CN107635578A - 抗前‑bcr拮抗剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了前‑B细胞受体(前‑BCR)拮抗剂的鉴定和前‑BCR拮抗剂作为靶向治疗的用途。组合物和方法通常涉及包含前‑B细胞受体(前‑BCR)拮抗剂，并且被工程化以作为T细胞嵌合受体表达的组合物。在一些实施方案中，前‑BCR拮抗剂可以包括抗前‑BCR抗体。

Description

抗前-BCR拮抗剂和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月5日提交的美国临时专利申请系列号62/112,339的优先权，其通过引用并入本文。
序列表
本申请包含作为ASCII文本文件，通过EFS-Web电子方式提交给美国专利和商标局的序列表，其标题为“2016-02-05-SequenceListing_ST25.txt”，大小为4KB，于2016年2月5日创建。由于序列表的电子提交，电子提交的序列表同时用作37 CFR§1.821(c)所要求的纸质副本和§1.821(e)所要求的CRF。序列表中包含的信息通过引用并入本文。
发明内容
在一个方面，本公开描述了包含针对前-B细胞受体(前-BCR)的拮抗剂的组合物。
在一些实施方案中，拮抗剂可以衍生自特异性结合前-BCR的替代轻组分(VpreB，λ5)的抗体。
在一些实施方案中，抗体可以包括单价抗体片段，例如scFv或Fab-Fc。在一些实施方案中，抗体可以是重组的，和/或经工程化以递送毒素有效载荷。在一些实施方案中，抗体可以被人源化。在一些实施方案中，抗体可以包括抗VpreB抗体，例如抗VpreB1抗体。
在一些实施方案中，针对前-BCR的拮抗剂可以包括被工程化以作为T细胞嵌合受体表达的抗体片段。
在一些实施方案中，针对前-BCR的拮抗剂可以包括阻断前-BCR与半乳凝素结合的肽或抗体衍生物，无论是溶解的还是存在于基质细胞的背景中。
在另一方面，本公开描述了一种药物组合物，其包含上面概述的组合物的任何实施方案和药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开描述了一种治疗B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)的方法。通常，该方法包括以有效改善BCP-ALL的至少一种症状或临床病征的量向具有BCP-ALL的受试者施用上面概述的药物组合物的任何实施方案。
在另一方面，本公开描述了包括上面概述的组合物的任何实施方案的药剂盒。
本发明的上述概述不旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每个实施。下面的描述更具体地举例说明了说明性的实施方案。在整个申请的几个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作一个代表性的组，并且不应被解释为排他列表。
附图简述
图1. 前-BCR及其早期信号传导配偶体Lyn和Syk。
图2. A)使用Fab缀合的量子点(QD655，QD585)进行前-BCR寡聚动力学的2-色跟踪。B)使用FPLC大小排阻色谱法(Superdex 75 10/300)从二价片段(级分B)分离α-Igβ Fab(级分C)。C)考马斯染色凝胶，表明来自FPLC的级分C中的Fab的产率。D)通过蛋白质印迹用链霉抗生物素蛋白-HRP检测的生物素化Fab片段的纯化。
图3. A)使用MODELLER算法构建了几种不同的基于生物抗体或肽同源性模型。基于离散优化蛋白质能量(DOPE)得分选择最佳候选者。B)基于由前-BCR X射线结构(pdb代码：2H32)构建的模型，将同源性模型蛋白质对接(即ZDock算法)到推定的前-BCR。C)同样，同源性建模和分子对接提供了对破坏前-BCR/半乳凝素-1相互作用(pdb代码：2LKQ)的拮抗剂的洞察。D)使用GROMOS或AMBER力场，将构建的模型放置在填充有显性溶剂并经受能量最小化、NVT/NPT系综和生产MD(即受控分子动力学，伞形采样)的模拟箱中，以在不同设计的前-BCR调节剂之间比较自由能结合。
图4. 使用与工程化替代物或λ5轻链变体配对的IgG重链测试VpreB结合特异性。
图5. A)显示抗VpreB1 Fab结合至活的前-B ALL细胞(697细胞系)的数据。B)完整的抗VpreB IgG的内在化是缓慢和剂量依赖的。C)显示完整的Alexa 647缀合的VpreB IgG与活细胞的亚纳摩尔结合的数据。
图6. 显示白血病细胞的抗-VpreB1 IgG调理作用支持体外人NK细胞杀伤(ADCC)，并且是剂量依赖性的数据。A)BCP-ALL细胞的NK介导的杀伤(来自Promega的Cytotox 96®非放射性细胞毒性测定)。B)BCP-ALL细胞的NK介导的杀伤(细胞成活力的7AAD流动测定)。
图7. 治疗性抗体及其衍生物的临床前研究在BCP-ALL的异种移植模型中进行。
图8. 基于CD79a ITAM或Syk的磷酸化以及BCL6表达的前-BCR信号传导的蛋白质印迹分析。A)使用大的(bulky)抗VpreB Fab(5μM)将前-BCR同二聚化界面阻断30分钟，在过钒酸盐存在下减少磷酸-CD79a(Y182)和磷酸-Syk(Y352)的积累。B)用抗VpreFab处理24小时消除BCL6的表达。C)用Bay-61-3606和/或达沙替尼孵育697细胞导致在过钒酸盐存在下磷酸化CD79a(pY182)和Syk(pY352)的积累减少。D)达沙替尼处理24小时抑制BCL6的表达。用3-a-氨基胆甾烷(3AC)抑制SHIP-1也导致24小时后BCL6水平的降低，而Jak抑制剂托法替尼导致BCL6蛋白水平升高。E)用3AC处理30分钟，在过钒酸盐存在下增强磷酸-Syk的积累；托法替尼在相同条件下对Syk磷酸化没有影响。
图9. 前-B ALL细胞表面上的前-BCR二聚化的直接证据。A)基于前-BCR晶体结构(pdb代码：2H32)，链霉抗生物素蛋白(pdb代码1STP)和估计的QD半径，相互作用距离估计的实验模型。B)时间推移图像序列(20帧/秒)表示2至15秒的时间内连续接合(serialengagement)。C)从具有分离距离(作为观察参数)的隐马尔科夫模型得出的两个QD相互作用之间最可能的状态(二聚体，结构域，游离)的Viterbi图。D)抗Igβ Fab-QD655(顶线)和Fab-QD585(底线)的双通道3D轨迹显示在15秒内重复连续接合的两个受体，且在分离到采集结束之前相关运动的几个实例。E，F)分别在100nm和200nm处用697(左)和Nalm6(右)细胞系见到的作为分离距离的函数的位移(顶线，跳跃幅度)和不相关运动程度(底线)的显著下降。G，H)HMM确定状态(游离和二聚体)之间的状态特异性扩散显示在二聚体状态下细胞系中的扩散减少。(I，J)二聚体寿命分布与估计的离解速率(off-rate)，分别由具有100nm和300nm的相互作用距离和结构域大小的HMM模型预测。
图10. 半乳凝素-1稳定二聚化并促进高阶复合物的形成。A)标记的半乳凝素-1(红色)和前-BCR(绿色)的结合。箭头表示聚类形成和与前-BCR的共定位。B，C)用10mM乳糖处理阻断半乳凝素-1的糖结合结构域在不同分离距离处显示出不相关的跳跃距离的位移和不同抗Igβ探针的跳跃幅度的明显差异。D)在半乳凝素-1处理中与10mM乳糖进行孵育导致前-BCR扩散的总体增加。E)用原钒酸钠加H2O2处理697细胞阻断磷酸酶的组成活性，以在增强信号传导(tonic signaling)条件下(用单独过钒酸盐处理10分钟，20分钟或30分钟)增进磷酸-Syk(Y352)的水平。通过用半乳凝素+/-乳糖处理，而不是单独使用半乳凝素，增加了在过钒酸盐存在下磷酸-Syk Y352的积累。
