多核苷酸序列。
72.包含权利要求65-71中任一项的核酸的载体。
73.包含权利要求72的载体的宿主细胞。
74.权利要求73的宿主细胞，其中宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
75.权利要求74的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞或CHO细胞。
76.制备IL-22Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在适于表达IL-22Fc融合蛋白的条件下培养权利要求73-75中任一项的宿主细胞的步骤。
77.权利要求76的方法，还包括从细胞培养物或培养基获得IL-22Fc融合蛋白的步骤。
78.权利要求77的方法，还包括移除无岩藻糖基化的IL-22Fc融合蛋白的步骤。
79.权利要求78的方法，其中无岩藻糖基化的IL-22Fc融合蛋白是通过亲和柱层析移除的。
80.权利要求76或77的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
81.权利要求76-79中任一项的方法，其中宿主细胞是CHO细胞。
82.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-43和47-64中任一项的IL-22Fc融合蛋白和至少一种可药用的运载体。
83.权利要求82的药物组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:24、或SEQIDNO:26的氨基酸序列。
84.权利要求82或83的药物组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列。
85.权利要求84的药物组合物，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
86.权利要求82-85中任一项的药物组合物，其中IL-22Fc融合蛋白在CHO细胞中生产。
87.权利要求82-86中任一项的药物组合物，其中IL-22Fc融合蛋白的Fc区未糖基化。
88.权利要求82-87中任一项的药物组合物，还包含额外的治疗剂。
89.药物组合物，其包含权利要求1-43和47-64中任一项的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白和至少一种可药用的运载体，其中可药用的运载体是胶凝剂。
90.权利要求89的药物组合物，其中胶凝剂是多糖。
91.权利要求89或90的药物组合物，其中胶凝剂是纤维素剂。
92.权利要求89-91中任一项的药物组合物，其中胶凝剂是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、POE-POP嵌段聚合物、海藻酸盐、透明质酸、聚丙烯酸、羟乙基甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。
93.权利要求92的药物组合物，其中胶凝剂是羟丙基甲基纤维素。
94.权利要求89-93中任一项的药物组合物，其中药物组合物用于局部施用。
95.治疗有需要的对象中炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括对对象施用权利要求82-88中任一项的药物组合物。
96.治疗患者中IBD的方法，所述方法包括对有需要的对象施用包含权利要求1-43中任一项的IL-22Fc融合蛋白或权利要求47-64中任一项的组合物的药物组合物。
97.权利要求95或96的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
98.权利要求97的方法，其中IBD是溃疡性结肠炎。
99.权利要求97的方法，其中IBD是克罗恩氏病。
100.权利要求95-99中任一项的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、或SEQIDNO:14的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
101.权利要求100的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
102.权利要求101的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
103.权利要求95-102中任一项的方法，其中对对象共同施用至少一种额外的治疗剂。
104.权利要求95-103中任一项的方法，其中静脉内、皮下或腹膜内施用药物组合物。
105.在有需要的对象中抑制肠中微生物感染、在微生物感染期间保护肠中杯状细胞、增强肠中上皮细胞完整性、上皮细胞增殖、上皮细胞分化、上皮细胞迁移或上皮创伤愈合的方法，所述方法包括向对象施用权利要求82-88中任一项的药物组合物的步骤。
106.权利要求105的方法，其中上皮细胞是肠上皮细胞。
107.权利要求105-106中任一项的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、或SEQIDNO:14的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
108.权利要求107的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
109.权利要求108的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
110.权利要求105-109中任一项的方法，其中对对象共同施用至少一种额外的治疗剂。
111.权利要求105-110中任一项的方法，其中静脉内、腹膜内或皮下施用药物组合物。
112.治疗有需要的对象中急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，所述方法包括对对象施用权利要求82-88中任一项的药物组合物。
113.治疗患者中急性肾损伤或急性胰腺炎的方法，所述方法包括对有需要的对象施用包含权利要求1-43中任一项的IL-22Fc融合蛋白或权利要求47-64中任一项的组合物的药物组合物。
114.权利要求112或113的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、或SEQIDNO:14的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
