CN111405912B - 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法 - Google Patents

用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111405912B
CN111405912B CN201880076711.3A CN201880076711A CN111405912B CN 111405912 B CN111405912 B CN 111405912B CN 201880076711 A CN201880076711 A CN 201880076711A CN 111405912 B CN111405912 B CN 111405912B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrna
rna
seq
uridine
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880076711.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111405912A (zh
Inventor
C·东布罗夫斯基
J·D·芬恩
A·M·R·史密斯
S·C·亚历山大
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intellia Therapeutics Inc
Original Assignee
Intellia Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intellia Therapeutics Inc filed Critical Intellia Therapeutics Inc
Priority to CN202510091858.1A priority Critical patent/CN119955825A/zh
Publication of CN111405912A publication Critical patent/CN111405912A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111405912B publication Critical patent/CN111405912B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C12N9/222—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]-associated [CAS] enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供用于基因编辑的组合物及方法。在一些实施例中，提供一种编码Cas9的多核苷酸，其可提供改良的编辑效率、降低的免疫原性或其它益处中的一种或多种。

Description

用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
本申请要求基于2017年9月29日提出的美国临时申请第62/556,144号的优先权，且其全部内容以引用方式并入。
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表且其全部内容以引用方式并入本文中。于2018年9月28日创建的该ASCII拷贝命名为2018-09-28_01155-0020-00PCT_ST25.txt且大小为963,200个字节。
技术领域
本发明是关于用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法，该基因组编辑涉及RNA引导的DNA结合剂，诸如CRISPR-Cas系统及其亚基。
背景技术
RNA引导的DNA结合剂，诸如CRISPR-Cas系统可用于进行靶基因组编辑，包括在真核细胞中及活体内。已显示此类编辑能够不活化某些有害等位基因或校正某些有害点突变。该结合剂可通过提供编码的mRNA来原位表达。然而，现有方法提供的编辑效率可能要比所需编辑效率低或可能具有非所期望的免疫原性，例如可能会引起细胞介素含量的升高为非所期望的。
因此，需要经改良的用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法。本发明旨在提供用于基因组编辑的组合物及方法，其提供一或多种益处，诸如经改良的编辑效率或经降低的免疫原性(例如施用后经降低的细胞介素的升高量)中的至少一者；或至少为公众提供一种有用选择。在一些实施例中，提供一种编码RNA引导的DNA结合剂的多核苷酸，其中其密码子使用、非编码序列(例如UTR)、异源域(例如NLS)及/或核苷酸含量中的一项或多项以本文所揭示的方式与现有多核苷酸不同。已发现此类特征可提供诸如上文所述的益处。在一些实施例中，经改良的编辑效率出现在哺乳动物的器官或细胞型，诸如肝脏或肝细胞中或对其具有特异性。
发明详述
实施例1为一种包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架的mRNA，其中该开放阅读框架的尿苷含量在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％范围内。
实施例2为一种包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架的mRNA，其中该开放阅读框架的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内。
实施例3为一种包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架的mRNA，其中该开放阅读框架的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至最小腺嘌呤含量的150％范围内。
实施例4为一种包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架的mRNA，其中该开放阅读框架的腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％范围内。
实施例5为一种包含与SEQ ID NO：1、4、7、9、10、11、12、14，15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175任一项具有至少90％的一致性的序列的mRNA，其中该mRNA包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架。
实施例6为一种包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架的mRNA，其中该开放阅读框架与SEQ ID NO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175以下任一项在至少其前30、50、70、100、150、200、250或300个核苷酸上具有至少90％的一致性。
实施例7为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为(i)表1、表2或表3中所列的密码子或(ii)一组表4中所列的密码子。
实施例8为一种编码RNA引导的DNA结合剂的mRNA，其包含编码RNA引导的DNA结合剂的开放阅读框架，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为表1、表2、表3中所列的密码子或(ii)一组表4中所列的密码子。
实施例9为如技术方案7或8的mRNA，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为表4中低U1组的密码子。
实施例10为如技术方案7或8的mRNA，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为表4中低A组的密码子。
实施例11为如技术方案7或8的mRNA，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为表4中低A/U组的密码子。
实施例12为如技术方案7或8的mRNA，其中开放阅读框架由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为表4中长半衰期组的密码子。
实施例13为如技术方案7至12中任一项的mRNA，其中至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为(i)表1、表2或表3中所列的密码子或(ii)一组表4中所列的密码子。
实施例14为如技术方案1至5或7至13中任一项的mRNA，其中开放阅读框架与SEQID NO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175任一项在至少其前30、50、70、100、150、200、250或300个核苷酸上具有至少90％的一致性。
实施例15为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架与SEQ ID NO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175任一项在至少其序列之前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上具有至少90％的一致性。
实施例16为如技术方案1至4或6至15中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ IDNO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175任一项有至少90％的一致性的序列。
实施例17为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％范围内。
实施例18为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架的尿苷含量在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％范围内。
实施例19为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至最小腺嘌呤含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％范围内。
实施例20为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架的腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至最小腺嘌呤二核苷酸含量的101％、102％、103％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％范围内。
实施例21为如前述技术方案中任一项的mRNA，其包含与SEQ ID NO：32、34、36、38、41或75—77中的任一项有至少90％的一致性的5′UTR。
实施例22为如前述技术方案中任一项的mRNA，其包含与SEQ ID NO：33、35、37、39或40中的任一项有至少90％的一致性的3′UTR。
实施例23为如技术方案21或22的mRNA，其中mRNA包含来自同一来源的5′UTR及3′UTR。
实施例24为如前述技术方案中任一项的mRNA，其包含选自Cap0、Cap1及Cap2的5′帽结构。
实施例25为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中开放阅读框架具有提高哺乳动物中的mRNA转译的密码子。
实施例26为如技术方案25的mRNA，其中开放阅读框架具有提高哺乳动物的特定器官中的mRNA转译的密码子。
实施例27为如技术方案26的mRNA，其中器官为肝脏。
实施例28为如技术方案25至27中任一项的mRNA，其中哺乳动物为人类。
实施例29为如技术方案25至28中任一项的mRNA，其中相对于包含具有由SEQ IDNO：5组成的序列的ORF的mRNA的转译，密码子提高哺乳动物中的mRNA的转译。
实施例30为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中当以医药组合物形式向哺乳动物施用该mRNA时，哺乳动物展现出比施用包含具有大于150％最小尿苷含量的编码Cas9核酸酶的ORF的mRNA的哺乳动物低至少5倍的细胞介素反应。
实施例31为如技术方案30的mRNA，其中包含具有大于150％最小尿苷含量的编码Cas9核酸酶的ORF的mRNA具有由SEQ ID NO：5组成的序列。
实施例32为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂具有双股核酸内切酶活性。
实施例33为如技术方案32的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂包含Cas裂解酶。
实施例34为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂具有切口酶活性。
实施例35为如技术方案34的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂包含Cas切口酶。
实施例36为如技术方案1至31中任一项的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂包含dCas DNA结合域。
实施例37为如技术方案33或35至36中任一项的mRNA，其中Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合域为Cas9裂解酶、Cas9切口酶、或dCas9 DNA结合域。
实施例38为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中经编码的RNA引导的DNA结合剂包含核定位信号(NLS)。
实施例39为如技术方案38的mRNA，其中NLS连接于RNA引导的DNA结合剂的C端。
实施例40为如技术方案38的mRNA，其中NLS连接于RNA引导的DNA结合剂的N端。
实施例41为如技术方案38至40中任一项的mRNA，其中NLS包含与SEQ ID NO：78-91中的任一项具有至少80％、85％、90％或95％的一致性的序列。
实施例42为如技术方案38至40中任一项的mRNA，其中NLS包含SEQ ID NO：78—91中的任一项的序列。
实施例43为如技术方案38至42中任一项的mRNA，其中NLS由与SEQ ID NO：92-104中的任一项的序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％的一致性的序列编码。
实施例44为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：4、7或9有至少90％的一致性的序列。
实施例45为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：4、7或9有至少95％的一致性的序列。
实施例46为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：4、7或9有至少98％的一致性的序列。
实施例47为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：4、7或9有100％一致性的序列。
实施例48为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：111、114或117有至少90％的一致性的序列。
实施例49为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：111、114或117有至少95％的一致性的序列。
实施例50为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：111、114或117有至少98％的一致性的序列。
实施例51为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：112、122或125有100％一致性的序列。
实施例52为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：112、122或125有至少90％的一致性的序列。
实施例53为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：112、122或125有至少95％的一致性的序列。
实施例54为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107—175有至少90％的一致性的序列。
实施例55为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175有至少95％的一致性的序列。
实施例56为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175有至少98％的一致性的序列。
实施例57为如技术方案37至43中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66、或107-175有100％一致性的序列。
实施例58为如技术方案37至57中任一项的mRNA，其中该mRNA编码包含SEQ ID NO：3、6、8或186-196的氨基酸序列的多肽。
实施例59为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中RNA引导的DNA结合剂进一步包含异源功能域。
实施例60为如技术方案59的mRNA，其中异源功能域为FokI核酸酶。
实施例61为如技术方案59的mRNA，其中异源功能域为转录调节域。
实施例62为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中当以包含脂质纳米颗粒的医药组合物形式向哺乳动物施用有效量的mRNA以及靶向哺乳动物的TTR基因的引导RNA时，在得自哺乳动物肝细胞的至少50％基因组DNA中的TTR基因座处形成插入缺失标记(indel)。
实施例63为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中当以包含脂质纳米颗粒的医药组合物形式向哺乳动物施用有效量的mRNA以及靶向哺乳动物的TTR基因的引导RNA时，哺乳动物的血清中的TTR的浓度降低至少50％。
实施例64为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例65为如技术方案64的mRNA，其中经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷中的一种或多种。
实施例66为如技术方案64的mRNA，其中经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷或5-甲氧基尿苷中的一种或两种。
实施例67为如技术方案64的mRNA，其中经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。
实施例68为如技术方案64的mRNA，其中经修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。
实施例69为如技术方案64至68中任一项的mRNA，其中15％至45％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例70为如技术方案64至68中任一项的mRNA，其中至少20％或至少30％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例71为如技术方案70的mRNA，其中至少80％或至少90％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例72为如技术方案70的mRNA，其中100％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
实施例73为如技术方案64至72中任一项的mRNA，其中当以包含脂质纳米颗粒的医药组合物形式向哺乳动物施用有效量的mRNA以及靶向哺乳动物的TTR基因的引导RNA时，在得自哺乳动物肝细胞的至少70％或至少90％基因组DNA中的TTR基因座处形成插入缺失标记(indel)。
实施例74为如技术方案64至73中任一项的mRNA，其中当以包含脂质纳米颗粒的医药组合物形式向哺乳动物施用mRNA以及靶向哺乳动物的TTR基因的引导RNA时，哺乳动物的血清中的TTR的浓度降低至少70％或至少90％。
实施例75为如技术方案62、63、71或72的mRNA，其中动物为小鼠且引导RNA具有由SEQ ID NO：42组成的序列。
实施例76为如技术方案62、63、71或72的mRNA，其中动物为大鼠且引导RNA具有由SEQ ID NO：69组成的序列。
实施例77为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或176-185中的任一项有至少90％的一致性的序列。
实施例78为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或176-185中的任一项有至少95％的一致性的序列。
实施例79为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或176-185中的任一项有至少98％的一致性的序列。
实施例80为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或176-185中的任一项有至少99％的一致性的序列。
实施例81为如前述技术方案中任一项的mRNA，其中该mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或176-185中的任一项有100％一致性的序列。
实施例82为一种表达构建体，其包含以可操作方式连接编码如前述技术方案中任一项的mRNA的序列的启动子。
实施例83为一种包含如技术方案82的表达构建体的质粒。
实施例84为一种包含如技术方案82的表达构建体或如技术方案83的质粒的宿主细胞。
实施例85为一种制备mRNA的方法，该方法包含使如技术方案82的表达构建体或如技术方案83的质粒与核糖核酸聚合酶在容许进行mRNA的转录的条件下接触。
实施例86为如技术方案85的方法，其中活体外进行接触步骤。
实施例87为一种组合物，其包含如技术方案1至81中任一项的mRNA及至少一种引导RNA。
实施例88为一种脂质纳米颗粒，其包含如技术方案1至81中任一项的mRNA。
实施例89为一种医药组合物，其包含如技术方案1至81中任一项的mRNA及医药学上可接受的载体。
实施例90为如技术方案88的脂质纳米颗粒或如技术方案89的医药组合物，其进一步包含至少一种引导RNA。
实施例91为如技术方案87至90中任一项的组合物或脂质纳米颗粒，其中至少一种引导RNA靶向TTR。
实施例92为一种基因组编辑或修饰靶基因的方法，其包含使细胞与如技术方案1至83或87至91中任一项的mRNA、表达构建体、组合物或脂质纳米颗粒接触。
实施例93为如技术方案1至83或87至91中任一项的mRNA、表达构建体、组合物或脂质纳米颗粒的用途，其用于基因组编辑或修饰靶基因。
实施例94为如技术方案1至83或87至91中任一项的mRNA、表达构建体、组合物或脂质纳米颗粒的用途，其用于制造用于基因组编辑或修饰靶基因的药剂。
实施例95为如技术方案92至94中任一项的方法或用途，其中基因组编辑或修饰靶基因在肝脏细胞中进行。
实施例96为如技术方案95的方法或用途，其中肝脏细胞为肝细胞。
实施例97为如技术方案92至96中任一项的方法或用途，其中基因组编辑或修饰靶基因在活体内进行。
实施例98为如技术方案92至97中任一项的方法或用途，其中基因组编辑或修饰靶基因在经分离或经培养的细胞中进行。
所揭示的序列的简要说明
对于序列本身，参见下文序列表。转录物序列一般包括GGG作为供与ARCA一起使用之前三个核苷酸，或包括AGG作为供与CleanCapTM一起使用之前三个核苷酸。因此，可对前三个核苷酸进行修饰以供与其它加帽结构方法，诸如牛痘加帽结构酶一起使用。启动子及聚-A序列不包括于转录物序列中。启动子，诸如T7启动子(SEQ ID NO：31)及聚-A序列，诸如SEQID NO：62或63可在5′及3′端处分别附接于所揭示的转录物序列。大多数核苷酸序列以DNA形式提供，但可通过将Ts变成Us而容易转化成RNA。
附图简述
图1A至图1D显示以0.5或1mg/kg(mpk)施用PBS或脂质纳米颗粒(LNP)调配物LNP417至LNP421后的IFN α、IL-6、TNF α及MCP-1的含量。
图2A至图2B显示以0.5或1mpk施用PBS或LNP调配物LNP417至LNP421后的血清TTR含量及肝脏编辑百分比。
图3显示由Cas9 DNA构建体进行的转录的活体外转录(IVT)产量。用未经修饰的尿苷-5′-三磷酸(UTP)或单独的(横轴上，0)、用与指定比例的5-甲氧基UTP混合(横轴上，20至80)的或与100％5-甲氧基UTP混合(100)的N1-甲基-假UTP进行转录。对于各组的三个条形图，左侧条形图使用N1-甲基-假UTP及/或5-甲氧基UTP及SEQ ID NO：2；中间的条形图使用未经修饰的UTP及/或5-甲氧基UTP及SEQ ID NO：2；且右侧条形图使用未经修饰的UTP及/或5-甲氧基UTP及SEQ ID NO：1。
图4显示根据Cas9(SEQ ID NO：2)及经最佳化的Cas9(SEQ ID NO：1)DNA构建体的活体外转录(IVT)结果的mRNA的纯度。由SEQ ID NO：2的Cas9序列用未经修饰的尿苷-5′-三磷酸(UTP)(正方形)或用单独(0)的或与指定比例的5-甲氧基UTP混合(20至80)的或与100％5-甲氧基UTP混合(100)的N1-甲基-假UTP(黑色圆形)进行转录。由SEQ ID NO：1的Cas9序列(浅色圆形)用未经修饰的UTP(0)或与指定比例的5-甲氧基UTP混合(20至80)或与100％5-甲氧基UTP混合(100)的未经修饰的UTP进行转录。各编码序列包括一个核定位信号。
图5A至图5D显示抗dsRNA抗体墨点分析法结果。结果是伴随双股RNA对照(A)、在UTP及/或5-甲氧基UTP存在下转录的Cas9(B)、在UTP及/或5-甲氧基UTP存在下转录的包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列(C)及在N1-甲基-假UTP及/或5-甲氧基UTP存在下转录的Cas9(D)而产生。图(B)至图(D)是用含有0％至100％5-甲氧基UTP及100％至0％UTP或N1-甲基UTP进行。
图6A及图6B显示用Cas9 mRNA处理的神经母细胞瘤2A细胞(Neuro 2A cell)中的mRNA的活体外编辑效率，其呈现为编辑百分比(A)或编辑EC50(B)。评定增加Cas9 mRNA中5-甲氧基-UTP的浓度的影响。由SEQ ID NO：2的Cas9序列用N1-甲基-假UTP(A中的左组；B中的深色圆形)或用单独(0)的或与指定比例的5-甲氧基UTP混合(20至80)或与100％5-甲氧基UTP混合(100)的未经修饰的尿苷-5′-三磷酸(UTP)(A中的中间组；B中的正方形)进行转录。由SEQ ID NO：1的Cas9序列(A中的右组；B中的浅色圆形)用未经修饰的UTP(0)或与指定比例的5-甲氧基UTP混合(20至80)或与100％5-甲氧基UTP混合(100)的未经修饰的UTP进行转录。各编码序列包括一个核定位信号。
图7A至图7D展示LNP调配物LNP720至LNP724给药后4小时时的血清细胞介素含量。图7A中的星号指示至少一个独立测量小于侦测极限。
图8A及图8B展示用LNP调配物LNP720至LNP724给药后7天时的血清TTR含量(A)及肝脏中的TTR编辑百分比(B)。图8A中的星号指示至少一个独立测量小于侦测极限。
图9显示以1mpk用LNP调配物LNP720至LNP724给药后7天时的脾脏中的TTR编辑百分比。
图10显示使用LNP调配物LNP720至LNP724及LNP685的初级小鼠肝细胞(PMH)中的TTR编辑百分比。
图11A及图11B显示投配包含Cas9 mRNA的调配物之后的血清TTR含量，在该Cas9mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。TTR数据呈现为血清含量(A)或相对于经TSS处理的动物中的TTR含量的百分比(B)。
图12显示以5mpk或2mpk投配包含Cas9 mRNA的调配物之后的肝脏中的TTR编辑百分比，在该Cas9 mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。
图13A至图13E显示投配指定LNP调配物之后的血清TTR含量及肝脏中的TTR编辑百分比。
图14显示用0.3、1、3或10ng LNP815-821、823或824处理的初级小鼠肝细胞(PMH)中的TTR编辑百分比。
图15A至图15B显示以指定引导物：Cas9比率及量投配合有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的血清TTR含量，在该Cas9 mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。
图16A至图16B显示以指定引导物：Cas9比率及量投配合有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的肝脏中的TTR编辑百分比，在该Cas9 mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。
图17A至图17B显示以指定引导物：Cas9比率及量投配含有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的脾脏中的TTR编辑百分比，在该Cas9 mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。
图18显示针对以指定引导物：Cas9比率投配含有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的肝脏中的Cas9表达的蛋白质印迹法，在该Cas9 mRNA中，ORF具有SEQ ID NO：5或4的序列。
图19A至图19B显示以指定量投配指定LNP调配物之后的血清TTR含量。
图20显示以指定量投配指定LNP调配物之后的肝脏中的TTR编辑百分比。
图21A至图21C显示以指定量投配指定LNP调配物之后的肝脏编辑含量(A)及血清TTR(B以μg/ml为单位；C呈TSS对照的百分比形式)。
图22A至22D显示以指定比率及量投配LNP调配物之后的血清TTR及编辑结果。
图23显示用Cas9 mRNA处理之后的Hep2G细胞中的Cas9蛋白质表达，在该Cas9mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图24显示以指定浓度用Cas9 mRNA处理之后的Hep2G细胞中的编辑百分比，在该Cas9 mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图25显示投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的肝脏中的Cas9表达，在该Cas9mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图26显示投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的TTR基因座处的活体内编辑结果，在该Cas9 mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图27A至图27B显示投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的血清TTR(A)及血清TTR(TSS％)(B)，在该Cas9 mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图28显示以指定量投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的活体内肝脏编辑，在该Cas9 mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图29A至图29B显示以指定量投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的血清TTR含量(A)及血清TTR(TSS％)(B)，在该Cas9 mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列。
图30A至图30B显示投配具有Cas9 mRNA的LNP调配物之后的血清TTR含量(A)及肝脏中的编辑％(B)，在该Cas9 mRNA中，转录物具有指定SEQ ID NO的序列。
图31显示以指定剂量投配经mRNA调配的LNP之后的肝脏中的TTR编辑百分比，该mRNA具有指定帽结构及转录物序列。
图32显示以指定剂量投配经mRNA调配的LNP之后的血清TTR含量，该mRNA具有指定帽结构及转录物序列。
图33显示投配经编码Cas9的mRNA调配的LNP之后的肝脏中的TTR编辑百分比，在该mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列，包括如所指示的NLS。
图34A至图34B显示投配经编码Cas9的mRNA调配的LNP之后的血清TTR含量(A)及血清TTR(TSS％)(B)，在该mRNA中，ORF具有指定SEQ ID NO的序列，包括如所指示的NLS。
图35显示投配经编码Cas9且包括不同类别及活性含量的NLS序列的mRNA调配的LNP之后的NLS活性与编辑效率的相关性。
图36显示HepG2细胞中来自具有指定序列及如所指示的5′UTR的mRNA转录物的Cas9蛋白质的表达水平。
实施方式
现将详细参考本发明的某些实施例，其实例在附图中加以说明。尽管本发明将结合所说明的实施例描述，但应理解其并不意欲将本发明限于这些实施例。相反，本发明意欲涵盖所有替代方案、修改及等效物，其可如所附权利要求所限定包括在本发明内。
在详细描述本发明教示内容之前，应理解，本发明不限于特定组合物或方法步骤，因而可加以改变。应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书及所附权利要求中所用，单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个所指物。因此，例如，提及“结合物”包括复数个结合物且提及“细胞”包括复数个细胞及其类似者。
数值范围包括界定该范围的数字。考虑到有效数字及与测量相关的误差，测量及可测量值应理解为大致的。此外，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”及“包括(include/includes/including)”的使用并不意欲为限制性的。应理解，前述一般描述及详细描述仅为示例性及解释性的且并不限制教示内容。
术语“约”或“大约”意谓如由一般熟习此项技术者所测定的特定值的可接受的误差，其在某种程度上视如何测量或测定该值、或变化程度不会实质上影响所述标的物的特性(例如在10％、5％、2％或1％内)而定。因此，除非有相反指示，否则以下说明书及所附权利要求中所阐述的数值参数为可视设法获得的所需特性而变化的近似值。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求的范畴，各数值参数至少应根据所报导的有效数字的数目且通过应用普通舍入技术来解释。
除非以上说明书中具体指出，否则本说明书中叙述“包含”各种组分的实施例亦设想为“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；本说明书中叙述“由各种组分组成”的实施例亦设想为“包含”所述组分或“基本上由所述组分组成”；且本说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施例亦设想为“由所述组分组成”或“包含”所述组分(此互换性并不适用于此等术语在权利要求中的使用)。
本文所用的章节标题仅出于组织目的而不应解释为以任何方式限制所需标的物。在以引用的方式并入的任何文献与本说明书的表述内容(包括(但不限于)定义)相矛盾的情况下，以本说明书的表述内容为准。虽然本教示内容是与多个实施例结合描述，但并不意欲将本教示内容限制于该实施例。相反，如熟习此项技术者将了解，本教示内容涵盖各种替代方案、修改及等效物。
A.定义
除非另外说明，否则如本文所用的以下术语及片语意欲具有以下含义：
如本文所用，术语“或其组合”是指在该术语前面所列项的所有排列及组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情况下顺序为重要的，则亦包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续此实例，明确地包括含有一或多个项或条项的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟习此项技术者应理解，除非另外自上下文显而易知，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语数目的限制。
如本文所用，术语“试剂盒”是指相关组分，诸如一或多种多核苷酸或组合物及一或多种相关材料，诸如递送装置(例如注射器)、溶剂、溶液、缓冲剂、说明书或干燥剂的封装组。
除非本文另有规定，否则“或”是依包括性意义使用，即，等效于“及/或”。