图11. 对前-BCR扩散和二聚化的系综测量的VpreB Fab和半乳凝素处理的比较。A)总体均方位移(MSD)值显示相对于增强信号传导(中间线)的抗VpreB Fab(1μM，顶线)的前-BCR扩散显著增加，表明二聚体破坏。相比之下，用半乳凝素-1(10μM，底线)的前-BCR交联10分钟显著减慢受体扩散。B)在各种处理条件下从单个序列文件收集的扩散系数的分布中可以看出明显的差异。C)用抗VpreB Fab(1μM)进行10分钟处理破坏了前-BCR同型相互作用，如与增强信号传导(中线)相比较，通过两个探针之间的短分离距离的不相关的跳跃距离(左侧，顶线)和跳跃幅度(右侧，顶线)没有下降所证明的。相比之下，用10μM半乳凝素-1处理10分钟促进了前-BCR聚集，如相对于增强信号传导，通过较大的分离距离的不相关的跳跃距离(左侧，底线)和跳跃幅度(右侧，底线)的急剧下降所证明的。
图12. A)单独或与低剂量长春新碱(10 ng/ml)组合时，用α-VpreB Fab(5μM)长时间孵育697细胞适度地增强凋亡。B，C)当与长春新碱组合施用细胞可渗透激酶抑制剂(达沙替尼，Bay-61-3606，托法替尼，3AC)时，在697细胞中观察到增强的凋亡。
图13. A)对697和Nalm6细胞以及来自两个BCP-ALL患者(＃238，＃280)的原代细胞上代替轻链组分VpreB和信号传导亚单位Igβ/CD79b的表面表达的基于流式细胞术的分析。B)从两个细胞系和原代细胞上的每个50秒获取序列的系综MSD得到的前-BCR扩散系数的比较。C)用lyn(达沙替尼)或Syk(Bay-61-3606)而不是Jak(托法替尼)的抑制剂处理697细胞导致相对于增强信号传导的前-BCR扩散的全面增加。D)用抗VpreB Fab(5μM)处理后，患者＃280细胞中观察到前-BCR扩散的增加。
图14. 显示前-BCR信号传导有助于某些BCP-ALL母细胞的存活的数据。显示患者＃280的数据。A)单独或与0.1 ng/ml至100 ng/ml的剂量的长春新碱组合，用达沙替尼(10μM)长时间孵育后，细胞凋亡(膜联蛋白标记)和细胞活力丧失(7AAD标记)增加。B)单独或与低剂量长春新碱(10 ng/ml)组合，用α-VpreB Fab(5μM)孵育＃280患者细胞24小时后细胞凋亡增加。C，D)用α-VpreB Fab、达沙替尼或3AC处理患者＃280细胞24小时导致BCL6水平明显下降。
说明性实施方案的详细描述
B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)是儿童常见的肿瘤，并且是青少年和青年的侵袭性疾病。BCP-ALL的总体生存率从20世纪60年代的10％逐渐提高到目前的90％左右。然而，选择患者亚组似乎没有受益于风险适应的强化治疗，因而需要采用完全新颖的治疗方法。因为用常规治疗，高风险白血病的结果似乎已达到平台，所以对毒性较小的治疗的需求已经变得更大。
本文所述的治疗策略和方法使用抗前-B细胞受体(抗前-BCR)拮抗剂，例如抗前-BCR抗体。BCP-ALL的强化细胞毒性治疗几乎普遍导致免疫抑制，从而导致随机会性感染发生的并发症。这些感染可能夺走2％至5％的新诊断的患者以及在复发情况中治疗的患者的20％或更多的生命。特别地，感染是婴儿致死和唐氏综合征病例的原因。因此，本公开描述了促进和保护适应性免疫系统的现有成熟B细胞组分，而不是消除其保护作用的治疗策略。
因为健康的正常T细胞和B细胞常常处于G0/G1期静息状态，并且因此较少暴露于化疗诱导的细胞损伤，所以可能在后期治疗中恢复健康的免疫功能。这些治疗阶段包括巩固临时维持(Consolidation Interim Maintenance)和维持阶段，其中骨髓恢复和免疫功能回到接近正常状态。本公开描述了前-B细胞受体(前-BCR)作为治疗靶标的用途和开发基于拮抗剂的方法作为靶向治疗。这些策略针对最小残留疾病(MRD)，同时保护成熟B细胞，因此有利于功能性免疫应答，以控制否则在BCP-ALL患者中造成重大死亡风险的机会性感染。
图1示出了前-BCR的结构特征，其通常包括膜Ig重链(表面μ)，替代轻链(CD179a，CD79b)和Igα和Igβ信号传导亚单位(CD79a，CD79b)。Igα和Igβ在其细胞质尾部各自带有一个ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)。在受体聚集后，ITAM被src家族酪氨酸激酶(Lyn)磷酸化，然后形成脾脏酪氨酸激酶(Syk)的双SH2结构域的结合位点。Syk的招募涉及传导正向的下游信号，调节细胞命运决定。在正常的B细胞发育过程中，来自前-BCR的增强信号传导允许通过原-B细胞-前-B细胞检查点的进展，和组装完全功能性B细胞受体所需的IgL基因重组过程的完成。来自前-BCR的增强信号传导被认为是配体非依赖性的，并由替代轻链组分的自身低聚化介导。在BCP-ALL细胞中，前-BCR之间的这些同型性相遇可能是短暂的但频繁的，即产生有助于对化疗挑战的抵抗的促生存信号。
可以通过可溶性和基质结合的半乳凝素的更稳定的交联来增强前-BCR信号传导。半乳凝素涉及几种血液恶性肿瘤，特别是MLL重排的BCP-ALL，其中LGALS1的表达与不良结果相关。半乳凝素家族成员是二价或五价的；当它们以可溶形式结合受体靶标时，该特征介导交联。因为半乳凝素可以结合基质元件，它们也可能在微环境(microenvironmentalniche)中发挥作用，以支持对治疗和MRD的抵抗。在基质母细胞突触处半乳凝素介导的前-BCR“聚类”可能是非常强的刺激。
本文描述的治疗策略利用前-BCR参与B细胞发育的早期阶段。抗前-BCR拮抗剂(例如，抗体)的鉴定可以利用允许针对特异性结合前-BCR的人抗体而筛选大噬菌体文库的技术。(Sea Lane Biotechnologies，LLC，Mountain View，CA)。取决于它们的表位特异性，这些试剂可以阻断同二聚化和/或半乳凝素结合。当这种特异性被工程化到修饰的人IgG时，可以开发治疗性抗体，其能够1)募集免疫效应细胞，2)阻断信号传导和/或3)递送有效负载。或者，嵌合受体可以由T细胞受体或包含用于在T细胞中表达的ITAM(基于免疫酪氨酸的激活基序)的其它信号传导受体构成，作为T细胞介导的免疫治疗的手段。
相对于目前的免疫疗法(例如抗CD19，抗CD22和/或抗CD19-CAR)使用抗前-BCR抗体的一个优点是使用抗前-BCR抗体可以在患者中节省成熟的B细胞，用于对机会性感染的功能适应性免疫。
对于对Syk，BTK，PI3K和Jak2有选择性的激酶抑制剂的敏感性，筛选BCP-ALL细胞系和患者母细胞。Syk和PI3K抑制剂在所有测试的患者样品中诱导细胞死亡，而Jak2抑制剂阻止细胞周期中的前-B细胞。Syk和PI3K抑制剂的作用与在白血病母细胞中组成型产生增殖和促存活的信号传导的前-BCR一致。由于这些激酶在大多数白细胞中的重要性，直接靶向前-BCR可以提供更高特异性的治疗，这可以进一步保护婴儿和儿童的正常免疫细胞功能。
