CN110036112B - 引发受主要组织相容性复合体e分子限制的t细胞的巨细胞病毒载体 - Google Patents

Abstract

公开了缺乏活性UL128、UL130、UL146和UL147蛋白的CMV载体，其还可以包含限制CMV表达的一种或多种微小RNA调节元件(MRE)。用所公开的CMV载体免疫允许选择不同的CD8+T细胞应答‑受MHC‑Ia、MHC‑II或MHC‑E限制的CD8+T细胞。

Description

引发受主要组织相容性复合体E分子限制的T细胞的巨细胞病 毒载体

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月18日提交的美国临时申请第62/409,840号的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及巨细胞病毒(CMV)载体在免疫中的用途，更具体地说，涉及巨细胞病毒(CMV)载体在产生以MHC-E限制为特征的T细胞应答中的用途。特定的实施例涉及受MHC-E限制的CD8+T细胞的产生。

致谢政府支持

本公开是在美国政府的支持下根据美国国立卫生研究院授予的授权号P01AI094417和R01 AI117802的条款创建的。美国政府拥有本公开的某些权利。

参考通过EFS-WEB电子提交的序列表

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发明内容

本文公开了遗传修饰的CMV疫苗载体。在遗传修饰的CMV疫苗载体的实施例中，本文所述的遗传修饰改变了由CMV疫苗载体引发的CD8+T细胞应答的表位靶向和主要组织相容性复合体(MHC)限制，包括引发识别由细胞表面MHC-II和MHC-E蛋白限制的独特表位的CD8+T细胞应答的能力。由本文所述的CMV疫苗载体引发的MHC-II和MHC-E限制性CD8+T细胞应答是非常规的，并且在对感染因子的天然免疫应答中很少观察到。此外，对于未经遗传修饰的CMV疫苗载体，未观察到由本文所述的CMV疫苗载体引发的MHC-II和MHC-E限制性CD8+T细胞应答的广度和效力。在一些实施例中，并且不受特定理论的束缚，本发明人认为MHC-E限制性CD8+T细胞可利用对MHC-E限制性免疫应答缺乏病原体和肿瘤免疫逃避适应，并且可以主要或仅引发这种应答的本文所述的遗传修饰的CMV疫苗载体为针对靶向病原体和肿瘤的独特有效疫苗提供了可能。与该假设一致的是发现只有引发MHC-E限制性CD8+T细胞的疫苗在非人灵长类动物模型中保护免受AIDS攻击。此外，MHC-E具有有限的多态性，使得靶向MHC-E限制性表位的保护性应答在个体中是保守的。因此，在一些实施例中，本文所述的遗传修饰的CMV疫苗载体引发在遗传多样性个体之间共享的MHC-E限制性T细胞应答。

本文公开了CMV载体，所述CMV载体包含第一核酸序列，其编码至少一种异源抗原；和第二核酸序列，其包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA的存在下沉默表达的微小RNA识别元件(MRE)。MRE与CMV基因可操作地连接，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强其生长。所述载体不表达：活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；

本文还公开了CMV载体，所述CMV载体包含第一核酸序列，其编码至少一种异源抗原；第二核酸序列，其包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA的存在下沉默表达的MRE；和第三核酸序列，其包含在由髓细胞谱系细胞表达的微小RNA的存在下沉默表达的MRE。MRE与CMV基因可操作地连接，所述CMV基因对于CMV生长是必需的或增强其生长。所述载体不表达：活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；

本文还公开了人巨细胞病毒(HCMV)载体，所述HCMV载体包含第一核酸序列，其编码至少一种异源抗原。所述载体不表达：活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；

本文还公开了在受试者中产生对至少一种异源抗原的免疫应答的方法。该方法包括以有效引发对至少一种异源抗原的CD8+T细胞应答的量向所述受试者施用本文公开的类型的CMV载体。在一些实施例中，由所述载体引发的CD8+T细胞的至少10％受MHC-E或其直系同源物的限制。在另外的实施例中，由所述载体引发的CD8+T细胞的少于10％受多态性MHC-Ia类或其直系同源物的限制。在替代实施例中，由所述载体引发的CD8+T细胞的至少50％受MHC-Ia类或其直系同源物的限制。在又其他实施例中，由所述载体引发的CD8+T细胞的至少10％受MHC-II或其直系同源物的限制。

本文公开的CMV载体的异源抗原可以是任何异源抗原，包括衍生自例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫属寄生虫和结核分枝杆菌的病原体特异性抗原。在其他实施例中，异源抗原可以是肿瘤抗原，包括例如与急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌和生殖细胞肿瘤相关的肿瘤抗原。在一些实施例中，异源抗原可以是组织特异性抗原或宿主自身抗原，包括例如衍生自T细胞受体可变区的抗原或源自B细胞受体可变区的抗原。

本文还公开了产生识别MHC-E-肽复合物的CD8+T细胞的方法。该方法包括以有效产生识别MHC-E/肽复合物的一组CD8+T细胞的量向第一受试者施用CMV载体。CMV载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；在一些实施例中，CMV载体还包含第二核酸序列，其包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的MRE。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤抗原、自身抗原或组织特异性抗原。在一些实施例中，该方法可以进一步包括从CD8+T细胞组鉴定第一CD8+T细胞受体，其中第一CD8+T细胞受体(TCR)识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物。在一些实施例中，通过DNA或RNA测序鉴定第一CD8+T细胞受体。在一些实施例中，该方法可以进一步包括用表达载体转染从第一受试者或第二受试者分离的一个或多个T细胞，其中表达载体包含编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列，其中所述第二CD8+T细胞受体包含第一CD8+T细胞受体的CDR3α和CDR3β，从而产生识别MHC-E/异源抗原衍生肽复合物的一个或多个转染CD8+T细胞。在一些实施例中，该方法可以进一步包括向第一或第二受试者施用转染的CD8+T细胞以治疗疾病，例如癌症、病原体感染或自身免疫性疾病或病症。在一些实施例中，该方法可以进一步包括向第一或第二受试者施用转染的CD8+T细胞以诱导对自身抗原或组织特异性抗原的自身免疫应答。

本文还公开了识别MHC-E-肽复合物的转染的CD8+T细胞，所述MHC-E-肽复合物通过包括以下步骤的方法制备：(1)以有效产生识别MHC-E/肽复合物的一组CD8+T细胞的量向第一受试者施用CMV载体，(2)从所述CD8+T细胞组鉴定第一CD8+T细胞受体，其中第一CD8+T细胞受体识别MHC-E/异源抗原衍生的复合物；(3)从第一受试者或第二受试者中分离一个或多个CD8+T细胞；以及(4)用表达载体转染从第一或第二受试者分离的一个或多个CD8+T细胞，从而产生识别MHC-E-肽复合物的转染T细胞。CMV载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；在一些实施例中，CMV载体还包含第二核酸序列，其包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的MRE。表达载体包含编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列和与编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二CD8+T细胞受体包含第一CD8+T细胞受体的CDR3α和CDR3β。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤抗原、自身抗原或组织特异性抗原。本文还公开了治疗疾病，例如癌症、病原体感染或自身免疫性疾病或病症的方法，该方法包括向第一或第二受试者施用识别MHC-E-肽复合物的转染的CD8+T细胞。

附图说明

通过以下结合附图的详细描述将容易理解实施例。通过示例而非限制的方式在附图的图中示出了实施例。

图1显示了由差异编程的RhCMV/SIVgag载体引发的SIVgag特异性CD8+T细胞的表位靶向和MHC限制。使用流式细胞术细胞内细胞因子染色(ICS)对由指定的RhCMV载体引发的SIVgag特异性CD8+T细胞应答进行表位作图，以检测125个连续15mer gag肽(具有11个氨基酸重叠)的识别。产生特异性CD8+T细胞应答的单个肽用框表示，框的模式指定MHC限制，如通过用抗-pan-MHC-I mAb W6/32(其阻断对非多态性MHC-E和多态性MHC-Ia分子两者的识别)，MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP阻断所测定的。MHC-Ia、MHC-E-和MHC-II-限制分别是基于单独的W6/32(无填充)，单独的VL9(对角线阴影标记)和单独的CLIP(水平阴影标记)阻断>90％的应答，不符合这些标准的应答标记为不确定(实心填充)。箭头表示MHC-II超级表位(水平阴影标记)和MHC-E超级表位MHC-E超级表位(对角线阴影标记)。

图2显示了未接种疫苗(n＝15；下图)或用以下疫苗接种的恒河猴(RM)的重复，限制剂量，直肠内SIVmac239攻击的结果：毒株68-1RhCMV/SIV载体(n＝15；左上图)；毒株68-1.2RhCMV载体(n＝15；中上图)；或UL128缺失的(ΔUL128)68-1.2RhCMV载体(n＝14；右上图)。所有载体表达相同的SIV Gag，Retanef(Rev/Nef/Tat融合)和5'-Pol插入物。

图3显示了CyCMV构建体的测序覆盖图。在CyCMV-BAC的下一代测序中，将通过质量控制的所有测序读数与CyCMV-BAC的从头组装的共有序列比对。显示了每种构建体的共有序列的ORF图。顶部条表示给定BAC与亲本BAC序列之间的核苷酸同一性百分比，深灰色为100％相同。替换Cy13.1ORF的SIVgag序列和HCMV UL128、UL130、UL146和UL147的CyCMV同源物在顶部条中以浅灰色描绘。亲本BAC和CyCMVΔRL13/Gag之间唯一的序列差异是用SIVgag替换RL13的CyCMV同源物。CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130另外缺乏UL128和UL130的同源物，而在CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130ΔUL146-147中另外缺失HCCMV UL146和UL147的六种同源物。在多数序列中不存在不需要的重组或假突变。

图4显示了通过克隆到细菌人工染色体(31908)中产生的CyCMV构建体的示意图，并且该构建体缺失单独的与HCMV UL128和UL130同源的基因(ΔUL128-UL130)，或其与HCMVUL146和UL147同源的六个基因家族的组合(ΔUL128-UL130+ΔUL146/7家族)。

图5A至5C显示了来自CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130载体接种的食蟹猴的外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞术图。图5A显示了来自CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130载体接种的食蟹猴的PBMC的流式细胞术图，所述食蟹猴用4个氨基酸重叠的15mer SIVgag肽(GAGORF)或用对应于MHC-II或MHC-E超级表位的指示SIVgag肽进行刺激(Gag53＝对应于SIVmac239的gag蛋白中的氨基酸序列211-222的肽；Gag73＝AA 290-301，Gag69＝AA 276-284，Gag120＝AA 482-490)。图5B显示了在pan-MHC-I阻断mAb W6/32(抗MHC-I阻断MHC-E和MHC-Ia)，MHC-II结合CLIP肽(抗MHC-II)或MHC-E结合VL9肽(抗MHC-E)存在下，与非超级表位MHC-II或MHC-Ia限制性肽(Gag12＝SIVmac239gag中的AA 45-59，Gag33＝132-140AA)一起孵育后CD8+T细胞的代表性流式细胞术图。图5C显示了使用流式细胞术ICS检测125个连续15mer gag肽(具有11个氨基酸重叠)的识别的SIVgag特异性CD8+T细胞的表位靶向和MHC限制。产生特异性CD8+T细胞应答的单个肽用框表示，框的模式指定MHC限制，如通过用抗-pan-MHC-I mAb W6/32，MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP阻断所测定的。MHC-Ia-、MHC-E-和MHC-II-限制分别是基于单独的W6/32(从左下角到右上角的阴影标记)，单独的VL9(从右下角到左上角的阴影标记；水平阴影标记)和单独的CLIP(实心填充)阻断>90％的应答，不符合这些标准的应答标记为不确定(无填充)。

图6A至6C显示了来自CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130ΔUL146-147载体接种的食蟹猴的PBMC的流式细胞术图。图6A显示来自CyCMVΔRL13/GagΔUL128-130ΔUL146-147载体接种的食蟹猴的PBMC的流式细胞术图，所述食蟹猴用4个氨基酸重叠的15mer SIVgag肽(GAG ORF)或用对应于MHC-II或MHC-E超级表位的指示SIVgag肽进行刺激。图6B显示了在pan-MHC-I阻断mAb W6/32(抗MHC-I)，MHC-II结合CLIP肽(抗MHC-II)或MHC-E结合VL9肽(抗MHC-E)存在下，与超级表位MHC-II或MHC-E限制性肽一起孵育后CD8+T细胞的代表性流式细胞术图。图6C显示了使用流式细胞术ICS检测125个连续15mer gag肽(具有11个氨基酸重叠)的识别的SIVgag特异性CD8+T细胞的表位靶向和MHC限制。产生特异性CD8+T细胞应答的单个肽用框表示，框的模式指定MHC限制，如通过用抗-pan-MHC-I mAb W6/32，MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP阻断所测定的。MHC-Ia-、MHC-E-和MHC-II-限制分别是基于单独的W6/32(从左下角到右上角的阴影标记)，单独的VL9(从右下角到左上角的阴影标记；水平阴影标记)和单独的CLIP(实心填充)阻断>90％的应答，不符合这些标准的应答标记为不确定(无填充)。

图7显示了通过将68-1基因改造成野生型全长基因组(FL)而产生的RhCMV分离株68-1和RhCMV构建体的示意图。Fl的某些构建体缺失单独的与HCMV UL128和UL130同源的RhCMV基因(ΔUL128-UL130)，或其与HCMV UL146和UL147同源的六个RhCMV基因家族的组合(ΔUL128-UL130+ΔUL146/7家族)。