“多核苷酸”及“核酸”在本文中用于指代包含核苷或具有沿主链连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其包括习知RNA、DNA、混合RNA-DNA及为其类似物的聚合物。核酸“主链”可由多个键组成，其包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、膦酸甲酯键或其组合中的一种或多种。核酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代，例如2′甲氧基或2′卤基取代的类似化合物。含氮碱基可为习知碱基(A、G、C、T、U)；其类似物(例如经修饰的尿苷，诸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其它)；肌核苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮或氮杂嘌呤、脱氮或氮杂嘧啶、在5或6位处具有取代基的嘧啶碱基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位处具有取代基的嘌呤碱基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶；美国专利第5,378,825号及PCT第WO 93/13121号)。对于一般论述，参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36，Adams等人编，第11版，1992。核酸可包括一或多个“无碱基”残基，其中主链不包括针对聚合物位置的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可仅包含习知RNA或DNA糖、碱基及键，或可包括习知组分及取代两者(例如具有2′甲氧基键的习知碱基或含有习知碱基及一或多个碱基类似物两者的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(LNA)，一种含有一或多种LNA核苷酸单体的类似物，该单体具有模拟糖构象的锁定于RNA中的双环呋喃糖单元，其会增强对互补RNA及DNA序列的杂交亲和性(Vester及Wengel，2004，Biochemistry 43(42)：13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且可通过在RNA中存在尿嘧啶或其类似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其类似物而有所不同。
“经修饰的尿苷”在本文中用于指代除胸苷外的具有与尿苷相同的氢键受体且与尿苷存在一或多种结构性差异的核苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为经取代的尿苷，即其中一或多个非质子取代(例如烷氧基，诸如甲氧基)代替质子的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为经取代的假尿苷，即其中一或多个非质子取代(例如烷基，诸如甲基)代替质子的假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为经取代的尿苷、假尿苷或经取代的假尿苷中的任一个。
如本文所用，“尿苷位置”是指多核苷酸中由尿苷或经修饰的尿苷占据的位置。因此，例如，其中“100％的尿苷位置为经修饰的尿苷”的多核苷酸在相同序列的习知RNA(其中所有碱基均为标准A、U、C或G碱基)中应为尿苷的每个位置处均含有经修饰的尿苷。除非另外指明，否则本发明中或附随本发明的序列表(sequence table/sequence listing)的多核苷酸序列中的U可为尿苷或经修饰的尿苷。
如本文所用，若第一序列与第二序列的比对显示整个第二序列的X％或大于X％的位置与第一序列相匹配，则该第一序列视为“包含与第二序列具有至少X％一致性的序列”。例如，序列AAGA包含与序列AAG具有100％一致性的序列，因为与第二序列的全部三个位置均出现匹配，所以比对结果为100％一致性。RNA与DNA之间的差异(通常而言，尿苷更换为胸苷或反之亦然)及核苷类似物(诸如经修饰的尿苷)的存在不会造成多核苷酸之间一致性或互补性的差异，只要相关核苷酸(诸如胸苷、尿苷或经修饰的尿苷)具有相同互补序列(例如针对胸苷、尿苷或经修饰的尿苷均为腺苷；另一实例为胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，这两者均以鸟苷作为互补序列)即可。因此，例如，序列5′-AXG(其中X为任何经修饰的尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)视为与AUG具有100％一致性，因为两者与同一序列(5′-CAU)完全互补。比对算法实例为Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法，其是此项技术中熟知者。熟习此项技术者应理解选择何种算法及参数设置才适合于所要比对的一对指定序列；对于具有一般类似长度及预期氨基酸有＞50％一致性或核苷酸有＞75％一致性的序列而言，由EBI于www.ebi.ac.uk网站服务器提供的Needleman-Wunsch算法接口的具有默认设置的Needleman-Wunsch算法通常为合适的。
“mRNA”在本文中用于指代非DNA且包含可转译成多肽的开放阅读框架的多核苷酸(即可作为由核糖体及氨基酰化tRNA进行转译的底物)。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物，例如2′-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施例中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2′-甲氧基核糖残基或其组合组成。通常而言，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或小于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有经修饰的尿苷。
如本文所用，“RNA引导的DNA结合剂”意谓具有RNA及DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性具有序列特异性且视RNA的序列而定。示例性RNA引导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”亦称作“Cas蛋白质”，其涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶及dCasDNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有经RNA引导的DNA结合活性的单链多肽，诸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶及2类Cas切口酶(例如H840A、D10A或N863A变异体)，其进一步具有经RNA引导的DNA裂解酶或切口酶活性，及2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变异体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变异体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变异体)及eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A变异体)蛋白质及其变体。Cpf1蛋白质(Zetsche等人，Cell，163：1-13(2015))与Cas9同源且含有类RuvC核酸酶域。Zetsche的Cpf1序列以全文引用的方式并入。参见例如Zetsche，表S1及表S3。“Cas9”涵盖Spy Cas9、本文中所列的Cas9的变异体及其等效物。参见例如，Makarova等人，Nat Rev Microbiol，13(11)：722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60：385-397(2015)。
如本文所用，给定开放阅读框架(ORF)的“最小尿苷含量”为以下的ORF的尿苷含量：(a)每个位置处使用最小尿苷密码子及(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列。给定氨基酸的最小尿苷密码子为具有最少尿苷的密码子(通常0或1个，除了苯丙氨酸的密码子外，其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)。出于评估最小尿苷含量的目的，经修饰的尿苷残基视为等效于尿苷。
如本文所用，给定开放阅读框架(ORF)的“最小尿苷二核苷酸含量”为以下的ORF的最低可能的尿苷二核苷酸(UU)含量：(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上文所论述)及(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列。尿苷二核苷酸(UU)含量在绝对意义上可表示为ORF中的UU二核苷酸的计数或基于比率，表示为尿苷二核苷酸的尿苷所占据的位置的百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个)。出于评估最小尿苷二核苷酸含量的目的，经修饰的尿苷残基视为等效于尿苷。
如本文所用，给定开放阅读框架(ORF)的“最小腺嘌呤含量”为以下的ORF的腺嘌呤含量：(a)每个位置处使用最小腺嘌呤密码子及(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列。给定氨基酸的最小腺嘌呤密码子为具有最少腺嘌呤的密码子(通常0或1个，除了赖氨酸及天冬酰胺的密码子外，其中最小腺嘌呤密码子具有2个腺嘌呤)。出于评估最小腺嘌呤含量的目的，经修饰的腺嘌呤残基视为等效于腺嘌呤。
如本文所用，给定开放阅读框架(ORF)的“最小腺嘌呤二核苷酸含量”为以下的ORF的最低可能的腺嘌呤二核苷酸(AA)含量：(a)在每个位置处使用最小腺嘌呤密码子(如上文所论述)及(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列。腺嘌呤二核苷酸(AA)含量在绝对意义上可表示为ORF中的AA二核苷酸的计数或基于比率，表示为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤所占据的位置的百分比(例如，UAAUA的腺嘌呤二核苷酸含量为40％，因为腺嘌呤二核苷酸的腺嘌呤占据了5个位置中的2个)。出于评估最小腺嘌呤二核苷酸含量的目的，经修饰的腺嘌呤残基视为等效于腺嘌呤。
“引导RNA”、“gRNA”及“引导物”在本文中互换使用来指代crRNA(也称为CRISPRRNA)或crRNA与trRNA(也称为tracrRNA)的组合任一个。crRNA及trRNA可以单一RNA分子(单引导RNA，sgRNA)或以两个独立RNA分子(双引导RNA，dgRNA)形式缔合。“引导RNA”或“gRNA”是指各类型。trRNA可为天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或变化的trRNA序列。
如本文所用，“引导序列”是指引导RNA中与靶序列互补且通过由RNA引导的DNA结合剂将引导RNA导引至靶序列以供结合或修饰(例如裂解)的序列。“引导序列”也可称为“靶序列”或“间隔序列”。引导序列的长度可为20个碱基对，例如在化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(即Spy Cas9)及相关Cas9同源物/直是同源物的情况下。较短或较长序列亦可用作引导物，例如长度为15-、16-、17-、18-、19-、21-、22-、23-、24-或25-个核苷酸。在一些实施例中，靶序列处于例如基因中或染色体上，且与引导序列互补。在一些实施例中，引导序列与其相应靶序列之间的互补性或一致性的程度可为约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，引导序列与标靶区可为100％互补或一致的。在其它实施例中，引导序列与标靶区可含有至少一个错配。例如，引导序列及靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施例中，引导序列及标靶区可含有1至4个错配，其中引导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施例中，引导序列及标靶区可含有1、2、3或4个错配，其中引导序列包含20个核苷酸。
针对Cas蛋白质的靶序列包括基因组DNA的正股及负股两者(即给定序列及该序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物为双股核酸。因此，在论述引导序列“与靶序列互补”的情况下，应理解，引导序列可导引引导RNA结合至靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施例中，在引导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，引导序列与靶序列(例如不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，不同的处在于引导序列中U取代T。
如本文所用，“插入缺失标记(indel)”是指由多个核苷酸组成的插入/缺失突变，该核苷酸在核酸中的双股断裂(DSB)位点处进行插入或缺失。
如本文所用，“基因减弱(knockdown)”是指特定基因产物(例如蛋白质、mRNA或两者)的表达降低。可通过侦测由组织或细胞群(例如在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质或通过侦测来自相关组织或细胞群的蛋白质的总细胞量来测量蛋白质的基因减弱。用于测量mRNA的基因减弱的方法为已知的，且包括对自相关组织或细胞群分离的mRNA进行测序。在一些实施例中，“基因减弱”可指代特定基因产物表达有一些损失，例如经转录的mRNA的量下降或由细胞群(包括活体内细胞群，诸如这些出现在组织中者)表达或分泌的蛋白质的量下降。
如本文所用，“基因剔除”是指丧失细胞中特定蛋白质的表达。可通过侦测由组织或细胞群(例如在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质的量或通过侦测组织或细胞群中蛋白质的总细胞量来测量基因剔除。在一些实施例中，本发明方法在一或多种细胞(例如在细胞群，包括活体内细胞群，诸如这些出现在组织中者)“基因剔除”靶蛋白。在一些实施例中，基因剔除并非例如通过插入缺失标记(indel)导致形成突变靶蛋白，而是细胞中完全丧失靶蛋白的表达。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指引导RNA以及RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas裂解酶、切口酶或dCas DNA结合剂(例如Cas9)。在一些实施例中，引导RNA将RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas9导引至靶序列，且该引导RNA与靶序列杂交且该结合剂结合于靶序列；在结合剂为裂解酶或切口酶的情况下，结合之后进行裂解或切口。
如本文所用，“靶序列”是指靶基因中与gRNA的引导序列互补的核酸序列。靶序列与引导序列的相互作用导引RNA引导的DNA结合剂结合，且在靶序列中潜在地链裂或裂解(视试剂活性而定)。
如本文所用，“治疗”是指用于个体的疾病或病症的治疗剂的任何施用或施用，且包括抑制疾病、遏制其发展、缓解疾病的一或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一或多种症状的复发。
B.示例性多核苷酸及组合物
1.具有低尿苷含量的mRNA及ORF
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至其最小尿苷含量的约150％范围内。在一些实施例中，ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量等于其最小尿苷含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约150％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约145％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约140％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约135％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约130％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约125％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约120％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约115％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约110％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约105％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约104％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约103％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约102％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约101％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至其最小尿苷二核苷酸含量的200％范围内。在一些实施例中，ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量等于其最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量等于其最小尿苷二核苷酸含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于其最小尿苷二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至呈编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的90％或低于90％的尿苷二核苷酸含量范围内。在一些实施例中，ORF的尿苷二核苷酸含量小于或等于编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大尿苷二核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷三核苷酸含量在0个尿苷三核苷酸至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个尿苷三核苷酸范围内(其中一连串较长的尿苷计为其内特有三尿苷区段的数目，例如尿苷四核苷酸含有两个尿苷三核苷酸，尿苷五核苷酸含有三个尿苷三核苷酸等)。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷三核苷酸含量在0％尿苷三核苷酸至0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％尿苷三核苷酸范围内，其中尿苷三核苷酸的百分比含量计算为序列中由形成尿苷三核苷酸的一部分(或一连串较长尿苷)，以使得序列UUUAAA及UUUUAAAA将各具有50％的尿苷三核苷酸含量的尿苷所占据的位置的百分比。例如，在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF不合尿苷三核苷酸。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷三核苷酸含量在其最小尿苷三核苷酸含量至呈编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的90％或低于90％的尿苷三核苷酸含量范围内。在一些实施例中，ORF的尿苷三核苷酸含量小于或等于编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大尿苷三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF具有极少核苷酸均聚物，例如重复的相同核苷酸的串。例如，在一些实施例中，当自表1中所列的密码子选择最小尿苷密码子时，通过选择降低核苷酸均聚物的数量及长度的最小尿苷密码子(例如，对于丙氨酸，选择GCA代替GCC；或对于甘氨酸，选择GGA代替GGG；或对于赖氨酸，选择AAG代替AAA)来构筑mRNA。
可例如通过在ORF的足够多的一部分中使用最小尿苷密码子来降低给定ORF的尿苷含量或尿苷二核苷酸含量或尿苷三核苷酸含量。例如，可通过将氨基酸转化成密码子而将RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列转译回ORF序列，其中ORF中的一些或全部使用以下所示的示例性最小尿苷密码子。在一些实施例中，ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表1中所列的密码子。
表1.示例性最小尿苷密码子
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF由其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表1中所列的密码子的一组密码子组成。
2.具有低腺嘌呤含量的mRNA及ORF
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至其最小腺嘌呤含量的约150％范围内。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量等于其最小腺嘌呤含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约150％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约145％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约140％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约135％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约130％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约125％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约120％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约115％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约110％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约105％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约104％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约103％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约102％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤含量小于或等于其最小腺嘌呤含量的约101％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至其最小腺嘌呤二核苷酸含量的200％范围内。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％、190％、185％、180％、175％、170％、165％、160％、155％、150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约200％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约195％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约190％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约185％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约180％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约175％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约170％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约165％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约160％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约155％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量等于最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约150％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约145％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约140％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约135％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约130％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约125％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约120％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约115％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约110％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约105％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约104％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约103％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约102％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于其最小腺嘌呤二核苷酸含量的约101％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至呈编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量的90％或低于90％的腺嘌呤二核苷酸含量范围内。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤二核苷酸含量小于或等于编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大腺嘌呤二核苷酸含量约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤三核苷酸含量在0个腺嘌呤三核苷酸至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个腺嘌呤三核苷酸范围内(其中一连串较长的腺嘌呤计为其内特有三腺嘌呤区段的数目，例如腺嘌呤四核苷酸含有两个腺嘌呤三核苷酸，腺嘌呤五核苷酸含有三个腺嘌呤三核苷酸等)。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤三核苷酸含量在0％腺嘌呤三核苷酸至0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％或2％腺嘌呤三核苷酸范围内，其中腺嘌呤三核苷酸的百分比含量计算为序列中由形成腺嘌呤三核苷酸的一部分(或一连串较长腺嘌呤)，以使得序列UUUAAA及UUUUAAAA将各具有50％的腺嘌呤三核苷酸含量的腺嘌呤所占据的位置的百分比。例如，在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于2％。例如，在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1.5％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于1％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.9％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.8％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.7％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.6％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.5％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.4％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.3％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.2％。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于0.1％。在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF不含腺嘌呤三核苷酸。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF具有极少核苷酸均聚物，例如重复的相同核苷酸的串。例如，在一些实施例中，当自表1中所列的密码子选择最小腺嘌呤密码子时，通过选择降低核苷酸均聚物的数量及长度的最小腺嘌呤密码子(例如，对于丙氨酸，选择GCA代替GCC；或对于甘氨酸，选择GGA代替GGG；或对于赖氨酸，选择AAG代替AAA)来构筑mRNA。
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的腺嘌呤三核苷酸含量在其最小腺嘌呤三核苷酸含量至呈编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的90％或低于90％的腺嘌呤三核苷酸含量范围内。在一些实施例中，ORF的腺嘌呤三核苷酸含量小于或等于编码与相关mRNA相同的蛋白质的参考序列的最大腺嘌呤三核苷酸含量的约85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。
可例如通过在ORF的足够多的一部分中使用最小腺嘌呤密码子来降低给定ORF的腺嘌呤含量或腺嘌呤二核苷酸含量或腺嘌呤三核苷酸含量。例如，可通过将氨基酸转化成密码子而将RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列转译回ORF序列，其中ORF中的一些或全部使用以下所示的示例性最小腺嘌呤密码子。在一些实施例中，ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表2中所列的密码子。
表2.示例性最小腺嘌呤密码子
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF由其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表2中所列的密码子的一组密码子组成。
3.具有低腺嘌呤及低尿苷含量的mRNA及ORF
就可行性而言，上文关于低腺嘌呤含量所述的任一特征可与上文关于低尿苷含量所述的任一特征组合。例如，可提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至其最小尿苷含量的约150％范围内(例如ORF的尿苷含量小于或等于其最小尿苷含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)，且该ORF的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至其最小腺嘌呤含量的约150％范围内(例如小于或等于其最小腺嘌呤含量的约145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％)。对于尿苷及腺嘌呤二核苷酸亦如此。同样，ORF中的尿苷核苷酸及腺嘌呤二核苷酸的含量可如上文所阐述。同样，ORF中的尿苷二核苷酸及腺嘌呤核苷酸的含量可如上文所阐述。
可例如通过在ORF的足够多的一部分中使用最小尿苷及腺嘌呤密码子来降低给定ORF的尿苷及腺嘌呤核苷酸及/或二核苷酸含量。例如，可通过将氨基酸转化成密码子而将RNA引导的DNA结合剂的氨基酸序列转译回ORF序列，其中ORF中的一些或全部使用以下所示的示例性最小尿苷及腺嘌呤密码子。在一些实施例中，ORF中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表3中所列的密码子。
表3.示例性最小尿苷及腺嘌呤密码子
氨基酸 最小尿苷密码子
A 丙氨酸 GCC或GCG
G 甘氨酸 GGC或GGG
V 缬氨酸 GUC或GUG
D 天冬氨酸 GAC
E 谷氨酸 GAG
I 异亮氨酸 AUC
T 苏氨酸 ACC或ACG
N 天冬酰胺 AAC
K 赖氨酸 AAG
S 丝氨酸 AGC或UCC或UCG
R 精氨酸 CGC或CGG
L 亮氨酸 CUG或CUC
P 脯氨酸 CCG或CCC
H 组氨酸 CAC
Q 谷氨酰胺 CAG
F 苯丙氨酸 UUC
Y 酪氨酸 UAC
C 半胱氨酸 UGC
W 色氨酸 UGG
M 甲硫氨酸 AUG
在一些实施例中，提供一种编码包含开放阅读框架(ORF)的RNA引导的DNA结合剂的mRNA，该ORF由其中至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为表3中所列的密码子的一组密码子组成。如表3中可看出，三个所列丝氨酸密码子中的每一个含有一个A或一个U。在一些实施例中，对于丝氨酸，通过使用AGC密码子来优先化进行尿苷最小化。在一些实施例中，对于丝氨酸，通过使用UCC及/或UCG密码子优先化进行腺嘌呤最小化。
4.提高转译及/或对应于高度表达的tRNA的密码子；示例性密码子组
在一些实施例中，mRNA包含具有增加哺乳动物，诸如人类中的转译的密码子的ORF。在其它实施例中，mRNA包含具有增加哺乳动物，例如人类的器官，诸如肝脏中的转译的密码子的ORF。在其它实施例中，mRNA包含具有增加哺乳动物，例如人类的细胞型，诸如肝细胞中的转译的密码子的ORF。哺乳动物中；哺乳动物(人类)的细胞型、器官中；人类器官等中的转译的提高可相对于ORF的野生型序列转译程度或相对于以下ORF进行测定：该ORF具有与ORF所源自的生物体或在一定氨基酸含量下含有最类似ORF的生物体，诸如化脓链球菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)或另一原核生物(当情况可能为来源于原核生物的Cas核酸酶，诸如来自下文所述的其它原核生物的Cas核酸酶时)的密码子分布相匹配的密码子分布。可替代地，在一些实施例中，哺乳动物中；哺乳动物(人类)的细胞型、器官中；人类器官等中的Cas9序列转译的提高是相对于具有SEQ ID NO：5，同时在所有其它方面(包括任何适用点突变、异源域及其类似者)相同的序列的ORF的转译进行测定。适用于提高人类，包括人类肝脏及人类肝细胞中的表达的密码子可为对应于人类肝脏/肝细胞中高度表达的tRNA的密码子，其论述于Dittmar KA，PLos Genetics 2(12)：e221(2006)中。在一些实施例中，ORF中至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为对应于哺乳动物，诸如人类中的高度表达的tRNA(例如针对各氨基酸的表达最高的tRNA)的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为对应于哺乳动物器官，诸如人类器官中的高度表达的tRNA(例如针对各氨基酸的表达最高的tRNA)的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为对应于哺乳动物肝脏，诸如人类肝脏中的高度表达的tRNA(例如针对各氨基酸的表达最高的tRNA)的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为对应于哺乳动物肝细胞，诸如人类肝细胞中的高度表达的tRNA(例如针对各氨基酸的表达最高的tRNA)的密码子。
可替代地，通常可使用对应于生物体(例如人类)中的高度表达的tRNA的密码子。
前述密码子选择方法中的任一个与上文所示的最小尿苷及/或腺嘌呤密码子可例如通过以下进行组合：以表1、表2或表3的密码子开始，且随后在可利用多于一种选择的情况下，使用对应于一般生物体(例如人类)中，或相关器官或细胞型，诸如肝脏或肝细胞(例如人类肝脏或人类肝细胞)中的较高度表达的tRNA的密码子。
在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为来自表4中所示的密码子组(例如低U1、低A或低A/U密码子组)的密码子。低U1、低G、低C、低A及低A/U组中的密码子使用将所指定的核苷酸减至最小的密码子，同时在可利用多于一种选择的情况下，亦使用对应于高度表达的tRNA的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为来自表4中所示的低U1密码子组的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为来自表4中所示的低A密码子组的密码子。在一些实施例中，ORF中至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子为来自表4中所示的低A/U密码子组的密码子。
表4.示例性密码子组.
