JPH1142087A - 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法 - Google Patents
抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法Info
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- JPH1142087A JPH1142087A JP9202684A JP20268497A JPH1142087A JP H1142087 A JPH1142087 A JP H1142087A JP 9202684 A JP9202684 A JP 9202684A JP 20268497 A JP20268497 A JP 20268497A JP H1142087 A JPH1142087 A JP H1142087A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトプレＢ細胞およびヒトプロＢ細胞と特異
的に反応する抗体であって、ヒトプレＢ細胞レセプター
を膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞およびＶｐｒｅ
Ｂ分子を細胞内に発現しているヒトプロＢ細胞を該抗体
により免疫染色して、免疫染色された細胞のみを顕微鏡
で観察することが可能である抗体を提供すること。 【解決手段】 ヒトプレＢ細胞の膜表面に発現している
ヒトプレＢ細胞レセプターのＳＬ鎖の構成員の一である
ＶｐｒｅＢ分子またはヒトプロＢ細胞内に発現している
ＶｐｒｅＢ分子と反応し、代替軽鎖のλ５分子とは反応
せず、かつその反応性が、該抗体が反応したヒトプレＢ
細胞またはヒトプロＢ細胞を顕微鏡で検出することが可
能な程度の反応性である抗体。
的に反応する抗体であって、ヒトプレＢ細胞レセプター
を膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞およびＶｐｒｅ
Ｂ分子を細胞内に発現しているヒトプロＢ細胞を該抗体
により免疫染色して、免疫染色された細胞のみを顕微鏡
で観察することが可能である抗体を提供すること。 【解決手段】 ヒトプレＢ細胞の膜表面に発現している
ヒトプレＢ細胞レセプターのＳＬ鎖の構成員の一である
ＶｐｒｅＢ分子またはヒトプロＢ細胞内に発現している
ＶｐｒｅＢ分子と反応し、代替軽鎖のλ５分子とは反応
せず、かつその反応性が、該抗体が反応したヒトプレＢ
細胞またはヒトプロＢ細胞を顕微鏡で検出することが可
能な程度の反応性である抗体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトプレＢ細胞の
膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞レセプターの代替
軽鎖のＶｐｒｅＢ分子およびヒトプロＢ細胞の細胞内に
発現しているＶｐｒｅＢ分子に反応する抗体またはその
活性フラグメントに関する。また、本発明は、サポニン
緩衝液を用いて、前記抗体またはその活性フラグメント
によりヒトプロＢ細胞を検出する検出方法に関する。本
発明の抗体は、急性リンパ性白血病の診断に応用でき
る。
膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞レセプターの代替
軽鎖のＶｐｒｅＢ分子およびヒトプロＢ細胞の細胞内に
発現しているＶｐｒｅＢ分子に反応する抗体またはその
活性フラグメントに関する。また、本発明は、サポニン
緩衝液を用いて、前記抗体またはその活性フラグメント
によりヒトプロＢ細胞を検出する検出方法に関する。本
発明の抗体は、急性リンパ性白血病の診断に応用でき
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ細胞は、骨髄の造血幹細胞から前駆細
胞、プロＢ細胞、プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞
の各段階を経て形質細胞に分化することが知られてい
る。
胞、プロＢ細胞、プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞
の各段階を経て形質細胞に分化することが知られてい
る。
【０００３】Ｂ細胞の表面には抗原認識レセプターとし
て免疫グロブリン（以下、Ｉｇと記載することがある）
が発現している。この抗原認識レセプターは、重鎖と軽
鎖の２種のポリペプチドから構成されているが、Ｂ細胞
の分化につれて、その構成が変化する。
て免疫グロブリン（以下、Ｉｇと記載することがある）
が発現している。この抗原認識レセプターは、重鎖と軽
鎖の２種のポリペプチドから構成されているが、Ｂ細胞
の分化につれて、その構成が変化する。
【０００４】以下にマウスを例として、Ｂ細胞の分化と
その抗原認識レセプターについて説明する。
その抗原認識レセプターについて説明する。
【０００５】プロＢ細胞では、プロＢ細胞レセプターが
細胞表面に発現していることが知られている。プロＢ細
胞レセプターは、代替重鎖（ＳＨ鎖）と呼ばれる重鎖
（Ｈ鎖）に、λ５およびＶｐｒｅＢと呼ばれる二つのポ
リペプチドが会合した代替軽鎖（ＳＬ鎖）が会合してい
る。代替軽鎖（サロゲイトライト鎖（ＳＬ鎖））は、λ
５分子（以下λ５ということがある）とＶｐｒｅＢ分子
（以下ＶｐｒｅＢということがある）が会合して通常の
軽鎖（Ｌ鎖）の代わりをすることからそう呼ばれてい
る。λ５が軽鎖の定常領域に相当し、ＶｐｒｅＢが軽鎖
の可変領域に相当する。
細胞表面に発現していることが知られている。プロＢ細
胞レセプターは、代替重鎖（ＳＨ鎖）と呼ばれる重鎖
（Ｈ鎖）に、λ５およびＶｐｒｅＢと呼ばれる二つのポ
リペプチドが会合した代替軽鎖（ＳＬ鎖）が会合してい
る。代替軽鎖（サロゲイトライト鎖（ＳＬ鎖））は、λ
５分子（以下λ５ということがある）とＶｐｒｅＢ分子
（以下ＶｐｒｅＢということがある）が会合して通常の
軽鎖（Ｌ鎖）の代わりをすることからそう呼ばれてい
る。λ５が軽鎖の定常領域に相当し、ＶｐｒｅＢが軽鎖
の可変領域に相当する。
【０００６】プレＢ細胞では、プレＢ細胞レセプターが
細胞表面に発現していることが知られている。プレＢ細
胞レセプターは、μ鎖と呼ばれる重鎖（Ｈ鎖）に、λ５
およびＶｐｒｅＢと呼ばれる二つのポリペプチドが会合
した代替軽鎖（ＳＬ鎖）が会合している。
細胞表面に発現していることが知られている。プレＢ細
胞レセプターは、μ鎖と呼ばれる重鎖（Ｈ鎖）に、λ５
およびＶｐｒｅＢと呼ばれる二つのポリペプチドが会合
した代替軽鎖（ＳＬ鎖）が会合している。
【０００７】未熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞では、抗原認
識レセプターとして、μ鎖に通常のＬ鎖が結合したＢ細
胞レセプターが発現している。
識レセプターとして、μ鎖に通常のＬ鎖が結合したＢ細
胞レセプターが発現している。
【０００８】上記からわかるように、λ５およびＶｐｒ
ｅＢは、プロＢ細胞およびプレＢ細胞にのみ細胞の膜表
面に発現する。
ｅＢは、プロＢ細胞およびプレＢ細胞にのみ細胞の膜表
面に発現する。
【０００９】ヒトＢ細胞の分化と抗原認識レセプターに
ついても、上記と同様の知見が報告されている。
ついても、上記と同様の知見が報告されている。
【００１０】従来、ヒトプレＢ細胞レセプター、ヒトＶ
ｐｒｅＢまたはヒトλ５と反応する抗体としては、以下
に示すものが知られている。それぞれの反応性等を表１
に示す。 抗ヒトプレＢ細胞レセプター抗体：ＳＬＣ１、ＳＬＣ
２，ＳＬＣ３、ＳＬＣ４（Ｃｅｌｌ、７３巻、７３−８
６ページ、１９９３年） 抗ヒトプレＢ細胞レセプター抗体：９Ｃ２（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．、２４巻、２５７−２６４ペー
ジ、１９９４年） 抗ヒトＶｐｒｅＢ抗体：３Ｃ７、６Ｆ６（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．、２６巻、２１７２−２１８０
ページ、１９９６年） 抗ヒトＶｐｒｅＢ抗体：Ｂ−ＭＡＤ１７６、Ｂ−ＭＡ
Ｄ６８８、Ｂ−ＭＡＤ７９２、Ｂ−ＭＡＤ１１１２
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３巻、２６９３−２６９
８ページ、１９９６年）
ｐｒｅＢまたはヒトλ５と反応する抗体としては、以下
に示すものが知られている。それぞれの反応性等を表１
に示す。 抗ヒトプレＢ細胞レセプター抗体：ＳＬＣ１、ＳＬＣ
２，ＳＬＣ３、ＳＬＣ４（Ｃｅｌｌ、７３巻、７３−８
６ページ、１９９３年） 抗ヒトプレＢ細胞レセプター抗体：９Ｃ２（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．、２４巻、２５７−２６４ペー
ジ、１９９４年） 抗ヒトＶｐｒｅＢ抗体：３Ｃ７、６Ｆ６（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ．、２６巻、２１７２−２１８０
ページ、１９９６年） 抗ヒトＶｐｒｅＢ抗体：Ｂ−ＭＡＤ１７６、Ｂ−ＭＡ
Ｄ６８８、Ｂ−ＭＡＤ７９２、Ｂ−ＭＡＤ１１１２
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３巻、２６９３−２６９
８ページ、１９９６年）
【００１１】
【表１】
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】Ｂ細胞分化の異常は、
白血病を引き起こす。Ｂ細胞が分化のどの段階で異常増
殖したかを知ることは、白血病の治療上重要である。特
に、小児の急性リンパ性白血病では、プロＢ細胞あるい
はプレＢ細胞の異常増殖が原因であることが多い。現
在、一般的に診断で使われているＢ細胞表面マーカーと
しては、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０
抗体、抗ＣＤ２１抗体がある。これらの抗体をＢ細胞と
反応させ、その結果により、当該Ｂ細胞がどの段階のも
のか知ろうとしている。しかし、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｃ
Ｄ２０抗体および抗ＣＤ２１抗体は未熟Ｂ細胞や成熟Ｂ
細胞とも反応し、抗ＣＤ１０抗体はＴ細胞や上皮細胞に
も反応する。したがって、これらの抗体では、ヒトプロ
Ｂ細胞またはヒトプレＢ細胞のみを特異的に検出するこ
とは不可能であった。
白血病を引き起こす。Ｂ細胞が分化のどの段階で異常増
殖したかを知ることは、白血病の治療上重要である。特
に、小児の急性リンパ性白血病では、プロＢ細胞あるい
はプレＢ細胞の異常増殖が原因であることが多い。現
