CN1069641C

CN1069641C - 一种清洁纯化紫杉醇的方法

Info

Publication number: CN1069641C
Application number: CN 98121946
Authority: CN
Inventors: 陈建民; 邓名莉; 郑志坚; 王康跃; 鲍余钦
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 1998-10-10
Filing date: 1998-10-10
Publication date: 2001-08-15
Anticipated expiration: 2018-10-10
Also published as: CN1222518A

Abstract

本发明是一种纯化紫杉醇粗产物，清洁制备精产品的方法。该方法使用填充色谱柱，常压下经梯度淋洗含10～48%紫杉醇的粗产品，以50～300目硅胶填充制备的色谱柱，用无毒性的正构烷烃(正戊烷～正辛烷)、乙酸酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯)为淋洗剂，常压下分离纯化紫杉醇。淋洗后的溶液经旋转蒸发回收溶剂，溶液浓缩后的分段产物经真空冷冻干燥，获得99.5%～99.9%的紫杉醇。该方法工艺简单，成本低，纯化过程无污染，溶剂、淋洗剂可以回收，便于工业化生产。

Description

一种清洁纯化紫杉醇的方法

本发明是一种清洁纯化紫杉醇的方法。

紫杉醇是一种具有广谱抗癌活性的天然有机化合物。1971年Wani(JAmer.Chem.Soc.,1971,93,2325)等首次报道从印度短叶红豆杉(Taxuobrevifolia)中分离得到了紫杉醇，并且确认紫杉醇对肺癌、肝癌、乳房癌细胞及其它肿瘤细胞具有广泛的强杀伤作用，副作用非常小。它的分子式为C₄₇H₂₁NO₁₄，分子结构如下：

1979年Schiff等(Nature,1979,277,665)确认紫杉醇药理作用机理独特，既能促进微管蛋白的聚合，又能稳定微管不致解聚。1983年美国食品和药品署(FDA)批准进入Ⅰ期临床，目前已进入第Ⅲ期临床试验，被认为是近20年来发现的最有希望的抗癌药。

紫杉醇的来源极为有限。它是从紫杉科树木的树皮中提取和纯化来的，树皮中含量约40～160mg/kg。该树种生长极为缓慢，通常一棵百年老树的树干直径约6英寸，每棵树上一般只能剥取2.5kg的树皮。提取25kg的纯紫杉醇提供1万2千例癌症患者临床试验，相当于需要3万棵紫杉树的树皮。美国、加拿大、印度等国家有紫杉树自然资源，我国东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yunnanensis)和美丽红豆杉(T.chinensis var.mairei)的树皮、树干和杉叶中均含有紫杉醇，但含量较低。为了获取紫杉醇的来源，保护稀少树种，国外开展了红豆杉树的矮壮化及组织培养法，还有半合成及全合成紫杉醇的工作。然而。由于培养法每天仅获得纳克级的量，全合成得率较低，成本巨大，难以商业化。因此，从树中提取紫杉醇，特别是尽可能全部提取出紫杉醇，是目前唯一的、商业化的方法。

常用的分离和纯化步骤为使用甲醇或95％乙醇浸提树皮，除去溶剂，得浸膏用水溶解，脱脂后用二氯甲烷或三氯甲烷萃取；萃取组分浓缩后，经色谱层析得到紫杉烷类化合物的单体或混合物。使用浸提法从树皮中提取紫杉醇粗产物较为容易，但是将10～48％的粗产品直接纯化得到99.5～99.9％的精产品技术难度较大。另外，溶剂或淋洗剂不经回收直接排放，造成严重的环境污染。