5.经编码的RNA引导的DNA结合剂
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂为2类Cas核酸酶。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有裂解酶活性，其亦可称作双股核酸内切酶活性。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包含Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶(其可为例如第II型、第V型或第VI型Cas核酸酶)。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白质及其修饰形式。Cas9核酸酶的实例包括化脓链球菌、金黄色葡萄球菌及其它原核生物(参见例如下一段落中的清单)的II型CRISPR系统的那些及其经修饰(例如经工程改造或突变型)形式。参见例如，US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶的其它实例包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；及I型CRISPR系统的级联复合物或其Cas3亚基。在一些实施例中，Cas核酸酶可来自第IIA型、第IIB型或第IIC型系统。对于不同CRISPR系统及Cas核酸酶的论述，参见例如Makarova等人NAT.REV.MICROBIOL.9：467-477(2011)；Makarova等人，NAT.REV.MICROBIOL，13：722-36(2015)；Shmakov等人，MOLECULAR CELL，60：385-397(2015)。
可衍生出Cas核酸酶的非限制性示例性物种包括化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李氏菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)、酸热脂环杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、砷还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极单胞菌属(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属(Cyanothecesp.)、绿脓微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌候选种(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium yinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evesrigatum)、多变念珠藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospiramaxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoriasp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲高热杆菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)及海洋藻青菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施例中，Cas核酸酶为来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自脑膜炎双球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西斯氏菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶为来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其它实施例中，Cas核酸酶为来自以下的Cpf1核酸酶：土拉文氏杆菌(Francisella tularensis)、毛螺科菌、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、佩氏细菌(Peregrinibacteria bacterium)、帕库氏菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、白蚁甲烷支原体菌候选种(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施例中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌或毛螺科菌的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9具有两个核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域裂解非靶DNA股，且HNH域裂解靶DNA股。在一些实施例中，Cas9核酸酶包含多于一个RuvC域及/或多于一个HNH域。在一些实施例中，Cas9核酸酶为野生型Cas9。在一些实施例中，Cas9能够诱导靶DNA中的双股断裂。在某些实施例中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，其可裂解dsDNA的一个股，或其可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。一个示例性Cas9氨基酸序列提供呈SEQ ID NO：3形式。一个包括起始及终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列提供呈SEQ ID NO：4形式。一个适于包括在融合蛋白质中的示例性Cas9 mRNA编码序列提供呈SEQ ID NO：10形式。
在一些实施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中该蛋白质的一个域或区经不同蛋白质的一部分置换。在一些实施例中，Cas核酸酶域可经来自诸如Fok1的不同核酸酶的域置换。在一些实施例中，Cas核酸酶可为经修饰的核酸酶。
在其它实施例中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可为I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施例中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白质。在一些实施例中，Cas核酸酶可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有单股切口酶活性，即，可切割一个DNA股以产生单股断裂，亦称为“切口(nick)”。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶为引起dsDNA中出现切口，即，切割一个股但不切割DNA双螺旋的另一股的酶。在一些实施例中，Cas切口酶为其中例如通过催化域的一或多种变化(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点不活化的Cas核酸酶的形式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如关于Cas切口酶及示例性催化域变化的论述的美国专利第8,889,356号。在一些实施例中，Cas切口酶，诸如Cas9切口酶具有不活化的RuvC或HNH域。一个示例性Cas9切口酶氨基酸序列提供呈SEQ ID NO：6形式。一个包括起始及终止密码子的示例性Cas9切口酶mRNA ORF序列提供呈SEQ ID NO：7形式。一个适于包括在融合蛋白质中的示例性Cas9切口酶mRNA编码序列提供呈SEQ ID NO：11形式。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂经修饰而仅含有一个功能核酸酶域。例如，该结合剂蛋白质可经修饰以使得核酸酶域中的一者经突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施例中，使用具有活性降低的RuvC域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性RuvC域的切口酶。在一些实施例中，使用具有活性降低的HNH域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性HNH域的切口酶。
在一些实施例中，Cas蛋白质核酸酶域中的保守氨基酸经取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施例中，Cas核酸酶可在RuvC或类RuvC核酸酶域中包含氨基酸取代。RuvC或类RuvC核酸酶域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于化脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell Oct 22：163(3)：759-771。在一些实施例中，Cas核酸酶可在HNH或类HNH核酸酶域中包含氨基酸取代。HNH或类HNH核酸酶域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A(基于化脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如，Zetsche等人(2015)。其它示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A(基于新凶手弗朗西斯氏菌U112Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施例中，将与一对分别与靶序列的有义股及反义股互补的引导RNA组合提供编码切口酶的mRNA。在此实施例中，引导RNA将切口酶导引至靶序列且通过在靶序列的相对股上产生切口而引入DSB(即双切口)。在一些实施例中，使用双重切口可提高特异性及减少脱靶效应。在一些实施例中，连同靶向DNA的相对股的两个独立引导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。在一些实施例中，连同经选择以非常接近的两个独立引导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂缺乏裂解酶及切口酶活性。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些实施例中，dCas多肽为dCas9多肽。在一些实施例中，缺乏裂解酶及切口酶活性的RNA引导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽为其中例如通过催化域的一或多种变化(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点不活化的Cas核酸酶的形式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。示例性dCas9氨基酸序列提供呈SEQ ID NO：8形式。一个包括起始及终止密码子的示例性dCas9mRNA ORF序列提供呈SEQ ID NO：9形式。一个适于包括在融合蛋白质中的示例性dCas9mRNA编码序列提供呈SEQ ID NO：12形式。
6.异源功能域；核定位信号
在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包含一或多个异源功能域(例如为或包含融合多肽)。
在一些实施例中，异源功能域可促进将RNA引导的DNA结合剂输送至细胞核中。例如，异源功能域可为核定位信号(NLS)。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与1至10个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与1至5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与一个NLS融合。在使用一个NLS的情况下，NLS可连接在RNA引导的DNA结合剂序列的N端或C端处。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可C端融合至至少一个NLS。NLS亦可插入RNA引导的DNA结合剂序列内。在其它实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与多于一个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与2、3、4或5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可相同(例如两个SV40 NLS)或不同。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂与连接在羧基末端处的两个SV40NLS序列融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与两个NLS融合，一个NLS连接在N端处且一个连接在C端处。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可与3个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可不与NLS融合。在一些实施例中，NLS可为单联(monopartite)序列，诸如SV40 NLS、PKKKRKV(SEQ ID NO：78)或PKKKRRV(SEQ ID NO：90)。在一些实施例中，NLS可为双联序列，诸如核质蛋白的NLS、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO：91)。在一些实施例中，NLS序列可包含LAAKRSRTT(SEQ ID NO：79)、QAAKRSRTT(SEQ ID NO：80)、PAPAKRERTT(SEQ ID NO：81)、QAAKRPRTT(SEQ ID NO：82)、RAAKRPRTT(SEQ ID NO：83)、AAAKRSWSMAA(SEQ ID NO：84)、AAAKRVWSMAF(SEQ ID NO：85)、AAAKRSWSMAF(SEQ ID NO：86)、AAAKRKYFAA(SEQ ID NO：87)、RAAKRKAFAA(SEQ ID NO：88)或RAAKRKYFAV(SEQ ID NO：89)。在一具体实施例中，单一PKKKRKV(SEQ ID NO：78)NLS可连接在RNA引导的DNA结合剂的C端处。一或多个连接子视情况包括在融合位点处。在一些实施例中，根据前述实施例中任一个的一或多个NLS与一或多个额外异源功能域，诸如下文所述的异源功能域中的任一个组合存在于RNA引导的DNA结合剂中。
在一些实施例中，异源功能域可能能够调整RNA引导的DNA结合剂的胞内半衰期。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂的半衰期可得到提高。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂的半衰期可得到降低。在一些实施例中，异源功能域可能够增加RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能域可能够降低RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能域可作为蛋白质降解的信号肽。在一些实施例中，蛋白质降解可由蛋白水解酶，诸如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶蛋白酶介导。在一些实施例中，异源功能域可包含PEST序列。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施例中，泛素可为类泛素蛋白质(UBL)。类泛素蛋白质的非限制性实例包括小类泛素修饰因子(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，亦称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰因子-1(URM1)、神经元-前驱体-细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中亦称作Rub1)、人类白血球抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)及自噬-12(ATG12)、Fau类泛素蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰因子-1(UFM1)及类泛素蛋白-5(UBL5)。
在一些实施例中，异源功能域可为标记域。标记域的非限制性实例包括荧光蛋白质、纯化标签、抗原决定基标签及报导基因序列。在一些实施例中，标记域可为荧光蛋白质。适合荧光蛋白质的非限制实例包括绿色荧光蛋白质(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母绿(Emerald)、Azami绿(Azami Green)、单体Azami绿(Monomeric AzamiGreen)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白质(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白质(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、蓝宝石色(Sapphire)、T-蓝宝石色(T-sapphire))、强化型蓝荧光蛋白质(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi强化型蓝(Midoriishi-Cyan))、红色荧光蛋白质(mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-单体、HcRed串色(HcRed-Tandem)、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色荧光蛋白质(mOrange、mKO、Kusabira橙色(Kusabira-Orange)、单体Kusabira橙色(Monomeric Kusabira-Orange)、mTangerine、tdTomato)或任何其它适合荧光蛋白质。在其它实施例中，标记域可为纯化标签及/或抗原决定基标签。非限制性的示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)、壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(tandem affinitypurification，TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Sαftag 1、Sαftag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6×His、8×His、生物素羧基载体蛋白质(BCCP)、聚His及调钙蛋白。非限制性的示例性报导基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光素酶或荧光蛋白质。
在其它实施例中，异源功能域可将RNA引导的DNA结合剂靶向至特定细胞器、细胞型、组织或器官。在一些实施例中，异源功能域可将RNA引导的DNA结合剂靶向至线粒体。
在其它实施例中，异源功能域可为效应子域。当RNA引导的DNA结合剂导引至其靶序列时，例如当Cas核酸酶通过gRNA导引至靶序列时，效应子域可修饰或影响靶序列。在一些实施例中，效应子域可选自核酸结合域、核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)、表观遗传修饰域、转录活化域或转录抑制子域。在一些实施例中，异源功能域为核酸酶，诸如FokI核酸酶。参见例如美国专利第9,023,649号。在一些实施例中，异源功能域为转录活化因子或抑制子。参加例如Qi等人，“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression”，Cell 152：1173-83(2013)；Perez-Pinera等人，“RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors”，Nat.Methods10：973-6(2013)；Mali等人，“CAS9transcriptional activators for targetspecificity screening and paired nickases for cooperative genomeengineering”，Nat.Biotechnol.31：833-8(2013)；Gilbert等人，“CRISPR-mediatedmodular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes”，Cell 154：442-51(2013)。因此，RNA引导的DNA结合剂基本上变成可使用引导RNA导引以结合所需靶序列的转录因子。在某些实施例中，DNA修饰域为甲基化域，诸如去甲基化或甲基转移酶域。在某些实施例中，效应子域为DNA修饰域，诸如碱基编辑域。在特定实施例中，DNA修饰域为将特异性修饰引入DNA中的核酸编辑域，诸如脱氨酶域。参见例如WO 2015/089406；US 2016/0304846。WO 2015/089406及US 2016/0304846中所述的核酸编辑域、脱氨酶域及Cas9变异体是以引用的方式并入本文中。
7.UTR；Kozak序列
在一些实施例中，mRNA包含至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5′UTR。在一些实施例中，mRNA包含至少一个来自血球蛋白mRNA，例如人类α血球蛋白(HBA)mRNA、人类β血球蛋白(HBB)mRNA或有爪蟾蜍β血球蛋白(XBG)mRNA的UTR。在一些实施例中，mRNA包含来自血球蛋白mRNA，诸如HBA、HBB或XBG的5′UTR、3′UTR、或5′与3′UTR。在一些实施例中，mRNA包含来自牛生长激素、细胞巨大病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5′UTR。在一些实施例中，mRNA包含来自牛生长激素、细胞巨大病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3′UTR。在一些实施例中，mRNA包含来自牛生长激素、细胞巨大病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、α-微管蛋白、肿瘤蛋白质(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5’与3′UTR。
在一些实施例中，mRNA包含来自同一来源(例如组成型表达的mRNA，诸如肌动蛋白、白蛋白或血球蛋白(HBA、HBB或XBG))的5′及3′UTR。
在一些实施例中，本文所揭示的mRNA包含与SEQ ID NO：32、34、36、38或41中的任一项有至少90％的一致性的5′UTR。在一些实施例中，本文所揭示的mRNA包含与SEQ ID NO：33、35、37、39或40中的任一项有至少90％的一致性的3′UTR。在一些实施例中，前述一致性程度中的任一项为至少95％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，本文所揭示的mRNA包含具有SEQ ID NO：32、34、36、38或41中的任一项的序列的5′UTR。在一些实施例中，本文所揭示的mRNA包含具有SEQ ID NO：33、35、37、39或40中的任一项的序列的3′UTR。
在一些实施例中，mRNA不包含5′UTR，例如在5′帽结构与起始密码子之间不存在额外核苷酸。在一些实施例中，mRNA在5′帽结构与起始密码子之间包含Kozak序列(下文所述)，但不具有任何额外5′UTR。在一些实施例中，mRNA不包含3′UTR，例如在终止密码子与聚-A尾之间不存在额外核苷酸。
在一些实施例中，mRNA包含Kozak序列。Kozak序列可影响转译起始及由mRNA转译的多肽的总产量。Kozak序列包括可作为起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下至少一项成立：第一个N为A或G且第二个N为G。在核苷酸序列中，R意指嘌呤(A或G)。在一些实施例中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施例中，Kozak序列为具有零错配或呈小写字母形式的位置有至多一或两个错配的rccRUGg。在一些实施例中，Kozak序列为具有零错配或呈小写字母形式的位置有至多一或两个错配的rccAUGg。在一些实施例中，Kozak序列为具有零错配或呈小写字母形式的位置有至多一个、两个或三个错配的gccRccAUGG(SEQ ID NO：105的第4核苷酸至第13核苷酸)。在一些实施例中，Kozak序列为具有零错配或呈小写字母形式的位置有至多一个、二个、三个或四个错配的gccAccAUG。在一些实施例中，Kozak序列为GCCACCAUG。在一些实施例中，Kozak序列为具有零错配或呈小写字母形式的位置有至多一个、二个、三个或四个错配的gccgccRccAUGG(SEQ ID NO：105)。
8.示例性序列
在一些实施例中，mRNA包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF，其中该ORF包含与SEQID NO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项有至少90％的一致性的序列。在一些实施例中，mRNA包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF，其中该RNA引导的DNA结合剂包含与SEQ ID NO：3、6、8、13、16、19、22、25、28、68或186-196中的任一项有至少90％的一致性的氨基酸序列：，其中ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％范围内，及/或其尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内。在一些实施例中，mRNA包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF，其中该RNA引导的DNA结合剂包含与SEQ ID NO：3、6、8、13、16、19、22、25、28、68或186—196中的任一项有至少90％的一致性的氨基酸序列：，其中ORF的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至最小腺嘌呤含量的150％范围内，及/或其腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至最小腺嘌呤二核苷酸含量的150％范围内。在一些此类实施例中，腺嘌呤含量及尿苷核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，腺嘌呤含量及尿苷二核苷酸含量两者均小于或等于其相应最小值的150％。在一些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或67中的任一项有至少90％的一致性的序列，其中该序列包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF。在一些实施例中，mRNA包含与SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或67中的任一项有至少90％的一致性的序列，其中该序列包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF，其中省去SEQ ID NO：43、44、51、53、55-61或67的前三个核苷酸。在一些实施例中，前述一致性程度中的任一项为至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在一些实施例中，mRNA包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF，其中该ORF与SEQ IDNO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项在至少其前30、50、70、100、150、200、250或300个核苷酸上有至少90％的一致性。前30、50、70、100、150、200、250或300个核苷酸是自起始密码子(典型地，ATG)的第一个核苷酸开始测量，以使得A为第1核苷酸，T为第2核苷酸等。在一些实施例中，开放阅读框架与SEQ ID NO：1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项在至少其序列之前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％上具有至少90％的一致性。ORF的序列的长度为自起始密码子开始至终止密码子结束的核苷酸的数目，且其序列之前10％、12％、15％、20％、25％、30％或35％对应于自起始密码子的第一个核苷酸开始，构成总序列的长度的指定百分比的核苷酸的数目。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：43具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：43的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：44具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：44的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：56具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：56的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：57具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：57的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：58具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：58的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：59具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：59的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：60具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：60的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：61具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：61的ORF(即SEQ ID NO：4)由SEQ ID NO：7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：176具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：176的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107—175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：177具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：177的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107—175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：178具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：178的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：179具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：179的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：180具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：180的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：181具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：181的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：182具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：182的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：183具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：183的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代：。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：184具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：184的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，包含编码RNA引导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ ID NO：185具有至少90％的一致性的序列，视情况地，其中SEQ ID NO：185的ORF由SEQ ID NO：4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66或107-175中的任一项替代的ORF取代。