在、一般的に診断で使われているＢ細胞表面マーカーと
しては、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０
抗体、抗ＣＤ２１抗体がある。これらの抗体をＢ細胞と
反応させ、その結果により、当該Ｂ細胞がどの段階のも
のか知ろうとしている。しかし、抗ＣＤ１９抗体、抗Ｃ
Ｄ２０抗体および抗ＣＤ２１抗体は未熟Ｂ細胞や成熟Ｂ
細胞とも反応し、抗ＣＤ１０抗体はＴ細胞や上皮細胞に
も反応する。したがって、これらの抗体では、ヒトプロ
Ｂ細胞またはヒトプレＢ細胞のみを特異的に検出するこ
とは不可能であった。
【００１３】臨床診断の場においては、細胞を顕微鏡で
観察することが行われている。他の方法に比し、最も簡
便かつ速く、さらに設備の設置場所が最小限ですむ方法
であるからである。しかし、細胞の染色が非常に弱い場
合は、ＦＡＣＳのような高精度の検出方法では検出でき
ても、顕微鏡では観察することができない。上記〜
に挙げたヒトプレＢ細胞レセプター等に対する抗体、特
にＶｐｒｅＢに対する抗体はいずれも、ＦＡＣＳの結果
が示されているのみである。すなわち、該抗体に反応し
た細胞を顕微鏡で観察することが可能な程度に染色する
ことができる程度の反応性のあるものかどうか示されて
いない。また、ヒトプロＢ細胞との反応性も、細胞表面
の反応性が示されているだけであり、細胞内染色につい
ては示されていない。
観察することが行われている。他の方法に比し、最も簡
便かつ速く、さらに設備の設置場所が最小限ですむ方法
であるからである。しかし、細胞の染色が非常に弱い場
合は、ＦＡＣＳのような高精度の検出方法では検出でき
ても、顕微鏡では観察することができない。上記〜
に挙げたヒトプレＢ細胞レセプター等に対する抗体、特
にＶｐｒｅＢに対する抗体はいずれも、ＦＡＣＳの結果
が示されているのみである。すなわち、該抗体に反応し
た細胞を顕微鏡で観察することが可能な程度に染色する
ことができる程度の反応性のあるものかどうか示されて
いない。また、ヒトプロＢ細胞との反応性も、細胞表面
の反応性が示されているだけであり、細胞内染色につい
ては示されていない。
【００１４】本発明は、ヒトプレＢ細胞およびヒトプロ
Ｂ細胞と特異的に反応する抗体であって、ヒトプレＢ細
胞レセプターを膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞お
よびＶｐｒｅＢ分子を細胞内に発現しているヒトプロＢ
細胞を該抗体により免疫染色して、免疫染色された細胞
のみを顕微鏡で観察することが可能である抗体を提供す
ることを課題とする。
Ｂ細胞と特異的に反応する抗体であって、ヒトプレＢ細
胞レセプターを膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞お
よびＶｐｒｅＢ分子を細胞内に発現しているヒトプロＢ
細胞を該抗体により免疫染色して、免疫染色された細胞
のみを顕微鏡で観察することが可能である抗体を提供す
ることを課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の抗体は、ヒトプ
レＢ細胞の膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞レセプ
ターのＳＬ鎖の構成員の一つであるＶｐｒｅＢ分子また
はヒトプロＢ細胞内に発現しているＶｐｒｅＢ分子と反
応し、代替軽鎖のλ５分子とは反応せず、かつその反応
性が、該抗体が反応したヒトプレＢ細胞またはヒトプロ
Ｂ細胞を顕微鏡で検出することが可能な程度の反応性で
ある抗体である。
レＢ細胞の膜表面に発現しているヒトプレＢ細胞レセプ
ターのＳＬ鎖の構成員の一つであるＶｐｒｅＢ分子また
はヒトプロＢ細胞内に発現しているＶｐｒｅＢ分子と反
応し、代替軽鎖のλ５分子とは反応せず、かつその反応
性が、該抗体が反応したヒトプレＢ細胞またはヒトプロ
Ｂ細胞を顕微鏡で検出することが可能な程度の反応性で
ある抗体である。
【００１６】
１．抗体の活性フラグメント 本発明においては、抗体は活性フラグメントをも包含す
るものである。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活
性を有する抗体のフラグメントを意味し、具体的には、
Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖなどを挙げる
ことができる。例えば、本発明の抗体をペプシンで分解
するとＦ（ａｂ’）2 が得られ、パパインで分解すると
Ｆａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）2 を２−メルカプトエ
タノールなどの試薬で還元して、モノヨード酢酸でアル
キル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは重鎖可変領域
と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体活
性フラグメントである。
るものである。活性フラグメントとは、抗原抗体反応活
性を有する抗体のフラグメントを意味し、具体的には、
Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖなどを挙げる
ことができる。例えば、本発明の抗体をペプシンで分解
するとＦ（ａｂ’）2 が得られ、パパインで分解すると
Ｆａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）2 を２−メルカプトエ
タノールなどの試薬で還元して、モノヨード酢酸でアル
キル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは重鎖可変領域
と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体活
性フラグメントである。
【００１７】これらの活性フラグメントを保持し、その
他の部分を他の動物のフラグメントに置換することでキ
メラ抗体が得られる。本明細書において、「キメラ抗
体」とは、可変領域または抗原結合ドメインと定常領域
またはエフェクタードメインとがそれぞれ遺伝的に異な
った種に属する免疫グロブリン断片から構成されている
抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変
（Ｖ）領域断片は、ヒト定常（Ｃ）領域断片、例えばγ
１またはγ４と連結され得る。
他の部分を他の動物のフラグメントに置換することでキ
メラ抗体が得られる。本明細書において、「キメラ抗
体」とは、可変領域または抗原結合ドメインと定常領域
またはエフェクタードメインとがそれぞれ遺伝的に異な
った種に属する免疫グロブリン断片から構成されている
抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変
（Ｖ）領域断片は、ヒト定常（Ｃ）領域断片、例えばγ
１またはγ４と連結され得る。
【００１８】２．遺伝子工学的な製法 本発明の抗体は、遺伝子工学的な方法を用いても得られ
る。例えば、プレＢ細胞レセプターのμ鎖とＳＬ鎖の会
合物質で免疫した動物の脾細胞、リンパ球又は本発明の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲ
ＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作
製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリーにより抗体を発
現させる。抗原と反応する抗体を産生するクローンをス
クリーニングによりｃＤＮＡライブラリーから得、得ら
れたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体
を、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等の方法を組み合わせて精製す
ることができる。
る。例えば、プレＢ細胞レセプターのμ鎖とＳＬ鎖の会
合物質で免疫した動物の脾細胞、リンパ球又は本発明の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲ
ＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作
製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリーにより抗体を発
現させる。抗原と反応する抗体を産生するクローンをス
クリーニングによりｃＤＮＡライブラリーから得、得ら
れたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体
を、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等の方法を組み合わせて精製す
ることができる。
【００１９】３．検出方法 本発明の抗体を用いたヒトプレＢ細胞、ヒトプロＢ細
胞、プレＢ細胞レセプターまたはＶｐｒｅＢ分子の検出
は、ＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ法、免疫沈降または顕微鏡
観察のいずれにおいても可能である。特に、ＦＡＣＳ法
または顕微鏡観察では、細胞表面のプレＢ細胞レセプタ
ーやＶｐｒｅＢ分子を検出するだけでなく、抗体と検体
を混合し、反応させるときにサポニン緩衝液を用いるこ
とにより細胞内のＶｐｒｅＢ分子をも染色して、該分子
または該分子を内部に有する細胞を検出することができ
る。
胞、プレＢ細胞レセプターまたはＶｐｒｅＢ分子の検出
は、ＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ法、免疫沈降または顕微鏡
観察のいずれにおいても可能である。特に、ＦＡＣＳ法
または顕微鏡観察では、細胞表面のプレＢ細胞レセプタ
ーやＶｐｒｅＢ分子を検出するだけでなく、抗体と検体
を混合し、反応させるときにサポニン緩衝液を用いるこ
とにより細胞内のＶｐｒｅＢ分子をも染色して、該分子
または該分子を内部に有する細胞を検出することができ
る。
【００２０】４．イムノトキシンとしての使用 本発明の抗体に毒素を結合させたイムノトキシンを作製
することは、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７巻（１９９０年）８２９１−８２
９５ページに記載の方法により可能である。このイムノ
トキシンをプレＢ細胞またはプロＢ細胞由来の白血病患
者に投与することで、患者体内で増殖したプレＢ細胞ま
たはプロＢ細胞に選択的に毒素を作用させ、該細胞を死
滅させ、該細胞由来の白血病を治療することができる。