单分子跟踪已经成为直接观察和测量细胞膜中的蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏方法。图2A说明了该技术如何允许人们测量前-BCR同型聚集动力学的频率和寿命。产生抗CD79b单克隆抗体的稳定Fab片段(图2B和图2C)，其可以靶向Igβ的细胞外结构域(图2B)。Fab已经用生物素标记，用于与抗生物素蛋白-量子点(QD)缀合，这是一个需要仔细滴定以确保1:1化学计量的步骤，其是确保QD探针保持单价所需要的。
然后将明亮荧光QD添加到成像室中的活细胞的培养基中，其中它们结合细胞表面前-BCR并允许实时跟踪稀疏标记的受体之间的相互作用。图9表明前-BCR在活的BCP-ALL细胞上参与同型相互作用，并且这些相互作用是高度动态的。
图9A提供了通过单粒子跟踪(SPT)观察前-BCR二聚化的策略的详细说明。图9B示出了在活的697细胞(来自BCP-ALL患者的细胞系(Findley等人，1982，Blood 60：1305-1309))的表面上实时捕获前-BCR二聚化的SPT成像的实例。该对在8-20秒之间的间隔中解离和重新结合数次，然后它们在细胞表面的分开方向作为单体扩散离开。图9C中的Viterbi图报告了这两种受体随时间的状态特异性转变，如以前详细描述的隐马尔可夫模型(HMM)所定义的(Low-Nam等人，2011，Nat Struct Mol Biol 18：1244-1249)。对于该对，同型相互作用寿命短(<3秒)。
图9D中的3D图示出了图9C所示的相同的前-BCR二聚体对的另一视图。3D图示出了每个抗Igß Fab-QD探针随时间的相对X和Y位置。基于它们的极其接近度和相关运动，两个前-BCR在成像开始时被二聚化。它们在大约10秒钟的解离是显而易见的，随后是很短的重新接合，然后在图像采集期结束时，在分开的方向上解离和扩散。
图9E和9F中的曲线提供额外的证据表明，前-BCR在活细胞上经历同型相互作用。这通过不相关的运动(底线)和跳跃幅度(顶线)的特征性下降作为紧密分离距离的函数来证明。对697细胞(图9E)以及Nalm6细胞进行这些分析(图9F；Hurwitz等，1979，Int JCancer 23：174-180)。这些数据提供了统计学上严格的验证，即在两个不同的BCP-ALL细胞系的表面上经常发生前-BCR二聚化。不相关的跳跃距离的急剧下降在150nm和200nm之间开始，潜在地表明前-BCR形成链和较大的同型寡聚体。两种细胞系的BCP-ALL细胞表面标志物的细胞遗传学和表达见表1。
表1. 前-ALL细胞系的特征
图9G和9H中的数据比较两种细胞系表面上前-BCR单体和二聚体的相对迁移率。在游离状态(顶线)中，前-BCR具有相对快的扩散系数(在697细胞上为0.16 μm2/sec，在Nalm6细胞上为0.12 μm2/sec)。相比之下，前-BCR相互作用对的扩散速率(在它们自缔合时仅在间隔期间表示跳跃分布)显著较慢，在697细胞上为0.059 μm2/sec，在Nalm6细胞上为0.015。使用抗Igβ或抗-mIgμ QD探针，对于这些细胞上的前-BCR计算的平均均方位移(MSD)值(即不是状态特异性的)是相似的。697和Nalm6细胞中前-BCR扩散的平均MSD值分别为0.129 μm2/sec和0.09 μm2/sec。这些数据至少由于两个原因是重要的。首先，数据提供了前-BCR同型相互作用发生的确定的证据。第二，数据显示，这些相互作用是基于其解离的随机过程而动态的，导致表示数据集内的所有结合和去结合事件的二聚体寿命的特征性范围(图9I和图9J)。
虽然前-BCR缺乏经典的“配体”，但它们可以通过结合到替代轻链组分而聚集它们的蛋白质来激活。这在图10A中示出，其显示697细胞与Alexa 555缀合的半乳凝素-1(红色)的孵育导致在5分钟内明显聚集前-BCR(绿色)。合并的图像显示了这些聚簇中半乳凝素-1和前-BCR的显著共定位(黄色)。对于这些实验，以10μM的浓度使用半乳凝素-1，因为在该浓度下，可溶性半乳凝素-1在二聚体状态下应至少为90％。使用抗Igβ Fab-QD探针进行单点跟踪，以评估半乳凝素-1对前-BCR扩散的影响。图10B和图10C显示在半乳凝素-1处理的697细胞表面上的前-BCR的跳跃幅度和不相关运动二者的显著下降。大部分的前-BCR变得基本上不能移动(图10D)。
与半乳凝素-1结合的前-BCR的明显减缓可以至少部分归因于与其它糖蛋白的糖介导的网格(lattice)。这在图10的数据中示出，来自在过量乳糖(10mM)存在下阻断半乳凝素-1的凝集素结合位点进行的实验。在这些条件下，观察到扩散受体的较大的总跳跃分布(顶线，图10B)和相关运动开始的较短的相互作用距离(底线，图10C)。在乳糖存在下，半乳凝素1交联的前-BCR的总体扩散明显更快(图10D)，在增强信号传导条件下接近前-BCR的值。
此外，如果例如抗体也有效地阻断半乳凝素结合以及随之发生的前-BCR激活，则靶向前-BCR的拮抗剂(例如，抗VpreB抗体)可提供额外的优点。本公开具体包括在半乳凝素是可溶性二聚化配体的情况下或在基质细胞的背景下将半乳凝素提供给BCP-ALL细胞的情况下，阻断半乳凝素介导的前-BCR活化的前-BCR拮抗剂。
前-BCR结构的分子刺激可以形成设计阻断同型相互作用和/或半乳凝素介导的交联的前-BCR拮抗剂的基础。从广泛的靶向前-BCR或半乳凝素-1的生物调节剂的氨基酸序列开始，3D分子模型可以通过同源性建模构建(MODELLER, University of California SanFrancisco, San Francisco, CA; ROSETTA, Rosetta Commons.org)，使用来自具有高序列和/或3D同一性的高分辨率结构信息的坐标。然后可以通过评分算法，例如分散优化蛋白质能量(DOPE)得分，选择最佳候选者，图3A。然后可以将生物拮抗剂的最佳同源性模型用作分别对接(GRAMM-X，Tovchigrechko等人，2006，Nucleic Acids Res 34(Web Serverissue)：W310-314; ZDOCK，Pierce等，2014，Bioinformatics 30(12)：1771-1773)到半乳凝素-1(pdb：1W6O)或前-BCR(pdb：2H32)的建立的高分辨率NMR或X射线结构的基础，图3B-C。然后，这些构建的模型可以被并入具有周期性边界条件并被显性溶剂围绕的模拟箱(图3D)中，准备用于分子动态(MD)模拟。对于MD模拟，可以使用例如GROMACS软件(University ofGroningen, Groningen, Netherlands)，以及GROMOS和/或AMBER力场。分子模型用最陡下降算法进行能量最小化，并用适当的NPT / NVT系综平衡，以维持适当的生理压力、密度和温度。接下来，可以在纳秒至微秒的时间尺度上执行几种不同的生产分子动力学模拟技术，例如受控分子动力学(SMD)或伞形采样(US)，以建立相对的拉力和结合自由能。还可以测量其它信息，例如COM最小距离、均方根波动(RMSF)、均方根偏差(RMSD)、可接近表面积(SASA)和/或氢键合计数，以洞察发生的关键分子相互作用。可以选择用于测试抑制性分子(例如治疗性抗体)的能量上最有利的构象异构体(conformer)。