在一些实施例中，与SEQ ID NO 43、44、56-61或176-185的任选地经取代的序列的一致性程度为至少95％。在一些实施例中，与SEQ ID NO 43、44、56-61或176-185的任选地经取代的序列的一致性程度为至少98％。在一些实施例中，与SEQ ID NO 43、44、56-61或176-185的任选地经取代的序列的一致性程度为至少99％。在一些实施例中，与SEQ ID NO43、44、56-61或176-185的任选地经取代的序列的一致性程度为100％。
9.聚-A尾
在一些实施例中，mRNA进一步包含聚-A尾。在一些情况下，聚-A尾在聚-A尾中的一或多个位置处经一或多个非腺嘌呤核苷酸”“锚”中断。聚-A尾可包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸，且亦包含一或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的聚-A尾可包含位于3′至编码RNA引导的DNA结合剂或相关序列的核苷酸的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的聚-A尾包含位于3′至编码RNA引导的DNA结合剂或相关序列的核苷酸的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚-A尾编码于用于活体外转录mRNA的质粒中且变成转录物的一部分。编码于质粒中的聚-A序列，即聚-A序列中的连续腺嘌呤核苷酸的数目可能并不精确，例如质粒中的100聚-A序列可能不会在经转录的mRNA中产生恰好100聚-A序列。在一些实施例中，聚-A尾未编码于质粒中，且通过PCR加尾或酶加尾，例如使用大肠杆菌聚(A)聚合酶来添加。
在一些实施例中，一或多个非腺嘌呤核苷酸定位成中断连续腺嘌呤核苷酸，以使得聚(A)结合蛋白可结合于连续腺嘌呤核苷酸的一段。在一些实施例中，一或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，一或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8至50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，一或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8至100个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸在一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个腺嘌呤核苷酸之后且之后为至少8个连续腺嘌呤核苷酸。
本发明的聚-A尾可包含一个以下顺序：连续腺嘌呤核苷酸，继之以一或多个非腺嘌呤核苷酸，视情况继之以额外腺嘌呤核苷酸。
在一些实施例中，聚-A尾包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2至10个非腺嘌呤核苷酸的一个连续段。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些情况下，一或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8至50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施例中，一或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况下，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸为胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，非腺嘌呤核苷酸为胸腺嘧啶核苷酸。在其中存在多于一个非腺嘌呤核苷酸的一些情况下，非腺嘌呤核苷酸可选自：a)鸟嘌呤及胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤及胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸。包含非腺嘌呤核苷酸的示例性聚-A尾提供呈SEQ ID NO：62形式。
10.经修饰的核苷酸
在一些实施例中，mRNA在一些或所有尿苷位置处包含经修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素或C1-C3烷氧基修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为在1位处，例如用C1-C3烷基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可为，例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷为假尿苷及N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为假尿苷及5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷及5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷及N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为假尿苷及5-碘尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷及5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施例中，根据本发明的mRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为经修饰的尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为经修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或其组合。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，且其余者为N1-甲基假尿苷。在一些实施例中，根据本发明的mRNA中10％至25％、15％至25％、25％至35％、35％至45％、45％至55％、55％至65％、65％至75％、75％至85％、85％至95％或90％至100％的尿苷位置为5-碘尿苷，且其余者为N1-甲基假尿苷。
11.5′帽结构
在一些实施例中，本文所揭示的mRNA包含5′帽结构，诸如Cap0、Cap1或Cap2。5′帽结构通常为经由5′-三磷酸连接至mRNA的5′至3′链的第一个核苷酸，即第一个帽结构近端核苷酸的5′位的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可经进一步修饰，如下文例如关于ARCA所论述)。在Cap0中，mRNA的第一及第二帽结构近端核苷酸的核糖两者均包含2′-羟基。在Cap1中，mRNA的第一及第二转录核苷酸的核糖分别包含2′-甲氧基及2′-羟基。在Cap2中，mRNA的第一及第二帽结构近端核苷酸的核糖两者均包含2′-甲氧基。参见例如Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33)：12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA114(11)：E2106-E2115。大多数内源高等真核生物mRNA，包括哺乳动物mRNA(诸如人类mRNA)包含Cap1或Cap2。归因于通过先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1及IFIT-5识别为“非自体(non-self)”，Cap0及与Cap1及Cap2不同的其它帽结构在哺乳动物，诸如人类中可呈免疫原性，其可导致细胞介素，包括I型干扰素含量升高。先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1及IFIT-5亦可与eIF4E竞争结合具有除Cap1或Cap2外的帽结构的mRNA，此可能会抑制mRNA的转译。
帽结构可以共转录方式包括在内。例如，ARCA(抗反向帽结构类似物；ThermoFisher Scientific目录号AM8045)为包含连接至鸟嘌呤核糖核苷酸的5′位的7-甲基鸟嘌呤3′-甲氧基-5′-三磷酸的帽结构类似物，其可在一开始时活体外并入转录物中。ARCA产生Cap0帽结构，其中第一个帽结构近端核苷酸的2′位为羟基。参见例如，Stepinski等人(2001)“Synthesis and properties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs 7-methyl(3′-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3′deoxy)GpppG”，RNA 7：1486-1495。ARCA结构显示如下。
CleanCapTM AG(m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于以共转录方式提供Cap1结构。CleanCapTM AG及CleanCapTMGG的3′-O-甲基化形式亦可分别以目录号N-7413及N-7433购自TriLink Biotechnologies。CleanCapTM AG结构显示如下。CleanCapTM结构在本文中有时会使用上文所列的目录号的最后三个数字来指代(例如对于TriLink Biotechnologies目录号N-7113，使用“CleanCapTM 113”指代)。
可替代地，可以转录后方式将帽结构添加至RNA。例如，牛痘加帽结构酶可在市面上购得(New England Biolabs目录号M2080S)，且具有由其D1亚基提供的RNA三磷酸酶及鸟苷酰基转移酶活性及由其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶活性。因此，在S-腺苷甲硫氨酸及GTP存在下，可将7-甲基鸟嘌呤添加至RNA，以产生Cap0。参见例如Guo，P.及Moss，B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4023-4027；Mao，X.及Shuman，S.(1994)J.Biol.Chem.269，24472-24479。对于帽结构及加帽结构方法的其它论述，参见例如WO2017/053297及Ishikawa等人，Nucl.Acids.Symp.Ser.(2009)第53期，129-130。
12.引导RNA
在一些实施例中，与本文所揭示的mRNA组合来提供至少一个引导RNA。在一些实施例中，引导RNA提供呈与mRNA分离的分子。在一些实施例中，引导RNA提供呈本文所揭示的mRNA的一部分，诸如UTR的一部分。在一些实施例中，至少一个引导RNA靶向TTR。
在一些实施例中，引导RNA包含经修饰的sgRNA。在一些实施例中，sgRNA包含SEQID NO：74中所示出的修饰模式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，且其中全部N′均包含引导序列。例如，SEQ ID NO：74涵盖在本文中，其中N′经本文所揭示的引导序列中的任一者置换。尽管N′经引导物的核苷酸取代，但修饰仍如SEQ ID NO：74中所示。即，尽管引导的核苷酸置换“N′”，但前三个核苷酸仍为经2′OMe修饰的，且在第一核苷酸与第二核苷酸、第二核苷酸与第三核苷酸及第三核苷酸与第四核苷酸之间存在硫代磷酸酯键。
13.脂质；调配物；递送
在一些实施例中，将本文所述的单独或伴有一或多个引导RNA的mRNA调配于脂质纳米颗粒中或经由该脂质纳米颗粒施用；参见例如2017年3月30日申请的要求2016年3月30日申请的U.S.S.N.62/315,602的优先权，且标题为“CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒调配物(LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS)”的PCT/US2017/024973，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。可利用熟习此项技术者已知的能够将核苷酸递送至个体的任何脂质纳米颗粒(LNP)来施用本文所述的RNA，在一些实施例中，该RNA伴有一或多个引导RNA。在一些实施例中，将本文所述的单独或伴有一或多个引导RNA的mRNA调配于脂质体、纳米颗粒、胞外体或微囊泡中或经由脂质体、纳米颗粒、胞外体或微囊泡施用。乳液、微胞及悬浮液可为用于局部及/或表面递送的适合组合物。
本文揭示RNA的LNP调配物，包括CRISPR/Cas载荷(CRISPR/Cas cargo)的多个实施例。此类LNP调配物可包括(i)CCD脂质，诸如胺脂质、(ii)中性脂质、(iii)辅助脂质及(iv)隐形脂质，诸如PEG脂质。LNP调配物的一些实施例包括“胺脂质”以及辅助脂质、中性脂质及隐形脂质，诸如PEG脂质。“脂质纳米颗粒”意谓包含通过分子间力彼此物理缔合的复数个(即多于一个)脂质分子的粒子。
CCD脂质
用于将CRISPR/Cas mRNA及引导RNA组分递送至肝脏细胞的脂质组合物包含CCD脂质。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质A，其为十八-9，12-二烯酸(9Z，12Z)-3-((4，4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦称作(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯酸3-((4，4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。
脂质A可描绘为：
可根据WO2015/095340(例如第84-86页)合成脂质A。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质B，其为((5-((二甲胺基)甲基)-1，3-伸苯基)双(氧基))双(辛烷-8，1-二基)双(癸酸酯)，亦称作((5-((二甲胺基)甲基)-1，3-伸苯基)双(氧基))双(辛烷-8，1-二基)双(癸酸酯)。脂质B可描绘为：
可根据WO2014/136086(例如第107-109页)合成脂质B。
在一些实施例中，CCD脂质为脂质C，其为2-((4-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1，3-二基(9Z，9′Z，12Z，12′Z)-双(十八-9，12-二烯酸酯)。
脂质C可描绘为：
在一些实施例中，CCD脂质为脂质D，其为3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三酯。
脂质D可描绘为：
可根据WO2015/095340合成脂质C及脂质D。
CCD脂质亦可为脂质A、脂质B、脂质C或脂质D的等效物。在某些实施例中，CCD脂质为脂质A的等效物、脂质B的等效物、脂质C的等效物或脂质D的等效物。
胺脂质
在一些实施例中，用于生物活性剂的递送的LNP组合物包含“胺脂质”，其定义为脂质A或其等效物，包括脂质A的缩醛类似物。
在一些实施例中，胺脂质为脂质A，其为十八-9，12-二烯酸(9Z，12Z)-3-((4，4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦称作(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。
脂质A可描绘为：
可根据WO2015/095340(例如第84-86页)合成脂质A。在某些实施例中，胺脂质为脂质A的等效物。
在某些实施例中，胺脂质为脂质A的类似物。在某些实施例中，脂质A类似物为脂质A的缩醛类似物。在特定LNP组合物中，缩醛类似物为C4-C12缩醛类似物。在一些实施例中，缩醛类似物为C5-C12缩醛类似物。在其它实施例中，缩醛类似物为C5-C10缩醛类似物。在其它实施例中，缩醛类似物是选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11及C12缩醛类似物。
适用于本文所述的LNP中的胺脂质可活体内生物降解。胺脂质具有低毒性(例如以大于或等于10mg/kg的量在动物模型中得到耐受而不具有不良作用)。在某些实施例中，包含胺脂质的LNP包括其中会在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内自血浆清除至少75％的胺脂质的LNP。在某些实施例中，包含胺脂质的LNP包括其中会在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内自血浆清除至少50％的mRNA或gRNA的LNP。在某些实施例中，包含胺脂质的LNP包括其中例如通过测量脂质(例如，胺脂质)、RNA(例如mRNA)或其它组分，会在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内自血浆清除至少50％的LNP的LNP。在某些实施例中，测量LNP的经脂质囊封组分对游离脂质组分、RNA组分或核酸组分。
脂质清除率可如文献中所述来测量。参见Maier，M.A.等人Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics.Mol.Ther.2013，21(8)，1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，以0.3mg/kg通过静脉内快速注射经由外侧尾部静脉向六至八周龄雄性C57BL/6小鼠施用含有靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96及168小时收集血液、肝脏及脾脏样本。在收集组织之前向小鼠灌注生理盐水且处理血液样本以获得血浆。处理且通过LC-MS分析所有样本。此外，Maier描述了一种用于评定施用LNP-siRNA调配物之后的毒性的程序。例如，以0、1、3、5及10mg/kg(5只动物/组)经由单一静脉内快速注射以5mL/kg的剂量体积向雄性史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)施用靶向荧光素酶的siRNA。在24小时之后，由清醒的动物的颈静脉获得约1mL血液且分离血清。在给药后72小时，将所有动物安乐死以用于尸体剖检。进行临床症状、体重、血清化学、器官重量及组织病理学的评定。尽管Maier描述了用于评定siRNA-LNP调配物的方法，但此等方法亦可适用于评定本发明的LNP组合物的投药的清除率、药物动力学及毒性。
胺脂质引起增加的清除速率。在一些实施例中，清除速率为脂质清除速率，例如自血液、血清或血浆清除胺脂质的速率。在一些实施例中，清除速率为RNA清除速率，例如自血液、血清或血浆清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施例中，清除速率为自血液、血清或血浆清除LNP的速率。在一些实施例中，清除速率为自组织，诸如肝脏组织或脾脏组织清除LNP的速率。在某些实施例中，清除速率的高速率会产生不具有显著不良作用的安全分布。胺脂质减少循环中及组织中的LNP积聚。在一些实施例中，循环中及组织中的LNP积聚减少会产生不具有显著不良作用的安全分布。
可视本发明的胺脂质所处的培养基的pH而定，对该胺脂质进行电离。例如，在弱酸性培养基中，胺脂质可经质子化且因此带有正电荷。相反地，在弱碱性培养基中，诸如其中pH为大约7.35的血液中，胺脂质可不经质子化且因此不带电荷。在一些实施例中，可在至少约9的pH下对本发明的胺脂质进行质子化。在一些实施例中，可在至少约10的pH下对本发明的胺脂质进行质子化。
胺脂质带有电荷的能力与其固有pKa有关。例如，本发明的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.2范围内的pKa。例如，本发明的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.5范围内的pKa。当已发现，pKa在约5.1至约7.4范围内的阳离子型脂质对将载荷活体内递送至例如肝脏为有效的时，此可为有利的。此外，已发现，pKa在约5.3至约6.4范围内的阳离子型脂质对活体内递送至例如肿瘤为有效的。参见例如WO2014/136086。
其它脂质
适用于本发明的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性、不带电荷或两性离子型脂质。适用于本发明中的中性磷脂的实例包括(但不限于)5-十七基苯-1，3-二醇(间苯二酚)、二软脂酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、1-肉豆蔻酰基-2-软脂酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-软脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-软脂酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1，2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-软脂酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1，2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、软脂酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰基胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二软脂酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、软脂酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在一个实施例中，中性磷脂可选自由以下组成的群：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)及二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一实施例中，中性磷脂可为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇及烷基间苯二酚。适用于本发明中的辅助脂质包括(但不限于)胆固醇、5-十七基间苯二酚及胆固醇半丁二酸酯。在一个实施例中，辅助脂质可为胆固醇。在一个实施例中，辅助脂质可为胆固醇半丁二酸酯。
“隐形脂质”为改变纳米颗粒可在活体内(例如血液中)存在的时长的脂质。隐形脂质可通过例如减少粒子聚集且控制粒度辅助调配过程。本文中所用的隐形脂质可调节LNP的药物动力学特性。适用于本发明中的隐形脂质包括(但不限于)具有连接至脂质部分的亲水性头基的隐形脂质。适用于本发明脂质组合物的隐形脂质及关于此类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等人，Pharmaceutical Research，第25卷，第1期，2008，第55-71页及Hoekstra等人，Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52。额外适合PEG脂质揭示于例如WO 2006/007712中。
在一个实施例中，隐形脂质的亲水性头基包含选自基于PEG的聚合物的聚合物部分。隐形脂质可包含脂质部分。在一些实施例中，隐形脂质为PEG脂质。
在一个实施例中，隐形脂质包含选自基于以下的聚合物的聚合物部分：PEG(有时称作聚(环氧乙烷))、聚(恶唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚氨基酸及聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。
在一个实施例中，PEG脂质包含基于PEG(有时称作聚(环氧乙烷))的聚合物部分。
PEG脂质进一步包含脂质部分。在一些实施例中，脂质部分可源自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)，包括包含二烷基甘油基或二烷基甘油酰胺基的那些，该基团具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长，其中该链可包含一或多个官能基，诸如酰胺基或酯基。在一些实施例中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基可进一步包含一或多个经取代的烷基。链长可为对称或不对称的。
除非另外指明，否则如本文所用，术语“PEG”意谓任何聚乙二醇或其它聚伸烷醚聚合物。在一个实施例中，PEG为乙二醇或环氧乙烷的视情况经取代的直链或分支链聚合物。在一个实施例中，PEG为未经取代的。在一个实施例中，PEG经例如一或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基、或芳基取代。在一个实施例中，该术语包括PEG共聚物，诸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris，Poly(ethylene glycol)chemistry：biotechnical and biomedical applications(1992))；在另一实施例中，该术语不包括PEG共聚物。在一个实施例中，PEG的分子量为约130至约50,000，在一子实施例中，约150至约30,000，在一子实施例中，约150至约20,000，在一子实施例中，约150至约15,000，在一子实施例中，约150至约10,000，在一子实施例中，约150至约6,000，在一子实施例中，约150至约5,000，在一子实施例中，约150至约4,000，在一子实施例中，约150至约3,000，在一子实施例中，约300至约3,000，在一子实施例中，约1,000至约3,000且在一子实施例中，约1,500至约2,500。
在某些实施例中，PEG(例如与脂质部分或脂质，诸如隐形脂质结合)、为“PEG-2K”，亦称为“PEG2000”，其具有约2,000道尔顿的平均分子量。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n为45，意谓经数量平均化的聚合度包含约45个亚基。然而，亦可使用此项技术中已知的其它PEG实施例，包括例如其中经数量平均化的聚合度包含约23个亚基(n＝23)及/或68个亚基(n＝68)的那些。在一些实施例中，n可在约30至约60范围内。在一些实施例中，n可在约35至约55范围内。在一些实施例中，n可在约40至约50范围内。在一些实施例中，n可在约42至约48范围内。在一些实施例中，n可为45。在一些实施例中，R可选自H、经取代的烷基及未经取代的烷基。在一些实施例中，R可为未经取代的烷基。在一些实施例中，R可为甲基。
在本文中描述的任一实施例中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，来自日本东京的NOF)、PEG-二软脂酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，日本东京的NOF)、PEG-二月桂酰甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘油酰胺、PEG-二软脂酰甘油酰胺、及PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8′-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3′，6′-二氧杂辛烷]胺甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3，4-双十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)(目录号880150P，来自美国亚拉巴马州阿拉巴斯特(Alabaster，Alabama，USA)的Avanti Polar Lipids)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，来自美国亚拉巴马州阿拉巴斯特的Avanti Polar Lipids)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，日本东京的NOF)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)、及1，2-二硬脂氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施例中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在一个实施例中，PEG脂质可为化合物S027，其揭示于WO2016/010840(第[00240]至[00244]段)中。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在一个实施例中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施例中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施例中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施例中，PEG脂质可为PEG2k-C18。
LNP可含有(i)用于囊封及用于核内体逃逸(endosomal escape)的胺脂质、(ii)用于稳定的中性脂质、(iii)亦用于稳定的辅助脂质及(iv)隐形脂质，诸如PEG脂质。
在一些实施例中，LNP组合物可包含RNA组分，其包括以下中的一种或多种：RNA引导的DNA结合剂、Cas核酸酶mRNA、2类Cas核酸酶mRNA、Cas9 mRNA及gRNA。在一些实施例中，LNP组合物可包括2类Cas核酸酶及gRNA作为RNA组分。在某些实施例中，LNP组合物可包含RNA组分、胺脂质、辅助脂质、中性脂质及隐形脂质。在某些LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其它组合物中，中性脂质为DSPC。在其它实施例中，隐形脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，LNP组合物包含脂质A或脂质A的等效物；辅助脂质；中性脂质；隐形脂质；及引导RNA。在某些组合物中，胺脂质为脂质A。在某些组合物中，胺脂质为脂质A或其缩醛类似物；辅助脂质为胆固醇；中性脂质为DSPC且隐形脂质为PEG2k—DMG。
在某些实施例中，根据调配物中脂质组分的相应摩尔比描述脂质组合物。本发明的实施例提供根据调配物中脂质组分的相应摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约30mol％至约60mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约40mol％至约60mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约45mol％至约60mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约60mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约55mol％至约60mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约55mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约50mol％。在一个实施例中，胺脂质的mol％可为约55mol％。在一些实施例中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施例中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。所有mol％数均以LNP组合物的脂质组分的一定分率给定。在某些实施例中，胺脂质mol％的LNP批次间变化率将低于15％、低于10％或小于5％。
在一个实施例中，中性脂质的mol％可为约5mol％至约15mol％。在一个实施例中，中性脂质的mol％可为约7mol％至约12mol％。在一个实施例中，中性脂质的mol％可为约9mol％。在一些实施例中，LNP批料的中性脂质mol％将为目标中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施例中，LNP批次间变化率将低于15％、低于10％或小于5％。
在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约20mol％至约60mol％。在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约55mol％。在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约50mol％。在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约40mol％。在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约50mol％。在一个实施例中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约40mol％。在一个实施例中，基于胺脂质、中性脂质及PEG脂质浓度而调整辅助脂质的mol％以使脂质组分达100mol％。在一些实施例中，LNP批料的辅助脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施例中，LNP批次间变化率将低于15％、低于10％或小于5％。
在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约1mol％至约10mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约10mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约8mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约4mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％至约4mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约3mol％。在一个实施例中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％。在一些实施例中，LNP批料的PEG脂质mol％将为目标PEG脂质mol％的±30％、4±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施例中，LNP批次间变化率将低于15％、低于10％或小于5％。