毒素としては、エキソトキシン、ジフテリアトキシン等
がある。
することは、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７巻（１９９０年）８２９１−８２
９５ページに記載の方法により可能である。このイムノ
トキシンをプレＢ細胞またはプロＢ細胞由来の白血病患
者に投与することで、患者体内で増殖したプレＢ細胞ま
たはプロＢ細胞に選択的に毒素を作用させ、該細胞を死
滅させ、該細胞由来の白血病を治療することができる。
毒素としては、エキソトキシン、ジフテリアトキシン等
がある。
【００２１】５．複合物としての使用 本発明の抗体またはその活性フラグメントは、単独でも
用いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレ
ングリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として
用いることができる。このような複合物は、一般に、生
体内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発
揮することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、
ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例
えば、アンティボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュ
アル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）（コールドスプリングハーバー・ラ
ボラトリー、１９８８年出版）に記載されている。一般
的には、ＳＰＤＰ（ファルマシア製）等の２価反応性試
薬を用いれば、活性フラグメントをアルブミン等と容易
に結合させることができる。
用いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレ
ングリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として
用いることができる。このような複合物は、一般に、生
体内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発
揮することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、
ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例
えば、アンティボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュ
アル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ）（コールドスプリングハーバー・ラ
ボラトリー、１９８８年出版）に記載されている。一般
的には、ＳＰＤＰ（ファルマシア製）等の２価反応性試
薬を用いれば、活性フラグメントをアルブミン等と容易
に結合させることができる。
【００２２】
【実施例】以下に本発明の実施例を示し、より具体的に
本発明を説明するが、本発明は以下に限定されるもので
はなく、免疫する動物、対象とする細胞株、標識抗体等
は、目的に応じて適宜他のものが使用可能である。
本発明を説明するが、本発明は以下に限定されるもので
はなく、免疫する動物、対象とする細胞株、標識抗体等
は、目的に応じて適宜他のものが使用可能である。
【００２３】＜実施例１＞抗体の作製 １．抗原の作製 １）抗原遺伝子組み換え体の作製 （１）λ５遺伝子およびＶｐｒｅＢ遺伝子の作製 ヒトλ５遺伝子およびヒトＶｐｒｅＢ遺伝子は、ヒトプ
レＢ細胞Ｎａｌｍ６から常法によりｍＲＮＡを調製し、
該ｍＲＮＡについて、下記のプライマーでＲＴ−ＰＣＲ
法を行うことにより作製した。作製したｍＲＮＡについ
てそれぞれシークエンスを行い、ヒトλ５およびヒトＶ
ｐｒｅＢ遺伝子の塩基配列を有することを確認した。
レＢ細胞Ｎａｌｍ６から常法によりｍＲＮＡを調製し、
該ｍＲＮＡについて、下記のプライマーでＲＴ−ＰＣＲ
法を行うことにより作製した。作製したｍＲＮＡについ
てそれぞれシークエンスを行い、ヒトλ５およびヒトＶ
ｐｒｅＢ遺伝子の塩基配列を有することを確認した。
【００２４】 λ５プライマ ５’プライマ 5'-GGA ACT CGA GCC ACA AGG ACC TCT GAC CCT-3' ３’プライマ 5'-GGA AGC GGC CGC AGG CCT TTG GGT GGG GTC GG-3' ＶｐｒｅＢプライマ ５’プライマー 5'-GGA ACT CGA GGG AGT CAG AGC TCT GCA TGT-3' ３’プライマー 5'-GGA AGC GGC CGC AGG GGA TGC GTG CCT CTG CT-3'
【００２５】（２）ベクターへの挿入 サイトメガロウィルスのプロモーターとイムノグロブリ
ンのμ鎖のエンハンサーをもつ哺乳類動物用の発現ベク
ターＢＣＭＧＳＨｙｇ（この製法については、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７２巻、９６９−９７２ページに記載の
方法に従った。）に、（１）で作製したλ５遺伝子およ
びＶｐｒｅＢ遺伝子を常法により挿入した。
ンのμ鎖のエンハンサーをもつ哺乳類動物用の発現ベク
ターＢＣＭＧＳＨｙｇ（この製法については、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７２巻、９６９−９７２ページに記載の
方法に従った。）に、（１）で作製したλ５遺伝子およ
びＶｐｒｅＢ遺伝子を常法により挿入した。
【００２６】（３）形質転換体の作製 マウスμ鎖を発現する宿主Ｌｔｋ- （マウスμ鎖）に、
（２）で作製したベクターを、エレクトロポーレーショ
ン法により導入し(この方法については、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１７２巻、９６９−９７２ページを参照のこ
と）、キメラのプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒ
トλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）を発現および分泌する形質転
換体Ｌｔｋ- （マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅ
Ｂ）を作製した。
（２）で作製したベクターを、エレクトロポーレーショ
ン法により導入し(この方法については、Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１７２巻、９６９−９７２ページを参照のこ
と）、キメラのプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒ
トλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）を発現および分泌する形質転
換体Ｌｔｋ- （マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅ
Ｂ）を作製した。
【００２７】（４）形質転換体の選別 形質転換体Ｌｔｋ- （マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒトＶ
ｐｒｅＢ）を、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンと
Ｇ４１８を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を培地
として、９６穴プレートで、３７℃、５％ＣＯ2 下で培
養した。 培養上清を下記の条件１のＥＬＩＳＡ法により測定し
た。１２００ウェル中、約６００ウェルにコロニーが発
現し、そのうち４０５ｎｍでの吸光度の高い１６ウェル
を陽性として選択した。
ｐｒｅＢ）を、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンと
Ｇ４１８を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を培地
として、９６穴プレートで、３７℃、５％ＣＯ2 下で培
養した。 培養上清を下記の条件１のＥＬＩＳＡ法により測定し
た。１２００ウェル中、約６００ウェルにコロニーが発
現し、そのうち４０５ｎｍでの吸光度の高い１６ウェル
を陽性として選択した。
【００２８】ＥＬＩＳＡ条件１ ９６穴プレートのコーティング：ヤギ抗マウスＩｇＭ
（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。 試料：形質転換体Ｌｔｋ- （マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒ
トＶｐｒｅＢ）の培養上清 検出用抗体：アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＭ（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ）社製を３００倍希釈） 基質：ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、
シグマ社製）
（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。 試料：形質転換体Ｌｔｋ- （マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒ
トＶｐｒｅＢ）の培養上清 検出用抗体：アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＭ（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓ）社製を３００倍希釈） 基質：ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、
シグマ社製）
【００２９】のＥＬＩＳＡを数回繰り返し、さら
に、陽性株については、限界希釈法を用いてクローン化
し、プレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒ
トＶｐｒｅＢ）を高発現する陽性株を選択した。該陽性
株をＬｔｋ- １７−７２と名付けた。
に、陽性株については、限界希釈法を用いてクローン化
し、プレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒトλ５／ヒ