图8A至8D显示了用所示构建体接种的恒河猴中对整个SIVgag(使用重叠肽)或指示的MHC-E或MHC-II限制性“超级表位”肽的CD8+T细胞应答。在接种后的指示天数通过PBMC的ICS测量T细胞应答。图8A显示了用FL-RhCMVΔRL13gag接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。图8B显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。图8C显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130ΔUL146(3)接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。图8D显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130ΔUL147(6)接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。

图9A至9C显示了用所示构建体接种的恒河猴中对整个SIVgag(使用重叠肽)或指示的MHC-E或MHC-II限制性“超级表位”肽的CD8+T细胞应答。在接种后的指示天数通过PBMC的ICS测量T细胞应答。图9A显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130HCMVUL146-UL147接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。图9B显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130HCMVUL146接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。图9C显示了用FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-UL130HCMVUL147接种的恒河猴的CD8+T细胞应答。

图10显示了通过galK重组产生RhCMV Rh156/Rh108miR-126-3p突变病毒的示意图。Rh156和Rh108分别是必需HCMV基因UL122(IE2)和UL79的RhCMV同源物。

图11是显示所示细胞类型(恒河猴肺成纤维细胞、恒河猴脐静脉内皮细胞、源自CD14+单核细胞的恒河猴巨噬细胞，其获自PBMC并在m-CSF存在下培养10天)中miR-126-3p表达的柱状图。通过qPCR从10ng RNA测量MiR表达。拷贝数由标准曲线测定。

图12显示了一组两个图，表明使用以miR-126-3p模拟物(“+miR-126”)或对照miRNA(“+Neg”)转染的恒河猴成纤维细胞中的RhCMV 68-1RTN Rh156/Rh108miR-126-3p(“68-1miR-126”)病毒或RhCMV 68-1RTN Rh156/Rh108miR-126突变体(“68-1miR-126mut”)病毒的多步生长曲线。毒株68-1RhCMV缺乏HCMV UL128和UL130以及UL146和UL147的同源物。RTN＝通过EF1a启动子表达并插入RhCMV基因Rh211中的SIVmac239的rev、tat和nef蛋白的融合蛋白。该病毒在每个Rh156和Rh108的3'-非翻译区中含有mir126-3p的四种靶向序列。

图13显示了一组两个图，表明使用内皮细胞中的RhCMV 68-1.2Rh156/Rh108miR-126-3p(“68-1.2miR-126”)病毒或RhCMV 68-1Rh156/Rh108miR-126突变体(“68-1.2miR-126mut”)病毒的多步生长曲线。毒株68-1.2含有另一RhCMV毒株的UL128和UL130同源物，并且缺失UL146和UL147的同源物。该病毒在每个Rh156和Rh108的3'-非翻译区中含有mir126-3p的四种靶向序列。

图14显示了用68-1RhCMVmiR126/SIVgag接种的恒河猴(RM)的SIVgag特异性T细胞频率和SIVgag特异性CD8+T细胞的相关表位靶向和MHC限制。毒株68-1RhCMV缺乏HCMVUL128和UL130以及UL146和UL147的同源物。SIVmac239的SIVgag通过EF1a启动子表达并插入RhCMV基因Rh211中。该病毒在每个Rh156和Rh108的3'-非翻译区中含有mir126-3p的四种靶向序列。

图14的上图显示了在接种68-1RhCMVmir126/SIVgag的2RM中随时间测量的SIVgag特异性T细胞频率。左上图显示了每只RM中对SIVgag的CD4+和CD8+T细胞应答，以及4个氨基酸重叠并覆盖整个SIVgag蛋白的125个重叠的15mer肽的池。上中图显示了每只RM中对由MHC-E呈现的两个SIVgag超级表位肽Gag69和Gag120的CD8+T细胞应答。右上图显示了每只RM中对由MHC-II呈现的两个SIVgag超级表位肽Gag53和Gag73的CD8+T细胞应答。图14的下图显示了SIVgag特异性CD8+T细胞的表位靶向和MHC限制，其中各个肽导致由框指示的特异性CD8+T细胞应答。框的模式指定MHC限制，如通过用抗-pan-MHC-I mAb W6/32，MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP阻断所测定的。MHC-Ia-、MHC-E-和MHC-II-限制分别是基于单独的W6/32(实心填充)，单独的W6/32和VL9(中等填充)和单独的CLIP(浅填充)阻断>90％的应答，不符合这些标准的应答标记为不确定(无填充)。

图15是一组流式细胞术图，显示来自毒株RhCMV 68-1miR126/gag载体接种的恒河猴的PBMC，所述恒河猴猴用4个氨基酸重叠的15mer SIVgag肽(SIVgag ORF)或用对应于MHC-II或MHC-E超级表位的指示SIVgag肽刺激。通过CD69和TNF-α表达鉴定响应MHC-E或MHC-II结合的SIVgag肽的CD8+T细胞。

图16显示了通过galK重组产生RhCMV Rh156/Rh108miR-126-3p/miR-142-3p突变病毒的示意图。Rh156和Rh108分别是必需HCMV基因UL122(IE2)和UL79的RhCMV同源物。

图17显示了用68-1RhCMVmir126mir142/SIVgag接种的恒河猴(RM)的SIVgag特异性T细胞频率和SIVgag特异性CD8+T细胞的相关表位靶向和MHC限制。毒株68-1RhCMV缺乏HCMV UL128和UL130以及UL146和UL147的同源物。SIVmac239的SIVgag通过EF1a启动子表达并插入RhCMV基因Rh211中。该病毒含有mir126-3p的两个靶向序列和每个Rh156和Rh108的3'-非翻译区中的髓样特异性mir142-3p的两个靶向序列。

图17的上图显示了在接种有68-1RhCMVmir126mir142/SIVgag的1只RM的随时间测量的SIVgag特异性T细胞频率。图17的左上图显示了每只RM的对SIVgag的CD4+和CD8+T细胞应答，以及4个氨基酸重叠并覆盖整个SIVgag蛋白的125个重叠的15mer肽的池。图17的上中图显示了每只RM的对由MHC-E呈现的两个常见SIVgag肽的CD8+T细胞应答。图17的右上图显示了每只RM的对由MHC-II呈现的两个常见SIVgag肽的CD8+T细胞应答。图17的下图显示了SIVgag特异性CD8+T细胞的表位靶向和MHC限制，其中由框指示导致特异性CD8+T细胞应答的各个肽。框的模式指定MHC限制，如通过用抗-pan-MHC-I mAb W6/32，MHC-E阻断肽VL9和MHC-II阻断肽CLIP阻断所测定的。MHC-Ia、MHC-E-和MHC-II-限制分别是基于单独的W6/32(无填充)，单独的W6/32和VL9(对角线阴影标记)和单独的CLIP(水平阴影标记)阻断>90％的应答，不符合这些标准的应答标记为不确定(实心填充)。这些结果表明68-1RhCMV(＝缺失UL128、UL130、UL146、UL147的同源物)mir126mir142/SIVgag仅引发MHC-Ia限制性CD8+T细胞。

具体实施方式

在以下详细描述中，参考形成其一部分的附图，并且其中通过说明的方式示出了可以实践的实施例。应当理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以利用其他实施例并且可以进行结构或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应被视为具有限制意义，并且实施例的范围由所附权利要求及其等同物限定。

可以以有助于理解实施例的方式依次将各种操作描述为多个离散操作；然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是根据顺序的。

描述可以使用基于透视的描述，例如上/下、后/前和顶/底。这种描述仅用于促进讨论，并不旨在限制所公开实施例的应用。

可以使用术语“耦合”和“连接”及其衍生物。应该理解，这些术语并不旨在作为彼此的同义词。而是，在特定实施例中，“连接”可用于指示两个或更多个元件彼此直接物理或电接触。“耦合”可以表示两个或更多个元件直接物理或电接触。然而，“耦合”还可以表示两个或更多个元件彼此不直接接触，但仍然彼此协作或相互作用。

出于描述的目的，“A/B”形式或“A和/或B”形式的短语表示(A)、(B)或(A和B)。出于描述的目的，“A、B和C中的至少一个”形式的短语表示(A)、(B)、(C)、(A和B)、(A和C)、(B和C)或(A、B和C)。出于描述的目的，“(A)B”形式的短语表示(B)或(AB)，即A是任选元素。

描述可以使用术语“实施例(embodiment或embodiments)”，其可以各自指代相同或不同实施例中的一个或多个。此外，关于实施例使用的术语“包含”、“包括”，“具有”等是同义的。

本文的实施例提供重组CMV载体，包括但不限于包含编码至少一种异源蛋白抗原的核酸的重组CMV载体，和至少一种对由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA具有特异性的微小RNA识别元件，其可操作地连接于CMV生长必需的或增强其生长的CMV基因。所述载体不表达：活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；或活性UL146/147蛋白或其直系同源物。本文还提供了人巨细胞病毒(HCMV)载体，包括但不限于包含编码至少一种异源蛋白抗原的核酸的重组HCMV载体，并且所述载体不表达：活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；或活性UL146/147蛋白或其直系同源物。还公开了使用新型重组CMV载体的方法，例如在受试者中产生针对异源抗原的免疫应答的方法。

I.术语

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。

本文引用的所有出版物、专利、专利申请、因特网站点和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列二者)均出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、因特网站点或登录号/数据库序列被具体地和单独地指出通过引用并入。

尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但是下面描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在是限制性的。为了便于审阅本公开的各种实施例，提供了以下对具体术语的解释：

抗原：如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”可互换用于指能够在受试者中诱导免疫应答的物质，通常是蛋白质。该术语还指在一旦施用于受试者(直接或通过向受试者施用编码蛋白质的核苷酸序列或载体)的意义上具有免疫活性的蛋白质，该蛋白质能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。

施用：如本文所用，术语“施用”意指通过任何有效途径向受试者提供或给予受试者药剂，例如包含有效量的包含外源抗原的CMV载体的组合物。示例性施用途径包括但不限于注射(例如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。

有效量：如本文所用，术语“有效量”是指药剂的量足以产生所需的应答，例如减少或消除病况或疾病的体征或症状或诱导对抗原的免疫应答，所述药剂例如包含异源抗原的CMV载体或识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物的转染的CD8+T细胞。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或多种症状和/或潜在原因的有效量。有效量可以是治疗有效量，包括防止特定疾病或病况的一种或多种体征或症状发展的量，例如与传染病、癌症或自身免疫性疾病相关的一种或多种体征或症状。

微小RNA：如本文所用，术语“微小RNA”或“miRNA”是指参与基因表达控制的主要生物分子类别。例如，在人的心脏、肝或脑中，miRNA在组织特化或细胞谱系决定中起作用。此外，miRNA影响多种过程，包括早期发育、细胞增殖和细胞死亡，以及细胞凋亡和脂肪代谢。大量的miRNA基因，不同的表达模式以及丰富的潜在miRNA靶标表明miRNA可能是遗传多样性的重要来源。

成熟miRNA通常是18至25个核苷酸的非编码RNA，其调节包括与miRNA互补的序列的mRNA的表达。已知这些小RNA分子通过调节mRNA的稳定性和/或翻译来控制基因表达。例如，miRNA与靶mRNA的3'UTR结合并抑制翻译。miRNA还可以与靶mRNA结合并通过RNAi途径介导基因沉默。miRNA还可通过引起染色质浓缩来调节基因表达。

miRNA通过与miRNA识别元件(MRE)结合而沉默一个或多个特定mRNA分子的翻译，其被定义为直接与mRNA转录物上某处的miRNA配对并与其相互作用的任何序列。通常，MRE存在于mRNA的3'非翻译区(UTR)中，但它也可以存在于编码序列或5'UTR中。MRE不一定是miRNA的完美互补物，通常仅具有与miRNA互补的少数碱基并且通常在互补性的那些碱基内含有一个或多个错配。MRE可以是能够与miRNA充分结合的任何序列，使得MRE可操作地连接的基因(例如CMV基因，其对于体内生长是必需的或增强体内生长)的翻译被miRNA沉默机制如RISC抑制。

突变：如本文所用，术语“突变”是指核酸或多肽序列与正常、共有或“野生型”序列的任何差异。突变体是包含突变的任何蛋白质或核酸序列。另外，具有突变的细胞或生物体也可以称为突变体。

一些类型的编码序列突变包括点突变(单个核苷酸或氨基酸的差异)；沉默突变(不会导致氨基酸改变的核苷酸差异)；缺失(其中缺少一个或多个核苷酸或氨基酸，直至并包括基因的整个编码序列缺失的差异)；移码突变(其中不可被3分割的许多核苷酸的缺失导致氨基酸序列改变的差异)。导致氨基酸差异的突变也可称为氨基酸置换突变。氨基酸置换突变可以通过氨基酸序列中特定位置处相对于野生型的氨基酸变化来描述。

核苷酸序列或核酸序列：术语“核苷酸序列”和“核酸序列”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，包括但不限于信使RNA(mRNA)、DNA/RNA杂合体或合成核酸。核酸可以是单链的，或部分或完全双链的(双链体)。双链核酸可以是同源双链或异源双链。