在某些实施例中，载荷包括编码RNA引导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA，及gRNA或编码gRNA的核酸，或mRNA及gRNA的组合。在一个实施例中，LNP组合物可包含脂质A或其等效物。在一些方面中，胺脂质为脂质A。在一些方面中，胺脂质为脂质A等效物，例如脂质A的类似物。在某些方面中，胺脂质为脂质A的缩醛类似物。在各种实施例中，LNP组合物包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质及PEG脂质。在某些实施例中，辅助脂质为胆固醇。在某些实施例中，中性脂质为DSPC。在特定实施例中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在一些实施例中，LNP组合物可包含脂质A、辅助脂质、中性脂质及PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包含胺脂质、DSPC、胆固醇及PEG脂质。在一些实施例中，LNP组合物包含PEG脂质，该脂质包含DMG。在某些实施例中，胺脂质选自脂质A，及脂质A的等效物，包括脂质A的缩醛类似物。在其它实施例中，LNP组合物包含脂质A、胆固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
本发明的实施例亦提供根据待囊封的核酸的胺脂质的带正电胺基(N)与带负电磷酸基团(P)之间的摩尔比描述的脂质组合物。此可由方程式N/P数学表示。在一些实施例中，LNP组合物可包含脂质组分，其包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质及隐形脂质；及核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施例中，LNP组合物可包含脂质组分，其包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质及隐形脂质；及RNA组分，其中N/P比为约3至10。在一个实施例中，N/P比可为约5至7。在一个实施例中，N/P比可为约4.5至8。在一个实施例中，N/P比可为约6。在一个实施例中，N/P比可为6±1。在一个实施例中，N/P比可为6±0.5。在一些实施例中，N/P比将为目标N/P比的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施例中，LNP批次间变化率将低于15％、低于10％或小于5％。
在一些实施例中，RNA组分可包含mRNA，诸如本文所揭示的mRNA，例如编码Cas核酸酶的mRNA。在一个实施例中，RNA组分可包含Cas9 mRNA。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，LNP进一步包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施例中，RNA组分包含Cas核酸酶mRNA及gRNA。在一些实施例中，RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA及gRNA。
在某些实施例中，LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质及PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其它包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其它包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的实施例中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的特定组合物中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在一些实施例中，LNP组合物可包含gRNA。在某些实施例中，LNP组合物可包含胺脂质、gRNA、辅助脂质、中性脂质及PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其它包含gRNA的实施例中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在一个实施例中，LNP组合物可包含sgRNA。在一个实施例中，LNP组合物可包含Cas9 sgRNA。在一个实施例中，LNP组合物可包含Cpf1 sgRNA。在一些包含sgRNA的组合物中，LNP包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质及PEG脂质。在某些包含sgRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其它包含sgRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其它包含sgRNA的实施例中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在某些实施例中，LNP组合物包含本文所揭示的mRNA，例如编码Cas核酸酶的mRNA，及gRNA，其可为sgRNA。在一个实施例中，LNP组合物可包含胺脂质、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质及PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA及gRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA及gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其它包含编码Cas核酸酶的mRNA及gRNA的实施例中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施例中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在某些实施例中，LNP组合物包括Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA，及至少一个gRNA。在某些实施例中，LNP组合物包括比率为约25∶1至约1∶25的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施例中，LNP调配物包括比率为约10∶1至约1∶10的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施例中，LNP调配物包括比率为约8∶1至约1∶8的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。如本文中所测量，比率是以重量计。在一些实施例中，LNP调配物包括比率为约5∶1至约1∶5的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA。在一些实施例中，比率范围为约3∶1至1∶3、约2∶1至1∶2、约5∶1至1∶2、约5∶1至1∶1、约3∶1至1∶2、约3∶1至1∶1、约3∶1、约2∶1至1∶1。在一些实施例中，gRNA与mRNA的比为约3∶1或约2∶1。在一些实施例中，gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶的比为约1∶1。比率可为约25∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶10或1∶25。
本文中所揭示的LNP组合物可包括模板核酸。模板核酸可经编码Cas核酸酶的mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA共调配。在一些实施例中，模板核酸可经引导RNA共调配。在一些实施例中，模板核酸可经编码Cas核酸酶的mRNA及引导RNA两者共调配。在一些实施例中，模板核酸可经编码Cas核酸酶的mRNA及引导RNA分开调配。模板核酸可与LNP组合物一起或与其分开递送。在一些实施例中，模板核酸可为单股或双股的，其视所需修复机制而定。模板可具有与靶DNA或与邻近于靶DNA的序列同源的区域。
本文所述的LNP及LNP调配物中的任一者适用于递送单独或与一或多个引导RNA一起的编码RNA引导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶的mRNA。在一些实施例中，涵盖一种包含以下的LNP组合物：RNA组分及脂质组分，其中脂质组分包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质及隐形脂质；且其中N/P比为约1至10。
在一些情况下，脂质组分包含脂质A或其缩醛类似物、胆固醇、DSPC及PEG-DMG；且其中N/P比为约1至10。在一些实施例中，脂质组分包含：约40至60mol％胺脂质；约5至15mol％中性脂质；及约1.5％至10mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为辅助脂质，且其中LNP组合物的N/P比为约3至10。在一些实施例中，脂质组分包含：约50至60mol％胺脂质；约8至10mol％中性脂质；及约2.5％至4mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为辅助脂质，且其中LNP组合物的N/P比为约3至8。在一些情况下，脂质组分包含：约50至60mol％胺脂质；约5至15mol％DSPC；及约2.5％至4mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为胆固醇，且其中LNP组合物的N/P比为约3至8。在一些情况下，脂质组分包含：48至53mol％脂质A；约8至10mol％DSPC；及约1.5％至10mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为胆固醇，且其中LNP组合物的N/P比为3至8±0.2。
在一些实施例中，LNP是通过混合RNA水溶液与有机溶剂基脂质溶液，例如100％乙醇而形成。适合溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可将医药学上可接受的缓冲液用于例如LNP的活体内投药。在某些实施例中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施例中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施例中，组合物的pH在约7.2至约7.7范围内。在其它实施例中，组合物的pH在约7.3至约7.7范围内或约7.4至约7.6范围内。在其它实施例中，组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。组合物的pH可用微型pH探针进行测量。在某些实施例中，组合物中包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO及乙二醇。示例性组合物可包括至多10％低温保护剂，诸如蔗糖。在某些实施例中，LNP组合物可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％低温保护剂。在某些实施例中，LNP组合物可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％蔗糖。在一些实施例中，LNP组合物可包括缓冲液。在一些实施例中，缓冲液可包含磷酸酯缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液及其混合物。在某些示例性实施例中，缓冲液包含NaCl。在某些实施例中，省去NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM范围内。在一些实施例中，NaCl的量为约45mM。在一些实施例中，缓冲液为Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM范围内。在一些实施例中，Tris的量为约50mM。在一些实施例中，缓冲液包含NaCl及Tris。LNP组合物的某些示例性实施例含有5％蔗糖及45mM NaCl的Tris缓冲液。在其它示例性实施例中，组合物含有呈约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl及pH 7.5下的约50mM Tris。盐、缓冲液及低温保护剂量可有所变化以使总体调配物的重量莫耳渗透浓度得到维持。例如，最终重量莫耳渗透浓度可维持低于450mOsm/L。在其它实施例中，重量莫耳渗透浓度在350与250mOsm/L之间。某些实施例的最终重量莫耳渗透浓度为300+/-20mOsm/L。
在一些实施例中，使用微流混合、T型混合或交错混合。在某些方面中，流动速率、接头大小、接头几何结构、接头形状、管径、溶液及/或RNA及脂质浓度可有所变化。LNP或LNP组合物可例如经由渗析、切向流过滤或层析得到浓缩或纯化。LNP可以例如悬浮液、乳液或冻干粉末形式储存。在一些实施例中，LNP组合物储存于2至8℃下，在某些方面中，LNP组合物储存于室温下。在其它实施例中，冷冻储存，例如在-20°℃或-80℃下储存LNP组合物。在其它实施例中，将LNP组合物储存于约0℃至约-80℃范围内的温度下。可在使用之前例如在冰上，在4℃下、在室温下或在25℃下融化冷冻LNP组合物。可将冷冻LNP组合物维持在不同温度下，例如在冰上，在4℃下、在室温下、在25℃下或在37℃下。
在一些实施例中，LNP组合物具有大于约80％的囊封率。在一些实施例中，LNP组合物的粒度小于约120nm。在一些实施例中，LNP组合物的pdi小于约0.2。在一些实施例中，存在此等特征中的至少两者。在一些实施例中，存在此等三个特征中的每一者。用于测定此等参数的分析方法论述于下文通用试剂及方法章节中。
在一些实施例中，与本文所揭示的mRNA缔合的LNP供用于制备药剂。
电致孔为递送载荷的熟知手段，且任何电致孔方法可用于递送本文所揭示的gRNA中的任一者。在一些实施例中，电致孔可用于递送本文所揭示的mRNA及一或多个引导RNA。
在一些实施例中，提供一种用于将本文所揭示的mRNA递送至离体细胞的方法，其中mRNA与LNP缔合或不与LNP缔合。在一些实施例中，mRNA/LNP或mRNA亦与一或多个引导RNA缔合。
在一些实施例中，当以医药组合物形式向哺乳动物施用本文所揭示的mRNA时，该哺乳动物展现出比施用最小尿苷含量大于150％的编码Cas9核酸酶的mRNA的哺乳动物要低至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的细胞介素反应。可如实例中所述测定细胞介素反应。细胞介素反应之间的差异可以一组细胞介素，诸如以下细胞介素中的至少一种、两种、三种或四种的平均变化的形式来测量：IFN α、IL-6、TNF α及MCP-1。在一些实施例中，当以医药组合物形式向哺乳动物施用本文所揭示的mRNA时，该哺乳动物展现出比施用具有编码Cas9核酸酶的ORF的mRNA的哺乳动物要低至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的细胞介素反应，其中ORF的序列由SEQ IDNO：5组成。在一些实施例中，具有由SEQ ID NO：5组成的序列的ORF中的尿苷为未经修饰的。据通常理解，除mRNA外的比较组合物的特征应保持恒定，包括剂量，且剂量应处于适当范围，诸如0.1至5mpk或本文所述的其它范围内(例如，如mRNA功效的测定章节所论述)。
在一些实施例中，编码引导RNA的核苷酸序列可位于相同载体、转录物或包含编码RNA引导的DNA结合剂的核苷酸序列的mRNA上。在一些实施例中，引导RNA的表达及RNA引导的DNA结合剂的表达可通过其自身对应启动子来驱动。在一些实施例中，引导RNA的表达可由驱动RNA引导的DNA结合剂的表达的相同启动子来驱动。在一些实施例中，引导RNA及编码RNA引导的DNA结合剂的ORF可包含于单一转录物中。例如，引导RNA可处于RNA引导的DNA结合剂转录物的非转译区(UTR)中。在一些实施例中，引导RNA可处于RNA引导的DNA结合剂转录物的5′UTR中。在一些实施例中，引导RNA可处于RNA引导的DNA结合剂转录物的3′UTR中。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂转录物的胞内半衰期可通过将引导RNA包含在该转录物的3′UTR中且藉此缩短其3′UTR的长度而减小。在其它实施例中，引导RNA可处于RNA引导的DNA结合剂转录物的内含子中。在一些实施例中，可在引导RNA所处的内含子处添加适合剪接位点以使得自转录物恰当地剪接掉引导RNA。在一些实施例中，相同载体上紧邻的RNA引导的DNA结合剂及引导RNA的表达可促进较高效形成RNA引导的DNA结合剂与引导RNA的核糖核蛋白复合物。
在一些实施例中，提供一种包含本发明的mRNA的医药调配物。在一些实施例中，提供一种包含至少一种脂质，例如包含本发明的mRNA的LNP的医药调配物。可使用适用于递送RNA的任何LNP，诸如上文所述的LNP；其它示例性LNP描述于3月30，2017日申请的PCT/US2017/024973中。医药调配物可进一步包含医药学上可接受的载体，例如水或缓冲液。医药调配物可进一步包含一或多种医药学上可接受的赋形剂，诸如稳定剂、防腐剂、膨化剂或其类似者。医药调配物可进一步包含一或多种医药学上可接受的盐，诸如氯化钠。在一些实施例中，医药调配物经调配以用于静脉内施用。在一些实施例中，医药调配物经调配以用于递送至肝循环中。
C.mRNA功效的测定
在一些实施例中，当与RNP的其它组分，例如至少一个gRNA，诸如靶向TTR的gRNA一起表达时，测定mRNA的功效。
具有裂解酶活性的RNA引导的DNA结合剂可引起DNA中发生双股断裂。非同源末端连接(NHEJ)为一种以下方法，通过该方法，DNA中的双股断裂(DSB)经由重新连接断裂末端而得到修补，其可能会产生呈插入/缺失(插入缺失标记(indel))突变形式的错误。在重新连接末端之前，DSB的DNA末端常常会经历酶处理，其引起在一或两个股处添加或移除核苷酸。重新连接之前的此等添加或移除引起DNA序列中NHEJ修复位点处存在插入或缺失(插入缺失标记(indel))突变。归因于插入缺失标记(indel)的多种突变会改变阅读框架或过早地引入终止密码子，且因此产生非功能性蛋白质。
在一些实施例中，基于活体外模型而测定编码核酸酶的mRNA的功效。在一些实施例中，活体外模型为HEK293细胞。在一些实施例中，活体外模型为HUH7人类肝癌细胞。在一些实施例中，活体外模型为初级肝细胞，诸如初级人类或小鼠肝细胞。
在一些实施例中，通过TTR的编辑百分比测量RNA的功效。用于测定编辑百分比的示例性程序在以下实例中给出。在一些实施例中，将TTR的编辑百分比与当mRNA包含具有未经修饰的尿苷的SEQ ID NO：5的ORF且所有其它者为相同的时所获得的编辑百分比进行比较。
在一些实施例中，使用施用包含mRNA及靶向TTR的gRNA，例如SEQ ID NO：42的LNP后的小鼠中的血清TTR浓度来测定mRNA的功效。在一些实施例中，使用施用包含mRNA及靶向TTR的gRNA，例如SEQ ID NO：69的LNP后的大鼠中的血清TTR浓度来测定mRNA的功效。血清TTR浓度可以绝对术语或以相对于假处理对照的基因减弱％来表示。在一些实施例中，使用施用包含mRNA及靶向TTR的gRNA，例如SEQ ID NO：42的LNP后的小鼠中的肝脏中的编辑百分比来测定mRNA的功效。在一些实施例中，有效量能够达成血清TTR的至少50的编辑％或50的基因减弱％。示例性有效量在0.1至10mg/kg(mpk)，例如0.1至0.3mpk、0.3至0.5mpk、0.5至1mpk、1至2mpk、2至3mpk、3至5mpk、5至10mpk范围内，或为0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5、或10mpk。
在一些实施例中，侦测基因编辑事件，诸如靶DNA中的插入/缺失(“插入缺失标记(indel)”)突变的形成及同源定向修复(HDR)事件会利用伴随加标签的引物且分离加标签的扩增产物的线性扩增(后文称为“LAM-PCR”或“线性扩增(LA)”法)。
在一些实施例中，该方法包含自已经诱导而具有双股断裂(DSB)且视情况地，已具有HDR模板以修复DSB的细胞分离细胞DNA；用加标签的引物进行至少一轮DNA的线性扩增；分离包含标签的线性扩增产物，藉此舍弃用非加标签的引物扩增的任何扩增产物；视情况进一步扩增分离产物；且分析线性扩增产物或经进一步扩增的产物以测定靶DNA中是否存在编辑事件，诸如双股断裂、插入、缺失或HDR模板序列。在一些情况下，编辑事件可经定量。如本文所用(包括在HDR及非HDR编辑事件，诸如插入缺失标记(indel)的情形下)，定量及其类似者包括侦测总体中编辑事件的次数及/或类型。
在一些实施例中，仅进行一轮线性扩增。
在一些情况下，加标签的引物包含分子条形码。在一些实施例中，加标签的引物包含分子条形码，且仅进行一轮线性扩增。
在一些实施例中，分析步骤包含对线性扩增产物或经进一步扩增的产物进行测序。测序可包含熟习此项技术者已知的任何方法，包括次世代测序(next generationsequencing)及将线性扩增产物或经进一步扩增的产物克隆于质粒中且对质粒或质粒的一部分进行测序。在其它方面中，分析步骤包含对线性扩增产物或经进一步扩增的产物进行数字PCR(dPCR)或液滴式数字PCR(ddPCR)。在其它情况下，分析步骤包含使线性扩增产物或经进一步扩增的产物与经设计以鉴别包含HDR模板序列的DNA的核酸探针接触，且侦测已结合至线性扩增产物或经进一步扩增的产物的探针。在一些实施例中，该方法进一步包含测定靶DNA中HDR模板的位置。
在某些实施例中，该方法进一步包含测定靶DNA中插入位点的序列，其中插入位点为HDR模板并入靶DNA中所处的位置，且其中插入位点可包括部分靶DNA序列及部分HDR模板序列。
在一些实施例中，使用加标签的引物的靶DNA的线性扩增进行1至50轮、1至60轮、1至70轮、1至80轮、1至90轮或1至100轮。
在一些实施例中，使用加标签的引物的靶DNA的线性扩增包含分离DNA双螺旋体的变性步骤、使引物结合的黏接步骤及延伸步骤。在一些实施例中，线性扩增为等温的(不需要温度变化)。在一些实施例中，等温线性扩增为环介导等温扩增(LAMP)、股置换扩增(SDA)、解螺旋酶依赖性扩增或切口酶扩增反应。
在一些实施例中，加标签的引物黏接至与期望编辑事件位置，例如插入、缺失或模板插入位点相距至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300、至少1,000、至少5,000或至少10,000个核苷酸的靶DNA。
在一些实施例中，加标签的引物包含分子条形码。在一些实施例中，分子条形码包含与靶DNA不互补的序列。在一些实施例中，分子条形码包含6、8、10或12个核苷酸。
在一些实施例中，引物上的标签为生物素、抗生蛋白链菌素、地高辛(digoxigenin)、DNA序列或荧光异硫氰酸盐(FITC)。
在一些实施例中，使用对引物上的标签具有特异性的捕捉试剂分离线性扩增产物。在一些实施例中，捕捉试剂处于珠粒、固体载体、基质或管柱上。在一些实施例中，分离步骤包含使线性扩增产物与对引物上的标签具有特异性的捕捉试剂接触。在一些实施例中，捕捉试剂为生物素、抗生蛋白链菌素、地高辛、DNA序列或荧光异硫氰酸盐(FITC)。
在一些实施例中，标签为生物素且捕捉试剂为抗生蛋白链菌素。在一些实施例中，标签为抗生蛋白链菌素且捕捉试剂为生物素。在一些实施例中，标签处于引物的5′端、引物的3′端上或处于引物内部。在一些实施例中，在分离步骤之后移除标签及/或捕捉试剂。在一些实施例中，不移除标签及/或捕捉试剂，且在标签及/或捕捉试剂存在下进行进一步扩增及分析步骤。
在一些实施例中，进一步扩增为非线性的。在一些实施例中，进一步扩增为数字PCR、qPCR或RT-PCR。在一些实施例中，测序为次世代测序(NGS)。
在一些实施例中，靶DNA为基因组或线粒体。在一些实施例中，靶DNA为原核或真核细胞的基因组DNA。在一些实施例中，靶DNA为哺乳动物DNA。靶DNA可来自非分裂细胞或分裂细胞。在一些实施例中，靶DNA可来自初级细胞。在一些实施例中，靶DNA来自复制细胞。
在一些情况下，在线性扩增之前剪切细胞DNA。在一些实施例中，经剪切的DNA的平均尺寸在0.5kb与20kb之间。在一些情况下，细胞DNA经剪切而呈0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、12.0、12.25、12.5、12.75、13.0、13.25、13.5、13.75、14.0、14.25、14.5、14.75、15.0、15.25、15.5、15.75、16.0、16.25、16.5、16.75、17.0、17.25、17.5、17.75、18.0、18.25、18.5、18.75、19.0、19.25、19.5、19.75或20.0kb的平均尺寸。在一些情况下，细胞DNA经剪切而呈约1.5kb的平均尺寸。
D.示例性用途、方法及治疗
在一些实施例中，mRNA、LNP或医药组合物供用于基因组编辑，例如编辑靶基因中。在一些实施例中，mRNA、LNP或医药组合物供用于修饰靶基因，例如改变其序列或后生状态(epigenetic status)中。在一些实施例中，mRNA、LNP或医药组合物供用于在靶基因中诱导双股断裂(DSB)中。在一些实施例中，mRNA、LNP或医药组合物供用于在靶基因中诱导插入缺失标记(indel)中。在一些实施例中，提供本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物的用途，其用于制备用于基因组编辑，例如编辑靶基因的药剂。在一些实施例中，提供本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物的用途，其用于制备用于修饰靶基因，例如改变其序列或后生状态的药剂。在一些实施例中，提供本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物的用途，其用于制备用于在靶基因中诱导双股断裂(DSB)的药剂。在一些实施例中，提供本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物的用途，其用于制备用于在靶基因中诱导插入缺失标记(indel)的药剂。在一些实施例中，靶基因处于个体，诸如哺乳动物，诸如人类中。在一些实施例中，靶基因处于器官，诸如肝脏，诸如哺乳动物肝脏，诸如人类肝脏中。在一些实施例中，靶基因处于肝脏细胞，诸如哺乳动物肝脏细胞，诸如人类肝脏细胞中。在一些实施例中，靶基因处于肝细胞，诸如哺乳动物肝细胞，诸如人类肝细胞中。在一些实施例中，肝脏细胞或肝细胞处于原位。在一些实施例中，肝脏细胞或肝细胞分离于例如培养物中，诸如原代培养物中。亦提供对应于本文所揭示的用途的方法，其包含向个体施用本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物或使细胞，诸如上文所述的细胞与本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物接触。
在一些实施例中，mRNA、LNP或医药组合物供用于疗法中或治疗疾病，例如与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)中。在一些实施例中，提供本文所揭示的mRNA(例如以本文所提供的组合物形式)的用途，其用于制备例如用于治疗患有与TTR相关的淀粉样变性(ATTR)的个体的药剂。
在一些实施例中，出于上文关于生物体、器官或原位细胞所论述的用途中的任一者静脉内施用mRNA、LNP或医药组合物。在一些实施例中，以在0.01至10mg/kg(mpk)，例如0.01至0.1mpk、0.1至0.3mpk、0.3至0.5mpk、0.5至1mpk、1至2mpk、2至3mpk、3至5mpk、5至10mpk范围内或0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5或10mpk的剂量施用mRNA、LNP或医药组合物。
在涉及个体之前述实施例中的任一者中，个体可为哺乳动物。在涉及个体之前述实施例中的任一者中，个体可为人类。在涉及个体之前述实施例中的任一者中，个体可为牛、猪、猴、绵羊、狗、猫、鱼或家禽。
在一些实施例中，静脉内施用本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物或将其用于静脉内投药。在一些实施例中，将引导RNA、组合物及调配物施用至肝循环中或用于肝循环中的投药。
在一些实施例中，单次施用本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物足以使靶基因产物的表达发生基因减弱。在一些实施例中，单次施用本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物足以使靶基因产物的表达发生基因剔除。在其它实施例中，不止一次施用本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物对于使编辑、修饰、插入缺失标记(indel)形成、DSB形成或其类似者经由累积效应达至最大可为有益的。
在一些实施例中，会在递送之后1年、2年、3年、4年、5年或10年看到本文所揭示的mRNA、LNP或医药组合物的治疗功效。
在一些实施例中，治疗会减缓或中断疾病进展。
在一些实施例中，治疗会引起器官功能或器官，诸如肝脏的疾病的症状得到改善、稳定或减缓其变化。
在一些实施例中，通过增加个体的存活时间来测量治疗功效。
E.示例性DNA分子、载体、表达构建体、宿主细胞及制造方法
在某些实施例中，本发明提供一种DNA分子，其包含编码mRNA中的任一者的序列，该mRNA编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂。在一些实施例中，除了RNA引导的DNA结合剂序列之外，DNA分子进一步包含不编码RNA引导的DNA结合剂的核酸。不编码RNA引导的DNA结合剂的核酸包括(但不限于)启动子、强化子、调节序列及编码引导RNA的核酸。
在一些实施例中，DNA分子进一步包含编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA的核苷酸序列。在一些实施例中，编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA的核苷酸序列包含或由以下组成：通过来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的引导序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA组成的核酸可进一步构成载体序列，其中该载体序列包含或由以下组成：不会与crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起经天然发现的核酸。在一些实施例中，crRNA及trRNA由一个载体中的非连续核酸编码。在其它实施例中，crRNA及trRNA可由连续核酸编码。在一些实施例中，crRNA及trRNA由单一核酸的相对股编码。在其它实施例中，crRNA及trRNA由单一核酸的相同股编码。
在一些实施例中，DNA分子进一步包含以可操作方式连接编码mRNA中的任一者的序列的启动子，该mRNA编码本文所述的RNA引导的DNA结合剂。在一些实施例中，DNA分子为适用于在哺乳动物细胞，例如人类细胞或小鼠细胞，诸如人类肝细胞或啮齿动物(例如小鼠)肝细胞中表达的表达构建体。在一些实施例中，DNA分子为适用于在哺乳动物器官，例如人类肝脏或啮齿动物(例如小鼠)肝脏的细胞中表达的表达构建体。在一些实施例中，DNA分子为质粒或游离基因组。在一些实施例中，DNA分子包含于宿主细胞，诸如细菌或经培养的真核细胞中。示例性细菌包括变形菌门，诸如大肠杆菌。示例性经培养的真核细胞包括初级肝细胞，包括啮齿动物(例如小鼠)或人源的肝细胞；肝细胞细胞株，包括啮齿动物(例如小鼠)或人源的肝细胞；人类细胞株；啮齿动物(例如小鼠)细胞株；CHO细胞；微生物真菌，诸如裂殖或出芽酵母，例如酵母菌，诸如酿酒酵母；及昆虫细胞。
在一些实施例中，提供一种制造本文所揭示的mRNA的方法。在一些实施例中，此类方法包含使本文所述的DNA分子与核糖核酸聚合酶在容许转录的条件下接触。在一些实施例中，活体外，例如在无细胞系统中进行接触。在一些实施例中，核糖核酸聚合酶为噬菌体源的核糖核酸聚合酶，诸如T7核糖核酸聚合酶。在一些实施例中，提供包括至少一种如上文所论述的经修饰的核苷酸的NTP。在一些实施例中，NTP包括至少一种如上文所论述的经修饰的核苷酸且不包含UTP。
在一些实施例中，单独或与一或多个引导RNA一起的本文所揭示的mRNA可包含在一或多个载体的载体系统中或通过其递送。在一些实施例中，载体中的一种或多种或所有载体可为DNA载体。在一些实施例中，载体中的一种或多种或所有载体可为RNA载体。在一些实施例中，载体中的一种或多种或所有载体可为环状的。在一些实施例中，载体中的一种或多种或所有载体可为线性的。在一些实施例中，载体中的一种或多种或所有载体可包封在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制性示例性载体包括质粒、噬菌粒、黏质粒、人工染色体、袖珍染色体、转座子、病毒载体及表达载体。
非限制性示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助依赖型腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体及反转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体可为AAV载体。在其它实施例中，病毒载体可为慢病毒载体。在一些实施例中，慢病毒可为非整合性的。在一些实施例中，病毒载体可为腺病毒载体。在一些实施例中，腺病毒可为高克隆容量或“无肠(gutless)”腺病毒，其中除5′及3′倒转末端重复序列(ITR)及包装信号(‘I’)之外的所有病毒编码区自病毒中删除以增加其包装容量。在又其它实施例中，病毒载体可为HSV-1载体。在一些实施例中，HSV-1类载体为辅助依赖型，且在其它实施例中，其为非辅助依赖型。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有结构性组分的辅助病毒用于包装，而移除非必需病毒功能的缺失30kb的HSV-1载体不需要辅助病毒。在其它实施例中，病毒载体可为噬菌体T4。在一些实施例中，当清空病毒头时，噬菌体T4可能能够包装任何线性或环状DNA或RNA分子。在其它实施例中，病毒载体可为杆状病毒载体。在又其它实施例中，病毒载体可为反转录病毒载体。在使用具有较小克隆容量的AAV或慢病毒载体的实施例中，可能需要使用多于一个载体以递送如本文所揭示的载体系统的全部组分。例如，一个AAV载体可含有编码Cas蛋白的序列，而第二AAV载体可含有一或多个引导序列。