115.权利要求114的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8或SEQIDNO:12的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
116.权利要求115的方法，其中药物组合物包含含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的IL-22Fc融合蛋白。
117.权利要求112-116中任一项的方法，其中对对象共同施用至少一种额外的治疗剂。
118.权利要求112-117中任一项的方法，其中静脉内、皮下或腹膜内施用药物组合物。
119.加速或改善对象中创伤愈合的方法，所述方法包括对有需要的对象施用权利要求82-94中任一项的药物组合物。
120.加速或改善对象中创伤愈合的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的包含权利要求1-43中任一项的IL-22多肽，或IL-22Fc融合蛋白或权利要求47-64中任一项的组合物的药物组合物。
121.权利要求119-120的方法，其中创伤是慢性创伤或感染的创伤。
122.权利要求119-121中任一项的方法，其中对象患糖尿病。
123.权利要求122的方法，其中患糖尿病的对象具有II型糖尿病。
124.权利要求119-123中任一项的方法，其中创伤是糖尿病足部溃疡。
125.权利要求119-124中任一项的方法，其中施用药物组合物直到创伤完全闭合。
126.权利要求119-125中任一项的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列。
127.权利要求126的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
128.权利要求119-127中任一项的方法，其中对对象共同施用用于加速或改善创伤愈合的至少一种额外的治疗剂。
129.权利要求119-128中任一项的方法，其中静脉内、皮下、腹膜内或局部施用药物组合物。
130.权利要求129的方法，其中局部施用药物组合物。
131.预防或治疗心血管病况的方法，所述病况包括动脉粥样硬化斑块形成的病理学，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的权利要求82-88中任一项的药物组合物。
132.预防或治疗心血管病况的方法，所述病况包括动脉粥样硬化斑块形成的病理学，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的包含权利要求1-43中任一项的IL-22多肽或IL-22Fc融合蛋白，或权利要求47-64中任一项的包含IL-22Fc融合蛋白的组合物的药物组合物。
133.权利要求131或132的方法，其中心血管病况选自由冠状动脉疾病、冠状微血管疾病、中风、颈动脉疾病、外周动脉疾病和慢性肾病组成的组。
134.权利要求131或132的方法，还包括减慢动脉粥样硬化斑块形成的进展或预防动脉粥样硬化的标志。
135.权利要求134的方法，其中动脉粥样硬化的标志包括斑块聚集或血管炎症。
136.权利要求131-135中任一项的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列。
137.权利要求136的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
138.权利要求131-137中任一项的方法，其中对对象共同施用至少一种额外的治疗剂。
139.权利要求131-132的方法，其中对象已经被鉴定为处于发展出心血管病况的风险。
140.权利要求131-139中任一项的方法，其中静脉内、皮下或腹膜内施用药物组合物。
141.治疗代谢综合征的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的权利要求82-88中任一项的药物组合物。
142.治疗代谢综合征的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的包含权利要求1-43中任一项的IL-22Fc融合蛋白或权利要求47-64中任一项的包含IL-22Fc融合蛋白的组合物的药物组合物。
143.权利要求141-142的方法，还包括降低与代谢综合征相关的一种或多种风险因子，包括腹部肥胖、高血糖、血脂异常、和高血压中的一种或多种。
144.权利要求141-143的方法，还包括降低对象中细菌脂多糖(LPS)的水平。
145.权利要求141-144中任一项的方法，其中对象需要改变HDL/LDL脂谱。
146.权利要求141-145中任一项的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列。
147.权利要求146的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
148.权利要求141-147中任一项的方法，其中对对象共同施用至少一种额外的治疗剂。
149.权利要求141-148中任一项的方法，其中静脉内、皮下或腹膜内施用药物组合物。
150.治疗急性内毒素血症、败血病，或二者的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的权利要求82-88中任一项的药物组合物。
151.治疗急性内毒素血症、败血病，或二者的方法，所述方法包括对有需要的对象施用治疗有效量的包含权利要求1-43中任一项的IL-22Fc融合蛋白或权利要求47-64中任一项的包含IL-22Fc融合蛋白的组合物的药物组合物。
152.权利要求150或151的方法，其中对象需要改变HDL/LDL脂谱。
153.权利要求150-152中任一项的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含选自由SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12和SEQIDNO:14组成的组的氨基酸序列。
154.权利要求153的方法，其中IL-22Fc融合蛋白包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
155.权利要求150-154中任一项的方法，其中对对象共同施用用于治疗急性内毒素血症、败血病，或二者的至少一种额外的治疗剂。
156.权利要求150-155中任一项的方法，其中静脉内、皮下或腹膜内施用药物组合物。
157.权利要求95-156中任一项的方法，其中对象是人。
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