编码可溶性前-BCR样蛋白变体的一系列载体如下文更详细描述的那样进行工程化。(Sea Lane Biotechnologies，LLC，Mountain View，CA)。(图4)。这些形式包括天然三聚体前-BCR功能单元，包括与替代轻链组分配对的功能性人IgG1重链或与单个多肽链配对的全长人IgG1重链，该单个多肽链是VpreB1基因与λ5之间的基因融合的产物(融合1)。通过消除λ5N末端和VpreB1 C-末端的一个或两个肽延伸，构建变体多肽。所有产生的“Surrobodies”都通过在哺乳动物细胞中共转染分离自抗流感H5N1血凝素抗体的功能性人重链与前-BCR三聚体或其融合变体的组分而表达。此外，制备了含有与恒定λ融合的VpreB1的多肽(融合2)，以及含有与λ5融合的可变λ链的多肽(融合3)。
背景组合免疫库(Contextual Combinatorial Immune Repertoire，ConCIRT)合成文库针对重组Surrobody淘选，其包括与融合1形式的替代轻链配对的功能性抗流感H5N1血凝素重链。噬菌体淘选开始于ConCIRT文库的增殖。完整文库由超过100个独立的噬菌体展示子文库中排列的560亿完全人、合成构建的抗体组成。源自四个人种系VH基因(代表两个最大的人VH家族，VH1和VH3)的重链多样性与四个Vκ框架基因和五个Vλ框架基因配对。将与96孔微量滴定板上包被的靶蛋白结合的噬菌体洗脱并滴定。将所得洗出液扩增以用于随后的一轮淘选。四轮噬菌体淘选后，通过ELISA测定分析来自富集噬菌体库的各个克隆的特异性结合。
测试各克隆结合细菌表达的抗-PLGF Surrobody的能力，其中融合1构建体作为重链配偶体。为了评估所选克隆与VpreB1(SEQ ID NO：2)或λ5链的特异性结合，将抗流感重链与融合2或融合3配对。在用与融合2构建体配对的大肠杆菌来源的重链包被的ELISA板上进行VpreB1结合特异性的测试。对于λ5特异性结合，大肠杆菌表达的重链与融合3构建体配对。
通过用HRP缀合的抗-myc抗体检测来确定粗制细菌裂解物中的特异性命中(specific hit)。在阳性ELISA命中鉴定后，对特异性克隆进行测序。回收特异性识别VpreB1链蛋白(SEQ ID NO：2)的16种抗VpreB1独特抗体。这组特异性单克隆抗体对于重链和轻链二者使用不同的种系，使用κ和λ亚型二者，显示极大序列多样性。发现所有噬菌体衍生的抗体特异性识别VpreB1多肽(SEQ ID NO：2)。这组特异性单克隆抗体显示出极大序列多样性，其包括与κ和λ亚型的轻链配对的重链的四个不同VH框架。发现所有16种噬菌体衍生的抗体特异性识别替代轻链的VpreB1多肽(CD179a; SEQ ID NO：2)(表2)。
表2. 自ConCIRT抗体噬菌体文库分离的选择Fab命中的概述
人重链 人轻链(κ) 人轻链(λ)
VH1 4 3
VH3 5 4
这些抗体针对VpreB1内的前-BCR表位的具体识别是一个重要的发现。VpreB1与其它人Ig可变结构域共有低序列同源性，因此相对于识别λ5组分中的表位的抗体提供了优点，λ5组分与人Igλ恒定区共有高得多的序列同源性。与VpreB1链的结合确保了对恶性细胞上表达的前-BCR的有效和特异性结合，不与循环IgG分子结合，因此减少可能结合到循环的人Ig/λ分子上的治疗性mAb的衰弱和消除可能性。前导抗体的结合亲和力示于表3中。
表3. 抗人VpreB1 IgG与SgG的结合亲和力
图5中提供了抗前-BCR抗体与活的白血病细胞上的前-BCR结合的确认。图5中的结果提供了结合活的前B(697)细胞的抗VpreB1(Fab片段)的流式细胞术测量。将Fab片段在37℃下以800nM或1600nM的浓度孵育15分钟，随后用缀合至Alexa Fluor 647(LifeTechnologies，Grand Island，NY)的第二抗κ轻链进行15分钟室温处理。相对于用第二抗体对照处理的细胞，荧光强度有明显的变化。图5B和图5C中的结果显示完整的抗VpreB1 IgG也以亚纳摩尔亲和力结合，并以剂量依赖的方式内化到BCP-ALL细胞中。
制备所有16个Fab并测试其在ELISA测定形式中的相对结合亲和力。相对亲和力ELISA的标志是在平板上逐行使用包被的抗原浓度的梯度。估计该组Fab的亲和力范围为对于最高亲和力结合剂的0.85nM低至对于最低亲和力结合剂的250nM之间。
图11A中的数据显示抗VpreB1 Fab阻断前-BCR同型相互作用。数据报告为前-BCR的系综扩散系数(MSD)加和减抗-VpreB1 Fab的饱和水平(1μM)的变化。在这些实验中，在进行单粒子跟踪(SPT)之前，将Fab在37℃下加到697细胞中15分钟。用抗VpreB1 Fab单价阻断剂靶向前-BCR显著增加了前-BCR的总体扩散。图10B中的框图报告了总结发现，其中VpreBFab治疗导致不存在固定部分(D <0.05 μm2/sec)。为了比较，用半乳凝素-1处理后，前-BCR的移动性要低得多。
图11C中的曲线提供了在未处理细胞(中间，在增强信号传导条件下)对比用抗VpreB Fab(顶线)或半乳凝素-1(底线)处理的细胞的表面上对跟踪的前-BCR对的不相关运动和跳跃幅度的变化的总体比较。这些数据再次表明，可以通过针对替代轻链的单价阻断抗体来防止前-BCR自身缔合，而半乳凝素-1诱导大规模的前-BCR聚集。
图8中的结果评估抗VpreB Fab以及针对前-BCR下游信号传导配偶体Lyn、Syk和SHIP1(INPP5D)的抑制剂阻断来自前-BCR的增强信号传导的能力。如图8A所示，用抗VpreBFab处理细胞30分钟阻断了在过钒酸盐存在下磷酸-Igα(CD79a)ITAM和磷酸-Sik的积累。如图8B所示，BCL6表达在用抑制同型相互作用的抗VpreB Fab进行过夜处理后也被阻断。
图8C显示，将达沙替尼加入过钒酸盐处理的697细胞阻断了Lyn介导的参与募集和激活Syk的CD79a磷酸化。Syk抑制剂Bay-61-3606和达沙替尼的组合完全阻断磷酸酶抑制过程中磷酸-CD79a的积累，这表明Syk的反式磷酸化与Lyn的活性结合用于完全磷酸化。Syk抑制剂也减少Syk PY352的积累约20％，与作为Lyn和Syk二者的底物的酪氨酸一致。参与BCL6表达的增强信号传导的前-BCR-Lyn-Syk轴明显地被证明，因为用达沙替尼过夜处理消除BCL6水平。使用Jak抑制剂托法替尼处理697细胞在过钒酸盐存在下不会改变Syk磷酸化(图8E)。使用托法替尼进行过夜处理导致697细胞中BCL6水平升高，与Jak介导的BCL6抑制的释放一致(图8D)。用SHIP1抑制剂处理细胞轻度升高Syk磷酸化(图8E)，并完全抑制BCL6的表达(图8D)。这些结果进一步证实了结论：前-BCR增强信号，包括下游信号传导配偶体SHIP，支持BCP-ALL存活。
图6、图8和图11-13的结果说明完整的和Fab抗VpreB抗体对活的BCP-ALL细胞具有影响。如果需要，抗体的亲和力成熟也可以通过诱变和重新筛选来实现。可以测试最佳候选物阻断前-BCR二聚化和/或半乳凝素结合(在单分子跟踪测定中)、信号传导(通过蛋白质印迹)和/或诱导凋亡(通过流动)的能力。
由于阻断前-BCR促存活信号传导可能对于化学敏化是有利的，因此可以单独或与亚致死剂量的化疗剂例如长春新碱或柔红霉素组合比较细胞凋亡。例如，细胞与VpreB Fab的过夜孵育稍微增强细胞的7-AAD和膜联蛋白-V标记(14.9％的细胞，与8.5％的基础水平相比，图12A)。VpreB Fab与10ng / ml长春新碱的组合也略微增强细胞凋亡(81.4％凋亡细胞，与之相比，长春新碱单独为69.9％)。与这些结果一致，细胞可渗透的激酶抑制剂(例如达沙替尼，Bay-61-3606，托法替尼和3AC)也在一系列剂量内增强用长春新碱处理的细胞中的细胞凋亡(图12)。