在一些实施例中，载体可能能够驱动细胞中一或多个编码序列，诸如本文所揭示的mRNA的编码序列的表达。在一些实施例中，细胞可为原核细胞，诸如细菌细胞。在一些实施例中，细胞可为真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施例中，真核细胞可为哺乳动物细胞。在一些实施例中，真核细胞可为啮齿动物细胞。在一些实施例中，真核细胞可为人类细胞。驱动不同类型细胞中的表达的适合启动子为此项技术中已知的。在一些实施例中，启动子可为野生型。在其它实施例中，启动子可经修饰以供较高效或较有效表达。在又其它实施例中，启动子可经截短但仍保留其功能。例如，启动子可具有正常尺寸或适用于将载体适当包装于病毒中的减小的尺寸。
在一些实施例中，载体系统可包含一个编码RNA引导的DNA结合剂的核苷酸序列的复本。在其它实施例中，载体系统可包含多于一个编码RNA引导的DNA结合剂的核苷酸序列的复本。在一些实施例中，编码RNA引导的DNA结合剂的核苷酸序列可以可操作方式连接至少一个转录或转译控制序列。在一些实施例中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作方式连接至少一个启动子。
在一些实施例中，启动子可为组成性、诱导性或组织特异性的。在一些实施例中，启动子可为组成性启动子。非限制性示例性的组成性启动子包括细胞巨大病毒即刻早期启动子(CMV)、猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延长因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能性片段或前述中的任一者的组合。在一些实施例中，启动子可为CMV启动子。在一些实施例中，启动子可为经截短的CMV启动子。在其它实施例中，启动子可为EF1a启动子。在一些实施例中，启动子可为诱导性启动子。非限制性示例性的诱导性启动子包括可通过热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的诱导性启动子。在一些实施例中，诱导性启动子可为具有低基础(非经诱导)表达程度的诱导性启动子，诸如Tet-启动子(Clontech)。
在一些实施例中，启动子可为组织特异性启动子，例如对肝脏中的表达具有特异性的启动子。
载体可进一步包含编码至少一个引导RNA的核苷酸序列。在一些实施例中，载体包含一个引导RNA的复本。在其它实施例中，载体包含多于一个引导RNA的复本。在具有多于一个引导RNA的实施例中，引导RNA可不同以使得其靶向不同靶序列，或可相同以便其靶向相同靶序列。在其中载体包含多于一个引导RNA的一些实施例中，各引导RNA可具有其它不同特性，诸如在与RNA引导的DNA结合剂的核糖核蛋白复合物中的活性或稳定性。在一些实施例中，编码引导RNA的核苷酸序列可以可操作方式连接至少一个转录或转译控制序列，诸如启动子、3′UTR或5′UTR。在一个实施例中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人，RNA.201521：1683-9；Scherer等人，Nucleic Acids Res.2007 35：2620-2628。在一些实施例中，启动子可通过RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包括U6及H1启动子。在一些实施例中，编码引导RNA的核苷酸序列可以可操作方式连接小鼠或人类U6启动子。在其它实施例中，编码引导RNA的核苷酸序列可以可操作方式连接小鼠或人类H1启动子。在具有多于一个引导RNA的实施例中，用于驱动表达的启动子可相同或不同。在一些实施例中，编码引导RNA的crRNA的核苷酸及编码引导RNA的trRNA的核苷酸可提供于相同载体上。在一些实施例中，编码crRNA的核苷酸及编码trRNA的核苷酸可通过同一启动子驱动。在一些实施例中，crRNA及trRNA可转录为单一转录物。例如，crRNA及trRNA可由单一转录物进行处理以形成双分子引导RNA。或者，crRNA及trRNA可转录为单分子引导RNA。在其它实施例中，crRNA及trRNA可通过其处于相同载体上的相应启动子来驱动。在又其它实施例中，crRNA及trRNA可通过不同载体编码。
在一些实施例中，组合物包含载体系统，其中该系统包含多于一个载体。在一些实施例中，载体系统可包含一个单一载体。在其它实施例中，载体系统可包含两个载体。在其它实施例中，载体系统可包含三个载体。当将不同引导RNA用于多任务(multiplexing)时或当使用引导RNA的多个复本时，载体系统可包含多于三个载体。
在一些实施例中，载体系统可包含诱导性启动子以仅在其递送至靶细胞之后开始表达。非限制性示例性的诱导性启动子包括可通过热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的诱导性启动子。在一些实施例中，诱导性启动子可为具有低基础(非经诱导)表达程度的诱导性启动子，诸如Tet-启动子(Clontech)。
在其它实施例中，载体系统可包含组织特异性启动子以仅在其递送至特定组织中之后开始表达。
实例
提供以下实例以说明某些所揭示的实施例且不应理解为以任何方式限制本发明的范畴。
通用试剂及方法.除非另外指明，否则通过活体外转录(IVT)使用线性化质粒DNA模板及T7核糖核酸聚合酶来合成mRNA。转录通常由以下来进行：包含T7启动子的构建体；本文所揭示的转录物序列，诸如SEQ ID NO：43(其包含SEQ ID NO：1且编码SEQ ID NO：4的RNAORF)或SEQ ID NO：48(其包含SEQ ID NO：2且编码SEQ ID NO：5的RNA ORF)及编码于质粒中的聚-A尾(SEQ ID NO：63)。其中测试多个UTR的实验使用相似构建体，不同的处在于使用转录物序列，诸如SEQ ID NO：58及SEQ ID NO：59。通过与XbaI利用以下条件在37℃下培育2小时来线性化含有T7启动子及100nt聚(A/T)区的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)及1×反应缓冲液。通过在65℃下加热反应20分钟来灭活XbaI。使用二氧化硅最大自旋管柱(Epoch Life Sciences)自酶及缓冲盐纯化线性化质粒且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。用于产生经Cas9修饰的mRNA的IVT反应物在37℃下在以下条件下培育4小时：50ng/μL线性化质粒；2mM的GTP、ATP、CTP及UTP(或若指示，代替CTP或UTP的经修饰的三磷酸核苷酸(例如N1-甲基假UTP(Trilink))中的每一者；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反应缓冲液。在4小时培育之后，添加TURBO脱氧核糖核酸酶(ThermoFisher)至0.01U/μL的最终浓度，且再培育反应物30分钟以移除DNA模板。使用MegaClear转录清除试剂盒根据制造商方案(ThermoFisher)自酶及核苷酸纯化Cas9 mRNA。经由沉淀方案(在一些情况下，其继之以基于HPLC的纯化)来纯化mRNA。简言之，在DNA酶消化之后，通过添加0.21×体积的7.5MLiCl溶液且加以混合来沉淀mRNA，且通过离心来集结经沉淀的mRNA。移除上清液后，将mRNA复水。使用乙酸铵及乙醇再次沉淀mRNA。将5M乙酸铵连同2×体积的100％EtOH一起添加至mRNA溶液中，使最终浓度为2M。混合溶液且在-20℃下将其培育15分钟。再次通过离心集结经沉淀的mRNA，移除上清液且将mRNA复水。使用乙酸钠及乙醇沉淀mRNA作为最终步骤。将1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.5)连同2×体积的100％EtOH一起添加至溶液中。混合溶液且在-20℃下将其培育15分钟。再次通过离心集结经沉淀的mRNA，移除上清液，用70％低温乙醇洗涤集结粒且使其风干。将mRNA复水。对于经HPLC纯化的mRNA，在LiCl沉淀及复水之后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见例如Kariko等人Nucleic Acids Research，2011，第39卷，第21期e142)。合并选择用于汇集的溶离份且通过如上文所述的乙酸钠/乙醇沉淀来去盐。
对于所有方法，通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)测定转录物浓度，且通过利用Bioanlayzer(Agilent)进行毛细电泳法来分析转录物。
除非另外指明，否则用来自Charles River Laboratories的CD-1雌性小鼠及史泊格-多利大鼠进行活体内编辑实验。除非另外指明，否则小鼠中的血清TTR含量的分析如下进行。收集血液且如所指示地分离血清。
在适用实例中指明的情况下，亦测量经处理的小鼠中的细胞介素诱导。对于此分析，通过尾静脉切口收集大约50至100μL血液用于血清细胞介素测量。使血液在室温下凝结持续大约2小时，且随后在1000×g下离心10分钟，随后收集血清。测量IL-6、TNF-α、IFN-α及MCP-1的基于Luminex的磁珠多任务分析(Affymetrix ProcartaPlus，目录号Exp040-00000-801)用于收集样本中的细胞介素分析。如制造商方案中所指导地制备试剂盒试剂及标准品。使用所提供的样本稀释剂对小鼠血清进行4倍稀释，且将50μL添加至含有经50μL稀释抗体涂布的磁珠的孔中。将板在室温下培育2小时且随后加以洗涤。稀释生物素抗体(50μL)添加至珠粒且在室温下培育1小时。再次洗涤珠粒，之后将50μL稀释抗生蛋白链菌素-PE添加至各孔中，接着培育30分钟。再次洗涤珠粒且随后悬浮于100μL洗涤缓冲液中且在Bio-Plex 200仪器(Bio-Rad)上读取。使用Bioplex Manager 6.1版分析软件包，通过使用五参数逻辑曲线拟合脱离标准曲线计算的细胞介素浓度分析数据。
除非另外指明，否则使用未经修饰的ATP、GTP、CTP及UTP。除非另外指明，否则所有mRNA均编码有一个核定位信号。
通过使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop仪器，根据制造商方案，将脂质及RNA溶液微流混合或错流混合而形成LNP，如下文所述。除非另外指明，否则LNP含有45％脂质A、9％DSPC、44％胆固醇及2％PEG2k-DMG及4.5的N∶P比。
LNP调配-NanoAssemblr
通常，以不同脂质组分摩尔比将脂质纳米颗粒组分溶解于100％乙醇中。将RNA载荷溶解于25mM柠檬酸盐、100mM NaCl(pH 5.0)中，产生大约0.45mg/mL的RNA载荷浓度。用约4.5或约6的脂质胺与RNA磷酸(N：P)摩尔比，及以重量计呈1∶1的mRNA与gRNA的比调配LNP。
通过使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop仪器，根据制造商的方案，将脂质及RNA溶液微流混合而形成LNP。使用差分流动速率在混合期间维持水相与有机溶剂的2∶1比率。混合之后，收集LNP，在水中稀释(大约1∶1v/v)，在室温下保持1小时，且进一步用水稀释(大约1∶1v/v)，之后进行最终缓冲液更换。用PD-10去盐管柱(GE)来完成将最终缓冲液更换为50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)。必要时，用Amicon100kDa离心过滤器(Millipore)通过离心浓缩调配物。所得混合物随后使用0.2μm无菌过滤器过滤。在进一步使用之前，将最终LNP储存于-80℃下。
LNP调配-错流
对于使用错流技术制备的LNP，通过脂质的乙醇溶液与两个体积的RNA溶液及一个体积的水进行撞击喷流混合来形成LNP。经由混合十字管使脂质的乙醇溶液与两个体积的RNA溶液混合。经由沿线T形管将第四水流与十字管的引出流混合(参见WO2016010840图2.)。将LNP在室温下保持1小时且进一步用水稀释(大约1∶1v/v)。使用切向流过滤在平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上浓缩经稀释的LNP，且随后通过透滤，将其缓冲液更换为50mMTris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)。可替代地，用PD-10去盐管柱(GE)来完成将最终缓冲液更换为TSS。必要时，用Amicon 100kDa离心过滤器(Millipore)通过离心浓缩调配物。所得混合物随后使用0.2μm无菌过滤器过滤。在进一步使用之前，将最终LNP储存于4℃或-80℃下。
调配物分析
使用动态光散射(“DLS”)表征本发明的LNP的多分散性指数(“pdi”)及尺寸。DLS测量由将样本置于光源下而产生的光的散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示总体中(平均粒度周围)粒度的分布，其中完全均一总体的PDI为零。平均粒径及多分散性是通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer仪器来测量。在通过DLS测量之前，在PBS中将LNP样本稀释30×。连同数目平均直径及pdi一起报导Z-平均直径，其为平均粒径的基于强度的量度。Malvern Zetasizer仪器亦用于测量LNP的ζ电位。测量之前，将样本在0.1× PBS，pH 7.4中以1∶17(50μL于800μL中)稀释。
使用基于荧光的分析(ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度及游离RNA。囊封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1×TE缓冲液以适当方式稀释LNP样本以测定总RNA或用1×TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制得调配物的起始RNA溶液制备标准曲线，且稀释于1×TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中。随后将经稀释的染料(根据制造商的说明书)添加至标准品及样本中的每一者中，且使其在不存在光下在室温下培育大约10分钟。使用SpectraMaxM5微定量盘式读取器(Molecular Devices)，伴随分别设定成488nm、515nm及525nm的激发、自动截止及发射波长来读取样本。根据合适标准曲线测定总RNA及游离RNA。
囊封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。可使用相同程序测定基于DNA的载荷组分的囊封效率。对于单股DNA，可使用Oligreen染料，且对于双股DNA，可使用Picogreen染料。
典型地，当制备LNP时，囊封效率＞80％，粒度＜120nm且pdi为＜0.2。
LNP活体内递送
除非另外指出，否则各研究中使用在6至10周龄范围内的CD-1雌性小鼠。对动物称重且根据体重分组以基于组平均体重制备投配溶液。经由侧尾静脉以每只动物0.2mL(每公斤体重大约10mL)的体积投配LNP。在给药后大约6小时观测动物副作用。在投药后二十四小时测量体重，且动物通过在异氟烷麻醉下经由心脏穿刺放血而在各个时间点安乐死。将血液收集至血清分离管中或含有用于如本文所述的血浆的缓冲柠檬酸钠的管中。对于涉及活体内编辑的研究，自来自各动物的中叶或三个独立叶片(例如右中、左中及左外侧叶片)收集肝脏组织用于DNA提取及分析。
针对肝脏编辑通过次世代测序(NGS)及血清TTR含量(资料未示)测量小鼠群组。
甲状腺素转运蛋白(TTR)ELISA分析
收集血液且如所指示地分离血清。使用小鼠前白蛋白(甲状腺素转运蛋白)ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology，目录号OKIA00111)测定总小鼠TTR血清含量。根据制造商方案，使用大鼠特异性ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology目录号OKIA00159)来测量大鼠TTR血清含量。简言之，用试剂盒样本稀释剂将血清连续稀释至最终稀释度为10,000倍。随后将此稀释样本添加至ELISA板且随后根据指示进行分析。
NGS测序
简言之，为了定量地测定基因组中靶位置处的编辑效率，分离基因组DNA且利用深度测序鉴别存在通过基因编辑造成的插入及缺失。
在靶位点(例如TTR)周围设计PCR引物，且扩增相关基因组区。引物序列提供于下文中。根据制造商的方案(Illumina)进行额外PCR以对于测序添加所需化学性质。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类参考基因组(例如hg38)进行比对。将含有读段的所得档案映像至参考基因组(BAM档案)，其中选择与相关目标区重迭的读段且计算野生型读段的数目相对于含有插入、取代或缺失的读段的数目。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“编辑％”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数相比于包括野生型的序列读段的总数。
1.具有经修饰的核苷酸的Cas9 mRNA的活体内表征
用不同的如下表5中所示的经修饰的核苷酸内含物制备包含如SEQ ID NO：5中所阐述的ORF的mRNA。将mRNA与靶向甲状腺素转运蛋白基因(TTR)的引导RNA(G282；SEQ IDNO：42)合并且并入至LNP中。未经修饰的胞苷用于所有LNP中，除了LNP420。
表5.用于活体内研究的LNP417至LNP421
以0.5mg/kg(mpk)或1mpk剂量向小鼠施用LNP417至LNP421。给药后4小时(hpd)测量细胞介素(IFN α、IL-6、TNF α及MCP-1)诱导。结果示于图1A至图1D中。
在投药之后7天进行尸体剖检时，收集血清及肝脏分别用于血清TTR测量及编辑功效的分析。结果示于图2A至图2B中。
观测到，使用假尿苷及5-甲基CTP几乎完全消除细胞介素诱导。使用呈60％(LNP421)或100％(LNP417)的N1-甲基假尿苷亦会引起比未经修饰的Cas9 mRNA要少的细胞介素诱导，且60％N1-甲基假尿苷下的减少程度与100％类似。
所有经修饰的Cas9构建体在降低血清TTR方面有相似效应，且可能归因于增加的稳定性，其比未经修饰的构建体更有效。根据肝脏编辑数据，使用假尿苷及N1-甲基假尿苷的构建体同样有效。具有假尿苷及5-甲基胞苷的构建体的效应明显要比用单独假尿苷的构建体低。具有60％N1-甲基假尿苷的构建体的效应可能要比具有100％N1-甲基假尿苷的构建体略低。
2.编码Cas9的经修饰的mRNA的研发及活体外表征
Cas9序列(SEQ ID NO：1)经设计以改善肝脏表达且将尿苷减至最少。基于具有最少可能的尿苷含量及肝脏中对应tRNA的最大表达来选择密码子。对于肝脏tRNA表达，参见Dittmar KA，PLos Genetics 2(12)：e221(2006)。降低Cas9 mRNA的尿苷含量意欲降低对mRNA的先天性免疫反应及/或提供其它益处。表6显示基于tRNA含量的最佳肝脏密码子及具有最少可能数目的尿苷的密码子。最小尿苷密码子与最佳肝脏密码子不同的情况呈粗斜体形式。表格亦显示化脓链球菌Cas9的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中的各氨基酸的数目。
表6：密码子最佳化参数
在天冬氨酸及丝氨酸的情况下，对应于表达最高的tRNA的肝脏密码子包含胸苷，其将在对应mRNA中转录为尿苷。针对天冬氨酸及丝氨酸选择最小尿苷密码子(分别为GAC及AGC)。Cas9 ORF序列呈4140nt长，含有528个U(12.8％尿苷含量)，且在ORF中避免具有3个或多于3个连续尿苷的任何连接。序列中存在63种UU二核苷酸的情况(126/4140＝3％尿苷二核苷酸含量)。SEQ ID NO：2提供含有19.6％尿苷作为RNA ORF的替代Cas9序列。
SEQ ID NO：3提供由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2两者编码的Cas9的氨基酸序列作为未改变经编码的氨基酸序列的Cas9 ORF的新型设计。SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：1的ORF的RNA形式。SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：2的ORF的RNA形式。
亦评估经修饰的核苷酸的作用。用于转录Cas9转录的经修饰的UTP包括N1-甲基-假UTP及5-甲氧基-UTP。
N1-甲基-假UTP的结构为：
5-甲氧基-UTP的结构为：
针对包含SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5的ORF的mRNA，测定活体外转录(IVT)产量。两者均编码核定位信号(NLS)。在未经修饰的UTP或N1-甲基-假UTP任一者存在下，转录包含SEQ ID NO：5的序列。在未经修饰的UTP存在下，转录包含SEQ ID NO：4的序列。亦在渐增的5-甲氧基-UTP百分比下进行IVT，如图3的X轴上所示，其显示以分光光度法测定的此等构建体中的每一者的产量。
此等结果显示，当mRNA的5-甲氧基尿苷含量增加时，产量略微降低，但mRNA产量在所有条件下为可接受的。因此，可针对两个Cas9序列，经由所测试的条件产生具有可接受产量的Cas9 mRNA。
使用曲线下面积(AUC)分析法，依利用Agilent Bioanalyzer 2100获得的mRNA毛细电泳法(CE)迹线，计算活体外转录的mRNA的纯度(图4)。使用未经修饰的UTP所生成SEQID NO：5Cas9 mRNA的纯度通常会随5-甲氧基-UTP取代增加而提高，而用N1-甲基-假UTP制得的相同构建体则受增加的5-甲氧基-UTP取代的影响较小。
用未经修饰的UTP制得的SEQ ID NO：4Cas9似乎相对不受5-甲氧基-UTP取代的影响，在0％与20％之间的5-甲氧基-UTP取代度下，略微提高纯度。
不同mRNA的免疫原性的评估法是采用墨点分析法，使用抗dsRNA抗体作为双股(ds)mRNA特征的量度，其是潜在免疫原性的指标(图5A至图5D)。图5B及图5D使用包含SEQID NO：5的Cas9 mRNA序列且图5C使用包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列。对于使用未经修饰的UTP所生成的构建体(图5B至图5C)，随着5-甲氧基-UTP含量增加，双股型通常会明显降低。使用N1-甲基-假UTP所生成的mRNA(图5D)显示与抗dsRNA抗体的结合性下降，但与抗体的结合性亦呈现随5-甲氧基-UTP含量增加而降低。
随后由mRNA与靶向甲状腺素转运蛋白(TTR)的引导序列(G209；SEQ ID NO：64)一起转染至Neuro 2A细胞中，且测量编辑百分比，于活体外评估编辑效率。
如图6A中所示，评估由包含具有N1-甲基-假UTP及2个核定位序列及HA标签的SEQID NO：2的构建体转录的Cas9 mRNA(由最左边括号指示的群组)、由包含具有UTP及2个核定位序列及HA标签转录的SEQ ID NO：2的构建体转录的Cas9 mRNA(通过中间括号指示的组)及由包含具有UTP的SEQ ID NO：1的构建体转录的Cas9 mRNA(由最右边括号指示的群组)。对于各组，针对呈如X轴上所指示的0％至100％的增加量的5-甲氧基-UTP的转录来评定0.1ng至100ng的mRNA的不同浓度。未处理细胞未显示可测量的编辑。图6B显示表示为EC50值(ng)的编辑效率数据。
转录期间增加的5-甲氧基-UTP含量呈现对两个SEQ ID NO：5条件下的编辑效率具有不利作用，亦含有N1-甲基-假UTP的转录物要比含UTP的转录物稳健(例如在60％及80％5-甲氧基-UTP下)。相比之下，包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列的编辑效率对增加的5-甲氧基-UTP含量显示很小(若存在)效应。因此，根据此系统，包含SEQ ID NO：4mRNA的Cas9mRNA序列可伴随至多100％5-甲氧基-尿苷提供与含有未经修饰的尿苷的形式类似的编辑效率。
3.编码Cas9的mRNA的活体内表征
评估包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列对包含SEQ ID NO：5的Cas9 mRNA序列的活体内功效及在未经修饰的UTP、N1-甲基-假UTP、40％5-甲氧基-UTP+60％未经修饰的UTP或100％5-甲氧基-UTP存在下包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列的转录的效应。表7提供关于此等活体内研究组的信息。以脂质纳米颗粒(LNP)调配物形式施用各mRNA。
表7.用于活体内研究的LNP720至LNP724
活体内研究设计如下。CD-1雌性小鼠是来自Charles River(每组n＝5)。以每公斤1mg(mpk)或0.5mpk连同针对甲状腺素转运蛋白(TTR)的单一引导RNA(SEQ ID NO：42)一起对动物进行静脉内(i.v.)投配。在给药后4小时(hpd)针对MCP-1、IL-6、IFN-α及TNF-α的细胞介素分析对接受1mpk剂量的动物进行抽血。24hpd时针对总体健康对动物加以评定。在给药后7天进行尸体剖检，同时针对血清TTR分析收集血液，且针对次世代测序(NGS)编辑分析收集肝脏。
4hpd时收集来自以1mpk投配的动物的血清，且制备血清且根据制造商说明书运作小鼠4丛分析(Thermo Fisher)。针对MCP-1、IL-6、IFN-α及TNF-α的血清含量的结果展现于图7A至图7D中。此等结果表明，用经修饰的UTP制备的包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列(LNP721、LNP723或LNP724)显示相对较低含量的细胞介素产量。
亦在给药后7天评定血清中的TTR含量，如图8A及表8中所示。TSS(即5％蔗糖、45mMNaC1、50mM Tris(pH 7.5))样本指示未进行LNP处理的TTR含量。所有LNP调配物均描述于表7中。
表8：投配LNP720至LNP724之后的血清TTR含量的结果
表9及图8B提供关于如由次世代测序(NGS)测量的肝脏中TTR的编辑百分比的结果。
表9：呈投配LNP720至LNP724之后的肝脏中TTR的编辑百分比的结果
与TSS对照样本相比，包含Cas9的所有LNP均显示血清TTR含量降低及高于基线的编辑。在比较均用N1-甲基-假UTP转录的标准Cas9 mRNA(SEQ ID NO：5，LNP720)与包含SEQID NO：4mRNA的Cas9 mRNA序列(SEQ ID NO：4，LNP721)时，包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列显示经改良的活性(较低TTR及较高编辑％)。对于包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列，活性在N1-甲基-假UTP情况下为最高的，且伴随40％5-甲氧基-UTP+60％未经修饰的UTP的转录(LNP723)产生的活性要比100％5-甲氧基-UTP(LNP724)高。
作为脱靶效应的量度，亦测量用1mpk上文所述的LNP调配物投配的动物的脾脏中的编辑，如图7及表10中所示。对于所有LNP调配物，无论在Cas9或经最佳化的Cas9下，均在肝脏中看到大于20倍的较高编辑(图6A)。
表10：关于投配1mpk包含sgRNA及不同Cas9的LNP之后的脾脏中的TTR的编辑百分比的结果
4.编码Cas9的mRNA在初级小鼠肝细胞中的功效的表征
活体外评估不同LNP在初级小鼠肝细胞(PMH)中的功效。
在100ng下，表5中所述的所有LNP均支持TTR的编辑，如图10中所示。如所预期，未处理的细胞未显示可测量的TTR的编辑。
表11显示基于图10中展现的资料计算的各LNP的EC50值。
表11：针对PMH中TTR的基因编辑的经估算的EC50值(ng)
5.含Cas9 mRNA的LNP在大鼠中的活体内表征
在大鼠中评估包含SEQ ID NO：4的Cas9 mRNA序列对包含SEQ ID NO：5的Cas9mRNA序列的活体内功效。表12提供关于此等活体内研究组的信息。标准Cas9 mRNA是指SEQID NO：5，而缺乏U(U-dep)的mRNA是指SEQ ID NO：4。各mRNA是以脂质纳米颗粒(LNP)调配物形式施用。
LNP716(标准Cas9)及LNP738(缺乏U)LNP调配物的详情显示于表12中。
表12：LNP调配物表征
PDI＝多分散性指数
N∶P＝N∶P比，如上文所述
如先前所述测量血清TTR。
在大鼠中在2mpk及5mpk的剂量下将具有SEQ ID NO：5的ORF的Cas9 mRNA与具有SEQ ID NO：4的ORF的Cas9 mRNA(图11A至图11B)进行比较，如图11A及表13中所示。此等资料表明，在2mpk及5mpk两者下，与SEQ ID NO：5的Cas9 ORF相比，SEQ ID NO：4的Cas9 ORF引起血清TTR较显著降低。图11B及表13展示呈相对于经TSS处理的对照的值的百分比形式的此等结果。5mpk剂量的U-dep Cas9 LNP引起血清TTR含量降低大于90％。
表13：用LNP716及LNP738 Cas9调配物投配之后的血清TTR含量
KD％＝与TSS样本的平均血清浓度相比的基因减弱％
图10及表14显示用LNP716(标准)及LNP738(U-dep)调配物以2mpk及5mpk投配之后的TTR的肝脏编辑。尽管TSS显示可忽略的编辑，但LNP716及LNP738调配物两者均引起TTR的肝脏编辑。在比较调配物中，包含U缺乏的LNP738调配物引起的编辑为包含标准Cas9的LNP716调配物的两倍。
表14：用缺乏U及标准Cas9调配物投配之后的TTR的肝脏编辑
此等数据表明，缺乏U的Cas9 mRNA显著地改良肝脏中TTR的编辑程度。
6.具有不同UTR的mRNA的表征
将如表15中所指示的具有UTR及+/-血球凝集素(HA)标签的编码Cas9的mRNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用Nano AssemblrTM组配LNP，其含有45％脂质A、9％DSPC、44％胆固醇及2％PEG2k-DMG，且使用Amicon PD 10过滤器纯化，且以0.5mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.5或1.0mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后7天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。
表15.LNP662至LNP669 mRNA描述及血清TTR及肝脏编辑分析的结果
除非另外指明，否则mRNA中的UTR为HSD/Alb。HBA：人类α血球蛋白；HBB：人类β血球蛋白(HBB)；XBG：爪蟾β血球蛋白(XBG)。除非另外指明，否则mRNA含有100％N1-甲基假尿苷代替尿苷。
图13A至图13E显示血清TTR(在图13A中显示为μg/ml，且在图13B中显示为TSS的％)；所有LNP662至LNP669的肝脏编辑(图13C)；其中仅UTR变化的LNP663至LNP666的肝脏编辑(图13D)；及其中仅mRNA序列及UTP修饰变化的LNP662及LNP667至LNP669的肝脏编辑(图13E)。
人类白蛋白、人类α血球蛋白、人类β血球蛋白及爪蟾β血球蛋白UTR大致同样有效；人类α血球蛋白的值可略微较低但并不明确差值是否明显。
含有较少尿苷的SEQ ID NO：4的ORF增加肝脏中的编辑的量。用N1-甲基假尿苷制得的Cas9 mRNA要比用未经修饰的尿苷制得的Cas9 mRNA有效。
7.使用不同引导物：Cas9比的活体外及活体内编辑
将包含根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的ORF的mRNA与靶向TTR的引导RNA以如表16中所示的不同引导物：Cas9 mRNA重量比调配为LNP。通过如上文所指示的IVT合成用代替尿苷三磷酸的N1-甲基假尿苷三磷酸、HSD 5′UTR、人类白蛋白3′UTR及聚-A尾制得Cas9mRNA。
表16.用于活体外及活体内研究的LNP815至LNP824
LNP Cas9 SEQ ID NO RNA比(引导物：Cas9)
LNP815 5 2∶1
LNP816 5 1∶1
LNP817 5 1∶2
LNP818 5 1∶4
LNP819 5 1∶8
LNP820 4 2∶1
LNP821 4 1∶1
LNP822 4 1∶2
LNP823 4 1∶4
LNP824 4 1∶8
将初级小鼠肝细胞(PMH)涂铺于补充有3％食蟹猕猴血清的培养基中持续24小时，且随后用表16中所示的0.3、1、3或10ng LNP处理。48小时之后裂解细胞，且通过NGS测定编辑％。结果显示在图14及表17中。
表17.PMH中的活体外编辑
对于活体内表征，以0.2、0.5或1mpk向小鼠施用LNP(每组n＝5)。在给药后8天，将动物处死，收集血液及肝脏以及脾脏，且测量血清TTR、肝脏编辑及脾脏编辑。血清TTR结果显示在图15A至图15B及表18中。肝脏编辑结果显示在图16A至图16B及表19中。脾脏编辑结果显示在图17A至图17B及表20中。用媒剂(转化及储存溶液；“TSS”)投配阴性对照小鼠。使用LNP815至LNP819的实验及使用LNP820至LNP824的实验运作独立对照。
表18.用LNP815至LNP824投配之后的血清TTR含量
KD％提供相对于TSS对照的TTR含量的基因减弱％。
表19.用LNP815至LNP824投配之后的肝脏编辑
LNP820至LNP824通常产生大于或约等于相同比率下的其LNP815至LNP819对应物的肝脏编辑结果。LNP820至LNP824在0.5及1mpk下测试的比率范围内及0.2mpk下2∶1至1∶4的比率下显示恒定效能。
表20.用LNP815至LNP824投配之后的脾脏编辑
用各调配物以3mpk投配额外小鼠组(n＝2)，且在6hpd处死以用于测定肝脏中的蛋白质表达。来自用3mpk 1∶1及1∶4比率调配物(LNP816、LNP818、LNP821及LNP823)处理的小鼠的肝脏蛋白质的蛋白质印迹法展示在图18中。针对蛋白质印迹法的初级Ab为呈1∶5,000的ImmunopreciseTM兔抗Cas9，且二级Ab为呈1∶12,500的DylightTM山羊抗兔。Cas9蛋白质表达在使用具有SEQ ID NO：4的ORF的mRNA的LNP中明显较高。
8.经修饰的核苷酸的影响的表征
将编码Cas9且含有如表21中所指示的经修饰的核苷酸的mRNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。LNP1034含有自Trilink Biotechnologies有限责任公司市售获得的Cas9 mRNA且包括CleanCapTM(其中7-甲基鸟嘌呤帽结构之后的第一核苷酸经2′-O-甲基化的Cap1结构)。LNP1027至LNP1033含有包含根据SEQ ID NO：4的ORF的mRNA及ARCA(抗反向帽结构类似物)Cap0。使用Nano AssemblrTM组配LNP，其含有45％脂质A、9％DSPC、44％胆固醇及2％PEG2k-DMG，使用Amicon PD10过滤器纯化，且悬浮于TSS缓冲液中。LNP中的N∶P(氮与磷酸)比为4.5且调配物的RNA浓度为0.4mg/ml。以0.1或0.3mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后7天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。