可操作地连接：如本文中使用的术语“可操作地连接”，当第一核酸序列以对第二核酸序列具有影响的方式放置时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果miRNA与MRE的结合使编码序列的表达沉默，则MRE与被其沉默的编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以是连续的，或者它们可以在一定距离上操作。

启动子：如本文所用，术语“启动子”可以指指导核酸转录的许多核酸控制序列中的任何一种。通常，真核启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件或被一种或多种转录因子识别的任何其他具体DNA序列。启动子的表达可以通过增强子或阻遏子元件进一步调节。许多启动子的实例是可用的，并且是本领域普通技术人员所熟知的。包含与编码特定多肽的核酸序列可操作地连接的启动子的核酸可称为表达载体。

重组：如本文所用，关于核酸或多肽的术语“重组”是指具有非天然存在的序列或具有通过两个或更多个以其他方式分离的序列片段的人工组合制备的序列的核酸或多肽，例如，CMV载体，其包含异源抗原和/或通过添加与CMV基因可操作地连接的miRNA应答元件而使复制有缺陷，所述CMV基因对于体内生长是必需的或增强体内生长。这种人工组合通常通过化学合成或更常见地通过人工操作分离的核酸片段(例如通过基因工程技术)来实现。重组多肽还可以指使用重组核酸制备的多肽，包括转移至不是多肽天然来源的宿主生物体的重组核酸(例如，编码形成包含异源抗原的CMV载体的多肽的核酸)。

复制缺陷型：如本文所用，“复制缺陷型”CMV是一种病毒，其一旦在宿主细胞中就不能进行病毒复制，复制其基因组并由此产生病毒粒子的能力显著受限，具有传播缺陷或扩散缺陷。例如，传播缺陷型复制缺陷型病毒能够复制其基因组，但不能感染另一细胞，这是因为病毒颗粒不会从感染细胞中释放出来，或者因为非感染性病毒颗粒被释放。在另一个实例中，扩散缺陷型复制缺陷型病毒能够复制其基因组，并且能够感染另一细胞，但不能从感染的宿主分泌，因此该病毒不能从宿主扩散到宿主。在一些实施例中，复制缺陷型CMV是包含突变的CMV，所述突变导致缺乏一种或多种对病毒复制必需的基因(“必需基因”)或最佳复制所需的基因(“增强基因”)的表达。CMV必需和增强基因已在本领域中描述(特别是US2013/0136768，其通过引用并入本文)并在本文中公开。

药学上可接受的载体：如本文所用，使用“药学上可接受的载体”是常规的。《雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》,E.W.Martin，Mack出版公司，Easton，PA，第19版，1995，描述了组合物和适用于药物递送本文公开的组合物的制剂。通常，载体的性质取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括作为媒介物的药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学上中性的载体外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

多核苷酸：如本文所用，术语“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物。多核苷酸由四种碱基组成：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶(尿嘧啶用于RNA)。来自核酸的编码序列指示由核酸编码的蛋白质的序列。

多肽：术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换用来指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被氨基酸以外的化学部分中断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。

序列同一性/相似性：如本文所用，两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以根据同一性百分比来测量；百分比越高，序列同一性越高。序列相似性可以根据同一性或相似性百分比(其考虑保守氨基酸置换)来测量；百分比越高，序列越相似。具有显著量的序列同一性并且彼此功能相同或相似(例如，以不改变蛋白质功能或其大小的蛋白质的不同物种或突变形式起相同作用的蛋白质)的多肽或其蛋白质结构域可称为“同源物”。

用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述如下：Smith&Waterman，《应用数学进展(Adv Appl Math)》2,482(1981)；Needleman&Wunsch，《分子生物学杂志(J Mol Biol)》48,443(1970)；Pearson&Lipman，《美国国家科学院院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》85,2444(1988)；Higgins&Sharp，《基因(Gene)》73,237-244(1988)；Higgins&Sharp，《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》5,151-153(1989)；Corpet等人，《核酸综述(Nuc Acids Res)》16,10881-10890(1988)；Huang等人，《计算机在生物科学中的应用(Computer App Biosci)》8,155-165(1992)；和Pearson等人，《数学分子生物学(Meth Mol Bio)》24,307-331(1994)。另外，Altschul等人，《分子生物学杂志》215,403-410(1990)提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑因素。

NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人，(1990)同上)可从若干来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI，国家医学图书馆，38A楼，8N805室，贝塞斯达，MD20894)，并且可在因特网上获得，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。其他信息可在NCBI网站上找到。

BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。如果两个比较的序列具有同源性，则指定的输出文件将那些同源性区域呈现为比对序列。如果两个比较的序列不具有同源性，则指定的输出文件将不呈现比对序列。

一旦比对，通过计数在两个序列中呈现相同核苷酸或氨基酸残基的位置数确定匹配数。通过将匹配数除以所鉴定序列中所示序列的长度或除以铰接长度(例如来自所鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得值乘以100来确定序列同一性百分比。例如，当与具有1154个核苷酸的测试序列比对时，具有1166个匹配的核酸序列与测试序列具有75.0％的同一性(1166÷1554*100＝75.0)。序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下舍入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上舍入到75.2。长度值始终为整数。在另一个实例中，含有与来自如下鉴定序列的20个连续核苷酸比对的20个核苷酸区域的靶序列包含与所鉴定的序列具有75％序列同一性的区域(即，15÷20*100＝75)。

为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用设置为默认参数的预设BLOSUM62矩阵来使用Blast 2序列功能(缺口存在损失为11，每个残基缺口损失为1)。同源物的典型特征在于使用NCBI Basic Blast 2.0，具有数据库(例如nr数据库、swissprot数据库和专利序列数据库)的Gapped blastp，在与氨基酸序列的全长比对中计算到至少70％的序列同一性。用DUST过滤使用blastn程序搜索的查询(Hancock&Armstrong，《计算机在生物科学中的应用(Comput Appl Biosci)》10,67-70(1994)。其他程序使用SEG。另外，可以进行手动对准。当通过该方法评估时，具有甚至更大相似性的蛋白质将显示出增加的同一性百分比，例如与蛋白质的序列同一性为至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。

当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，使用Blast 2序列功能，利用设定为默认参数的PAM30矩阵进行比对(缺口开放9，缺口延伸罚分1)。当通过该方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质将显示出增加的同一性百分比，例如与蛋白质的序列同一性为至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。当比较少于整个序列的序列同一性时，同源物通常在10至20个氨基酸的短窗上具有至少75％的序列同一性，并且可具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性，这取决于它们与参考序列的同一性。在NCBI网站上描述了在这种短窗上测定序列同一性的方法。

如上所述，两个核酸分子密切相关的一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。然而，由于遗传密码的简并性，未显示高度同一性的核酸序列可编码相同或相似(保守的)氨基酸序列。可以使用该简并性来产生核酸序列的变化，以生产全部编码基本上相同蛋白质的多个核酸分子。这种同源核酸序列可以例如与编码蛋白质的核酸具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指活的多细胞脊椎动物生物体，是包括人和非人哺乳动物的一个类别。

超级表位：如本文所用，术语“超级表位”或“超级表位肽”是指在大于90％的群体中被T细胞识别的表位或肽，而不管MHC单倍型，即存在或不存在给定的MHC-I或MHC-II等位基因。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指改善疾病或病理状况的体征或症状进行的干预。如本文所用，关于疾病、病理状况或症状的术语“治疗”也指治疗的任何可观察的有益效果。有益效果可以通过以下来证明：例如，易感受试者疾病的临床症状的延迟发作，疾病的一些或所有临床症状的严重程度的降低，疾病的进展较缓慢，以及疾病的复发次数减少，受试者整体健康或身体状况的改善，或本领域熟知的对特定疾病具有特异性的其他参数。预防性治疗是对没有表现出疾病体征或仅表现出早期体征的受试者施用的治疗，目的是降低病理变化的风险。治疗性治疗是在疾病的体征和症状已发展后施用于受试者的治疗。

II.重组CMV载体及其使用方法

本文公开了能够重复感染生物体的人或动物巨细胞病毒(CMV)载体。CMV载体包含编码异源蛋白质抗原，并缺乏活性UL128、UL130、UL146和UL147蛋白质的表达的核酸序列。载体含有活性UL40、US27和US28基因。在一些实施例中，所述CMV载体是人CMV(HCMV)载体、食蟹猴CMV(CyCMV)载体或恒河猴CMV(RhCMV)载体。

本文还公开了CMV载体，其包含所有上述修饰，并且还包含用作miRNA应答元件(MRE)的核酸序列，其在内皮细胞表达的miRNA存在下沉默表达。由内皮细胞表达的这种miRNA的实例包括miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296和miR-328(Wu F，Yang Z，Li G.特定微小RNA对内皮功能和血管生成的作用，《生化和生物物理研究通讯(Biochemical and biophysical research communications)》2009；386(4):549.doi:10.1016/j.bbrc.2009.06.075.；其通过引用并入本文)。MRE与CMV基因可操作地连接，所述CMV基因对于CMV体内生长是必需的或增强其生长。这种基因的实例包括IE2和UL79，或其直系同源物。一个、两个、三个或更多个CMV基因可以各自与载体中的一个、两个、三个或更多个MRE可操作地连接。

在一些实施例中，MRE可以是在内皮细胞表达的miRNA存在下沉默表达的任何miRNA识别元件。在一些实施例中，载体的MRE在miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296和miR-328中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的MRE在miR-126-3p(SEQ ID NO:1)存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的MRE包含SEQID NO:2的序列。

在一些实施例中，本文公开的CMV载体包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的第一MRE和在髓细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的第二MRE。在一些实施例中，第一MRE在miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378和miR-296和miR-328中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，第一MRE在miR-126-3p(SEQ ID NO:1)存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的第一MRE包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施例中，第二MRE在miR-142-3p、miR-223、miR-27a、miR-652、miR-155、miR146a、miR-132、miR-21和miR-125中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，第二MRE在miR-142-3p(SEQ ID NO:3)存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的第二MRE包含SEQ ID NO:4的序列。包含在miR-142-3p存在下沉默表达的MRE的CMV载体公开于例如WO2017/087921中，其通过引用整体并入本文。

这种MRE可能是miRNA的精确互补。或者，其他序列可以用作给定miRNA的MRE。例如，可以从序列预测MRE。在一个实例中，可以在网站microRNA.org(www.microrna.org)上搜索miRNA。又将列出miRNA的mRNA靶标列表。例如，下列页面：http://www.microrna.org/microrna/getTargets.do？matureName＝hsa-miR-142-3p&organis m＝9606，最近访问于2015年10月6日，将列出miR-142-3p的推定mRNA靶标。对于页面上列出的每个靶标，可以访问“比对详细信息”并访问推定的MRE。在一些实施例中，载体的MRE在miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296和miR-328中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的MRE在miR-126-3p(SEQ ID NO:1)存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的MRE可在miR-142-3p(SEQ ID NO:3)存在下沉默表达。在一些实施例中，载体的MRE具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施例中，载体的MRE具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

本领域技术人员可以从文献中选择经验证的、推定的或突变的MRE序列，预测其在内皮细胞或髓细胞谱系细胞如巨噬细胞中表达的miRNA存在下诱导沉默。一个实例涉及上述网站。然后，本领域技术人员可以获得表达构建体，由此，报告基因(例如荧光蛋白、酶或其他报告基因)具有由启动子，例如组成型活性启动子或细胞特异性启动子，驱动的表达。然后可以将MRE序列引入表达构建体中。可以将表达构建体转染到合适的细胞中，并用感兴趣的miRNA转染细胞。报告基因表达的缺乏表明MRE在miRNA存在下沉默基因表达。

病原体特异性抗原可以源自任何人或动物病原体。病原体可以是病毒病原体，并且抗原可以是源自病毒病原体的蛋白质。病毒包括但不限于腺病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、1型单纯疱疹、2型单纯疱疹、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、卡波西肉瘤病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人博卡病毒和细小病毒B19。

病原体可以是细菌病原体，并且抗原可以是源自细菌病原体的蛋白质。致病菌包括但不限于百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次体立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)。