如初始抗VpreB研究所示，所有scFv可以被重新工程化用于表达为完整的二价抗体(scFv2-人Fc)，并评估前-BCR的结合和聚集，前-BCR内吞作用的诱导，和/或对于抗体介导的细胞毒性或吞噬，在体外募集人NK细胞和巨噬细胞的能力。
可以根据具体标准，包括表4所列的标准，选择用于临床前评估的其它前导候选者。
表4. 用于选择前导候选抗体的方法和标准
测定法 选择标准
蛋白质结合 对于重组h-VpreB的ELISA结合测定和动力学分析 在ELISA中合适的结合和有关功效，KD < 10-9 M，通过ELISA测定
与表达前-BCR的细胞结合 表达人前-BCR的细胞系的流式细胞术(FACS)和显微术。Nalm-6; RS4;11, REH 与膜结合的人前-BCR的特异性结合；内化
与原代母细胞结合 来自诊断有BCP-ALL的患者的人原代母细胞的流式细胞术(FACS) 与来自数个供体的原代肿瘤细胞结合
特异性细胞杀伤 表达VpreB/I5的细胞系(Nalm-6和697细胞)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬测定法(ADCC, ADCP)。使用原始患者材料作为靶细胞群验证效应器。 针对不同来源的多个靶细胞群的体外有效的ADCC和ADCP。例如，细胞系的>40%特异性的细胞死亡和对原始患者材料的功效。在异种移植物模型中跟踪前导候选者
前-BCR信号传导 表征
与来自合适的毒理学物种的VpreB的反应性 与小鼠和食蟹猴(Macaca fascicularis)重组VpreB的ELISA和组织学结合 对人VpreB的反应性和可用于毒理学研究的至少一个相关物种
结构域作图 人VpreB的重组结构域 鉴定Mab结合的preB蛋白的结构域。选择具有不同选择性的前导Ab和备份
所选抗体的临床前活性可以在体外和体内最初进行测试。图6A和6B中的结果显示，BCP-ALL细胞与完整的抗VpreB1抗体的孵育，随后与人NK细胞共孵育，导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。也可以通过建立的人异种移植模型(其中将人BCP-ALL细胞系植入免疫受损小鼠)中支持临床前研究。图7所示的图像记载了在SCID或NSG小鼠中，表达GFP的BCP-ALL细胞在骨骼，脾脏和肝脏中的散布。尾静脉注射697或Nalm-6细胞后，三周时间内疾病非常确定地进展；对于后者，母细胞也散布到脑。植入后一周，可以通过定义的给药方案，施用完整或修饰的阻断抗体多达另外两周，然后处死治疗的动物和移除器官。
已经通过小鼠传代的患者衍生细胞提供了一种扩增原代细胞进行临床前测试的方法，并说明了PDX小鼠模型的效用。通过膜联蛋白和Ki-67的IHC染色可以对组织切片中的凋亡细胞和增殖变化进行评分。也可以从小鼠中检测和恢复荧光成淋巴细胞。对于Syk和AKT磷酸化、细胞周期阶段和细胞凋亡，可以通过流动来测定荧光母细胞。
据报道，BCR-ABL1+急性成淋巴细胞性白血病中缺少前-BCR的表达，而其在其它BCP-ALL子集中的表达可能定义了靶向增强信号传导的疗法具有潜在价值的那些患者。图13报告使用来自两个不同的BCP-ALL患者样品(＃280，＃238)的细胞的数据，其具有可测量的前-BCR细胞表面表达水平。为了能够重复测量原代细胞以验证前-BCR扩散和药物敏感性研究，将患者样品在获取当天冷冻保存，然后在解冻后立即置于组织培养中，或者通过Nod-SCID-γ2缺陷小鼠传代。
图13A显示这两个患者样品的mIgμ的表面表达范围为每个细胞约4000至15,000拷贝，平均值为6000至7000。这些值非常类似于Nalm6细胞上的水平，并且约为在697上的mIgμ表达水平的一半。
抗Igβ Fab-QD探针用于单粒子跟踪(SPT)的跟踪，以评估未处理的原代细胞中的前-BCR扩散。图13C中的结果显示，虽然＃238细胞膜上的前-BCR的总体扩散系数与697细胞相似，但基本上没有固定部分。观察值的分布以及＃280的前-BCR的总体扩散系数与Nalm6细胞的前-BCR的扩散特征匹配良好。作为上述药物分析(drug profiling)的延伸，在SPT实验中，用三种酪氨酸激酶抑制剂中的每一种处理697细胞。Lyn和Syk抑制剂(分别为达沙替尼和Bay-61-3606)处理697细胞导致前-BCR的总体迁移增加(图13D)，与产生用于减慢受体扩散的信号传导配偶体的对接位点的ITAM磷酸化一致。患者＃280细胞与抗VpreB Fab或达沙替尼的孵育导致受体迁移显著增加(图13E)。
阻断前-BCR同型自身缔合可以使患者细胞对长春新碱敏感。图14A显示来自患者＃280的细胞与抗VpreB Fab的孵育增强细胞凋亡，无论是单独施用还是与低剂量长春新碱组合。患者＃280的母细胞也对作为单一药物的达沙替尼非常敏感(培养24小时后为80％7-AAD/膜联蛋白-V阳性)。更长的孵育是不可行的，因为来自该患者的细胞在没有药物的情况下或在至多5ng / ml的长春新碱存在下孵育时为40％7-AAD阳性。总之，数据表明，靶向前-BCR或其下游配偶体的药物可导致体外成淋巴细胞杀伤。
因此，在一个方面，本公开描述了通常包含前-BCR拮抗剂的组合物。如本文所用，术语“拮抗剂”是指能够与受体(例如前-BCR)结合以抑制受体的细胞活性的化合物。拮抗剂可以是直接结合受体的配体。或者，拮抗剂可以通过例如以下，间接地与受体结合：(a)与直接与受体结合的另一个分子形成复合物，或(b)另外导致另一种化合物的修饰，使得另一种化合物直接结合受体。如本文所用，“抑制”是指任何可测量的细胞活性降低。抑制程度可以表征为正常活性水平的百分比。因此，“抑制”包括但不需要活性的完全沉默。
在一些情况下，拮抗剂可以是特异性结合前-BCR的抗体。如本文所用，术语“特异性结合”是指在任何程度上对于特定靶标具有差异或非一般性亲和力。
如本文所用，术语“抗体”是指能够特异性结合特定靶标的免疫球蛋白的任何部分。因此，在一些实施方案中，抗体可以是抗体片段，例如单价形式的抗体(Fab-Fc)或与毒素缀合的完整抗体。一旦鉴定了抗体，抗体可以通过任何合适的方式产生，包括例如重组技术、合成技术、来自杂交瘤的表达和/或由杂交瘤产生的单克隆抗体的化学修饰。
除人或人源化抗体及其衍生物之外，抗体的Fab结合位点可以与TCR或其它含ITAM的免疫受体的组分符合读框地融合，将编码该“嵌合受体”的序列插入到病毒载体中，并引入到从患者中分离的T细胞中用于T细胞介导的免疫治疗。
本文所述的组合物可以与药学上可接受的载体一起配制成组合物。如本文所用，“载体”通常包括任何溶剂、分散介质、溶媒、包衣料、稀释剂、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药物活性物质的这种介质和/或试剂的使用是本领域公知的。除了任何常规的介质或试剂与活性成分不相容之外，考虑其在治疗性组合物中的用途。补充的活性成分也可以并入组合物中。如本文所用，“药学上可接受的”是指不是生物学或其它方面不期望的材料，即，所述材料可以与前-BCR拮抗剂一起施用于个体，而不引起任何不期望的生物效应或以有害的方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。