表21.用于活体内研究的LNP1027至LNP1034
对于其中列出经修饰的尿苷及/或胞苷核苷酸呈25％或50％的LNP，尿苷及/或胞苷的剩余部分分别为未经修饰的。
血清TTR结果展示于图19A至图19B(血清TTR结果分别以μg/mL及TSS对照的％表示)；图20(肝脏编辑)；及表22中。
表22.LNP1027至LNP1034的血清TTR及肝脏编辑结果
LNP1027的含N1-甲基假尿苷的mRNA具有比LNP1032的含假尿苷的mRNA略微较高的编辑效率。含有假尿苷及5-甲基胞嘧啶核苷两者的mRNA(LNP1033)的效能显著降低。含有25％5-碘尿苷的mRNA显示与含N1-甲基假尿苷的mRNA相等的编辑效率。在50％5-碘尿苷下，效能有所降低。来自Trilink的5-甲氧基尿苷mRNA显示较低活性。
9.大鼠中具有不同UTR的mRNA的影响的表征
此研究评估经ARCA加帽结构的具有HBB(人类β-血球蛋白)5′及3′UTR；XBG(爪蟾β-血球蛋白)5′及3′UTR；或具有人类HSD17B4(HSD)5′UTR及白蛋白(ALB)3′UTR的Cas9 mRNA在大鼠中的活体内功效。
使用上文所述的错流方法制备含有在LNP中呈1∶1摩尔比的靶向大鼠TTR基因的引导RNA(G534；SEQ ID NO：72)及Cas9 mRNA的调配物且将其在VivaFlowTM 50膜上过滤。LNP含有呈45∶9∶43∶3摩尔比的阳离子型脂质(脂质A)、胆固醇、DSPC及PEG2k-DMG且具有6.0的N∶P比。以1mpk及0.3mpk投配调配物。所有大鼠均为来自Charles River的史泊格多利雌性，每组n＝5。尸体剖检(给药后7天)时，针对TTR分析收集血清且针对编辑分析收集肝脏。在LNP1058中，mRNA含有HBB UTR。在LNP1059中，mRNA含有XBG UTR。在LNP1060中，mRNA分别含有HSD及ALB 5′及3′UTR。在所有情况下，mRNA编码序列是根据SEQ ID NO：4。
肝脏编辑及血清TTR结果展示于图21A至图21C及表23中。
表23.大鼠中使用LNP1058至LNP1060的肝脏编辑及血清TTR结果.
结果表明，LNP1058至LNP1060中所有经测试的mRNA均能够支持编辑。伴随LNP1059中含有XBG UTR的mRNA看到最高编辑程度及血清TTR的最显著降低。
10.RNA载荷：mRNA及gRNA共调配
此研究评估不同gRNA与mRNA比在小鼠中的活体内功效。通过如实例1中所指示的IVT合成用代替尿苷三磷酸的N1-甲基假尿苷三磷酸来制得经CleanCapTM加帽结构的具有SEQ ID NO：4的ORF、HSD 5′UTR、人类白蛋白3′UTR、Kozak序列及聚-A尾的Cas9 mRNA。
由所述mRNA及如实例2中所述的sg282(SEQ ID NO：42；G282)与脂质A、胆固醇、DSPC及PEG2k-DMG以55∶33∶9∶3摩尔比且以6的N∶P比制备LNP调配物。调配物的gRNA∶Cas9mRNA重量比如表24中所示。
表24.LNP1110至LNP1116的表征.
对于活体内表征，以每公斤0.1mg总RNA(引导RNA毫克数+mRNA毫克数)向小鼠施用以上LNP(每组n＝5)。在给药后7至9天，将动物处死，收集血液及肝脏，且如上文所述测量血清TTR及肝脏编辑。血清TTR及肝脏编辑结果展示于图22A及图22B中。用TSS媒剂投配阴性对照小鼠。
此外，以每公斤0.05mg mRNA的恒定mRNA剂量，同时将gRNA剂量自0.06mg/kg变为0.4mg/kg来向小鼠施用以上LNP(每组n＝5)。在给药后7至9天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。血清TTR及肝脏编辑结果展示于图22C及图22D中。用TSS媒剂投配阴性对照小鼠。
11.密码子方案的表征
设计使用不同密码子方案的Cas9序列以针对经改良的蛋白质表达进行测试。各序列经设计以使用独特密码子组编码SEQ ID No：3的Cas9氨基酸。在各开放阅读框架序列中，使用单一密码子编码各氨基酸。基于密码子在基于NCBI-GenBank Flat File Release160.0(Nakamura等人(2000)Nucl.Acids Res.28，292；Benson等人(2006)Nucleic AcidsRes.34(数据库期)，D16-20)的智人中的整个蛋白质编码基因中的出现频率及特定核苷酸在密码子中的丰度来改变序列。基于Table 4中所示的密码子方案，构筑编码SEQ ID NO：3的Cas9蛋白质的七个不同Cas9开放阅读框架(SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：108至SEQ ID NO：112)。将此等并入至亦含有HSD 5′UTR(SEQ ID NO：41)、白蛋白3′UTR、T7启动子及聚A尾的构建体中。含有白蛋白3′UTR及聚A尾的示例性序列为SEQ ID NO：53，其中3′UTR及聚A尾在HSD 5′UTR及SEQ ID NO：52的ORF之后。使用如由Presnyak及同事(2015)所述的基于用于改良的mRNA半衰期的最佳密码子的密码子流程编码SEQ ID NO：3的Cas9蛋白质的以类似方式构成的构建体(SEQ ID NO：107，使用表4的长半衰期密码子组)亦包括于此等评估中。
通过IVT产生各构建体的信使RNA。用800ng各Cas9 mRNA使用LipofectamineTMMessengerMAXTM转染剂(ThermoFisher)转染HepG2细胞。转染后六小时，通过冻融裂解细胞且通过离心清除。通过ELISA分析测定Cas9蛋白质含量。简言之，通过二辛可宁酸(蛋白)含量测定法测定总蛋白质浓度。根据制造商方案使用Cas9小鼠抗体(Origene，目录号CF811179)作为捕捉抗体且使用Cas9(7A9-3A3)小鼠mAb(Cell Signaling Technology，目录号14697)作为侦测抗体来制备MSD GOLD 96孔抗生蛋白链菌素SECTOR板(Meso ScaleDiagnostics，目录号L15SA-1)。在具有无EDTA的1×HaltTM蛋白酶抑制剂混合液(ThermoFisher，目录号78437)的稀释剂39中的呈0、0.12、0.49、1.95、7.81、31.25、125及500ng/mL的Cas9蛋白质用作校正标准。使用Meso Quickplex SQ120仪器(Meso ScaleDiscovery)读取ELISA板且用Discovery Workbench 4.0软件包(Meso Scale Discovery)分析资料。
通过将mRNA以及靶向甲状腺素转运蛋白(TTR)的引导物(G502；SEQ ID NO：70)转染于HepG2细胞中且测量编辑百分比来活体外评定编辑效率。在3ng至100ng的mRNA浓度下评定包含表25中所指示的SEQ ID No的Cas9 mRNA。未处理细胞未显示可测量的编辑。图23至图24及表25显示不同密码子组对Cas9蛋白质表达及活体外编辑的影响。
表25.具有不同密码子组的ORF的活体外编辑及表达.
为了测定密码子方案的活体内有效性，当使用表4中所述的密码子方案自编码Cas9的mRNA活体内表达时，测量Cas9蛋白质表达。将如表26中所指示的信使RNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用错流程序组配LNP，且其含有分别呈50∶38∶9∶3摩尔比的50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG，且具有6.0的N∶P比。使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)纯化LNP，且以0.32mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以1mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后3小时，将动物处死，收集肝脏且测量肝脏中的Cas9表达。使用上文所述的Meso Scale Discovery ELISA分析测量肝脏中的Cas9蛋白质表达。通过珠粒研磨机在具有1×Complete蛋白酶抑制剂片剂(Roche，目录号11836170001)的RIPA缓冲液(Boston Bioproducts BP-115)中将大约40mg肝脏组织均质化。图25及表26显示肝脏中的Cas9表达结果。低A及low A/U密码子方案(SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：112的ORF)的mRNA显示所测试的ORF的最高Cas9表达。阴性对照及SEQ ID NO：54的ORF的Cas9蛋白质表达小于定量下限(LLOQ)。
表26
ORF 平均Cas9(每公克肝脏的纳克数) 标准差
TSS ＜LLOQ 0.0
SEQ ID No：4 1644 1172
SEQ ID NO：52 1562 951
SEQ ID NO：54 ＜LLOQ 0.0
SEQ ID NO：111 2630 730
SEQ ID NO：112 2134 362
为了测定密码子方案的活体内有效性，自使用不同密码子方案的编码Cas9的mRNA活体内测量基因组编辑。将如表27中所指示的信使RNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ IDNO：42)调配为LNP。使用错流程序组配LNP，且其含有分别呈50∶38∶9∶3摩尔比的50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG，且具有6.0的N∶P比。使用Amicon PD-10过滤器(GEHealthcare)纯化LNP，且以0.05mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5，不同的处在于用SEQ ID NO：52处理的组，n＝4)。在给药后6天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。表27及图26显示活体内编辑结果。表27及图27A至图27B显示血清TTR含量。
表27
为了测定不同mRNA浓度下的密码子方案的功效，进行活体内剂量反应实验。将如表28中所指示的信使RNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用错流方法组配LNP且其含有50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG。使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)纯化LNP，且以0.7mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.03、0.1或0.3mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后7天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。表28及图28显示活体内编辑结果。表28及图29A至图29B显示血清TTR含量。
表28
为了测定具有不同UTR的密码子方案的有效性，在施用编码Cas9的mRNA后活体内测量基因组编辑。将如表29中所指示的信使RNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用错流程序组配LNP，且其含有分别呈50：38：9：3摩尔比的50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG，且具有6.0的N∶P比。使用Amicon PD-10过滤器(GEHealthcare)纯化LNP，且以0.05mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5；针对SEQ ID NO：43编辑，n＝4)。在给药后6天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。表29及图30A至图30B显示活体内编辑(B)及血清TTR结果(A)。
表29
mRNA构建体 编辑％ 标准差 血清TTR(μg/ml) 标准差
TSS 0 0 1274 214
SEQ ID No：43 28 4 630 152
SEQ ID No：176 35 8 482 138
SEQ ID No：177 37 9 316 143
SEQ ID No：178 42 6 524 192
12.加帽结构的影响的表征
将编码Cas9且含有如表30中所指示的帽结构、UTR及聚A尾的mRNA与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用错流程序组配LNP，其含有分别呈50∶38∶9∶3摩尔比的50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG，且具有6.0的N∶P比。使用AmiconPD-10过滤器(GE Healthcare)纯化LNP，且以0.06mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1或0.3mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后7天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。
图31及表30显示0.1mpk剂量下，具有Cap 1的mRNA具有比具有Cap 0的mRNA高约10％的平均编辑。在0.3mpk剂量下，具有XBG UTR的mRNA具有比具有HSD UTR的mRNA略微较高的平均编辑，除酶cap 0外。血清TTR结果显示于图32(血清TTR结果分别以μg/mL及TSS对照的％表示)；图31(肝脏编辑)；及表30中。
表30.针对活体内加帽结构研究的血清TTR及肝脏编辑结果
13.核定位信号的表征
设计且测试使用若干核定位信号(NLS)的Cas9序列以测定功效。十一种不同强度的非典型NLS是选自由Kosugi等人(2009)Journal of Biological Chemistry，284(1)，478-485所鉴别的NLS，如表31中所示。将此等氨基酸序列添加至Cas9氨基酸序列(SEQ IDNO：13)的羧基端。对照序列编码SEQ ID No.4。
表31
将具有如表31中所指示的NLS的编码Cas9的mRNA与与靶向TTR的引导RNA(G282；SEQ ID NO：42)调配为LNP。使用错流程序组配LNP，且其含有分别呈50∶38∶9∶3摩尔比的50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG，且具有6.0的N∶P比。使用Amicon PD-10过滤器(GE Healthcare)纯化LNP，且以0.07mg/ml的浓度(LNP浓度)使用。以0.1mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后7天，将动物处死，收集血液及肝脏，且测量血清TTR及肝脏编辑。结果展示在表32及图33中。对于对应于表32中列出的NLS的SEQ ID NO，参见表31。
表32-伴随不同核定位信号的肝脏编辑
NLS5显示相比于SV40 NLS的统计学上显著的增加(单向ANOVA，p＝0.006)。NLS4及NLS8各展现与SV40 NLS相比编辑增加的可能趋势，但在此实验中差距在统计学上并不显著。图34A至图34B显示施用核定位信号变异体后的血清TTR含量。Kosugi等人(2009)(见上文)，针对核定位程度的NLS的评级活性(表32中的”“NLS强度”)，其中10为完全在核内，且1为弥漫在整个细胞中。如此文献中评级的NLS活性与编辑效率正相关，如图35中所示。
14.UTR的影响的活体外表征
表33及图36显示来自具有不同5′UTR的转录物的Cas9表达。所有构建体均使用3′人类白蛋白UTR。通过IVT产生各构建体的信使RNA。使用线性化质粒产生SEQ ID No：179的信使RNA，且使用PCR产物作为模板生成所有其它者。用100ng各Cas9 mRNA及25nM最终浓度的靶向甲状腺素转运蛋白(TTR)的引导物(G502；SEQ ID NO：70)使用LipofectamineTMMessengerMAXTM转染剂(ThermoFisher)转染HepG2细胞。转染后六小时通过Nano-HiBiT裂解分析(Promega)裂解细胞。通过使用Nano-Nano-Glo HiBiT胞外侦测系统(Promega，目录号N2420)测定Cas9蛋白质含量。表33及图36显示来自具有不同5′UTR的转录物的Cas9表达。
表33：Cas9表达
15.至非人类灵长类动物的LNP递送
用如上文所述使用X-flow/TFF方法制备的LNP调配物进行三项研究。特定莫耳量及载荷提供于表34至表36中。含有Cas9 mRNA及引导RNA(gRNA)的各调配物具有以重量计1∶1的mRNA∶gRNA比。在表格中指示LNP的剂量(以mg/kg为单位，总RNA含量)、给药途径及动物是否接受地塞米松的预处理。对于接受地塞米松(Dex)预处理的动物，在施用LNP或媒剂之前1小时通过IV快速注射以2mg/kg施用Dex。
对于血液化学分析，针对所测量的各因素在如表格中所指示的时间对动物进行抽血。在处理前及处理后的NHP中测量细胞介素诱导。自受约束的清醒动物的外周静脉将最少0.5mL的全血收集于4ml血清分离管中。在室温下使血液结块最少30分钟，之后以2000×g离心15分钟。将血清等分于2个120μL聚丙烯微管中，且在分析之前各储存于-60℃至-86℃下。使用来自Meso Scale Discovery(MSD)的非人类灵长类动物U-Plex细胞介素定制试剂盒来加以分析。分析中包括以下参数：INF-g、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MCP-1及TNF-α，其中聚焦于IL-6及MCP-1。如制造商方案中所指导地制备试剂盒试剂及标准品。以纯形式使用NHP血清。将板运作于MSD Sector成像仪6000，伴随用MSD Discoverywork bench软件版本4012进行分析。
在处理前及处理后动物中通过酶免疫分析测量补体含量。自受约束的清醒动物的外周静脉将0.5mL体积的全血收集于0.5mL k2EDTA管中。以2000×g离心血液15分钟。将血浆等分于2个120μL聚丙烯微管中，且在分析之前各储存于-60℃至-86℃下。使用QuidelMicroVue Complement Plus EIA试剂盒(C3a-Cat号A031)或(Bb-Cat号A027)来加以分析。如制造商方案中所指导地制备试剂盒试剂及标准品。将板运作于450nm下的光密度下的MSDSector成像仪6000上。使用4参数曲线拟合分析结果。
细胞介素诱导及补体活化的数据提供于下表中。“BLQ”意谓小于定量限值。
表34，研究1
表35，研究2
表36，研究3
表37.根据研究1的IL-6测量
处理组 采血前 6小时 24小时
(1)TSS(媒剂) 5.71±2.70 29.1±20.37 7.05±3.49
(2)LNP699G502 9.73±8.34 1296.41±664.71 5.43±7.68
(3)LNP688G506 16.83±4.08 1749.47±1727.22 38.57±39.39
(4)LNP689G509 18.11±11.51 1353.49±766.66 32.42±18.40
(5)LNP690G510 13.95±1.85 11838±17161.74 90.07±96.02
表38.根据研究1的MCP-1测量
处理组 采血前 6小时 24小时
(1)TSS(媒剂) 810.49±178.27 1351.16±397.31 745.25±56.49
(2)LNP699G502 842.31±350.65 19298.49±11981.14 2092.89±171.21
(3)LNP688G506 1190.79±383.64 13500.17±12691.60 1414.71±422.43
(4)LNP689G509 838.63±284.42 14427.7±8715.48 1590±813.23
(5)LNP690G510 785.32±108.97 52557.24±48034.68 6319.77±983.37
表39.根据研究1的补体C3a测量
处理组 采血前 6小时 第7天
(1)TSS(媒剂) 23.9±11.95 25.51±14.79 30.67±18.36
(2)LNP699 G502 32.36±11.29 94.33±58.45 38.50±12.69
(3)LNP688 G506 22.30±1.73 127.00±22.34 37.80±6.86
(4)LNP689 G509 35.83±21.94 174.00±44.51 50.83±21.92
(5)LNP690 G510 36.30±8.21 163.00±40.60 42.50±12.44
表40.根据研究1的补体bb测量
表41.根据研究2的IL-6测量
处理组 采血前 90分钟 6小时 24小时 第7天
(1)TSS(媒剂) 1.77 11.46 4.2 2.76 3.01
(2)TSS(媒剂) 5.23 18.11 20.36 13.2 6.36
(3)LNP898G502 2.02 1305.75 1138.22 383.32 16.02
(4)LNP898G502 2.34 37.19 91.59 14.11 3.07
(5)LNP897G502 2.1 55.79 6.89 2.26 2.01
(6)LNP897G502 6.8 10.1 44.72 5.4 2.01
(7)LNP897G502 1.97 44.87 32.61 2.97 1.11
(8)LNP897G502 3.14 37.68 73.41 8.58 2.22
(9)LNP916GFP 1.6 BLQ 95.32 27.58 BLQ
(10)LNP916GFP 2.43 BLQ 883.01 66.71 BLQ
表42.根据研究2的MCP-1测量
表43.根据研究2的补体C3a测量
表44.根据研究2的补体bb测量
处理组 采血前 90分钟 6小时 24小时 第7天
(1)TSS(媒剂) 0.087 0.096 0.048 0.033 0.038
(2)TSS(媒剂) 0.369 0.311 0.146 0.1 0.106
(3)LNP898G502 0.087 0.953 0.647 0.277 0.065
(4)LNP898G502 0.099 0.262 0.123 0.049 0.044
(5)LNP897G502 0.067 0.479 0.209 0.036 0.036
(6)LNP897G502 0.141 0.433 0.34 0.11 0.074
(7)LNP897G502 0.1 0.345 0.396 0.096 0.127
(8)LNP897G502 0.261 0.458 0.409 0.244 0.313
(9)LNP916GFP 0.149 BLQ 0.714 0.382 BLQ
(10)LNP916GFP 0.117 BLQ 0.752 0.723 BLQ
表45.根据研究3的IL-6测量
处理组 采血前 90分钟 6小时 24小时 第7天
(1)TSS 1.89±0.97 2.56±1.41 0.90±0.71 BLQ 0.08
(2)LNP1021G502 210±0.35 7.44±5.16 6.94±8.45 1.07±1.11 1.76±0.98
(3)LNP1021G502 0.79 2.96 4.25 0.67 0.27
(4)LNP1022G502 1.54±1.32 20.42±31.60 13.94±10.10 0.98±0.41 2.04±0.65
(5)LNP1023G502 2.92±1.68 6.28±7.18 6.06±2.31 3.62±4.68 2.00±1.21
(6)LNP1024G509 1.43±0.62 2.64±1.92 7.72±11.96 0.45±0.19 0.88±0.79
(7)LNP1024G509 1.35±0.74 2.64±2.35 1.71±0.41 0.36±0.58 0.51±0.32
(8)LNP1025G509 1.64 2.68 25.65 0.58 2.00
(9)LNP1021G502 0.56 6.15 28.80 0.85 0.61
(10)LNP1022G502 1.76 8.66 2907.86 11.26 1.72
表46.根据研究2的MCP-1测量
表47.根据研究3的补体C3a测量
表48.根据研究3的补体bb测量
处理组 采血前 90分钟 6小时 24小时 第7天
(1)TSS 1.46±0.70 2.18±0.78 1.96±0.64 0.945±0.15 1.34±0.50
(2)LNP1021 G502 1.77±0.60 6.51±3.66 11.00±4.85 3.59±2.25 2.07±0.93
(3)LNP1021 G502 1.24 2.90 11.50 2.97 1.24
(4)LNP1022 G502 1.52±0.34 5.67±2.28 10.2±3.36 3.66±1.68 1.84±0.24
(5)LNP1023 G502 1.65±0.94 4.4±1 7.68±4.67 2.64±1.18 2.08±1.32
(6)LNP1024 G509 1.61±0.13 4.52±1.81 4.50±3.22 1.63±0.84 1.63±0.32
(7)LNP1024 G509 0.96 2.99 2.64 1.13 1.07
(8)LNP1025 G509 1.37±0.17 4.9±4.51 3.79±3.84 1.66±1.43 1.35±0.44
(9)LNP1021 G502 1.41 5.67 11.50 4.64 1.38
(10)LNP1022 G502 1.28 5.22 14.10 5.64 1.87
16.小鼠肝脏中不同mRNA的Cas9表达的比较
在施用编码Cas9的不同mRNA后活体内测量Cas9表达。将如表49中所指示的信使RNA与靶向小鼠TTR基因的小鼠sgRNA(1∶2的sgRNA∶mRNA重量比)调配为LNP。使用错流程序组配具有50％脂质A、9％DSPC、38％胆固醇及3％PEG2k-DMG及6.0的N∶P比的LNP。使用Sartocon Slice 200(Sartorius)纯化LNP，且以1.53mg/ml的浓度(RNA浓度)使用。针对如上文所述的RNA的平均粒径、多分散性(pdi)、总RNA含量及囊封效率分析LNP调配物(数据未示)。
以0.3mpk静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后1小时、3小时及6小时，将动物处死，收集肝脏组织，且如实例11中所述通过MSD ELISA测量Cas9蛋白质含量。表49显示Cas9蛋白质含量。在各时间点，在用SEQ ID NO：177处理的动物中侦测到比用SEQ IDNO：43处理的动物要多的Cas9蛋白质。
表49
17.不同mRNA的剂量反应的比较
比较编码Cas9的不同mRNA的活体内剂量反应曲线。用SEQ ID No.43及SEQ IDNo.177的mRNA及sg502(SEQ ID NO：70；G502)制备LNP调配物，如实例16中所述进行调配。将脂质纳米颗粒组分溶解于100％乙醇中，其中脂质组分摩尔比为50/9/38/3(LP01/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)。以约6的脂质胺与RNA磷酸(N∶P)摩尔比及以重量计1∶2的gRNA与mRNA比调配LNP。针对如上文所述的RNA的平均粒径、多分散性(pdi)、总RNA含量及囊封效率分析LNP调配物(数据未示)。
对于活体内表征，以每公斤(每组n＝5)0.03、0.1或0.3mg总RNA(引导RNA毫克数+mRNA毫克数)静脉内投配CD-1雌性小鼠(每组n＝5)。在给药后七天，将动物处死，收集血液及肝脏，且如实例1中所述测量血清TTR及肝脏编辑。用TSS媒剂投配阴性对照动物。编辑数据提供于下表50中。对于SEQ ID NO：43，提供平均8项活体内实验，各伴随5只动物。对于SEQID NO：177，提供活体内实验的平均值，各剂量下伴随5只动物。在各剂量下，用SEQ ID NO：177处理的动物中的编辑％要高于用SEQ ID NO：43处理的动物。
表50
序列表
以下序列表提供本文所揭示的序列的清单。应理解，若关于RNA提及DNA序列(包含Ts)，则Ts应由Us替代(其可视情况而为经修饰或未经修饰的)，且反之亦然。
*＝PS键；'m'＝2'-O-Me核苷酸。

Claims (40)

1.一种mRNA，其包含的开放阅读框架区为SEQ ID NO:111,113-119,146和148-154中的任一项所示的序列，其中所述开放阅读框架编码RNA引导的DNA结合剂。
2.如权利要求1所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:32、34、36、38、41或75至77中的任一项的序列的5'UTR。
3.如权利要求1所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:33、35、37、39或40中的任一项的序列的3'UTR。
4.如权利要求1所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:32、34、36、38、41或75至77中的任一项的序列的5'UTR，和SEQ ID NO:33、35、37、39或40中的任一项的序列的3'UTR。
5.如权利要求4所述的mRNA，其中所述mRNA包含来自同一来源的5'UTR及3'UTR。
6.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其包含选自Cap0、Cap1及Cap2的5'帽结构。
7.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9裂解酶。
8.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含的ORF区为SEQ ID NO:111的序列。
9.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9切口酶。
10.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含的ORF区为SEQ ID NO:114的序列。
11.如权利要求1至4中任一项所述的mRNA，其中所述RNA引导的DNA结合剂包含dCas9DNA结合域。
12.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含的ORF区为SEQ ID NO:117的序列。
13.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含编码SEQ ID NO:3、6、8或186-196中任一项所示的氨基酸序列的核酸序列。
14.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述RNA引导的DNA结合剂进一步包含异源功能域。
15.如权利要求14所述的mRNA，其中所述异源功能域为FokI核酸酶。
16.如权利要求14所述的mRNA，其中所述异源功能域为转录调节域。
17.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中至少10％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
18.如权利要求17所述的mRNA，其中所述经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷、假尿苷、5-甲氧基尿苷或5-碘尿苷中的一种或多种。
19.如权利要求17所述的mRNA，其中所述经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷或5-甲氧基尿苷中的一种或两种。
20.如权利要求17所述的mRNA，其中所述经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。
21.如权利要求17所述的mRNA，其中所述经修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。
22.如权利要求17所述的mRNA，其中15％至45％的所述尿苷被经修饰的尿苷取代。
23.如权利要求17所述的mRNA，其中至少20％或至少30％的所述尿苷被经修饰的尿苷取代。
24.如权利要求23所述的mRNA，其中至少80％或至少90％的所述尿苷被经修饰的尿苷取代。
25.如权利要求24所述的mRNA，其中100％的尿苷被经修饰的尿苷取代。
26.如权利要求1-4中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA为SEQ ID NO:177所示的序列。
27.一种表达构建体，其包含以可操作方式连接编码如权利要求1-26中任一项所述的mRNA的序列的启动子。
28.一种质粒，其包含如权利要求27所述的表达构建体。
29.一种宿主细胞，其包含如权利要求27所述的表达构建体或如权利要求28所述的质粒。
30.一种制备mRNA的方法，该方法包含使如权利要求27所述的表达构建体或如权利要求28所述的质粒与RNA聚合酶在容许进行所述mRNA的转录的条件下接触，其中在体外进行所述接触步骤。
31.一种组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的mRNA及至少一种引导RNA。
32.一种脂质纳米颗粒，其包含如权利要求1至26中任一项所述的mRNA。
33.一种医药组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的mRNA及医药学上可接受的载体。
34.如权利要求32所述的脂质纳米颗粒或如权利要求33所述的医药组合物，其进一步包含至少一种引导RNA。
35.如权利要求31-34中任一项所述的组合物或脂质纳米颗粒或医药组合物，其中至少一种引导RNA靶向TTR。
36.一种如权利要求1至27或31至35中任一项所述的mRNA、表达构建体、组合物、脂质纳米颗粒或医药组合物的用途，其用于制造用于基因组编辑或修饰靶基因的药剂。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述靶基因的基因组编辑或修饰是在肝脏细胞中进行。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述肝脏细胞为肝细胞。
39.如权利要求36至38中任一项所述的用途，其中所述靶基因的基因组编辑或修饰是在体内进行。
40.如权利要求36至38中任一项所述的用途，其中所述靶基因的基因组编辑或修饰是在经分离或培养的细胞中进行。