Senilh(J.Natural Products,1984,47,131)等从欧洲杉(Taxul bacata)提取紫杉醇使用如下步骤：

(1)用乙醇萃取树皮，浓缩；

(2)在水和二氯甲烷中分配；

(3)“过滤”色谱法分离；

(4)硅胶柱色谱分离；

(5)氧化铝色谱分离；

(6)中压硅胶柱色谱分离；

(7)制备HPLC分离。

Polysciences Inc.从T.brevifolis树皮中分离紫杉醇：

(1)甲醇或乙醇萃取树皮，混合萃取后浓缩除去大部分醇；

(2)浓缩液用二氯甲烷萃取，萃取质浓缩干燥至粉末；

(3)粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；

(4)含有紫杉醇的滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱

过滤；

(5)从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；

(6)结晶的紫杉醇进一步在硅胶柱中分离，该步中，最相似的产物

cephalomannine从紫杉醇中分离出来；

(7)从柱中流出的紫杉醇再结晶二次；

(8)未分离的混合物和其它溶质，循环处理得到纯紫杉醇。

Miller(J.Org.Chem.,1981,46,1469)采用下列步骤：

(1)用甲醇萃取Taxus wallichiana树根、树干、树叶，浓缩萃取液至固体；

(2)在水和己烷中分配；

(3)用氯仿萃取，然后浓缩；

(4)硅胶柱色谱法；

(5)二次硅胶柱色谱法；

(6)逆流分配法；

(7)二次逆流分配法；

(8)制备H-PLC分离纯化。

使用正相硅胶柱色谱法从Ornamental yew(Taxus Xmedia Hicksii)中提取(usp.5,279,949)：

(1)用70％乙醇萃取鲜叶；

(2)萃取物中活性炭脱色后过滤；

(3)萃取质浓缩除去大部分有机溶剂；

(4)水溶性组分离心与含紫杉醇的沉淀固体分离；

(5)固体进入正相硅胶柱色谱分离：

(6)二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇组分；

(7)反相色谱最后纯化。

Caster等(usp.5,440,055)用超临界法，同时使用N₂O、CO₂、C₃H₈、Freon-22或CHClF₂等作为超临界气体，提取紫杉醇。

Rao等(usp.5,380,916,1992)使用臭氧处理分离后的紫杉醇得纯紫杉醇(同时参见WO92/07842)。

1998年3月Durand等(usp.5,723,635)发明了利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇的方法。该方法使用一个色谱柱可以良好地从粗物质中分离纯化紫杉醇，一次处理量大：

(1)在制备柱规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗处理物；

(2)从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；

(3)在洗脱的柱子中回收紫杉醇和相似物；

(4)使用臭氧纯化最终产物。

上述诸多分离纯化方法，包括结晶法，高压正相色谱法，高压反相色谱法，离心分配色谱法和超临界萃取法等均需要高压、真空或超临界状态下进行，产品纯度仅在99％，主要杂质是cephalomannine，很难分离；制备高纯度的紫杉醇，还需要用臭氧或四氯化铯等处理；溶剂、淋洗液未回收，造成环境污染。

本发明的目的是建立一种工艺方法简单、纯化过程中无污染、淋洗液或溶剂可回收再使用、便于工业化且能得到高纯度紫杉醇的方法。

本发明使用市售10～48％紫杉醇产品为原料，正构烷烃、乙酸酯、分析用乙醇、乙腈等试剂均为分析纯，经蒸馏后使用。分析用甲醇为高效液相色谱纯，水为二次重蒸水，硅胶、活性炭纤维为分析纯。原料及产品分析使用的高效液相色谱仪为美国Beckman公司生产，110B双泵进样。128二极管振列检测器或126紫外检测器，4.6×250mmC₁₈色谱柱，流速为1.0ml/min，进样量为3μl。奔腾ⅡMMX266计算机控制高效液相色谱分析操作。Sbsz-Ⅰ型旋转蒸发仪，KLG-Ⅱ型冷冻干燥机，CS501-SP超级数显校温器，WZZ-2A自动旋光仪，WKS-1A数字熔点仪。质谱分析在美国CE&A公司生产的TOF-2000MIP飞行时间二次离子质谱仪上进行，电子能量15kev，荷质比m/e在0～1000范围内扫描。液-质连谱分析在美国惠普HP1100-MS上进行，Zorbax2.1×100mmC₁₈色谱柱，5μm，流速为0.3ml/min，进样量为5μl,APES源，传输电压为70伏，扫描范围为m/z在200～1200之间。