可将前-BCR拮抗剂配制成药物组合物。药物组合物可以配制成适于优选给药途径的各种形式。因此，组合物可以通过已知途径施用，包括例如口服、肠胃外(例如皮内、经皮、皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内等)。还可以通过持续或延迟释放来施用组合物。
制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域熟知的方法制备。用药学上可接受的载体制备组合物的方法包括使前-BCR拮抗剂与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂可以通过均匀地和/或密切地将活性化合物与液体载体、细分散的固体载体或两者结合，然后如果需要将产物成型为所需的制剂来制备。
可以以任何合适的形式提供前-BCR拮抗剂，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、纳米载体或任何形式的混合物。组合物可以与任何药学上可接受的赋形剂、载体或溶媒一起以制剂递送。
施用的前-BCR拮抗剂的量可以根据各种因素而变化，包括但不限于受试者的体重、身体状况和/或年龄、和/或给药途径。因此，包括在给定单位剂型中的前-BCR拮抗剂的绝对量可以广泛变化，并且取决于诸如受试者的物种、年龄、体重和身体状况以及给药方法等因素。因此，一般性阐明构成对于所有可能的应用有效的量的前-BCR拮抗剂的量是不实际的。然而，本领域普通技术人员可以适当地考虑这些因素来容易地确定适当的量。
一般来说，前-BCR拮抗剂的量是有效改善BCP-ALL的至少一种症状或临床病征的量。如本文所用，术语“改善”是指BCP-ALL特征性的症状或临床病征的程度、严重性、频率和/或可能性的任何减少。如本文所用，“症状”是指与BCP-ALL有关的患者状况的任何主观证据；“病征”或“临床病征”是指与BCP-ALL有关的客观身体发现，其能够由并非患者的人发现。
在一些实施方案中，所述方法可以包括施用足够的前-BCR拮抗剂作为单一药剂。治疗性抗体以0.1-20mg / kg的剂量施用，尽管在一些实施方案中，可以通过以该范围之外的剂量施用前-BCR拮抗剂来进行该方法。抗体的修饰，包括毒素的添加，糖基化状态的改变，IgG亚类的转换或其它工程化特征可以改变药代动力学、大小、效应功能、脱靶毒性和结合特征。在这些实施方案的一些中，该方法可以包括与另一种治疗剂共同施用或连续施用的组合疗法。
或者，可以使用紧接治疗过程开始之前获得的实际体重来计算剂量。对于以这种方式计算的剂量，使用Dubois方法在治疗过程开始之前计算体表面积(m2)：m2 =(wt kg0.425×高度cm0.725)×0.007184。在这样的实施方案中，该方法可以包括施用足够的前-BCR拮抗剂以提供例如约0.01mg / m2至约10mg / m2的剂量。
在一些实施方案中，前-BCR拮抗剂可以例如每周单剂量至多个剂量施用，尽管在一些实施方案中，该方法可以通过以该范围之外的频率施用前-BCR拮抗剂来进行。在某些实施方案中，前-BCR拮抗剂可以每月约一次至每周约五次来施用。
如本文所用，术语“和/或”是指所列出的要素中的一个或全部或者所列出的要素中的任何两个或更多个的组合；术语“包括”及其变体在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义；除非另有规定，否则可以互换使用“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”，表示一个或多于一个；并且通过端点对数值范围的叙述包括在该范围内包含的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
在前面的描述中，为了清楚起见，可以分开描述特定的实施方案。除非另有明确规定，特定实施方案的特征与另一实施方案的特征不相容，某些实施方案可以包括与一个或多个实施方案有关的本文所述的相容特征的组合。
对于包括离散步骤的本文公开的任何方法，可以以任何可行的顺序进行各步骤。并且，适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
本发明由本文描述的示例性实施方案来说明。应当理解，具体实施例、材料、量和程序将根据本文所阐述的本发明的范围和精神进行广泛解释。
实施例
细胞培养和处理
将BCP-ALL细胞系(697，Nalm6)的悬浮培养物在含有10％(v/v)HI FBS、1％青霉素/链霉素(Gibco，Gaithersburg，MD)和L-谷氨酰胺2mM的含酚红的RPMI 1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中生长。患者样品在补充有20％(v/v)HI FBS、1％青霉素/链霉素、1×胰岛素、转铁蛋白和硒(Gibco，Gaithersburg，MD)、1 mM丙酮酸钠(Gibco，Gaithersburg，MD)和55 μM 2-巯基乙醇(Gibco，Gaithersburg，MD)的IMDM，GlutaMAX培养基(Gibco，Gaithersburg，MD)中培养。在实验之前，将细胞用台氏液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)洗涤两次。除非另有说明，细胞用Bay-61-3606(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX;1μM)，达沙替尼(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX;1μM)，托法替尼(Selleck Chemicals LLC，Houston，TX;1μM)，抗VpreB Fab(1μM)，3AC(EchelonBiosciences，Inc.，Salt Lake City，UT)和/或重组半乳凝素-1(PreproTech，Rocky Hill，NJ;10μM)，+/-乳糖，预处理10分钟。
重组抗VpreB抗体的筛选和生产
由超过100个噬菌体展示子文库排列的560亿个合成构建的人抗体组成的背景组合免疫库(ConCIRT)合成文库(Xu等人，2008，PNAS 105：10756-10761)针对重组“Surrobody”进行淘选。Surrobody由自抗流感H5N1血凝素抗体分离，并与替代轻链组分(VpreB1，λ5)或与人VpreB1和λ5基因融合的产物的嵌合多肽配对的功能性人IgG1重链组成。洗脱并扩增与96孔微量滴定板上包被的Surrobody结合的噬菌体，用于随后的一轮淘选。四轮噬菌体淘选后，通过ELISA测定分析来自富集库的各个克隆的特异性结合。在用嵌合VpreB1-λ5多肽包被的ELISA板上进行VpreB1结合特异性的测试。用HRP缀合的抗myc抗体定量检测，然后进行基于ELISA的命中鉴定。阳性鉴定后，对亲和力范围为0.85-250nM的16个噬菌体衍生的克隆进行测序。选择克隆2460B04用于整合到哺乳动物表达质粒中，随后瞬时转染HEK293-F细胞以产生重组IgG抗体。完整的IgG被还原以产生抗VpreB1 Fab片段。通过流式细胞术评价抗VpreB1 Fab对活697细胞的反应性。结果示于图5。
抗CD79b IgG纯化