病原体可以是寄生虫，并且抗原可以是源自寄生虫病原体的蛋白质。寄生虫可以是原生动物生物体或引起疾病的原生动物生物体，例如但不限于棘阿米巴属(Acanthamoeba)、巴贝西虫病(Babesiosis)、小袋虫病(Balantidiasis)、芽囊原虫属(Blastocystosis)、球虫亚纲(Coccidia)、双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、阿米巴病(Amoebiasis)、贾第虫属(Giardia)、等孢球虫病(Isosporiasis)、利什曼病(Leishmaniasis)、原发性阿米巴脑膜炎(Primary amoebic meningoencephalitis，PAM)、疟疾(Malaria)、鼻孢子菌病(Rhinosporidiosis)、弓形体病-寄生虫性肺炎(Toxoplasmosis--Parasitic pneumonia)、滴虫病(Trichomoniasis)、昏睡症(Sleepingsickness)和查加斯病(Chagas disease)。寄生虫可以是蠕虫生物体或蠕虫或由蠕虫生物体引起的疾病，例如但不限于钩虫病/钩虫(Ancylostomiasis/Hookworm)、异尖线虫病(Anisakiasis)、蛔虫-寄生虫性肺炎(Roundworm--Parasitic pneumonia)、蛔虫-贝蛔虫病(Roundworm--Baylisascariasis)、绦虫-绦虫感染(Tapeworm--Tapeworm infection)、华支睾吸虫病(Clonorchiasis)、肾膨结线虫感染(Dioctophyme renalis infection)、裂头绦虫病-绦虫(Diphyllobothriasis--tapeworm)、麦地那龙线虫-棘唇虫病(Guinea worm--Dracunculiasis)、包虫病-绦虫(Echinococcosis--tapeworm)、蛲虫-蛲虫病(Pinworm--Enterobiasis)、肝吸虫-肝片吸虫病(Liver fluke--Fasciolosis)、姜片虫病-肠吸虫(Fasciolopsiasis--intestinal fluke)、颚口线虫病(Gnathostomiasis)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、眼丝虫病(Loa loa filariasis)、卡拉巴丝虫性肿块(Calabarswellings)、曼森丝虫病(Mansonelliasis)、丝虫病(Filariasis)、后殖吸虫病-肠吸虫(Metagonimiasis--intestinal fluke)、盘尾丝虫病(River blindness)、中华肝吸虫(Chinese Liver Fluke)、肺吸虫病(Paragonimiasis)、肺吸虫(Lung Fluke)、血吸虫病-血吸虫(Schistosomiasis--bilharzia)、裂体吸虫病(bilharziosis)或血吸虫病(所有类型)、肠血吸虫病(intestinal schistosomiasis)、尿路血吸虫病(urinaryschistosomiasis)、日本血吸虫的血吸虫病(Schistosomiasis by Schistosomajaponicum)、亚洲肠血吸虫病(Asian intestinal schistosomiasis)、裂头蚴病(Sparganosis)、类圆线虫病-寄生虫性肺炎(Strongyloidiasis--Parasitic pneumonia)、牛肉绦虫(Beef tapeworm)、猪肉绦虫(Pork tapeworm)、弓蛔虫病(Toxocariasis)、毛线虫病(Trichinosis)、血吸虫皮炎(Swimmer's itch)、鞭虫(Whipworm)和象皮病-淋巴丝虫病(Elephantiasis Lymphatic filariasis)。寄生虫可以是生物体或由生物体引起的疾病，例如但不限于肠内寄生虫(parasitic worm)、Halzoun综合征(Halzoun Syndrome)、蝇蛆病(Myiasis)、沙蚤(Chigoe flea)、人肤蝇(Human Botfly)和牙签鱼(Candiru)。寄生虫可以是外寄生虫或由外寄生虫引起的疾病，例如但不限于，臭虫(Bedbug)、头虱-虱病(Headlouse--Pediculosis)、体虱-虱病(Body louse--Pediculosis)、阴虱-虱病(Crab louse--Pediculosis)、蠕形螨-蠕形螨病(Demodex--Demodicosis)、疥疮(Scabies)、旋丽蝇幼虫(Screwworm)和锥蝇属(Cochliomyia)。

抗原可以是源自癌症的蛋白质。如本文所述，癌症包括白血病、淋巴瘤、肉瘤和源自实体瘤的那些。癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病；急性髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；儿童小脑或脑星形细胞瘤；基底细胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤；脑肿瘤；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤；脑肿瘤，脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；脑肿瘤，室管膜瘤；脑肿瘤，成神经管细胞瘤；脑肿瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤；乳腺癌；支气管腺瘤/类癌；伯基特淋巴瘤；儿童类癌肿瘤；胃肠类癌肿瘤；原发性不明的癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；儿童癌症；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；皮肤T细胞淋巴瘤；促纤维增生性小圆细胞瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤；食道癌；尤文家族肿瘤的尤文肉瘤；儿童颅内生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞肿瘤；颅外、性腺外或卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；脑干胶质瘤；胶质瘤，儿童脑星形细胞瘤；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；胃类癌；毛细胞白血病；头颈癌；心癌；肝细胞(肝)癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤；肾癌(肾细胞癌)；喉癌；白血病；急性淋巴细胞白血病(也称为急性成淋巴细胞性白血病)；急性髓性白血病(也称为急性粒细胞白血病)；慢性淋巴细胞白细胞(也称为慢性淋巴细胞性白血病)；慢性粒细胞白细胞(也称为慢性髓性白血病)；毛细胞白细胞；唇和口腔癌；肝癌(原发性)；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(除霍奇金外的所有淋巴瘤的旧分类)；原发性中枢神经系统淋巴瘤；Marcus Whittle致命疾病；华氏巨球蛋白血症；骨/骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤；儿童成神经管细胞瘤；黑色素瘤；眼内(眼)黑色素瘤；默克尔细胞癌；成人恶性间皮瘤；儿童间皮瘤；转移性鳞状细胞颈癌伴隐匿原发灶；口癌；儿童多发性内分泌腺瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样真菌病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；慢性粒细胞白血病；成人急性髓性白血病；儿童急性髓性白血病；多发性骨髓瘤(骨髓癌)；慢性骨髓增生性病症；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰岛细胞胰腺癌；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；松果体星形细胞瘤；松果体生殖细胞瘤；儿童松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体腺瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞癌(肾癌)；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；唾液腺癌；尤文肿瘤家族肉瘤；卡波西肉瘤；软组织肉瘤；子宫肉瘤；Sezary综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；默克尔细胞皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌-见皮肤癌(非黑色素瘤)；转移性鳞状细胞颈癌伴隐匿原发灶；胃癌；儿童幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病和Sezary综合征)；睾丸癌；咽喉癌；儿童胸腺瘤；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；儿童甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；成人未知的原发部位癌；儿童未知的原发部位癌症；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤；外阴癌；华氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤(肾癌)。

由于在编码UL128、UL130、UL146或UL147或其同源物或其直系同源物的核酸序列(感染其他物种的CMV的同源基因)中存在突变，载体不表达活性UL128、UL130、U146、UL147蛋白。突变可以是导致活性蛋白缺乏表达的任何突变。这种突变可包括点突变、移码突变、少于编码蛋白质的所有序列的缺失(截短突变)，或编码蛋白质的所有核酸序列的缺失，或任何其他突变。

在进一步的实例中，由于载体中存在包含抑制UL128、UL130、UL146或UL147蛋白表达的反义或RNAi序列(siRNA或miRNA)的核酸序列，载体不表达活性UL128、UL130、UL146或UL147蛋白。突变和/或反义和/或RNAi可以以任何组合使用，以产生缺乏活性UL128、UL130、UL146或UL147的CMV载体。

CMV载体可以包含本领域已知的其他失活突变以提供不同的免疫应答，例如失活的US11突变或失活的UL82(pp71)突变，或任何其他失活突变。CMV载体还可以包含编码本领域已知的病毒蛋白的一种或多种病毒基因中的至少一种失活突变，所述基因对于体内病毒传播(即，从细胞到细胞的扩散)是必需的或增强体内病毒传播。这种失活突变可以由点突变、移码突变、截短突变或编码病毒蛋白的所有核酸序列的缺失引起。失活突变包括病毒基因中的任何突变，所述基因最终导致功能降低或病毒蛋白功能完全丧失。在一些实施例中，CMV载体不表达活性UL82(pp71)蛋白或其直系同源物。在一些实施例中，CMV载体不表达活性US11蛋白或其直系同源物。在一些实施例中，CMV载体不表达活性UL82(pp71)蛋白或活性US11蛋白或其直系同源物。

本文还公开了在受试者中产生针对异源抗原的MHC-E限制性CD8⁺T细胞应答的方法。该方法包括向受试者施用有效量的CMV载体。在一个实施例中，CMV载体的特征在于具有编码至少一种异源抗原的核酸序列和不表达活性UL128、UL130、UL146或UL147蛋白的核酸序列。由该载体引发的CD8+T细胞应答的特征在于具有至少10％的针对MHC-E呈递的表位的CD8+T细胞。在进一步的实例中，CD8+T细胞的至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少90％、至少95％或至少95％受MHC-E限制。在一些实施例中，受MHC-E限制的CD8+T细胞识别由至少90％用载体免疫的其他受试者共有的肽。在一些实施例中，CD8+T细胞针对由MHC-E呈递的超级表位。在一些实施例中，该方法还可以产生受II类MHC限制的CD8+T细胞。在一些实施例中，由所述载体引发的CD8+T细胞的至少10％受II类MHC-E或其直系同源物的限制。在一些实施例中，其中由所述HCMV载体引发的CD8+T细胞的至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受II类MHC或其直系同源物的限制。在一些实施例中，受II类MHC限制的CD8+T细胞识别由至少90％用载体免疫的其他受试者共有的肽。在一些实施例中，CD8+T细胞针对II类MHC呈递的超级表位。

在第二实施例中，CMV载体的特征在于具有用作miRNA应答元件(MRE)的核酸序列，其可操作地连接至必需CMV基因IE2和UL79或其直系同源物。在一些实施例中，MRE在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达。在一些实施例中，MRE在miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296和miR-328中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，MRE在miR-126-3p存在下沉默表达。载体还含有至少一种异源抗原，并且不表达活性UL128、UL130、UL146或UL147蛋白。载体还含有活性UL40、US28和US27。由该载体引发的CD8+T细胞应答的特征在于具有至少10％的针对MHC-E呈递的表位的CD8+T细胞。在进一步的实例中，CD8+T细胞的至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受MHC-E限制。在一些实施例中，受MHC-E限制的CD8+T细胞中的一些识别由至少90％用载体免疫的其他受试者共有的肽。

在一些实施例中，该方法还包括鉴定由所述CMV载体引发的CD8+T细胞的CD8+T细胞受体，其中所述CD8+T细胞受体识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物。在一些实施例中，通过RNA或DNA测序鉴定CD8+T细胞受体。

在第三实施例中，CMV载体的特征在于具有用作MRE的两个核酸序列，其可操作地连接至必需CMV基因IE2和UL79或其直系同源物。在一些实施例中，第一MRE在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达，并且第二MRE在髓细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达。在一些实施例中，第一MRE在miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296和miR-328中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，第一MRE在miR-126-3p存在下沉默表达。在一些实施例中，第二MRE在miR-142-3p、miR-223、miR-27a、miR-652、miR-155、miR146a、miR-132、miR-21和miR-125中的一种或多种存在下沉默表达。在一些实施例中，第二MRE在miR-142-3p存在下沉默表达。载体还含有至少一种异源抗原，并且不表达活性UL128、UL130、UL146或UL147蛋白。载体还含有活性UL40、US28和US27。由该载体引发的CD8+T细胞应答的特征在于具有至少50％的针对由MHC Ia类呈递的表位的CD8+T细胞。

在一些实施例中，该方法还包括从所述CMV载体引发的CD8+T细胞鉴定CD8+T细胞受体，其中所述CD8+T细胞受体识别MHC I类/异源抗原衍生的肽复合物。在一些实施例中，通过RNA或DNA测序鉴定CD8+T细胞受体。

本文还公开了产生识别MHC-E-肽复合物的CD8+T细胞的方法。该方法包括以有效产生识别MHC-E/肽复合物的一组CD8⁺T细胞的量向第一受试者(或动物)施用CMV载体。CMV载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；在一些实施例中，CMV载体还包含第二核酸序列，其包含在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的MRE。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。在一些实施例中，宿主自身抗原是衍生自T细胞受体或B细胞受体的可变区的抗原。该方法还包括：从CD8+T细胞组鉴定第一CD8+T细胞受体，其中第一CD8+T细胞受体识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物；在一些实施例中，通过DNA或RNA测序鉴定第一CD8+T细胞受体。在一些实施例中，该方法还包括用表达载体转染所述一个或多个CD8+T细胞，其中所述表达载体包含编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列和与编码T细胞受体的核酸序列可操作连接的启动子，其中所述第二CD8+T细胞受体包含第一CD8+T细胞受体的CDR3α和CDR3β，从而产生一种或多种识别MHC-E/异源抗原衍生肽复合物的转染CD8+T细胞。用于以表达载体转染的一种或多种CD8+T细胞可以从第一受试者或第二受试者中分离。在一些实施例中，该方法可以进一步包括向第一或第二受试者施用一种或多种转染的T细胞以治疗疾病，例如癌症、病原体感染或自身免疫性疾病或病症。在一些实施例中，该方法可以进一步包括向第一或第二受试者施用一种或多种转染的T细胞以诱导对组织特异性抗原或宿主自身抗原的自身免疫应答。

还公开了转染的CD8+T细胞，其识别MHC-E-肽复合物，所述MHC-E-肽复合物通过包括以下步骤的方法制备：(1)以有效产生识别MHC-E/肽复合物的一组CD8+T细胞的量向第一受试者施用CMV载体，(2)从所述CD8⁺T细胞组鉴定第一CD8+T细胞受体，其中第一CD8+T细胞受体识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物；(3)从第一受试者或第二受试者中分离一个或多个CD8+T细胞；和(4)用表达载体转染从第一或第二受试者分离的一个或多个CD8+T细胞，从而产生识别MHC-E-肽复合物的转染T细胞。CMV载体包含编码至少一种异源抗原的第一核酸序列，并且不表达活性UL128蛋白或其直系同源物；活性UL130蛋白或其直系同源物；活性UL146蛋白或其直系同源物；或活性UL147蛋白或其直系同源物；在一些实施例中，CMV载体还包含第二核酸序列，其包含在由内皮细胞系细胞表达的微小RNA存在下沉默表达的MRE。表达载体包含编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列和与编码第二CD8+T细胞受体的核酸序列可操作地连接的启动子，其中第二CD8+T细胞受体包含第一CD8+T细胞受体的CDR3α和CDR3β。异源抗原可以是任何抗原，包括病原体特异性抗原、肿瘤特异性抗原、宿主自身抗原或组织抗原。在一些实施例中，通过RNA或DNA测序鉴定第一CD8+T细胞受体。本文还公开了治疗疾病，例如癌症、病原体感染或自身免疫性疾病或病症的方法，该方法包括向第一或第二受试者施用识别MHC-E-肽复合物的转染的T细胞。本文还公开了诱导针对宿主自身抗原或组织特异性抗原的自身免疫应答的方法，该方法包括向第一或第二受试者施用识别MHC-E-肽复合物的转染的T细胞。