トＶｐｒｅＢ）を高発現する陽性株を選択した。該陽性
株をＬｔｋ- １７−７２と名付けた。
【００３０】２）抗原蛋白質の大量培養 上記でとった形質転換体Ｌｔｋ- １７−７２を、５％Ｆ
ＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で、複数の１Ｌ容ローラボ
トルにて３７℃で培養した。１本のローラボトルに２０
０ｍｌの培地を注入して、２週間培養した。２週間の培
養後、培地中のプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒ
トλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）の濃度を上記と同様にＥＬＩ
ＳＡ条件１により測定した結果、約５ｎｇ／ｍｌの濃度
であった。
ＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で、複数の１Ｌ容ローラボ
トルにて３７℃で培養した。１本のローラボトルに２０
０ｍｌの培地を注入して、２週間培養した。２週間の培
養後、培地中のプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒ
トλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）の濃度を上記と同様にＥＬＩ
ＳＡ条件１により測定した結果、約５ｎｇ／ｍｌの濃度
であった。
【００３１】３）抗原の精製 （１）濃縮 ２）の培養上清２Ｌを集め、濃縮装置（ＭＩＮＩＴＡＮ
（登録商標、ミリポア社製））を使用して約１０倍に濃
縮した。
（登録商標、ミリポア社製））を使用して約１０倍に濃
縮した。
【００３２】（２）精製 ビーズ（ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ、ファルマ
シア社製）にラット抗マウスμ鎖抗体を常法により付
け、カラムに充填した。 このカラムに濃縮した培養上清を２週間循環させて通
し、培養上清中のプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／
ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）を抗原蛋白質としてビーズ
に結合させた抗原−ビーズ結合体を作製した。 合計で約２０Ｌの培養上清について上記の濃縮および精
製を行い抗原蛋白質５０μｇを５００μｌの抗原ビーズ
に結合させた抗原蛋白質−ビーズ結合体を作製した（培
地中の抗原蛋白質の回収率は５０％であった。）。
シア社製）にラット抗マウスμ鎖抗体を常法により付
け、カラムに充填した。 このカラムに濃縮した培養上清を２週間循環させて通
し、培養上清中のプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／
ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）を抗原蛋白質としてビーズ
に結合させた抗原−ビーズ結合体を作製した。 合計で約２０Ｌの培養上清について上記の濃縮および精
製を行い抗原蛋白質５０μｇを５００μｌの抗原ビーズ
に結合させた抗原蛋白質−ビーズ結合体を作製した（培
地中の抗原蛋白質の回収率は５０％であった。）。
【００３３】２．免疫 上記で作製した抗原蛋白質−ビーズ結合体をメスのＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの四肢付け根皮下に、１匹あたり１μｇ
／１０μｌのビーズを免疫した。２回目以降の免疫に
は、抗原蛋白質−ビーズ結合体をＰＢＳの懸濁液にし
て、１匹あたり１μｇ／１０μｌのビーズを７日おきに
合計７回免疫した。その後、８週間おいてから抗原蛋白
質−ビーズ結合体より溶出させた抗原蛋白質溶液（抗原
蛋白質量３０μｇ）を尾より静注して追加免疫した。前
記抗原蛋白質溶液（抗原蛋白質−ビーズ結合体を０．１
Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶出した液）のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動の結果を図１に示す。電気泳動の結果、
μ鎖、λ５、ＶｐｒｅＢのバンドが見られ抗原蛋白質が
これらからなる分泌型プレＢ細胞レセプター（マウスμ
鎖／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）であることが確認され
た。
ＬＢ／ｃマウスの四肢付け根皮下に、１匹あたり１μｇ
／１０μｌのビーズを免疫した。２回目以降の免疫に
は、抗原蛋白質−ビーズ結合体をＰＢＳの懸濁液にし
て、１匹あたり１μｇ／１０μｌのビーズを７日おきに
合計７回免疫した。その後、８週間おいてから抗原蛋白
質−ビーズ結合体より溶出させた抗原蛋白質溶液（抗原
蛋白質量３０μｇ）を尾より静注して追加免疫した。前
記抗原蛋白質溶液（抗原蛋白質−ビーズ結合体を０．１
Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶出した液）のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ電気泳動の結果を図１に示す。電気泳動の結果、
μ鎖、λ５、ＶｐｒｅＢのバンドが見られ抗原蛋白質が
これらからなる分泌型プレＢ細胞レセプター（マウスμ
鎖／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）であることが確認され
た。
【００３４】３．モノクローナル抗体の作製 １）ハイブリドーマの作製 追加免疫３日後に、免疫したマウスの脾臓から脾細胞
２．２×１０8 個を取り出し、マウスミエローマ細胞Ｐ
ＡＩと４：１の割合でポリエチレングリコール（ベーリ
ンガー社製）細胞融合した。こうして得られたハイブリ
ドーマを９６穴プレート１０枚にまき、１００倍希釈の
ＨＡＴ（ベーリンガー社製）と５００倍希釈のＩＬ−６
（形質転換体Ｘ６３ＢＣＭＧＮｅｏ（この製法について
はＪ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．１７１巻、３８９−４００ペー
ジを参照のこと）の培養上清）を加えた２０％ＦＣＳ−
ＩＭＤＭ（ギブコ社製）で培養した。
２．２×１０8 個を取り出し、マウスミエローマ細胞Ｐ
ＡＩと４：１の割合でポリエチレングリコール（ベーリ
ンガー社製）細胞融合した。こうして得られたハイブリ
ドーマを９６穴プレート１０枚にまき、１００倍希釈の
ＨＡＴ（ベーリンガー社製）と５００倍希釈のＩＬ−６
（形質転換体Ｘ６３ＢＣＭＧＮｅｏ（この製法について
はＪ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．１７１巻、３８９−４００ペー
ジを参照のこと）の培養上清）を加えた２０％ＦＣＳ−
ＩＭＤＭ（ギブコ社製）で培養した。
【００３５】２）スクリーニング （１）ＥＬＩＳＡ 約２週間、ハイブリドーマを培養した。９６０ウェル
（プレート１０枚）中、約２６０ウェルにコロニーが発
現した。コロニーをつくったハイブリドーマの培養上清
を、下記の条件２のＥＬＩＳＡ法で測定した。
（プレート１０枚）中、約２６０ウェルにコロニーが発
現した。コロニーをつくったハイブリドーマの培養上清
を、下記の条件２のＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００３６】ＥＬＩＳＡ条件２ ９６穴プレートのコーティング：以下の４種類の抗体
を９６穴プレートにそれぞれコーティングした。コーテ
ィングに用いた各抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度のもの
を用い、プレートの各ウェルに５０μｌずつ加え、４℃
で一晩静置した。その後、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで洗浄した後、４％ＢＳＡ−０．２％ｔｗｅｅｎ
２０−ＰＢＳをブロッキング液として２００μｌずつ各
ウェルに加え、４℃で一時間静置した。 Ａ：ヤギ抗マウスμ鎖抗体（サザンバイオテクノロジー
アソシエイツ社製）でコーティングしてブロッキングし
た後、Ｌｔｋ- １７−７２の培養上清の１０倍濃縮液を
コーティングした。 Ｂ：ヤギ抗マウスμ鎖抗体（同上）でコーティングし
た。 Ｃ：ヒトＩｇＭ（μ鎖およびλ鎖）（サザンバイオテク
ノロジーアソシエイツ社製）でコーティングした。 Ｄ：ヒトＩｇＭ（μ鎖およびκ鎖）（サザンバイオテク
ノロジーアソシエイツ社製）でコーティングした。
を９６穴プレートにそれぞれコーティングした。コーテ
ィングに用いた各抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度のもの
を用い、プレートの各ウェルに５０μｌずつ加え、４℃
で一晩静置した。その後、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで洗浄した後、４％ＢＳＡ−０．２％ｔｗｅｅｎ
２０−ＰＢＳをブロッキング液として２００μｌずつ各
ウェルに加え、４℃で一時間静置した。 Ａ：ヤギ抗マウスμ鎖抗体（サザンバイオテクノロジー
アソシエイツ社製）でコーティングしてブロッキングし
た後、Ｌｔｋ- １７−７２の培養上清の１０倍濃縮液を
コーティングした。 Ｂ：ヤギ抗マウスμ鎖抗体（同上）でコーティングし
た。 Ｃ：ヒトＩｇＭ（μ鎖およびλ鎖）（サザンバイオテク
ノロジーアソシエイツ社製）でコーティングした。 Ｄ：ヒトＩｇＭ（μ鎖およびκ鎖）（サザンバイオテク
ノロジーアソシエイツ社製）でコーティングした。
【００３７】抗原抗体反応：各プレートを０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄した後、各ウェルに４％
ＢＳＡ−０．２％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを希釈液とし
て３０μｌずつ各ウェルに加え、さらに上記のハイブリ
ドーマの培養上清を３０μｌずつ各ウェルに加えて混合
し、室温で２時間静置し抗原抗体反応させた。 呈色反応：抗原抗体反応後、各プレートを０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄した後、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオ
テクノロジー社製を５００倍希釈）を検出用抗体として
１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置し