CB3-1杂交瘤细胞(由Dr.Max D. Cooper，Emory University慷慨提供)在含10％(v/v)HI FBS、1％青霉素/链霉素(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)、L-谷氨酰胺2mM(Gibco，Gaithersburg，MD)和1×β-巯基乙醇(Gibco，Gaithersburg，MD)的含酚红的RPMI1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培养。通过在250ml不含FBS的RPMI培养基中培养两周来扩增烧瓶培养物，然后收集培养基，通过以2000rpm离心澄清并通过0.22μm真空过滤器过滤。将培养基在蛋白A/G亲和柱上循环过夜(4℃)，用甘氨酸缓冲液(pH 2.5-3.0)洗脱IgG。洗脱的1ml级分用1M TRIS缓冲液(pH 9.0)中和。
Fab产生、生物素缀合和量子点标记
如前所述制备Fab-生物素探针(Low-Nam等人，2011，Nat Struct Mol Biol 18：1244-1249)。根据制造商的说明，将来源于CB3-1杂交瘤或抗IgM的IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.，West Grove，PA)透析至pH4.5的乙酸钠溶液中，以准备加入胃蛋白酶/琼脂糖(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)。IgG消化在37℃进行5小时，洗出液在4℃下透析至100mM磷酸盐，5mM EDTA，pH6.0，以准备通过2-巯基乙胺(2-MEA; ThermoFisherScientific，Waltham，MA)还原F(ab')2的链间二硫化物。将样品在2-MEA(50mM)中在37℃下孵育90分钟，然后在4℃下透析至储存缓冲液(100mM磷酸盐，5mM EDTA，pH 6.5-7.0)中4小时，多次交换缓冲液。使用EZ-LINK马来酰亚胺-PEG2-生物素(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，选择性地将由链间二硫键还原产生的暴露的硫醇基团与生物素缀合，并通过SDS-PAGE分析。为了去除上面的分子量带(F(ab')2和未消化的IgG)，在等度条件下，用0.5ml / min流速的磷酸盐缓冲盐水，使用Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare LifeSciences，Marlborough，MA)，通过FPLC尺寸排阻色谱在室温下回收消化的片段。通过用蛋白A/G琼脂糖珠(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)的批处理除去Fc片段的残留完整物。生物素：Fab摩尔比由FLUOREPORTER biotective绿色试剂(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)测定。将抗CD79b Fab-生物素或抗IgM Fab-生物素以1:1化学计量与PBS +1％(w / v)BSA中的Qdot655或Qdot585-链霉抗生物素蛋白混合以产生储备溶液。
活细胞的QD标记
将LAB-TEK成像室(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)在无菌水中在室温下用1mg / ml的聚-l-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)包被20分钟，接着洗涤三次。将BCP-ALL细胞在不含FBS的RPMI 1640中血清饥饿2小时，然后加入包被的孔中，并在37℃下孵育15分钟。将QD-Fab-CD79b或QD-Fab-IgM在含0.1%(w / v)BSA和20mM葡萄糖的台氏液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中在100pm下在37℃下加入10-15分钟。
单粒子跟踪和分析
本研究中使用的所有相应的GPU单粒子跟踪和轨迹伸长、平方位移、均方位移、相关运动、基准数据采集和图像配准以及三态隐马尔可夫模型之前已有详细描述(Low-Nam etal，2011，Nat Struct Mol Biol 18：1244-1249)。
半乳凝素-1克隆、表达和纯化
使用CACC正向引物(FWD：5'-CAC CAT GGC TTG TGG TCT GG-3'; SEQ ID NO：4)和反向引物(REV：5'-TCA GTC AAA GGC CAC ACA TTT GAT CT -3'; SEQ ID NO：5)，PCR扩增MGC人半乳凝素-1编码cDNA(LGALS1, 检索号BC001693)。使用pET101定向TOPO表达试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)将扩增产物克隆到pET101中，通过热休克将克隆的产物转化到ONE SHOT TOP10大肠杆菌(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中。将细胞用氨苄青霉素生长过夜。选择抗性培养物并分离DNA。通过热休克，用含LGALS1的pET101载体转化BL21 STAR ONE SHOT细胞(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，在SOC培养基(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中短暂生长，然后转化至含有氨苄青霉素的10mL LB。将培养物在37℃下摇荡生长过夜。在第二天，将含有氨苄青霉素的50mL LB用1mL过夜培养物接种。将培养物在37℃振荡(225-250rpm)培养2-3小时。加入IPTG(1mM)3-4小时以诱导表达。IPTG诱导后，通过离心(3000×g，4℃下10分钟)收获细胞。如前所详述的，细胞通过α-乳糖/琼脂糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)纯化(Carlow等人，2003，J Immunol171：5100-5106)。
蛋白质印迹
在说明的孵育+/-抑制剂或交联剂之后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并在含有1％NP-40和蛋白酶和磷酸酶抑制剂(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)的基于Tris的裂解缓冲液中在冰上保持15分钟。对于抑制剂对BCL6表达的影响，处理24小时。通过在4℃下以14,000×g离心10分钟澄清裂解物，然后加入到Laemmli还原缓冲液中。蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺上分离并转移到硝酸纤维素膜上。用含有5％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的TBST(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)封闭后，用对pCD79a (Tyr 182) (Cell SignalingTechnology, Inc., Danvers, MA)、pSyk (Tyr348) (Novus Biologicals LLC,Littleton, CO)、pSyk (Tyr 352) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA)或BCL6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX)特异性的抗体探查印迹。使用对β-肌动蛋白的抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作为上样对照。