在进一步的实例中，所述方法包括向受试者施用有效量的第二CMV载体，所述第二CMV载体包含编码第二异源抗原的核酸序列。该第二载体可以是任何CMV载体，包括具有活性UL128或UL130蛋白和/或活性UL146或147蛋白的CMV载体。第二CMV载体可包含第二异源抗原。第二异源抗原可以是任何异源抗原，包括与第一种CMV载体中的异源抗原相同的异源抗原。相对于施用第一CMV载体，第二CMV载体可以在任何时间施用，包括在施用第一CMV载体之前、同时或之后。这包括在第一载体之前或之后的任何数量的月、日、小时、分钟或秒施用第二载体。

当用作表达载体时，人或动物CMV载体在所选受试者例如人中是先天非致病性的。在一些实施例中，已对CMV载体进行修饰使其在所选受试者中具有非致病性(不能进行宿主-宿主扩散)。

异源抗原可以是非源自CMV的任何蛋白质或其片段，包括癌抗原、病原体特异性抗原、模式抗原(例如溶菌酶KLH或卵清蛋白)、组织特异性抗原、宿主自身抗原或任何其他抗原。

病原体特异性抗原可以源自任何人或动物病原体。病原体可以是病毒病原体、细菌病原体或寄生虫，并且抗原可以是源自病毒病原体、细菌病原体或寄生虫的蛋白质。寄生虫可以是生物体或由生物体引起的疾病。例如，寄生虫可以是原生动物生物体、原生动物生物体引起的疾病、蠕虫生物体或蠕虫、由蠕虫生物体引起的疾病、外寄生虫或由外寄生虫引起的疾病。

抗原可以是源自癌症的蛋白质。在某些实施例中，癌症是白血病或淋巴瘤。在某些实施例中，癌症源自实体瘤。在某些实施例中，癌症包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌和生殖细胞肿瘤。

抗原可以是宿主自身抗原。宿主自身抗原包括但不限于衍生自T细胞受体可变区或B细胞受体可变区的抗原。抗原可以是组织特异性抗原。组织特异性抗原包括但不限于精子抗原或虫卵抗原。

本文公开的CMV载体可用作含有重组CMV病毒或载体以及药学上可接受的载体或稀释剂的免疫原性、免疫学或疫苗组合物。含有重组CMV病毒或载体(或其表达产物)的免疫学组合物引发免疫应答——局部或全身。应答可以但不必是保护性的。含有重组CMV病毒或载体(或其表达产物)的免疫原性组合物同样引发局部或全身免疫应答，其可以但不必是保护性的。疫苗组合物引发局部或全身保护性应答。因此，术语“免疫学组合物”和“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(因为前两个术语可以是保护性组合物)。

本文公开的CMV载体可用于在受试者中诱导免疫应答的方法，包括向受试者施用包含重组CMV病毒或载体和药学上可接受的载体或稀释剂的免疫原性、免疫学或疫苗组合物。出于本说明书的目的，术语“受试者”包括所有动物，包括非人类灵长类动物和人，而“动物”包括除人以外的所有脊椎动物物种；并且“脊椎动物”包括所有脊椎动物，包括动物(如本文所用的“动物”)和人。并且，当然，“动物”的子集是“哺乳动物”，出于本说明书的目的，其包括除人之外的所有哺乳动物。

本文公开的CMV载体可用于含有重组CMV病毒或载体以及药学上可接受的载体或稀释剂的治疗组合物。本文公开的CMV载体可以通过将包含编码异源抗原的序列的DNA插入CMV基因组的必需或非必需区域来制备。该方法可以进一步包括从CMV基因组中删除一个或多个区域。该方法可包括体内重组。因此，该方法可包括在供体DNA存在下在细胞相容性介质中用CMV DNA转染细胞，所述供体DNA包含侧翼为与CMV基因组的部分同源的DNA序列的异源DNA，由此将异源DNA引入CMV的基因组中，并且任选地然后回收通过体内重组修饰的CMV。该方法还可包括切割CMV DNA以获得切割的CMV DNA，将异源DNA连接至切割的CMV DNA以获得杂合CMV-异源DNA，用杂合CMV-异源DNA转染细胞，并任选地然后回收由存在异源DNA修饰的CMV。由于包含体内重组，因此该方法还提供了包含非天然存在于CMV中的供体DNA的质粒，所述DNA编码CMV外来的多肽，供体DNA在CMV DNA的片段内，其以其他方式与CMV基因组的必需或非必需区域共线使得来自CMV的必需或非必需区域的DNA位于供体DNA的侧翼。可以将异源DNA插入CMV中以产生任何方向的重组CMV，当需要时，该重组CMV产生该DNA的稳定整合及其表达。

在重组CMV载体中编码异源抗原的DNA也可包括启动子。启动子可以来自任何来源，例如疱疹病毒，包括内源巨细胞病毒(CMV)启动子，例如人CMV(HCMV)、恒河猴CMV(RhCMV)、鼠或其他CMV启动子。启动子也可以是非病毒启动子，例如EF1α启动子。启动子可以是截短的转录活性启动子，其包含用病毒提供的反式激活蛋白反式激活的区域和衍生截短的转录活性启动子的全长启动子的最小启动子区。启动子可以由对应于最小启动子的DNA序列和上游调节序列的组合构成。最小启动子由CAP位点加TATA盒构成(基本转录水平的最小序列；不受调节的转录水平)；“上游调节序列”由上游元件和增强子序列构成。此外，术语“截短的”表示全长启动子不是完全存在的，即全长启动子的某些部分已被除去。并且，截短的启动子可以源自疱疹病毒，例如MCMV或HCMV，如HCMV-IE或MCMV-IE。基于碱基对，全长启动子的大小可以减少高达40％，甚至高达90％。启动子也可以是修饰的非病毒启动子。关于HCMV启动子，参考美国专利第5,168,062和5,385,839号。关于用质粒DNA转染细胞以从中表达，参考Felgner等人，(1994)，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269,2550-2561。并且，关于直接注射质粒DNA作为针对多种传染病的疫苗接种的简单且有效的方法，参考《科学(Science)》，259:1745-49,1993。因此，载体可以通过直接注射载体DNA来使用载体在本公开的范围内。

还公开了可以插入包含截短的转录活性启动子的重组病毒或质粒的表达盒。表达盒可以进一步包括功能性截短的多腺苷酸化信号；例如，虽被截短但却是功能性的SV40多腺苷酸化信号。考虑到自然界提供了更大的信号，截短的多腺苷酸化信号是功能性的确实是令人惊讶的。截短的多腺苷酸化信号解决了重组病毒如CMV的插入物大小的限制问题。表达盒还可以包括与其插入的病毒或系统有关的异源DNA；并且该DNA可以是如本文所述的异源DNA。

关于用于疫苗或免疫学组合物的抗原，还参见《斯特德曼医学词典(Stedman'sMedical Dictionary)》(第24版，1982，例如，疫苗定义(用于疫苗制剂中的表中所列抗原))；可以使用这种抗原或来自这种抗原的目标表位。关于异源抗原，本领域技术人员可以根据氨基酸和肽或多肽的相应DNA序列的知识以及特定氨基酸的性质(例如，大小，电荷等)和密码子字典选择异源抗原及其编码DNA，无需过多的实验。

确定抗原T表位的一种方法涉及表位作图。通过寡肽合成产生异源抗原的重叠肽。然后测试各个肽结合天然蛋白质引发的抗体或诱导T细胞或B细胞活化的能力。该方法特别适用于绘制T细胞表位，因为T细胞识别与MHC分子络合的短线性肽。

通常，如下产生对异源抗原的免疫应答：T细胞仅在蛋白质被切割成较小的肽时识别蛋白质，并且存在于位于另一细胞表面的称为“主要组织相容性复合体(MHC)”的复合体中。有两类MHC复合体——I类和II类，每类由许多不同的等位基因构成。不同物种和个体受试者具有不同类型的MHC复合体等位基因；据说他们有不同的MHC类型。一种类型的MHC I类分子称为MHC-E(人中的HLA-E，RM中的Mamu-E，小鼠中的Qa-1b)。

应注意，包含编码异源抗原的序列的DNA本身可包括用于驱动CMV载体中表达的启动子，或者DNA可限于异源抗原的编码DNA。该构建体可以相对于内源CMV启动子以这样的方向放置，使得其与启动子可操作地连接并由此表达。此外，可以实现编码异源抗原的DNA的多个拷贝或使用强或早期启动子或早期和晚期启动子或其任何组合，以便扩增或增加表达。因此，编码异源抗原的DNA可以相对于CMV内源启动子适当地定位，或者那些启动子可以进行易位以与编码异源抗原的DNA一起插入另一个位置。编码多于一种异源抗原的核酸可以包装在CMV载体中。

进一步公开了含有所公开的CMV载体的药物和其他组合物。可以配制这种药物和其他组合物，以便用于本领域已知的任何施用方法。这种药物组合物可以通过肠胃外途径(皮内、肌内、皮下、静脉内等)。施用也可以通过粘膜途径，例如口服、鼻、生殖器等。

所公开的药物组合物可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术制备。这种组合物可以以医学领域技术人员熟知的剂量和技术施用，同时考虑诸如特定患者的品种或物种、年龄、性别、体重和病况以及施用途径的因素。组合物可以单独施用，或者可以与其他CMV载体或与其他免疫学、抗原性或疫苗或治疗组合物共同施用或顺序施用。这种其他组合物可包括纯化的天然抗原或表位或通过重组CMV或另一载体系统表达的抗原或表位；并且考虑到上述因素进行施用。

组合物的实例包括用于孔口(例如口服、鼻、肛门、生殖器如阴道等)施用的液体制剂，例如悬浮液、糖浆或酏剂；和用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如可注射施用)的制剂，例如无菌悬浮液或乳液。在这种组合物中，重组体可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等，进行混合。

抗原、免疫学或疫苗组合物通常可含有佐剂和一定量的CMV载体或表达产物以引发所需的应答。在人应用中，明矾(磷酸铝或氢氧化铝)是典型的佐剂。皂苷及其纯化组分Quil A、弗氏完全佐剂和用于研究和兽医应用的其他佐剂具有毒性，这限制了它们在人疫苗中的潜在用途。还可以使用化学上定义的制剂，例如胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、磷脂缀合物，例如Goodman-Snitkoff等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》147:410-415(1991)描述的那些，如Miller等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》176：1739-1744(1992)所述在蛋白脂质体内包封蛋白质，以及将蛋白质包封在脂质囊泡如Novasome脂质囊泡(Micro VescularSystems公司,纳舒厄,N.H.)中。

组合物可以以单一剂型包装以通过肠胃外(例如，肌内、皮内或皮下)施用或孔口施用，例如，舌下(例如，口服)、胃内、粘膜，包括口内、肛门内、阴道内等施用进行免疫。同样，施用的有效剂量和途径由组合物的性质、表达产物的性质、直接使用时重组CMV的表达水平，和已知因素，如宿主品种或物种、年龄、性别、体重、病况和性质，以及LD₅₀和已知且不需要过多实验的其他筛选程序确定。表达产物的剂量范围可以为几微克至几百微克，例如5至500微克。可以以任何合适的量施用CMV载体以实现这些剂量水平的表达。在非限制性实例中：CMV载体可以至少10²pfu的量施用；因此，CMV载体可以至少以这种量施用；或者以在约10²pfu至约10⁷pfu的范围内的量施用。其他合适的载体或稀释剂可以是有或没有防腐剂的水或缓冲盐水。可以将CMV载体冻干用于在施用时重悬，或者可以在溶液中。“约”可以指定义值的1％、5％、10％或20％内。

应当理解，本公开的蛋白质和编码它们的核酸可以不同于本文说明和描述的确切序列。因此，本公开考虑了所示序列的缺失、添加、截短和置换，只要序列根据本公开的方法起作用即可。在这方面，取代通常本质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)非荷电极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳族氨基酸。可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸进行分离替换，反之亦然；用谷氨酸替换天冬氨酸，反之亦然；用丝氨酸替换苏氨酸，反之亦然；或者用结构相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守替换，对生物活性不会产生重大影响。因此，具有与所述蛋白质基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的次要氨基酸置换的蛋白质在本公开的范围内。

可以对本公开的核苷酸序列进行密码子优化，例如可以优化密码子以用于人细胞。例如，任何病毒或细菌序列都可如此改变。许多病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量稀有密码子，并且通过改变这些密码子以对应于所需受试者中常用的密码子可以实现异源抗原的增强表达，如Andre等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》72:1497-1503,1998。