た。その後、各プレートを０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで洗浄した後、ＰＮＰＰを基質として各ウェルに
１００μｌずつ加え、室温で３０分間静置して、呈色さ
せた。
ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄した後、各ウェルに４％
ＢＳＡ−０．２％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを希釈液とし
て３０μｌずつ各ウェルに加え、さらに上記のハイブリ
ドーマの培養上清を３０μｌずつ各ウェルに加えて混合
し、室温で２時間静置し抗原抗体反応させた。 呈色反応：抗原抗体反応後、各プレートを０．０５％
ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄した後、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（サザンバイオ
テクノロジー社製を５００倍希釈）を検出用抗体として
１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置し
た。その後、各プレートを０．０５％ｔｗｅｅｎ２０−
ＰＢＳで洗浄した後、ＰＮＰＰを基質として各ウェルに
１００μｌずつ加え、室温で３０分間静置して、呈色さ
せた。
【００３８】その後、４０５ｎｍにおける吸光度を測
定した。４０５ｎｍにおける吸光度が高くなるものを陽
性とし、Ａのコーティングで陽性となり、Ｂ、Ｃおよび
Ｄのコーティングで陰性となる培養上清を産生するハイ
ブリドーマを選択した。その結果、コロニーを作った２
６０ウェルのハイブリドーマのうち１４ウェルのハイブ
リドーマが選択された。
定した。４０５ｎｍにおける吸光度が高くなるものを陽
性とし、Ａのコーティングで陽性となり、Ｂ、Ｃおよび
Ｄのコーティングで陰性となる培養上清を産生するハイ
ブリドーマを選択した。その結果、コロニーを作った２
６０ウェルのハイブリドーマのうち１４ウェルのハイブ
リドーマが選択された。
【００３９】（２）細胞表面染色 上記で陽性株として選んだハイブリドーマ１４クローン
から、ヒトプレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６の細胞表面に
発現しているプレＢ細胞レセプターとの反応が陽性とな
るクローンを選択するために、細胞表面染色を行った。
具体的には、９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０
6 個のＮａｌｍ６細胞を入れ、それぞれに各クローンの
培養上清を５０μｌ加え、室温で３０分間反応させた。
その後、二次抗体として、ＰＥ標識ヤギ抗マウスκ鎖抗
体（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ各ウェルに加えた。
から、ヒトプレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６の細胞表面に
発現しているプレＢ細胞レセプターとの反応が陽性とな
るクローンを選択するために、細胞表面染色を行った。
具体的には、９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０
6 個のＮａｌｍ６細胞を入れ、それぞれに各クローンの
培養上清を５０μｌ加え、室温で３０分間反応させた。
その後、二次抗体として、ＰＥ標識ヤギ抗マウスκ鎖抗
体（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ各ウェルに加えた。
【００４０】この試料を、ファックスキャリバー（ＦＡ
ＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）に
て測定した。交差反応性の対象として、成熟Ｂ細胞Ｄａ
ｕｄｉ、ＬＢＷ−４についても同様に細胞表面染色して
ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒにて測定した。その結果、１
４クローン中、４クローンがＮａｌｍ６で陽性となり、
ＤａｕｄｉおよびＬＢＷ−４で陰性となった。
ＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）に
て測定した。交差反応性の対象として、成熟Ｂ細胞Ｄａ
ｕｄｉ、ＬＢＷ−４についても同様に細胞表面染色して
ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒにて測定した。その結果、１
４クローン中、４クローンがＮａｌｍ６で陽性となり、
ＤａｕｄｉおよびＬＢＷ−４で陰性となった。
【００４１】（３）免疫沈降 上記４クローンの培養上清１ｍｌをプロテインＧセファ
ロース（ファルマシア社製）２０μｌと（５０％Ｖ／
Ｖ）と４℃で一晩混合した。この混合液を１００００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離して抗体が結合したプロテインＧ
セファロースを取り分けた。該プロテインＧセファロー
スを溶解液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で洗浄した。
ロース（ファルマシア社製）２０μｌと（５０％Ｖ／
Ｖ）と４℃で一晩混合した。この混合液を１００００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離して抗体が結合したプロテインＧ
セファロースを取り分けた。該プロテインＧセファロー
スを溶解液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）
で洗浄した。
【００４２】アイソトープ35Ｓメチオニン・システイン
で内部標識したプレＢ細胞Ｎａｌｍ６を１×１０5 個と
溶解液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）とを
混合し細胞溶解液を得た。抗体結合プロテインＧセファ
ロースを細胞溶解液に懸濁し、２時間混合した。この混
合液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して免疫沈降
物（上記プロテインＧセファロースに結合したＮａｌｍ
６由来の蛋白質）を取り分けた。
で内部標識したプレＢ細胞Ｎａｌｍ６を１×１０5 個と
溶解液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）とを
混合し細胞溶解液を得た。抗体結合プロテインＧセファ
ロースを細胞溶解液に懸濁し、２時間混合した。この混
合液を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して免疫沈降
物（上記プロテインＧセファロースに結合したＮａｌｍ
６由来の蛋白質）を取り分けた。
【００４３】免疫沈降物を洗浄液（１％ＮＰ−４０、６
５０ｍＭ ＮａＣｌ）約１ｍｌで洗浄することを４回繰
り返し、電気泳動用の試料とした。免疫沈降物を２−メ
ルカプトエタノール存在下で９５℃で５分間還元した
後、１３％アクリルアミドゲルに展開した。プレＢ細胞
レセプター（ヒトμ／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）の３
バンドが確認できたのは、４クローンのうち１クローン
であった。該クローンの電気泳動の結果を図２に示す。
対照には、マウスＩｇＧを含む培養上清（コントロー
ル）および抗ヒトμ鎖抗体を含む培養上清を用いた。
５０ｍＭ ＮａＣｌ）約１ｍｌで洗浄することを４回繰
り返し、電気泳動用の試料とした。免疫沈降物を２−メ
ルカプトエタノール存在下で９５℃で５分間還元した
後、１３％アクリルアミドゲルに展開した。プレＢ細胞
レセプター（ヒトμ／ヒトλ５／ヒトＶｐｒｅＢ）の３
バンドが確認できたのは、４クローンのうち１クローン
であった。該クローンの電気泳動の結果を図２に示す。
対照には、マウスＩｇＧを含む培養上清（コントロー
ル）および抗ヒトμ鎖抗体を含む培養上清を用いた。
【００４４】３）クローニング 上記最終的に残った１クローンのハイブリドーマを限界
希釈法により、９６穴プレートに１細胞／ウェルとなる
ように撒いた後、１０日間培養した。１コロニー／ウェ
ルとなったコロニーを１０個選択し、ＥＬＩＳＡ条件２
にてＥＬＩＳＡ法により、Ａのコーティングでの吸光度
を測定した。最も吸光度が高くなったハイブリドーマを
ＨＳＬ９６と名付け、該ハイブリドーマを工業技術院生
命工学工業技術研究所に１９９７年５月３０日に寄託し
た（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２５１）。なお、ハイ
ブリドーマＨＳＬ９６が産生する抗体をＨＳＬ９６抗体
と呼ぶ。
希釈法により、９６穴プレートに１細胞／ウェルとなる
ように撒いた後、１０日間培養した。１コロニー／ウェ
ルとなったコロニーを１０個選択し、ＥＬＩＳＡ条件２
にてＥＬＩＳＡ法により、Ａのコーティングでの吸光度
を測定した。最も吸光度が高くなったハイブリドーマを
ＨＳＬ９６と名付け、該ハイブリドーマを工業技術院生
命工学工業技術研究所に１９９７年５月３０日に寄託し
た（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２５１）。なお、ハイ
ブリドーマＨＳＬ９６が産生する抗体をＨＳＬ９６抗体
と呼ぶ。
【００４５】４．モノクローナル抗体の大量産生 生後７週目のＩＣＲｎｕ／ｎｕ マウス（チャールス・
リーバ社製）の腹腔にプリスタン０．５ｍｌを注入し、
その５日後に、各マウスにハイブリドーマＨＳＬ９６を
１×１０7 個注入した。約２週間後、腹水を回収し、カ
プリル酸法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ８章、３００ページ、１９８
８年 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ出版、に記載の方法）にしたがって精製
し、モノクローナル抗体を得た。モノクローナルマウス
Ｉｇアイソタイピングキット（ファーミンジェン社製）
を用いて該抗体のサブクラスがＩｇＧ1κ であることを
確認した。
リーバ社製）の腹腔にプリスタン０．５ｍｌを注入し、
その５日後に、各マウスにハイブリドーマＨＳＬ９６を
１×１０7 個注入した。約２週間後、腹水を回収し、カ
プリル酸法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ８章、３００ページ、１９８
８年 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ出版、に記載の方法）にしたがって精製