本发明在纯化紫杉醇之前，需自装色谱柱。人工装柱加入硅胶填料时敲打柱子使其均匀装入，装好后的柱子柱内填料应无明显的断层或裂纹。紫杉醇粗产物溶于乙酸酯后，倒入色谱柱，加入正构烷烃、乙酸酯及其混合物梯度洗脱，各梯度溶剂和混合溶剂比例是：正构烷烃(100％)、正构烷烃∶乙酸酯(4∶1～2)、正构烷烃∶乙酸酯(1∶1～4)、乙酸酯(100％)。

市售紫杉醇粗产品纯度是10～48％，将其配制成紫杉醇浓度是2.5～10％(wt％)的乙酸酯溶液待纯化用，浓度太稀纯化效率不高，浓度太大纯化效果不好。

梯度淋洗用溶剂正构烷烃是正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷，乙酸酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯。

为提高纯化纯化效率，纯化用色谱柱长30-80cm，柱直径2.0～8.0cm为好。为使纯化后产品不带杂色，本发明用色谱柱上端装有25～35％硅胶体积的活性炭纤维，装柱时硅胶从柱上端口加入，柱的下端有聚四氟乙烯活塞，活塞下端为垫一层纤维玻璃的4#砂芯层，将硅胶装完后，最后装活性炭纤维，硅胶和活性炭纤维尺寸大小分别是50～300目和100～200目。

硅胶和活性炭纤维装柱前经90～120℃烘干活化1-3天，使其充分干燥，以去除吸附的过量水分。

紫杉醇粗产物经LC-MS的高效液相色谱分析(如图1)，在保留时间39.838、59.844、61.636、65.884min处分别检测出主要产物，0.976min处为进样峰。在位LC-MS的质谱分析表明(如图2)，61.636min的产物流入质谱仪后，在61.800min出得到质谱信号。使用API-ES正离子源，质谱数据为854.3，说明质量为853.3。使用Beckman生产的高效液相色谱仪及4.6×250mmC₁₈色谱柱，分析紫杉醇粗产物(如图3)，分别在18.00、29.10、34.39、36.05min处测出主要产物，2.24min处为进样峰。与标准紫杉醇出峰时间相对照，表明36.05min处为紫杉醇。使用面积归一法和内标法测得其含量为48.10％。

收集各段淋洗液，Ⅰ～Ⅳ经旋转蒸发浓缩，馏出的溶剂或淋洗液精馏后可反复使用，避免直接排放造成污染。浓缩液经-40℃真空冷冻干燥，分离得到淋洗液Ⅰ～Ⅵ中各种化合物。高效液相色谱分析与粗产物各组分相对照，Ⅰ～Ⅱ中不含紫杉醇，Ⅲ中含约l％的紫杉醇，Ⅳ中含99.5～99.9％的紫杉醇(高效液相色谱分析结果如图4所示)，对产物Ⅳ的质谱分析表明，其质量为853.4，见图5。分离得到的紫杉醇为白色结晶状粉末。熔点为215.4～215.6℃，旋光度为-49°(甲醇溶液中)。

分离得产物后，从柱中取出的硅胶及活性炭纤维经250～350焙烧1至3天，可反复使用，降低了制备成本。

本发明的清洁纯化紫杉醇粗产物的方法主要设备和试剂是填充色谱柱和淋洗液。常压下经梯度淋洗含10～48％紫杉醇粗产品后，经回收淋洗液及溶剂，冷冻干燥可得到99.5～99.5％的紫杉醇。工艺简单，淋洗液无霉易回收，与现有紫杉醇的纯化方法相比，具有成本低，纯化过程无污染，溶剂和淋洗液可以回收，便于工业化生产等诸多优点。