考虑了编码CMV载体的功能性和/或抗原性等同变体和衍生物以及其中包含的糖蛋白的核苷酸序列。这些功能等同的变体、衍生物和片段显示出保留抗原活性的能力。例如，不改变编码氨基酸序列的DNA序列的变化，以及导致氨基酸残基的保守置换，一个或几个氨基酸缺失或添加，以及氨基酸残基被氨基酸类似物置换的那些是不会显著影响编码多肽性质的那些变化。保守性氨基酸置换是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一个实施例中，变体与目标抗原、表位、免疫原、肽或多肽具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性。

通过在比对时比较序列来确定序列同一性或同源性，以便最大化重叠和同一性，同时最小化序列缺口。特别地，可以使用许多数学算法中的任何一种来确定序列同一性。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin&Altschul，《美国国家科学院院院刊》1990；87:2264-2268的算法，在Karlin&Altschul，《美国国家科学院院院刊》1993；90:5873-5877进行了修改。

用于比较序列的数学算法的另一个实例是Myers&Miller，《计算机在生物科学中的应用》1988；4:11-17的算法。这种算法被合并到ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。用于识别局部序列相似性和比对的区域的另一种适用的算法是如Pearson&Lipman，《美国国家科学院院院刊》1988；85:2444-2448所述的FASTA算法。

根据本公开使用WU-BLAST(华盛顿大学BLAST)2.0版软件是有利的。可以从ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下载用于多个UNIX平台的WU-BLAST 2.0版可执行程序。该程序基于WU-BLAST 1.4版，后者又基于公共领域NCBI-BLAST 1.4版(Altschul&Gish，1996，局部比对统计，Doolittle编辑，《酶学方法(Methods in Enzymology)》266:460-480；Altschul等人，《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》1990；215:403-410；Gish&States，1993；《自然遗传学(Nature Genetics)》3:266-272；Karlin&Altschul，1993；《美国国家科学院院院刊》90:5873-5877；所有这些都通过引用并入本文)。

使用标准重组DNA和克隆技术制备本公开的各种重组核苷酸序列和抗体和/或抗原。这种技术是本领域技术人员所熟知的。例如，参见“《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》”，第二版(Sambrook等人，1989)。

可以将本公开的核苷酸序列插入“载体”中。术语“载体”被本领域技术人员广泛使用和理解，并且如本文所用，术语“载体”以与本领域技术人员已知的含义一致使用。例如，本领域技术人员通常使用术语“载体”来指代允许或促进核酸分子从一种环境转移至另一种环境或允许或促进核酸分子操作的载体。

可以根据本公开使用允许表达本公开的病毒的任何载体。在某些实施例中，所公开的病毒可以在体外(例如使用无细胞表达系统)和/或在体外生长的培养细胞中使用，以产生编码的异源抗原(例如，病原体特异性抗原、HIV抗原、肿瘤抗原和抗体)，其然后可用于各种应用，例如生产蛋白质疫苗。对于这种应用，可以使用允许在体外和/或在培养细胞中表达病毒的任何载体。

对于所公开的待表达的异源抗原，编码异源抗原序列的蛋白质应与指导蛋白质转录和翻译的调节或核酸控制序列“可操作地连接”。如本文所用，当它们以这样的方式共价连接以使编码序列的表达或转录和/或翻译在核酸控制序列的影响或控制下时，编码序列和核酸控制序列或启动子被称为“可操作地连接”。“核酸控制序列”可以是任何核酸元件，例如但不限于本文所述的启动子、增强子、IRES、内含子和其他指导与其可操作地连接的核酸序列或编码序列的表达的元件。术语“启动子”在本文中用于指一组转录控制模块，其聚集在RNA聚合酶II的起始位点周围，并且当与本公开的蛋白质编码序列可操作地连接时，导致编码的蛋白质的表达。本公开的转基因的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其仅在暴露于某些特定外部刺激时启动转录，所述外部刺激例如但不限于抗生素如四环素，激素如蜕皮激素或重金属。启动子也可以对特定细胞类型、组织或器官具有特异性。许多合适的启动子和增强子是本领域已知的，并且任何这种合适的启动子或增强子可用于表达本公开的转基因。例如，合适的启动子和/或增强子可选自真核启动子数据库(EPDB)。

本公开涉及表达异源蛋白质抗原的重组病毒载体。在一些实例中，抗原是HIV抗原。有利地，HIV抗原包括但不限于美国公开第2008/0199493A1和2013/0136768A1号中讨论的HIV抗原，两者均通过引用并入本文。HIV、核酸或其免疫原性片段可用作HIV蛋白抗原。例如，可以使用美国公开第2008/0199493 A1和2013/0136768 A1号中讨论的HIV核苷酸。HIV抗体识别的任何抗原都可以用作HIV蛋白质抗原。蛋白质抗原也可以是SIV抗原。例如，可以使用美国公开第2008/0199493 A1和2013/0136768A1号中讨论的SIV抗原。

根据本公开使用的载体可以含有合适的基因调节区，例如启动子或增强子，使得可以表达本公开的抗原。

在受试者体内表达本发明的抗原，例如以产生针对HIV-1抗原的免疫应答和/或针对HIV-1的保护性免疫，应选择适于在该受试者上表达并且可在体内安全使用的表达载体。在一些实例中，可能需要在实验动物，例如用于本公开的HIV-1免疫原性组合物和疫苗的临床前测试中表达抗体和/或抗原。在其他实例中，可以在人受试者中表达抗原，例如在本公开的免疫原性组合物和疫苗的临床试验和实际临床应用中。

本文所述的CMV载体可含有可防止宿主-宿主扩散的突变，从而使病毒不能感染免疫功能不全或其他可能因CMV感染而面临并发症的受试者。本文所述的CMV载体还可含有导致呈递免疫显性和非免疫显性表位以及非经典MHC限制的突变。然而，本文所述的CMV载体中的突变不影响载体再次感染先前已经感染CMV的受试者的能力。这种CMV突变描述于，例如，美国专利公开2013-0136768；2010-0142823；2014-0141038；和PCT申请公开WO 2014/138209中，所有这些都通过引用并入本文。

所公开的CMV载体可以在体内施用，例如其目的是产生免疫原性应答，包括CD8+免疫应答，包括以MHC-E(或其同源物或直系同源物)限制的高百分比的CD8⁺T细胞应答为特征的免疫应答。例如，在一些实例中，可能期望在实验动物(例如恒河猴)中使用所公开的CMV载体，以使用RhCMV进行免疫原性组合物和疫苗的临床前测试。在其他实例中，期望在人受试者中使用所公开的CMV载体，例如在使用HCMV进行免疫原性组合物的临床试验和实际临床应用中。

对于此类体内应用，所公开的CMV载体作为免疫原性组合物的组分施用，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。本公开的免疫原性组合物适用于刺激针对异源抗原(包括病原体特异性抗原)的免疫应答，并可用作用于预防、改善或治疗AIDS的针对HIV-1的预防性或治疗性疫苗的一种或多种组分。本公开的核酸和载体特别适用于提供基因疫苗，即用于将编码本公开抗原的核酸递送至受试者(例如人)的疫苗，使得抗原然后在受试者中表达以引发免疫应答。

动物(包括人)的免疫时间表(或方案)是众所周知的，并且可以容易地确定特定受试者和免疫原性组合物的免疫时间表(或方案)。因此，免疫原可以一次或多次施用于受试者。优选地，在免疫原性组合物的单独施用之间存在设定的时间间隔。虽然每个受试者的这种间隔不同，但通常范围为10天至数周，一般为2、4、6或8周。对于人，间隔通常为2至6周。在本公开的一个特别有利的实施例中，间隔更长，有利地为约10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。免疫方案通常具有1至6次的免疫原性组合物的施用，但可以具有少至一次或两次或四次。诱导免疫应答的方法还可包括用免疫原施用佐剂。在某些情况下，一年、半年或其他长间隔(5至10年)加强免疫可以补充初始免疫计划。本方法还包括各种初始-加强免疫方案。在这些方法中，进行一次或多次初始免疫，然后进行一次或多次加强免疫。每次免疫的实际免疫原性组合物可以相同或不同，免疫原性组合物(例如，含有蛋白质或表达载体)的类型、免疫原的途径和制剂也可以变化。例如，如果表达载体用于初始和加强步骤，则它可以是相同或不同的类型(例如，DNA或细菌或病毒表达载体)。一种适用的初始-加强免疫方案提供两次初始免疫，间隔四周，然后在最后一次初始免疫4和8周后进行两次加强免疫。对于本领域技术人员来说显而易见的是，使用本公开的DNA、细菌和病毒表达载体包含几种排列和组合，以提供初始和加强方案。可以重复使用CMV载体，同时表达源自不同病原体的不同抗原。

实例

以下实例仅用于说明。鉴于本公开，本领域技术人员将认识到，这些实例的变化和所公开的公开内容的其他实例是可能的，无需过多实验。

实例1

MHC-E反应对于保护免受SIV是重要的

毒株68-1RhCMV/SIV载体提供了曾经对高毒性SIV观察到的最佳保护作用(Hansen，S.G.等人，“通过效应记忆T细胞疫苗对高致病性SIV进行深度早期控制”，《自然(Nature)》473,523-7,(2011)；Hansen,S.G.等人，“高致病性SIV感染的免疫清除”，《自然》502,100-4,(2013)；Hansen,SG.等人，“效应记忆T细胞应答与保护恒河猴免受粘膜猿猴免疫缺陷病毒攻击有关”，《自然医学(Nature medicine)》15,293-9,(2009)(下文“Hansen2009”))。特别地，毒株68.1引发MHC-E和MHC-II限制性CD8+T细胞(Hansen，S.G.等人，“巨细胞病毒载体违背CD8+T细胞表位识别范例”，《科学》340,1237874(2013)(下文“Hansen《科学》2013”)；Hansen,S.G.等人，“受主要组织相容性复合体E限制的广泛靶向的CD8(+)T细胞应答”，《科学》351,714-20(2016)(下文“Hansen 2016”))；然而，之前尚未确定这种“非常规”T细胞反应在调节保护中的重要性。

RhCMV 68-1缺乏HCMV UL128和UL130的同源物，并且将UL128和UL130重新插入RhCMV 68-1(毒株68-1.2RhCMV/gag(UL128/UL130修复))导致从MHC-E和MHC-II完全切换至MHC-Ia(图1)(也参见Hansen《科学》2013)。此外，从毒株68-1.2(毒株68-1.2RhCMV/gag(UL130修复)和毒株68-1.2RhCMV/gag(UL128修复))中删除UL128或UL130导致以下混合表型：MHC-I和MHC-II，但不是MHC-II超级表位特异性或MHC-E限制性CD8+T细胞(图1)(也参见WO/2014/138209)。

为了确定缺乏引发MHC-E限制性CD8+T细胞能力的载体是否能够保护恒河猴(RM)免受高毒性SIV的影响，RM使用以下三种载体之一接种：RhCMV 68-1(缺失UL128和UL130)；68-1.2(UL128和UL130完整)；和缺失UL128的68-1.2(UL130完整)。每种载体表达SIV抗原SIVgag、SIVrev-tat-nef-和SIVpol。使用Hansen 2009中描述的方法，在t＝0和t＝18周时，将RhCMV/SIV载体皮下施用(每个载体5×10⁶PFU)两次，并且在第91周开始重复，限制剂量，直肠内SIVmac239攻击。用低剂量SIVmac239反复攻击所有RM，直到通过SIV Vif特异性T细胞应答的从头发展证实SIV感染“发生”，仅确定确实的SIV感染的动物的结果。SIV Vif未包括在疫苗中，因此这些应答来自SIV感染。虽然15个68-1RhCMV/SIV接种的RM中的8个显示(典型的)严格的SIV控制，但所有68-1.2和UL128缺失的68-1.2RhCMV/SIV接种的RM在攻击后显示出明显的进行性感染，类似于未接种的对照(图2)。在比较通过阴道内途径用SIVmac239攻击的雌性RM中的68-1与68-1.2RhCMV/SIV疫苗接种的独立实验中观察到相同的结果。在所有3个疫苗组中，SIV特异性CD4+和CD8+T细胞应答的幅度和功能表型是相当的，载体免疫原性的唯一显著差异是SIV特异性CD8+T细胞靶向的表位的性质。具体而言，68-1是MHC-E或MHC-II限制的；(ΔUL128)68-1.2是MHC-Ia或MHC-II限制的(不包括MHC-II超级表位)；并且68-1.2仅是MHC-Ia限制的。这些结果强烈表明MHC-E限制性CD8+T细胞和潜在的MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞对于保护免受SIV是重要的。

实例2

除了UL128和UL130的同源物之外，UL146和UL147同源基因的缺失是在食蟹猴中诱导MHC-E应答所必需的

RhCMV 68-1是一种成纤维细胞适应病毒，其含有多个基因缺失、基因倒位和单点突变(Malouli，D.等人，“BAC衍生的恒河猴巨细胞病毒株68-1的编码潜能和蛋白质组学分析的重新评估”，《病毒学杂志》86,8959-73(2012))。另外，野生型RhCMV不引发MHC-II和MHC-E应答(Hansen《科学》2013和Hansen 2016)。与RhCMV类似，野生型HCMV仅在特殊情况下引发HLA-E限制性CD8+T细胞(Pietra，G.等人，人CD8+细胞溶解性T淋巴细胞对巨细胞病毒衍生肽的HLA-E限制性识别，《美国国家科学院院院刊》100,10896-10901(2003))。据信，由于存在UL128和UL130，RM中的野生型RhCMV和人中可能的野生型HCMV不会引发MHC-E应答。然而，这并不排除MHC-E应答所需的68-1中的其他突变的可能性。为了解决这种可能性，确定了对于不同的物种食蟹猴(M.fascicularis)引发MHC-E应答所需的遗传变化。