し、モノクローナル抗体を得た。モノクローナルマウス
Ｉｇアイソタイピングキット（ファーミンジェン社製）
を用いて該抗体のサブクラスがＩｇＧ1κ であることを
確認した。
【００４６】＜実施例２＞抗体の特異性の確認１ーＥＬ
ＩＳＡ法 ＥＬＩＳＡ条件２と同様の条件で、下記各試料を下記各
コーティングした抗原蛋白質と反応させ、４０５ｎｍで
の吸光度を測定した。 コーティングした抗原蛋白質： Ｌｔｋ- １７−７２の培養上清の１０倍濃縮液（プレ
Ｂ細胞レセプター） ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒトκ鎖）（１０μｇ／
ｍｌ） ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒトλ鎖）（１０μｇ／
ｍｌ） 試料： ＨＳＬ９６の培養上清（ＨＳＬ９６抗体） マウスハイブリドーマ１４１ＰＦ１１の培養上清（抗
ヒトκ鎖抗体） マウスハイブリドーマＨＰ６０５４の培養上清（抗ヒ
トλ鎖抗体） 検出用抗体：アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ抗体の５００倍希釈液 基質：ＰＮＰＰ
ＩＳＡ法 ＥＬＩＳＡ条件２と同様の条件で、下記各試料を下記各
コーティングした抗原蛋白質と反応させ、４０５ｎｍで
の吸光度を測定した。 コーティングした抗原蛋白質： Ｌｔｋ- １７−７２の培養上清の１０倍濃縮液（プレ
Ｂ細胞レセプター） ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒトκ鎖）（１０μｇ／
ｍｌ） ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒトλ鎖）（１０μｇ／
ｍｌ） 試料： ＨＳＬ９６の培養上清（ＨＳＬ９６抗体） マウスハイブリドーマ１４１ＰＦ１１の培養上清（抗
ヒトκ鎖抗体） マウスハイブリドーマＨＰ６０５４の培養上清（抗ヒ
トλ鎖抗体） 検出用抗体：アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ抗体の５００倍希釈液 基質：ＰＮＰＰ
【００４７】結果を図３に示す。プレＢ細胞レセプター
と反応するのは、ＨＳＬ９６抗体のみであり、ＨＳＬ９
６抗体はヒトμ鎖、κ鎖またはλ鎖とは反応しないこと
が分かる。
と反応するのは、ＨＳＬ９６抗体のみであり、ＨＳＬ９
６抗体はヒトμ鎖、κ鎖またはλ鎖とは反応しないこと
が分かる。
【００４８】＜実施例３＞抗体の特異性の確認２−ＦＡ
ＣＳ法 １．細胞表面免疫染色 下記細胞株とＨＳＬ９６抗体を反応させて、細胞表面染
色を行い、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉ
ｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）にて測定した。 細胞株： プレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６ プレＢ白血病細胞株ＳＭＳ−ＳＢ プレＢ白血病細胞株６９７ Ｂリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ Ｔ白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ
ＣＳ法 １．細胞表面免疫染色 下記細胞株とＨＳＬ９６抗体を反応させて、細胞表面染
色を行い、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉ
ｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）にて測定した。 細胞株： プレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６ プレＢ白血病細胞株ＳＭＳ−ＳＢ プレＢ白血病細胞株６９７ Ｂリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ Ｔ白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ
【００４９】具体的には、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２
回洗浄した各細胞を緩衝液０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳに２
×１０7 個／ｍｌになるように懸濁し、１０分間氷上で
静置した。各細胞を９６穴プレートの各ウェルに５０μ
ｌ（１×１０6 個）取り、それぞれにビオチン標識ＨＳ
Ｌ９６抗体を１μｇ／ｍｌを１００μｌ加え、室温で３
０分間反応させた。その後、ＰＥ標識ストレプトアビジ
ン（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ各ウェルに加え、発色
させた。この試料を、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳ
Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）にて測
定した。
回洗浄した各細胞を緩衝液０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳに２
×１０7 個／ｍｌになるように懸濁し、１０分間氷上で
静置した。各細胞を９６穴プレートの各ウェルに５０μ
ｌ（１×１０6 個）取り、それぞれにビオチン標識ＨＳ
Ｌ９６抗体を１μｇ／ｍｌを１００μｌ加え、室温で３
０分間反応させた。その後、ＰＥ標識ストレプトアビジ
ン（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ各ウェルに加え、発色
させた。この試料を、ファックスキャリバー（ＦＡＣＳ
Ｃａｌｉｂｕｒ、ベクトンデッキンソン社製）にて測
定した。
【００５０】結果を図４に示す。ＨＳＬ９６抗体により
プレＢ白血病細胞が免疫染色されるが、Ｂリンパ腫細胞
およびＴ白血病細胞はＨＳＬ９６によっては免疫染色さ
れないことが確認された。
プレＢ白血病細胞が免疫染色されるが、Ｂリンパ腫細胞
およびＴ白血病細胞はＨＳＬ９６によっては免疫染色さ
れないことが確認された。
【００５１】２．細胞内免疫染色 上記の細胞表面染色と同様にして、細胞および抗体を懸
濁する緩衝液を０．１％ＢＳＡ−０．０５％サポニン−
１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）−ＰＢＳとして、
細胞内染色を行い、ファックスキャリバーにて測定し
た。結果を図５に示す。ＨＳＬ９６抗体により、プレＢ
白血病細胞は細胞内も免疫染色されるが、Ｂリンパ腫細
胞およびＴ白血病細胞は細胞内も免疫染色されないこと
が確認された。
濁する緩衝液を０．１％ＢＳＡ−０．０５％サポニン−
１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）−ＰＢＳとして、
細胞内染色を行い、ファックスキャリバーにて測定し
た。結果を図５に示す。ＨＳＬ９６抗体により、プレＢ
白血病細胞は細胞内も免疫染色されるが、Ｂリンパ腫細
胞およびＴ白血病細胞は細胞内も免疫染色されないこと
が確認された。
【００５２】また、プロＢ細胞株Ｎａｌｍ１６につい
て、上記の細胞内染色と同様にして、０．１％ＢＳＡ−
０．０５％サポニン−１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．
３）−ＰＢＳ緩衝液を用いて、ＨＳＬ９６抗体で細胞内
染色を行い、ファックスキャリバーにて測定した。。結
果を図６に示す。ＨＳＬ９６抗体により、プロＢ細胞で
あっても、サポニン緩衝液を用いることで細胞内免疫染
色が可能であることが示された。
て、上記の細胞内染色と同様にして、０．１％ＢＳＡ−
０．０５％サポニン−１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．
３）−ＰＢＳ緩衝液を用いて、ＨＳＬ９６抗体で細胞内
染色を行い、ファックスキャリバーにて測定した。。結
果を図６に示す。ＨＳＬ９６抗体により、プロＢ細胞で
あっても、サポニン緩衝液を用いることで細胞内免疫染
色が可能であることが示された。
【００５３】３．形質転換体Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の
細胞内免疫染色 マウスミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２３巻、１５４８ページ参照）に実
施例１の１．で作製したヒトλ５遺伝子またはヒトＶｐ
ｒｅＢ遺伝子をエレクトロポーレーション法により下記
の３通りに導入し、形質転換体を作製した。 λ５のみを導入（Ｘ６３／λ５） ＶｐｒｅＢのみを導入（Ｘ６３／ＶｐｒｅＢ） λ５およびＶｐｒｅＢを導入（Ｘ６３／λ＋Ｖ）
細胞内免疫染色 マウスミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１２３巻、１５４８ページ参照）に実
施例１の１．で作製したヒトλ５遺伝子またはヒトＶｐ
ｒｅＢ遺伝子をエレクトロポーレーション法により下記
の３通りに導入し、形質転換体を作製した。 λ５のみを導入（Ｘ６３／λ５） ＶｐｒｅＢのみを導入（Ｘ６３／ＶｐｒｅＢ） λ５およびＶｐｒｅＢを導入（Ｘ６３／λ＋Ｖ）
【００５４】上記の各形質転換体について、上記と同様
にサポニン緩衝液を用いて細胞内免疫染色を行い、ファ
ックスキャリバーにて測定した。結果を図７に示す。Ｈ
ＳＬ９６抗体は、組み換えＶｐｒｅＢ分子とは反応する
が、組み換えλ５分子とは反応しないことが確認され
た。
にサポニン緩衝液を用いて細胞内免疫染色を行い、ファ
ックスキャリバーにて測定した。結果を図７に示す。Ｈ
ＳＬ９６抗体は、組み換えＶｐｒｅＢ分子とは反応する
が、組み換えλ５分子とは反応しないことが確認され
た。
【００５５】＜実施例４＞抗体の特異性の確認３−免疫
沈降 ハイブリドーマＨＳＬ９６の培養上清を実施例１の３．
の２）の（３）免疫沈降と同様の方法で、Ｎａｌｍ６お
よび実施例３で作製した３種のＸ６３−Ａｇ８．６５３
形質転換体と反応させ、免疫沈降した。コントロールに
は、アイソタイプが同じ抗体を含む培養上清と反応させ
たプロテインＧセファロースと各細胞の溶解液とを反応
させ、遠心分離したものを用いた。また、ポジティブコ
ントロールとしてＡ８（ヒトλＬ鎖およびヒトλ５に反
応する抗体）で遠心分離することも行った。結果を図８
ないし図１１に示す。各図で左端のレーンがＡ８で免疫
沈降した結果、中央がコントロールの結果、右端がハイ