过钒酸盐处理
如先前所述(Imbert等人，1994，Biochem J 297(Pt 1)：163-173; Smrz等人，2008，JBiol Chem 283：10904-10918)，用过钒酸盐溶液处理BCP-ALL细胞。图8中的数据使用0至1.0的线性范围归一化报告，其中没有过钒酸盐处理的增强(tonic)设定为0，增强过钒酸盐处理设定为1.0：
化学敏化
为了建立靶向抑制剂与长春新碱的潜在协同作用的有效剂量范围，将697细胞在37℃下孵育3天，范围为0.1-100.0ng/mL长春新碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)；每个条件使用50,000个细胞。使用MATLAB曲线拟合工具箱(The MathWorks，Inc.，Natick，MA)，使用S形剂量-反应曲线拟合曲线。
流式细胞术检测
根据制造商的程序，根据与膜联蛋白-V-FITC(BioLegend，Inc.，San Diego，CA)的结合，和通过7-AAD标记(BioLegend，Inc.，San Diego，CA)测量的细胞活力丧失，测量白血病细胞凋亡。对于受体结合实验，将细胞在饱和条件下在含有抗CD79b-APC抗体(BioLegend，Inc.，San Diego，CA)或抗-VpreB-PE抗体(BioLegend，Inc.，San Diego, CA)的PBS中在冰上孵育1.5小时。根据制造商的说明书，使用含抗小鼠Fc抗体的QUANTUM SIMPLY CELLULAR(Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN)珠校准流动结果。按所述的，用KD控制条件下的非线性回归分析估计解离常数(Drake，A.W.，和S.L.Klakamp，2007，J Immunol Methods318：147-152)。所有流式细胞术数据收集均在HYPERCYT平台(IntelliCyt Corp.，Albuquerque，NM; Edwards等人，2009，Methods Mol Biol 486：151-165)上进行，并用FLOWJO软件包(FlowJo，LLC，Ashland，OR)分析。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及可电子得到的材料(包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交以及例如SwissProt，PIR，PRF，PDB中提供的氨基酸序列提交，和GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的完整公开内容通过引用整体并入本文。如果本申请的公开内容与通过引用并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致，则本申请的公开内容将适用。前面的详细描述和实施例仅仅是为了清楚的理解而给出的。从其中不应理解不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的精确细节，因为本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求书限定的发明内。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示组分数量，分子量等的所有数字应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，否则在说明书和权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并且不试图限制对权利要求的范围的等同物的原则，每个数值参数应至少根据所报告的有效数字的数量和通过应用普通舍入技术来解释。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含必定由其各自测试测量中存在的标准偏差所产生的范围。
所有标题都是为了方便读者，除非另有说明，否则不应用于限制标题后面的文本的含义。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1
UniProt检索号: P12018, 信号肽1-19
MSWAPVLLMLFVYCTGCGP
SEQ ID NO:2
UniProt检索号: P12018|20-145, 免疫球蛋白ι链
QPVLHQPPAMSSALGTTIRLTCTLRNDHDIGVYSVYWYQQRPGHPPRFLLRYFSQSDKSQ
GPQVPPRFSGSKDVARNRGYLSISELQPEDEAMYYCAMGARSSEKEEREREWEEEMEPTA
ARTRVP
SEQ ID NO:3
UniProt检索号: P12018, 信号肽+ 免疫球蛋白ι链
MSWAPVLLMLFVYCTGCGPQPVLHQPPAMSSALGTTIRLTCTLRNDHDIGVYSVYWYQQRPGHPPRFLLRYFSQSDKSQGPQVPPRFSGSKDVARNRGYLSISELQPEDEAMYYCAMGARSSEKEEREREWEEEMEPTAARTRVP
SEQ ID NO: 4
5'- CACCATGGCTTGTGGTCTGG -3'
SEQ ID NO:5
5'- TCAGTCAAAGGCCACACATTTGATCT -3'

Claims (12)

1.一种组合物，其包含：
前-B细胞受体(前-BCR)拮抗剂，其被工程化以作为T细胞嵌合受体表达。
2.权利要求1的组合物，其中所述前-BCR拮抗剂包含与前-BCR特异性结合的抗体。
3.权利要求2的组合物，其中所述抗体包含抗体片段。
4.权利要求3的组合物，其中所述抗体片段包含单价抗体。
5.权利要求4的组合物，其中所述单价抗体包含scFv或Fab-Fc。
6.权利要求2-5中任一项的组合物，其中所述抗体是人源化的。
7.权利要求2-6中任一项的组合物，其中所述抗体包含抗VpreB抗体。
8.权利要求7的组合物，其中所述抗VpreB抗体包含抗VpreB1抗体。
9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述拮抗剂是重组的。
10. 一种药物组合物，其包含：
前述权利要求中任一项的组合物；和
药学上可接受的载体。
11.一种方法，包括：
向具有B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)的受试者施用有效改善BCP-ALL的至少一种症状或临床病征的量的权利要求1-9中任一项的组合物。
12.一种药剂盒，其包含权利要求1-10中任一项的组合物。
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