图1粗原料的LC-MS高效液相色谱图图2粗原料的LC-MS质谱图图3粗原料的Beckman仪的高效液相色谱图图4组分Ⅵ的Beckman仪的高效液相色谱图图5组分Ⅵ的TOF-SIMS质谱图

实施例1：

称取100～200目硅胶225克和50～100目活性炭纤维10克，在马福炉中110℃烘干活化48小时后，人工填充于60cm长、柱φ2cm的柱子。柱子下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端为垫一层0.5克玻璃纤维的4#砂芯层。称取2克48％紫杉醇粗产物，溶于40ml乙酸甲酯，倒入层析色谱柱。依次加入300ml己烷(100％)、200ml己烷∶乙酸甲酯(4∶1)、600ml己烷∶乙酸甲酯(1∶1)、600ml乙酸甲酯(100％)，分别得到馏分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。77℃下分别旋转蒸发组分Ⅰ-Ⅳ，得到的浓缩组分经-40℃、10^-2τ下干燥40分钟。经真空干燥处理后的组分Ⅳ为白色粉末，经高效液相色谱分析为99.9％紫杉醇，熔点为215.6℃，旋光度为-49°(甲醇溶液中)。

实施例2：

称取100～200目硅胶280克和50～100目活性炭纤维10克，在马福炉中110℃烘干活化48小时后，人工填充于80cm长、柱φ3cm的柱子。柱子下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端为填充0.5克玻璃纤维的4#砂芯层。称取3.0克10％紫杉醇粗产物，溶于35ml乙酸乙酯，倒入层析色谱柱。依次加入600ml庚烷(100％)、400ml庚烷∶乙酸乙酯(2∶1)、400ml庚烷∶乙酸乙酯(1∶1)、300ml乙酸乙酯(100％)，分别得到馏分Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ。87℃下旋转蒸发组分Ⅴ-Ⅷ，得到的浓缩组分经-40℃、10^-2τ下干燥40分钟。经真空干燥处理后的组分Ⅷ为白色粉末，经高效液相色谱分析为99.5％紫杉醇，熔点为215.4℃，旋光度为-49°(甲醇溶液中)。

实施例3：

实施例1和2中旋转蒸发收集的溶剂及淋洗液经1万塔板数精馏分别回收己烷、乙酸甲酯、庚烷、乙酸乙酯，该精馏后的溶剂可反复使用。使用后的硅胶及活性碳纤维从柱中取出分开收集，在马福炉中110℃下烘干5小时，然后升温至300℃焙烧48小时。该方法处理的硅胶及活性碳纤维，可反复使用。

Claims

1、一种纯化紫杉醇的方法，采用硅胶填充的色谱性，进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，蒸发、浓缩并干燥，其特征在于：将待纯化的粗产物溶于乙酸酯，配制成紫杉醇浓度为2.5～10wt％的溶液装柱，洗脱溶剂的加入顺序是正构烷烃、4∶1～2的正构烷烃：乙酸酯、1∶1～4的正构烷烃：乙酸酯、乙酸脂，所述正构烷烃是正戊烷、正己烷、正庚烷或正辛烷，乙酸酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯。

2、根据权利要求1所述的纯化紫杉醇的方法，其特征是：色谱柱长30～80cm，柱直径2.0～8.0cm，色谱柱中除了填充硅胶外，其上端填充有2～5％体积量的活性炭纤维，硅胶是50～300目，活性炭纤维是100～200目。

3、根据权利要求1所述的纯化紫杉醇的方法，其特征是色谱柱用填充硅胶和活性炭纤维在装柱之前在90～120℃温度下烘干活化1～3天。

4、根据权利要求1所述的纯化紫杉醇的方法，其特征是色谱柱中使用过的硅胶和活性炭纤维在250～350℃下加热活化1～3天，可再生使用。