为了确定是否可以在食蟹猴中引发非常规CD8+T细胞，将食蟹猴CMV(CyCMV)克隆为细菌人工染色体(BAC)。用SIVgag替换Cy13.1基因(RhCMV Rh13.1和HCMV RL13的同源物)。通过下一代测序对得到的CyCMV BAC进行完全测序，证明存在所有预期的开放阅读框(图3)。为了检查UL128-130的缺失是否足以引发MHC-E限制性CD8+T细胞，从前体构建体中删除与HCMV UL128和UL130同源的CyCMV基因以产生CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130(图4)。

通过接种食蟹猴并监测外周血CD8+记忆T细胞对SIVgag肽的应答在体内评估CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130的免疫原性。用4个氨基酸重叠的15mer SIVgag肽(GAGORF)或用与MHC-II或MHC-E超级表位对应的指示的SIVgag肽对来自CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130载体接种的食蟹猴的PBMC进行刺激，并进行流式细胞术细胞内细胞因子染色(ICS)。超级表位肽是在90％或更多的动物中被识别的肽，不论MHC单倍型，即存在或不存在给定的MHC-I或MHC-II等位基因。通过IFN-γ和TNF-α表达鉴定响应MHC-E或MHC-II结合的SIVgag肽的CD8+T细胞(图5A)。当用覆盖整个蛋白质的重叠肽(GAG ORF)刺激T细胞时，动物引发对SIVgag的强烈的CD8T细胞应答。然而，CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130未引发CD8+T细胞应答，其识别先前在所有RhCMV 68-1免疫的猕猴中检测到的MHC-E超级表位应答(肽Gag69和Gag120，描述于Hansen《科学》2013和Hansen 2016)或MHC-II超级表位应答(Gag53和Gag73，描述于Hansen《科学》2013和Hansen 2016)(图5B)。相反，CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130诱导MHC-I和MHC-II限制性CD8+T细胞应答的混合物(图5C)。但是，没有观察到MHC-II超级表位应答。这些结果表明从野生型食蟹猴CMV中删除UL128和UL130不足以引发MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞。

至少有两种不同的可能性可解释这些结果：a)食蟹猴不能引发MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞，或b)RhCMV 68-1中的其他突变使该病毒能够在恒河猴中引发MHC-E限制性CD8+T细胞。除了UL128和UL130的同源物之外，RhCMV 68-1还缺乏与HCMV UL146和UL147具有同源性的基因(牛津，K.L.,M.K.Eberhardt,K.W.Yang,L.Strelow,S.Kelly,S.S.Zhou和P.A.Barry.2008，“野生型恒河猴巨细胞病毒ULb'区的蛋白质编码含量”，《病毒学(Virology)》373:181-8；其通过引用并入本文)。野生型RhCMV编码这些CXC-趋化因子样蛋白的六个拷贝，其中三个在RhCMV 68-1中缺失，其余3个基因的表达未知。概括一下RhCMV 68-1的这一特征，即产生的CyCMV不仅缺乏UL128和UL130的同源物，还缺乏UL146和UL147的所有六种同源物(图4)。用4个氨基酸重叠的15mer SIVgag肽(GAG ORF)或用与MHC-II或MHC-E超级表位对应的指示的SIVgag肽对来自CyCMVΔRL13/gagΔUL128-130ΔUL146-147载体接种的食蟹猴的PBMC进行刺激，并进行流式细胞术细胞内细胞因子染色(ICS)。通过IFN-γ和TNF-α表达鉴定响应MHC-E或MHC-II结合的SIVgag肽的CD8+T细胞。用CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128/130ΔUL146接种食蟹猴引发了识别MHC-E和MHC-II超级表位二者的CD8+T细胞(图6A)。特别地，Gag69被抗MHC-I和VL9肽阻断，但不被CLIP肽阻断，与MHC-E限制一致(MHC-E是非多态性MHC-I分子)，而Gag73被CLIP肽阻断，但不被抗MHC-I或VL9肽阻断，与MHC-II限制一致(图6B)。这些结果表明CyCMVΔRL13/SIVgagΔUL128-130ΔUL146-147引发MHC-E和MHC-II限制性CD8+T细胞，但不引发多态性MHC-Ia限制性CD8+T细胞(图6C)。

总之，这些数据表明UL146/147家族的CXC趋化因子样蛋白阻止MHC-E限制性CD8+T细胞以及MHC-II超级表位限制性CD8+T细胞的诱导。因此，这些数据支持如下见解：MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞可能仅由缺乏UL128和UL130二者，以及UL146和UL147的全部或部分或其全部同源物的CMV载体诱导。RhCMV对MHC-E限制性CD8+T细胞应答的诱导之前也已显示需要存在UL40和US28的同源物。由于CyCMV也含有这些基因，但是这些结果表明，如果CMV载体具有以下基因组成，它们将仅引发MHC-E应答：缺失UL128和UL130或同源物；缺失UL146和UL147的部分或全部或同源物；存在UL40或同源物；和存在US28或同源物。

实例3

恒河猴CMV和人CMV的UL146同源物阻止在恒河猴中诱导MHC-E应答

为证明RhCMV的UL146/147同源基因同样会阻止在RM中诱导MHC-E应答(即使缺失UL128和UL130时)，通过恢复产生高度突变的RhCMV 68-1的RhCMV分离株的原始序列产生RhCMV的野生型版本。RhCMV 68-1前体病毒的ULb'区由Gill等人(Gill，R.B.等人，“来自恒河猴巨细胞病毒株68-1的初始来源的UL/b'的编码潜力”，《病毒学》447:208-212)描述的原始分离株测序。使用RhCMV 68-1细菌人工染色体(BAC)的基因工程，在一系列诱变步骤中重建野生型全长基因组(FL-RhCMV)(图7)。使用FL-RhCMV-BAC作为起始点，将SIVgag插入HCMVRL13的RhCMV同源物中以产生FL-RhCMVΔRL13gag。接种RM后，观察到对SIVgag的CD8+T细胞应答，但没有观察到对MHC-II或MHC-E超级表位的应答(图8A)。接下来，删除UL128和UL130的RhCMV同源物以产生FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130。对RM进行接种后，同样观察到SIVgag-特异性CD8+T细胞应答，但没有观察到对MHC-E或MHC-II超级表位的应答(图8B)。这些观察结果强烈表明趋化因子的HCMV UL146/147基因家族的RhCMV同源物抑制MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞的诱导。

由于68-1RhCMV仅缺少HCMV UL146和UL147的6个同源物中的3个，因此HCMV UL146和UL147的中心3个同源物被删除以确定这是否能够使UL128-130缺失的RhCMV引发MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞。然而，令人惊讶的是，FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130ΔUL146(3)不能将CD8+T细胞引发至受MHC-II或MHC-E限制的超级表位肽(图8C)。这些结果表明，6个同源物中超过3个需要被删除或失活以引发MHC-E限制性CD8+T细胞。因此，删除UL146和UL147的所有6个同源物以产生FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130ΔUL146(6)。用该载体接种的RM能够引发识别MHC-II和MHC-E超级表位的CD8+T细胞(图8D)。这些结果证明UL146和UL147的所有6个同源物的缺失使得缺乏UL128+130的RhCMV能够引发MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞。

CyCMV和RhCMV均含有与两个HCMV基因UL146和UL147同源的6个基因。总之，上述数据表明，食蟹猴CMV和恒河猴CMV的这些趋化因子样基因阻止MHC-E限制性CD8+T细胞应答的诱导。为了确定该抑制作用在HCMV中是否是保守的，通过BAC重组工程将HCMV UL146和UL147单独或组合插入FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130ΔUL146(6)中。生成了三种不同的嵌合载体：FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130hcmvUL146-UL147(其含有HCMV基因而不是相应的RhCMV同源物)；FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130hcmvUL146(其含有HCMV UL146而不是相应的RhCMV同源物)；和FL-RhCMVΔRL13gagΔUL128-130hcmvUL147(其含有HCMV UL147而不是相应的RhCMV同源物)。当用这三种构建体接种RM时，三种重组载体中没有一种引发识别MHC-II或MHC-E超级表位的CD8+T细胞(图9A至9C)。这些结果表明，阻止MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞的能力是HCMV中的保守特征。基于这些和先前的结果，同样显而易见的是，HCMV载体需要具有以下特征以引发MHC-E限制性和MHC-II超级表位特异性CD8+T细胞：a)缺少UL128和UL130二者；b)缺少UL146和UL147二者；c)存在UL40；d)存在US28或US27。

实例4

包含内皮细胞特异性微小RNA识别元件(MRE)的CMV载体引发主要受MHC-E

限制的CD8+T细胞应答

为了限制基于RhCMV的载体在内皮细胞谱系细胞中复制的能力，RhCMV 68-1被设计成在必需病毒基因的3'UTR中含有内皮细胞特异性miR-126-3p靶序列。与表现出miR-142-3p的组织特异性表达的髓细胞谱系细胞类似，内皮细胞表达细胞谱系特异性的miR-126-3p。假设将miR-126-3p靶位点插入两个基本RhCMV基因(Rh156，与HCMV UL122(IE2)同源的必需立即早期基因，和Rh108，与HCMV UL79同源的必需早期基因)的3'UTR中，由于抑制编码这些病毒必需蛋白的mRNA的翻译，将阻断高表达miR-126-3p的内皮细胞中的病毒复制。

使用galK介导的BAC重组，将galK选择盒插入Rh156的3'UTR内，然后用含有4个拷贝的miR-126-3p结合位点的人工盒替换，所述miR-126-3p结合位点由8个随机核苷酸隔开。然后进行第二系列重组，从而将galK盒插入Rh108的3'UTR中，并用如上所述的人工盒将其替换(图10)。这些载体通过将该抗原(在EF1α启动子的控制下)插入基因Rh211中，另外表达源自SIVgag的异源抗原。使用PCR，利用针对插入位点侧翼区域设计的引物和随后的PCR产物测序，确认重组成功。随后将完整的BAC DNA电穿孔到原代恒河猴成纤维细胞中以回收病毒，并对病毒DNA进行测序。

肺成纤维细胞、脐静脉内皮细胞和巨噬细胞来源于恒河猴。从每种细胞类型中分离RNA，并对所有样品进行miR-126-3p和miR-142-3p的qRT-PCR。使用标准曲线从10ng RNA确定miR-126-3p和miR-142-3p拷贝数。miR-126-3p miRNA在恒河猴内皮细胞中高度表达，但在来自外周血的巨噬细胞中或原代成纤维细胞中以较低水平表达。相反，miR-142-3p在巨噬细胞中高度表达，但在内皮细胞或成纤维细胞中不是高度表达(图11)。这些数据表明，与恒河猴成纤维细胞或巨噬细胞相比，恒河猴内皮细胞谱系细胞表达更高水平的miR-126-3p，并提供了使用该miRNA靶向内皮细胞中必需RhCMV转录物的依据。

在miR-126-3p水平较高的细胞中，在必需基因(如Rh156和Rh108)中含有miR-126-3p结合位点的病毒生长受到严重限制，因为miR-126-3p负载的RNA诱导沉默复合体(RISC)将与Rh156和Rh108的3'UTR结合并阻断翻译。为了证明miR-126-3p表达对病毒复制的影响，将miR-126-3p或阴性对照模拟物转染到恒河猴成纤维细胞中，并且监测含有miR-126-3p靶位点的68-1RhCMV或等同大小的杂乱序列(68-1Rh156/Rh108miR-126mut)的病毒生长。具体地，用阴性对照miRNA或miR-126RNA模拟物转染端粒化的恒河猴成纤维细胞，转染后24小时，用RhCMV68-1Rh156/Rh108miR-126或RhCMV 68-1Rh156/Rh10miR-126mut感染细胞，MOI为0.01。在指定的时间收获细胞和上清液并在恒河猴成纤维细胞上滴定。如图12所示，转染miR-126-3p模拟物后，而不是转染对照miRNA后，对于68-1RhCMV Rh156/Rh108miR-126，细胞中的病毒生长和病毒至上清液的释放被严重抑制，但对于68-1RhCMV Rh156/Rh108miR-126mut，细胞中的病毒生长和病毒至上清液的释放没有被严重抑制。

为了进一步证明miR-126-3p抑制内皮细胞中的病毒生长，将miR-126-3p靶位点插入到RhCMV 68-1.2中的IE2和UL79同源物的3'UTR中，与RhCMV 68-1相比，由于完整的五聚体复合物，RhCMV 68-1.2在体外更有效地感染内皮细胞。用68-1.2RhCMV Rh156/Rh108miR-126或68-1.2RhCMV Rh156/Rh108miR-126mut感染原代恒河猴内皮细胞，MOI为0.01。感染后第7天、第14天、第21天和第28天收获感染的细胞或上清液，然后在恒河猴成纤维细胞上滴定病毒。如图13所示，68-1.2RhCMV Rh156/Rh108miR-126-3p在恒河猴内皮细胞中生长的能力严重受限，但含有杂乱的miR-126-3p靶序列的对照RhCMV 68-1.2(68-1.2RhCMV Rh156/Rh108miR-126mut)在恒河猴内皮细胞中生长的能力没有受到严重限制。