ブリドーマＨＳＬ９６の培養上清で免疫沈降した結果を
示す。各図においてバンドの濃さをコントロールと比較
することにより、ＦＡＣＳ法の結果と同様に、ＨＳＬ９
６抗体は、組み換えＶｐｒｅＢ分子とは反応するが、組
み換えλ５分子とは反応しないことが確認された。ま
た、ＥＬＩＳＡ法の結果と同様にＮａｌｍ６とＨＳＬ９
６抗体が反応することも確認された。
沈降 ハイブリドーマＨＳＬ９６の培養上清を実施例１の３．
の２）の（３）免疫沈降と同様の方法で、Ｎａｌｍ６お
よび実施例３で作製した３種のＸ６３−Ａｇ８．６５３
形質転換体と反応させ、免疫沈降した。コントロールに
は、アイソタイプが同じ抗体を含む培養上清と反応させ
たプロテインＧセファロースと各細胞の溶解液とを反応
させ、遠心分離したものを用いた。また、ポジティブコ
ントロールとしてＡ８（ヒトλＬ鎖およびヒトλ５に反
応する抗体）で遠心分離することも行った。結果を図８
ないし図１１に示す。各図で左端のレーンがＡ８で免疫
沈降した結果、中央がコントロールの結果、右端がハイ
ブリドーマＨＳＬ９６の培養上清で免疫沈降した結果を
示す。各図においてバンドの濃さをコントロールと比較
することにより、ＦＡＣＳ法の結果と同様に、ＨＳＬ９
６抗体は、組み換えＶｐｒｅＢ分子とは反応するが、組
み換えλ５分子とは反応しないことが確認された。ま
た、ＥＬＩＳＡ法の結果と同様にＮａｌｍ６とＨＳＬ９
６抗体が反応することも確認された。
【００５６】＜実施例５＞免疫染色した細胞の顕微鏡で
の観察 １．免疫染色したプレＢ細胞の顕微鏡での観察 プレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６を実施例３の１．と同様
にして、ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と反応させて細胞
内を免疫染色した。ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを
ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と反応させ、その蛍光を蛍
光顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。ＦＩＴＣの
蛍光が観察される細胞がＮａｌｍ６である。これによ
り、ＨＳＬ９６抗体を反応させて細胞内免疫染色した結
果、顕微鏡観察することで、容易にプレＢ細胞を検出す
ることができることが確認された。
の観察 １．免疫染色したプレＢ細胞の顕微鏡での観察 プレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６を実施例３の１．と同様
にして、ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と反応させて細胞
内を免疫染色した。ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを
ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と反応させ、その蛍光を蛍
光顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。ＦＩＴＣの
蛍光が観察される細胞がＮａｌｍ６である。これによ
り、ＨＳＬ９６抗体を反応させて細胞内免疫染色した結
果、顕微鏡観察することで、容易にプレＢ細胞を検出す
ることができることが確認された。
【００５７】２．免疫染色したプロＢ細胞の顕微鏡での
観察 プロＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ２７を実施例３の２．と同
様にして、ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と、サポニン緩
衝液を用いて反応させて細胞内を免疫染色した。ＦＩＴ
Ｃ標識ストレプトアビジンをビオチン標識ＨＳＬ９６抗
体と反応させ、その蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果
を図１３に示す。図１３（Ａ）がＨＳＬ９６抗体を反応
させた結果の顕微鏡写真であり、図１３（Ｂ）が対照と
してＨＳＬ９６抗体の代わりにマウスＩｇＧ1κ を反応
させた場合の顕微鏡写真である。ＦＩＴＣの蛍光が観察
される細胞がＮａｌｍ２７である。これにより、ＨＳＬ
９６抗体をプロＢ細胞に反応させて細胞内免疫染色した
結果、顕微鏡観察することで、容易にプレＢ細胞を検出
することができることが確認された。
観察 プロＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ２７を実施例３の２．と同
様にして、ビオチン標識ＨＳＬ９６抗体と、サポニン緩
衝液を用いて反応させて細胞内を免疫染色した。ＦＩＴ
Ｃ標識ストレプトアビジンをビオチン標識ＨＳＬ９６抗
体と反応させ、その蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果
を図１３に示す。図１３（Ａ）がＨＳＬ９６抗体を反応
させた結果の顕微鏡写真であり、図１３（Ｂ）が対照と
してＨＳＬ９６抗体の代わりにマウスＩｇＧ1κ を反応
させた場合の顕微鏡写真である。ＦＩＴＣの蛍光が観察
される細胞がＮａｌｍ２７である。これにより、ＨＳＬ
９６抗体をプロＢ細胞に反応させて細胞内免疫染色した
結果、顕微鏡観察することで、容易にプレＢ細胞を検出
することができることが確認された。
【００５８】上記の実施例２ないし４の特異性の結果
を、表２に示す。
を、表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】本発明のＨＳＬ９６抗体は、組み換えＶｐ
ｒｅＢ分子単体と反応することが確かめられているの
で、プロＢ細胞と細胞内においてＶｐｒｅＢ分子と反応
していることが考えられる。本発明のＨＳＬ９６抗体
は、プレＢ細胞およびプロＢ細胞のいずれについても細
胞内染色が可能であるが、従来の抗体ではこのような知
見はない。また、本発明のＨＳＬ９６抗体は、実施例５
で示したように、免疫染色した細胞を顕微鏡で観察する
ことが可能であるが、従来の抗体ではこのような知見は
ない。
ｒｅＢ分子単体と反応することが確かめられているの
で、プロＢ細胞と細胞内においてＶｐｒｅＢ分子と反応
していることが考えられる。本発明のＨＳＬ９６抗体
は、プレＢ細胞およびプロＢ細胞のいずれについても細
胞内染色が可能であるが、従来の抗体ではこのような知
見はない。また、本発明のＨＳＬ９６抗体は、実施例５
で示したように、免疫染色した細胞を顕微鏡で観察する
ことが可能であるが、従来の抗体ではこのような知見は
ない。
【００６１】
【発明の効果】本発明の抗体は、ヒトプレＢ細胞レセプ
ターの代替軽鎖のＶｐｒｅＢに反応して、λ５とは反応
しないが、ＶｐｒｅＢが軽鎖の可変領域に相当し、λ５
が定常領域に相当することから、本発明の抗体は、ヒト
プレＢ細胞に反応する抗体の中でも、その特異性が高い
ものである。
ターの代替軽鎖のＶｐｒｅＢに反応して、λ５とは反応
しないが、ＶｐｒｅＢが軽鎖の可変領域に相当し、λ５
が定常領域に相当することから、本発明の抗体は、ヒト
プレＢ細胞に反応する抗体の中でも、その特異性が高い
ものである。
【００６２】本発明の抗体により、ヒトのリンパ球の中
からヒトプレＢ細胞またはヒトプロＢ細胞の識別が可能
である。白血病の疑いのある患者の血液等の検体からリ
ンパ球を分離し、該リンパ球を本発明の抗体で免疫染色
して顕微鏡で観察する。このとき、細胞表面が染色され
ているのが観察された場合、該細胞はヒトプレＢ細胞で
あると特定でき、該患者がヒトプレＢ細胞の異常増殖に
よる白血病に罹患していると診断することが可能であ
る。このように本発明の抗体は、検体を顕微鏡で観察す
ることにより診断を可能とするので、臨床診断の効率を
飛躍的に向上させる。
からヒトプレＢ細胞またはヒトプロＢ細胞の識別が可能
である。白血病の疑いのある患者の血液等の検体からリ
ンパ球を分離し、該リンパ球を本発明の抗体で免疫染色
して顕微鏡で観察する。このとき、細胞表面が染色され
ているのが観察された場合、該細胞はヒトプレＢ細胞で
あると特定でき、該患者がヒトプレＢ細胞の異常増殖に
よる白血病に罹患していると診断することが可能であ
る。このように本発明の抗体は、検体を顕微鏡で観察す
ることにより診断を可能とするので、臨床診断の効率を
飛躍的に向上させる。
【００６３】また、サポニン緩衝液を使用して、リンパ
球内を、本発明の抗体で免疫染色して顕微鏡で観察した
とき、細胞が染色されているのが観察された場合、該細
胞はヒトプレＢ細胞またはヒトプロＢ細胞であると特定
することができ、その患者がヒトプレＢ細胞またはヒト
プロＢ細胞の異常増殖による白血病に罹患していると診
断することが可能である。
球内を、本発明の抗体で免疫染色して顕微鏡で観察した
とき、細胞が染色されているのが観察された場合、該細
胞はヒトプレＢ細胞またはヒトプロＢ細胞であると特定
することができ、その患者がヒトプレＢ細胞またはヒト
プロＢ細胞の異常増殖による白血病に罹患していると診
断することが可能である。
【００６４】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGAACTCGAG CCACAAGGAC CTCTGACCCT 30
【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGAAGCGGCC GCAGGCCTTT GGGTGGGGTC GG 32
【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGAACTCGAG GGAGTCAGAG CTCTGCATGT 30
【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGAAGCGGCC GCAGGGGATG CGTGCCTCTG CT 32
【図１】本発明の抗体を作製するために免疫原に用いた
キメラのプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒトλ５
／ヒトＶｐｒｅＢ）の電気泳動写真である。
キメラのプレＢ細胞レセプター（マウスμ鎖／ヒトλ５
／ヒトＶｐｒｅＢ）の電気泳動写真である。
【図２】免疫沈降によるスクリーニングで選択されたハ
イブリドーマの培養上清を用いた免疫沈降物の電気泳動
の結果を表す電気泳動写真である。
イブリドーマの培養上清を用いた免疫沈降物の電気泳動
の結果を表す電気泳動写真である。
【図３】プレＢ細胞レセプター、ヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖
およびヒトκ鎖）またはヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒ
トλ鎖）に対する本発明のＨＳＬ９６抗体、抗ヒトκ鎖
抗体または抗ヒトλ鎖抗体のそれぞれのＥＬＩＳＡの結
果を示す図である。
およびヒトκ鎖）またはヒトＩｇＭ（ヒトμ鎖およびヒ
トλ鎖）に対する本発明のＨＳＬ９６抗体、抗ヒトκ鎖
抗体または抗ヒトλ鎖抗体のそれぞれのＥＬＩＳＡの結
果を示す図である。
【図４】本発明のＨＳＬ９６抗体により、各細胞の細胞
表面を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図で
ある。
表面を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図で
ある。
【図５】本発明のＨＳＬ９６抗体により、各細胞の細胞
内を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図であ
る。
内を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図であ
る。
【図６】本発明のＨＳＬ９６抗体により、プロＢ細胞の
細胞内を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図
である。
細胞内を免疫染色してＦＡＣＳで測定した結果を示す図
である。
【図７】本発明のＨＳＬ９６抗体により、ヒトλ５遺伝
子またはヒトＶｐｒｅＢ遺伝子を導入した形質転換体お
よびヒトプレＢ細胞の細胞内を免疫染色してＦＡＣＳで
測定した結果を表す図である。
子またはヒトＶｐｒｅＢ遺伝子を導入した形質転換体お
よびヒトプレＢ細胞の細胞内を免疫染色してＦＡＣＳで
測定した結果を表す図である。
【図８】本発明のＨＳＬ９６抗体により、ヒトプレＢ細
胞を免疫沈降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す
電気泳動写真である。
胞を免疫沈降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す
電気泳動写真である。
【図９】本発明のＨＳＬ９６抗体により、ヒトλ５遺伝
子を導入した形質転換体およびヒトプレＢ細胞を免疫沈
降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す電気泳動写
真である。
子を導入した形質転換体およびヒトプレＢ細胞を免疫沈
降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す電気泳動写
真である。
【図１０】本発明のＨＳＬ９６抗体により、ヒトＶｐｒ
ｅＢ遺伝子を導入した形質転換体およびヒトプレＢ細胞
を免疫沈降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す電
気泳動写真である。
ｅＢ遺伝子を導入した形質転換体およびヒトプレＢ細胞
を免疫沈降して免疫沈降物を電気泳動した結果を表す電
気泳動写真である。
【図１１】本発明のＨＳＬ９６抗体により、ヒトλ５遺
伝子およびヒトＶｐｒｅＢ遺伝子を導入した形質転換体
およびヒトプレＢ細胞を免疫沈降して免疫沈降物を電気
泳動した結果を表す電気泳動写真である。
伝子およびヒトＶｐｒｅＢ遺伝子を導入した形質転換体
およびヒトプレＢ細胞を免疫沈降して免疫沈降物を電気
泳動した結果を表す電気泳動写真である。
【図１２】プレＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ６をＨＳＬ９６
抗体と反応させて細胞内を免疫染色してＦＩＴＣにより
発色させた結果を示す顕微鏡写真である。
抗体と反応させて細胞内を免疫染色してＦＩＴＣにより
発色させた結果を示す顕微鏡写真である。
【図１３】プロＢ白血病細胞株Ｎａｌｍ１６をＨＳＬ９
６抗体とサポニン緩衝液を用いて反応させて細胞内を免
疫染色してＦＩＴＣにより発色させた結果を示す顕微鏡
写真である。図１３（Ａ）がＨＳＬ９６抗体を反応させ
た結果であり、図１３（Ｂ）が対照としてマウスＩｇＧ
1κ を反応させた結果である。
６抗体とサポニン緩衝液を用いて反応させて細胞内を免
疫染色してＦＩＴＣにより発色させた結果を示す顕微鏡
写真である。図１３（Ａ）がＨＳＬ９６抗体を反応させ
た結果であり、図１３（Ｂ）が対照としてマウスＩｇＧ
1κ を反応させた結果である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年７月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【図６】
【図１】
【図４】
【図７】
【図２】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトプレＢ細胞の表面に発現しているヒ
トプレＢ細胞レセプターを構成する代替軽鎖のＶｐｒｅ
Ｂ分子およびヒトプロＢ細胞内に発現しているＶｐｒｅ
Ｂ分子と反応し、代替軽鎖のλ５分子とは反応せず、か
つ該抗体の反応性が、該抗体によりヒトプレＢ細胞また
はヒトプロＢ細胞を免疫染色して顕微鏡で観察すること
が可能な程度の反応性であることを特徴とする抗ヒトプ
レＢ細胞レセプター抗体またはその活性フラグメント。 - 【請求項２】 ハイブリドーマＨＳＬ９６（工業技術院
生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６２５
１で寄託されているハイブリドーマ）が産生するモノク
ローナル抗体またはその活性フラグメントである請求項
１に記載の抗体またはその活性フラグメント。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の抗体またはそ
の活性フラグメントにより検体中のヒトプロＢ細胞を免
疫染色して該ヒトプロＢ細胞を検出するヒトプロＢ細胞
の検出方法であって、ヒトプロＢ細胞内のＶｐｒｅＢ分
子を免疫染色するときにサポニン緩衝液を用いることを
特徴とするヒトプロＢ細胞の検出方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9202684A JPH1142087A (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法 |
| EP98935272A EP1001020A4 (en) | 1997-07-29 | 1998-07-29 | TEMPERED ANTIBODIES TO HUMAN PRE-B CELLS |
| PCT/JP1998/003384 WO1999006541A1 (fr) | 1997-07-29 | 1998-07-29 | Anticorps du recepteur des cellules pre-b non humaines |
| US09/494,252 US6335175B1 (en) | 1997-07-29 | 2000-01-31 | Anti-human pre-B cell receptor antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9202684A JPH1142087A (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1142087A true JPH1142087A (ja) | 1999-02-16 |
Family
ID=16461450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9202684A Withdrawn JPH1142087A (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1142087A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003500015A (ja) * | 1999-03-31 | 2003-01-07 | モア−リサーチ・アプリケーシヨンズ・リミテツド | モノクローナル抗体、抗原ならびに悪性疾患の診断および治療 |
| EP3253408A4 (en) * | 2015-02-05 | 2018-09-26 | Stc.Unm | Anti-pre-bcr antagonists and methods |
| JP2022514423A (ja) * | 2018-12-20 | 2022-02-10 | アー・ファウ・アー ライフサイエンス ゲー・エム・ベー・ハー | 生物学的結合分子の選別方法 |
| US12285494B2 (en) | 2021-02-16 | 2025-04-29 | Children's Health Care | Methods for treating B-ALL by administering a pre-BCR complex antagonist |
-
1997
- 1997-07-29 JP JP9202684A patent/JPH1142087A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003500015A (ja) * | 1999-03-31 | 2003-01-07 | モア−リサーチ・アプリケーシヨンズ・リミテツド | モノクローナル抗体、抗原ならびに悪性疾患の診断および治療 |
| EP3253408A4 (en) * | 2015-02-05 | 2018-09-26 | Stc.Unm | Anti-pre-bcr antagonists and methods |
| US10988533B2 (en) | 2015-02-05 | 2021-04-27 | Unm Rainforest Innovations | Anti-pre-BCR antagonists and methods |
| JP2022514423A (ja) * | 2018-12-20 | 2022-02-10 | アー・ファウ・アー ライフサイエンス ゲー・エム・ベー・ハー | 生物学的結合分子の選別方法 |
| US12285494B2 (en) | 2021-02-16 | 2025-04-29 | Children's Health Care | Methods for treating B-ALL by administering a pre-BCR complex antagonist |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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