在体内评估miR-126限制性病毒的免疫原性。为恒河猴接种68-1RhCMV Rh156/Rh108miR-126/SIVgag载体(缺少UL128、UL130、UL146和UL147的同源物，但含有HCMV UL40和US28的功能同源物，以及在EF1α启动子控制下的SIVgag转基因)，分离外周血CD8+记忆T细胞，并通过流式细胞术ICS分析所述CD8+记忆T细胞对重叠SIVgag肽的应答(图15)。动物引发对整个蛋白质的强烈的CD8T细胞应答，如在SIVgag的重叠肽存在下CD69和TNFα的上调所示。该结果表明疫苗载体的总体免疫原性不会因引入miR-126-3p靶位点而受到损害。然而，虽然载体引发受MHC-E限制的CD8+T细胞，但它没有将CD8+T细胞引向MHC-II限制性表位。为了进一步表征该T细胞表型，用68-1RhCMV miR-126/SIVgag接种两只RM，并通过在存在或不存在VL9或CLIP肽(其分别阻止MHC-E或MHC-II限制性CD8+T细胞应答)的情况下由ICS测量T细胞应答来确定125个SIVgag肽中的每一个的MHC-限制。如图14所示，由获自68-1RhCMV miR-126/SIVgag免疫的RM的CD8+T细胞识别的所有肽均由MHC-E呈递。这些结果表明RhCMV 68-1引发MHC-E和MHC-II限制性CD8+T细胞，因为它缺乏UL128、UL130、UL146和UL147的同源物并且表达UL40和US28的同源物。通过将miR-126-3p插入该骨架中，消除了MHC-II应答。

这些数据表明，诱导MHC-II限制性CD8+T细胞需要感染内皮细胞。因此，miR-126-3p靶位点的插入产生“仅MHC-E”载体，即仅引发MHC-E限制性CD8+T细胞，而不是受多态性MHC-I或MHC-II分子限制的T细胞的载体。由于MHC-E限制性CD8+T细胞是保护免受SIV和可能的HIV所必需的，因此这些数据还表明miR-126-3p插入可以改善载体功效，这将使CD8+T细胞应答集中在保护性表位上。因此，MHC-E优化的HCMV载体应具有以下特征：a)缺少UL128和UL130二者；b)缺少UL146和UL147二者；c)存在UL40；d)存在US28或US27；和e)将miR-126-3p靶位点插入必需基因如IE2或UL79(或已知对HCMV生长必需的任何基因)的3'UTR。

实例5

包含内皮细胞特异性和髓样特异性微小RNA识别元件(MRE)的CMV载体引发主要受MHC-Ia限制的CD8+T细胞应答

我们先前证明设计以在基本病毒基因的3'UTR中含有髓样特异性miR-142-3p靶序列的RhCMV 68-1具有与miR-126-3p插入完全相反的表型，完全丧失了MHC-E应答，同时保持MHC-II应答，产生仅MHC-II载体的设计(参见WO/2017/087921)。为了确定miR-142-3p和miR-126-3p联合插入的影响，我们使用BAC重组将每个miR-126-3p和miR-142-3p的两个拷贝插入Rh156和Rh108的3'UTR中(图16)。这些载体通过将该抗原(在EF1α启动子的控制下)插入基因Rh211中，另外表达源自SIVgag的异源抗原。使用PCR，利用针对插入位点侧翼区域设计的引物和随后的PCR产物测序，确认重组成功。随后将完整的BAC DNA电穿孔到原代恒河猴成纤维细胞中以回收病毒，并对病毒DNA进行测序。

在体内评估miR-126/mir-142-限制性病毒的免疫原性。为恒河猴接种68-1RhCMVRh156/Rh108miR-126miR-142/SIVgag载体(缺少UL128、UL130、UL146和UL147的同源物，但含有HCMV UL40和US28的功能同源物，以及在EF1α启动子控制下的SIVgag转基因)，分离外周血CD8+记忆T细胞，并通过流式细胞术ICS分析所述CD8+记忆T细胞对SIVgag肽的应答(图17)。如在ICS中使用重叠肽测量的，动物引发对整个SIVgag蛋白的稳健的CD8T细胞应答。然而，载体确实引发识别MHC-II或MHC-E限制性超级表位肽的CD8+T细胞。为了进一步表征该T细胞表型，在存在或不存在pan-MHC-I(阻断MHC-Ia和MHC-E)、VL9肽(阻断MH-E)或CLIP肽(阻断MHC-II)的情况下，通过ICS测量T细胞应答来确定125个SIVgag肽中的每一个的MHC-限制。如图17所示，由获自68-1RhCMV miR-126miR-142/SIVgag免疫的RM的CD8+T细胞识别的所有肽均由MHC-Ia呈递。这些结果表明缺少UL128、UL130、UL146和UL147或其同源物并表达UL40和US28的同源物的载体可以通过插入miR-126-3p和miR-142-3p二者重新编程以引发MHC-Ia限制性CD8+T细胞。

表1总结了上述实例的结果。所有基因完整且不受细胞类型特异性miR限制的野生型CMV引发常规的MHC-I限制性CD8+T细胞。UL128和UL130(单独或组合)的缺失导致引发MHC-I和(非超级表位)MHC-II限制性CD8+T细胞应答的混合物的载体。UL128和UL130以及UL146或UL147的同源物的缺失引发受MHC-II和MHC-E限制的T细胞应答，包括对MHC-II和MHC-E超级表位的应答。只有缺失所有这些基因的载体才能引发MHC-E和MHC-II限制性CD8+T细胞。缺乏UL146和UL147同源物但含有UL128和UL130同源物的载体不引发MHC-E或MHC-II限制性CD8+T细胞，而是引发常规MHC-I限制性CD8+T细胞。通过经由miR-126-3p靶向限制内皮细胞中的病毒基因表达，可以阻止MHC-II限制性CD8+T细胞的诱导，导致仅诱导MHC-E限制性CD8+T细胞的载体。通过经由miR-126-3p和miR-142-3p靶向限制内皮细胞和髓细胞谱系细胞中的病毒基因表达，可以阻止MHC-II和MHC-E-限制性CD8+T细胞的诱导，导致仅诱导MHC-Ia限制性CD8+T细胞的载体。

表1：产生CMV载体的特定MHC限制的遗传修饰的汇总

*将4个拷贝的miR靶序列插入基本病毒基因IE2(Rh156)和UL79(Rh108)的3'UTR中

**MHC-E限制性应答初始免疫也取决于Rh67和Rh214/220或其HCMV直系同源物(UL40和US27/28)的完整功能

实例6

在MHC-E的背景下产生对目标肽具有特异性的CD8+T细胞

在经典的多态性MHC-Ia分子的背景下识别目标抗原衍生肽的T细胞受体可用于转染自体T细胞以用于疾病如癌症或传染病的免疫疗法。这种方法的主要障碍是人群中的MHC-Ia多样性限制了将给定TCR用于MHC-Ia匹配患者。通过在非经典的非多态性MHC-E分子的背景下产生识别目标抗原衍生肽(例如，肿瘤抗原衍生的肽和病原体衍生的肽)的TCR，MHC匹配变得退化，并且所得到的TCR可用于所有患者。

识别MHC-E/肽复合物的CD8+T细胞在性质上是罕见的，并且目前还没有可靠的方法来产生针对目标抗原(例如肿瘤抗原、病原体衍生的抗原、组织特异性抗原，或宿主自身抗原)的这种T细胞。本文描述的方法基于以下发现：缺乏与HCMV UL128、UL130、UL146和UL147同源的基因的恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)和食蟹猴巨细胞病毒(CyCMV)载体以增加的频率引发MHC-E限制性CD8+T细胞。通过将目标抗原插入缺失UL128、UL130、UL146和UL147的RhCMV或CyCMV，可以产生针对由MHC-E呈递的单个肽的CD8+T细胞。可以通过包含MRE来进一步修饰CMV载体，所述MRE在由内皮细胞谱系细胞表达的微小RNA(例如miR-126-3p)存在下沉默基因表达。MHC-E/肽识别TCR可以通过许多方法中的任何一种进行鉴定，但通常依赖于通过PCR直接从单细胞、克隆扩增的单细胞的cDNA测序α和β链，或者从肽特异性CD8+T细胞的深度测序池测序α和β链。或者，可以通过首先为单细胞、克隆扩增的单细胞或肽特异性CD8+T细胞库创建完整的转录组文库来扩展RNA模板来间接衍生序列。可以通过在mRNA上进行的cDNA末端快速扩增(RACE)或RNA模板5'末端转换机制(SMART)计划来产生肽特异性可变序列。锚定在侧翼恒定区中或类似地从单肽反应性CD8+细胞的完整的转录组文库中锚定的PCR可以直接测序或对其各自的TCR可变区进行深度测序。可以进一步合成或克隆源自肽反应性CD8+T细胞的个体或池的TCR序列的α和β链的验证组合。然后可以将得到的TCR构建体转染到T细胞中，接着可以将其作为疗法(例如，癌症疗法或传染病疗法)施用于患者。在Barsov EV等人，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6,e23703(2011)中也讨论了克隆和转染TCR可变区的方法，其通过引用并入本文。

序列表

<110> 俄勒冈健康与科学大学

<120> 引发受主要组织相容性复合体E分子限制的T细胞的巨细胞病毒载体

<130> P105PCT

<150> 62/409,840

<151> 2016-10-18

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

ucguaccgug aguaauaaug cg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

cgcattatta ctcacggtac ga 22

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

uguaguguuu ccuacuuuau gga 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

tccataaagt aggaaacact aca 23

Claims (18)

1.人巨细胞病毒(HCMV)载体，其包含：

(a)第一核酸序列，其编码至少一种异源抗原；和

(b)第二核酸序列，其包含与CMV基因可操作地连接UL122或UL79的第一微小RNA识别元件(MRE)，其中所述MRE在miR-126-3p的存在下沉默UL122或UL79的表达并被插入所述UL122或UL79的3’UTR；

其中所述载体不表达活性UL128蛋白；不表达活性UL130蛋白；不表达活性UL146；并且不表达活性UL147蛋白，表达活性UL40蛋白；并表达活性US28或US27蛋白。

2.根据权利要求1所述的HCMV载体，其中所述至少一种异源抗原包含病原体特异性抗原、肿瘤抗原、组织特异性抗原或宿主自身抗原。

3.根据权利要求2所述的HCMV载体，其中所述宿主自身抗原是衍生自T细胞受体(TCR)可变区的抗原或衍生自B细胞受体可变区的抗原。

4.根据权利要求2所述的HCMV载体，其中所述病原体特异性抗原衍生自病原体，所述病原体选自由以下组成的群组：人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫属寄生虫和结核分枝杆菌。

5.根据权利要求2所述的HCMV载体，其中所述肿瘤抗原与癌症有关，所述癌症选自由以下组成的群组：急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌(RCC)和生殖细胞肿瘤。

6.根据权利要求1所述的HCMV载体用于制备供在受试者中产生针对所述至少一种异源抗原的免疫应答的方法中使用的药物中的用途，所述方法包括：

以有效引发对所述至少一种异源抗原的CD8+T细胞应答的量向所述受试者施用所述的HCMV载体。

7.根据权利要求1所述的HCMV载体用于制备供在受试者中产生针对所述至少一种异源抗原的免疫应答的方法中使用的药物中的用途，其中由所述HCMV载体引发的CD8+T细胞的至少10％受MHC-E的限制，该方法包括：

向该受试者施用所述HCMV载体，其量可有效引发CD8+T细胞对至少一种异源抗原的应答。

8.根据权利要求7所述的用途，其中由所述HCMV载体引发的CD8+T细胞的至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少75％受MHC-E的限制。

9.根据权利要求7所述的用途，其中受MHC-E限制的CD8+T细胞中的一些识别由至少90％用载体免疫的其他受试者共有的肽。

10.根据权利要求6所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用第二HCMV载体，所述第二HCMV载体包含编码至少一种异源抗原的核酸序列。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述第二HCMV载体表达一种或多种活性蛋白，所述活性蛋白选自由以下组成的群组：UL128；UL129；UL146；和UL147。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述第一HCMV载体和所述第二HCMV载体的所述至少一种异源抗原是相同的抗原。

13.根据权利要求10所述的用途，其中所述第二HCMV载体在所述第一HCMV载体之前，同时或之后施用。

14.根据权利要求6所述的用途，其中所述受试者先前已经暴露于HCMV。

15.根据权利要求6所述的用途，其中所述受试者是人或非人灵长类动物。

16.根据权利要求6所述的用途，其中施用所述HCMV载体包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内或口服施用所述HCMV载体。

17.根据权利要求7所述的用途，还包括鉴定由所述HCMV载体引发的CD8+T细胞的CD8+TCR，其中所述CD8+TCR识别MHC-E/异源抗原衍生的肽复合物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中通过DNA或RNA测序鉴定CD8+TCR。