CN201880076711.3A 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法 Active CN111405912B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510091858.1A CN119955825A (zh) 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762566144P 2017-09-29 2017-09-29
US62/566,144 2017-09-29
PCT/US2018/053439 WO2019067910A1 (en) 2017-09-29 2018-09-28 POLYNUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENOMIC EDITION

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510091858.1A Division CN119955825A (zh) 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111405912A CN111405912A (zh) 2020-07-10
CN111405912B true CN111405912B (zh) 2025-02-14

Family

ID=63878830

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880076711.3A Active CN111405912B (zh) 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
CN202510091858.1A Pending CN119955825A (zh) 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510091858.1A Pending CN119955825A (zh) 2017-09-29 2018-09-28 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11697806B2 (zh)
EP (1) EP3687581A1 (zh)
JP (2) JP7524057B2 (zh)
KR (2) KR102822306B1 (zh)
CN (2) CN111405912B (zh)
AR (1) AR113154A1 (zh)
AU (2) AU2018339089C1 (zh)
BR (1) BR112020005323A2 (zh)
CA (1) CA3077255A1 (zh)
CO (1) CO2020005181A2 (zh)
EA (1) EA202090873A1 (zh)
IL (3) IL311278B1 (zh)
MX (1) MX2020003602A (zh)
MY (1) MY202341A (zh)
PH (1) PH12020550359A1 (zh)
SA (1) SA520411627B1 (zh)
SG (1) SG11202002562QA (zh)
TW (1) TWI839337B (zh)
WO (1) WO2019067910A1 (zh)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017374044B2 (en) * 2016-12-08 2023-11-30 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide RNAs
AU2018240515B2 (en) 2017-03-24 2024-07-25 CureVac SE Nucleic acids encoding CRISPR-associated proteins and uses thereof
AR113154A1 (es) * 2017-09-29 2020-01-29 Intellia Therapeutics Inc Polinucleótidos, composiciones y métodos para edición del genoma
CA3100050A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
WO2019237069A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas for gene editing
US20200268906A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
AU2019361204A1 (en) 2018-10-18 2021-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
AU2019361203B2 (en) 2018-10-18 2026-03-26 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
JP7578590B2 (ja) 2018-10-18 2024-11-06 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
BR112021019224A2 (pt) * 2019-03-28 2021-11-30 Intellia Therapeutics Inc Polinucleotídeos, composições e métodos para expressão de polipeptídeo
EP3946598A1 (en) * 2019-03-28 2022-02-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent
AU2020248337A1 (en) * 2019-03-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating ATTR amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
WO2021016075A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Recombinase compositions and methods of use
CN114616002A (zh) 2019-09-13 2022-06-10 瑞泽恩制药公司 使用由脂质纳米颗粒递送的crispr/cas系统在动物中进行的转录调控
US11591607B2 (en) 2019-10-24 2023-02-28 Pairwise Plants Services, Inc. Optimized CRISPR-Cas nucleases and base editors and methods of use thereof
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
MX2022006950A (es) 2019-12-11 2022-11-07 Intellia Therapeutics Inc Arn guía modificados para edición de genes.
JP2023512758A (ja) 2020-02-07 2023-03-29 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド カリクレイン（ｋｌｋｂ１）遺伝子編集のための組成物および方法
IL296024A (en) 2020-03-04 2022-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Methods and compositions for modulating a genome
GB2632565B (en) 2020-04-09 2025-06-04 Verve Therapeutics Inc Base editing of PCSK9 and methods of using same for treatment of disease
US12188060B2 (en) 2020-05-15 2025-01-07 Crispr Therapeutics Ag Messenger RNA encoding Cas9 for use in genome-editing systems
CA3179420A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Avak Kahvejian Coronavirus antigen compositions and their uses
IL298363A (en) 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CA3180101A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
CA3182026A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
MX2023002439A (es) 2020-09-03 2023-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones immunogénicas y usos de las mismas.
US20240002839A1 (en) 2020-12-02 2024-01-04 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
IL303886A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Flagship Pioneering Inc Compositions of modified trems and uses thereof
AU2021411521A1 (en) 2020-12-30 2023-08-03 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
CN114717229B (zh) * 2021-01-05 2024-09-10 麦塞拿治疗(香港)有限公司 治疗性mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子
CN114717230B (zh) * 2021-01-05 2024-09-03 麦塞拿治疗(香港)有限公司 成纤维细胞生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
KR20240032013A (ko) 2021-06-10 2024-03-08 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집을 위한 내부 링커를 포함하는 변형된 가이드 rna
WO2023009547A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and uses thereof
JP2024534915A (ja) * 2021-09-03 2024-09-26 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 自己増幅性メッセンジャーリボ核酸におけるヌクレオチド塩基の置換
JP2024533311A (ja) 2021-09-08 2024-09-12 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ゲノムを調節するための方法及び組成物
ES2994006T3 (en) 2021-09-17 2025-01-16 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
JP2024538144A (ja) 2021-10-18 2024-10-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ポリリボヌクレオチドを精製するための組成物及び方法
EP4423271A2 (en) 2021-10-28 2024-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
EP4426822A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
MX2024006440A (es) 2021-11-24 2024-08-19 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones inmunogenicas y sus usos.
EP4436984A1 (en) 2021-11-24 2024-10-02 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Coronavirus immunogen compositions and their uses
AU2022397292A1 (en) 2021-11-24 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
KR20240117149A (ko) 2021-12-22 2024-07-31 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 폴리리보뉴클레오티드를 정제하기 위한 조성물 및 방법
MX2024007870A (es) 2021-12-23 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Polirribonucleotidos circulares que codifican polipeptidos antifusogenicos.
EP4460334A1 (en) * 2022-01-07 2024-11-13 Precision BioSciences, Inc. Optimized polynucleotides for protein expression
EP4473103A2 (en) 2022-02-02 2024-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease
JP2025511756A (ja) 2022-04-08 2025-04-16 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ セブン，エルエルシー ワクチン及び関連する方法
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
US20250295687A1 (en) 2022-05-09 2025-09-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
JP2025516638A (ja) 2022-05-13 2025-05-30 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ セブン，エルエルシー 二本鎖ｄｎａ組成物及び関連する方法
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
CN119421951A (zh) 2022-05-31 2025-02-11 瑞泽恩制药公司 用于c9orf72重复序列扩增疾病的crispr干扰疗法
EP4540389A2 (en) 2022-06-16 2025-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class i in a cell
US20250179492A1 (en) 2022-06-22 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
CN119585419A (zh) 2022-06-29 2025-03-07 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
IL318625A (en) 2022-07-29 2025-03-01 Regeneron Pharma Compositions and methods for transferrin receptor (TFR)-mediated delivery to brain and muscle
EP4569112A1 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
EP4590820A2 (en) 2022-09-22 2025-07-30 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
CN120265314A (zh) 2022-09-28 2025-07-04 瑞泽恩制药公司 抗体抗性修饰受体以增强基于细胞的疗法
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
AU2023372397A1 (en) 2022-10-31 2025-05-08 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
IL320016A (en) 2022-11-04 2025-06-01 Regeneron Pharma Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
EP4615465A1 (en) 2022-11-08 2025-09-17 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
AU2023379457A1 (en) 2022-11-14 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
TW202430215A (zh) 2022-12-14 2024-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法
CN120435560A (zh) * 2022-12-16 2025-08-05 深圳深信生物科技有限公司 提高rna分子翻译效率和/或稳定性的utr及其应用
WO2024137766A2 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) editing
WO2024138115A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Intellia Theraperutics, Inc. Systems and methods for genomic editing
US20240252520A1 (en) 2023-01-09 2024-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Therapeutic agents and their use for treating chronic wounds
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
US20240238473A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
IL322468A (en) 2023-02-13 2025-09-01 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Ionizable lipids containing degradable crosslinkers and lipid carriers for therapeutic compositions
JP2026507513A (ja) 2023-02-17 2026-03-04 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ セブン，エルエルシー 修飾されたウラシルを含むｄｎａ組成物
IL322378A (en) 2023-02-17 2025-09-01 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc DNA compositions containing modified cytosine
WO2024192420A1 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising polyribonucleotides and uses thereof
EP4680276A1 (en) 2023-03-15 2026-01-21 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
WO2024216128A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trems for use in correction of missense mutations
WO2025006684A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
AU2024309884A1 (en) 2023-06-30 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for increasing homology-directed repair
AU2024315073A1 (en) 2023-07-28 2026-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion
AU2024317483A1 (en) 2023-07-28 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
TW202521564A (zh) 2023-08-14 2025-06-01 美商英特利亞醫療公司 用於基於細胞之療法的ｃｄ７０ ｃａｒ－ｔ組合物及方法
TW202515994A (zh) 2023-08-14 2025-04-16 美商英特利亞醫療公司 用於對ｃｄ７０進行基因修飾之組合物及方法
WO2025038637A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
AU2024324870A1 (en) 2023-08-14 2026-02-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
WO2025042786A1 (en) 2023-08-18 2025-02-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
WO2025049432A1 (en) * 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for editing hla-a in cells pre-screened for the absence of one or both alleles of hla-h*01
WO2025049481A1 (en) * 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of editing an hla-a gene in vitro
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
CN121752723A (zh) * 2023-08-31 2026-03-27 正基基因科技有限公司 编码crispr相关蛋白的核酸及其应用
AU2024344058A1 (en) 2023-09-18 2026-04-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
TW202540417A (zh) 2023-11-10 2025-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之組合物、方法及系統
WO2025106670A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
WO2025128871A2 (en) 2023-12-13 2025-06-19 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025217225A1 (en) * 2024-04-08 2025-10-16 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for effective delivery of lipid nanoparticles operably linked to therapeutic molecules to multiple fetal muscle tissues and other organs for the treatment of genetic disorders
WO2025235388A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing
WO2025255308A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd8 co-receptor chimeric polypeptides in tcr cell therapy
WO2025265017A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i
WO2026006390A2 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas for genome editing
WO2026072529A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Mettl7a for improved embryo competence
WO2026080515A2 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof
WO2026078565A1 (en) * 2024-10-10 2026-04-16 Crispr Therapeutics Ag Messenger rna encoding cas9 for use in genome-editing systems

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
KR940703846A (ko) 1991-12-24 1994-12-12 비. 린네 파샬 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides)
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
CN104114572A (zh) * 2011-12-16 2014-10-22 现代治疗公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
EP4357457B1 (en) * 2012-10-23 2024-10-16 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
CA2895155C (en) 2012-12-17 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
EP3608308B1 (en) 2013-03-08 2021-07-21 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
ES2746803T3 (es) * 2013-05-15 2020-03-06 Robert Kruse Traducción intracelular de ARN circular
EP3011030B1 (en) 2013-06-17 2023-11-08 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
SMT202100691T1 (it) * 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx Inc Composizioni 5 comprendenti polinucleotidi sintetici che codificano proteine correlate a crispr e sgrna sintetici e metodi d'uso
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
ES2895651T3 (es) 2013-12-19 2022-02-22 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para la administración de agentes activos
SG10201912038TA (en) * 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
EP3169309B1 (en) 2014-07-16 2023-05-10 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
WO2016077123A1 (en) * 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
CA2969151A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
CN105821072A (zh) * 2015-01-23 2016-08-03 深圳华大基因研究院 用于DNA组装的CRISPR-Cas9系统及DNA组装方法
EP3265559B1 (en) 2015-03-03 2021-01-06 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
RU2749113C2 (ru) * 2015-04-22 2021-06-04 Куревак Аг Содержащая рнк композиция для лечения опухолевых заболеваний
JP7078812B2 (ja) * 2015-08-28 2022-06-01 バイオンテック・エスイー Ｒｎａの免疫原性を低減するための方法
ES2964690T3 (es) 2015-09-21 2024-04-09 Trilink Biotechnologies Llc Método para sintetizar ARN con caperuza 5'
EA201891338A1 (ru) * 2015-12-04 2018-12-28 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии
EP3405579A1 (en) * 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
US20180112234A9 (en) * 2016-03-14 2018-04-26 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene editing
TWI773666B (zh) 2016-03-30 2022-08-11 美商英特利亞醫療公司 Crispr/cas 組分之脂質奈米粒子調配物
AR113154A1 (es) * 2017-09-29 2020-01-29 Intellia Therapeutics Inc Polinucleótidos, composiciones y métodos para edición del genoma

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176772A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Also Published As

Publication number Publication date
US20200354702A1 (en) 2020-11-12
MY202341A (en) 2024-04-24
SG11202002562QA (en) 2020-04-29
JP2024133470A (ja) 2024-10-02
IL273307A (en) 2020-04-30
US11697806B2 (en) 2023-07-11
BR112020005323A2 (pt) 2020-09-24
SA520411627B1 (ar) 2024-03-17
EP3687581A1 (en) 2020-08-05
AU2018339089B2 (en) 2025-08-28
KR20200058508A (ko) 2020-05-27
JP7524057B2 (ja) 2024-07-29
CA3077255A1 (en) 2019-04-04
EA202090873A1 (ru) 2020-08-17
AU2018339089C1 (en) 2026-01-22
TWI839337B (zh) 2024-04-21
PH12020550359A1 (en) 2021-02-15
IL324936A (en) 2026-01-01
NZ762816A (en) 2024-04-26
IL311278A (en) 2024-05-01
CO2020005181A2 (es) 2020-05-15
CN119955825A (zh) 2025-05-09
CN111405912A (zh) 2020-07-10
AR113154A1 (es) 2020-01-29
IL311278B1 (en) 2026-01-01
AU2025271085A1 (en) 2025-12-18
US20240076636A1 (en) 2024-03-07
KR102822306B1 (ko) 2025-06-19
KR20250093420A (ko) 2025-06-24
WO2019067910A1 (en) 2019-04-04
JP2021500863A (ja) 2021-01-14
TW201923077A (zh) 2019-06-16
MX2020003602A (es) 2020-09-22
AU2018339089A1 (en) 2020-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111405912B (zh) 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
US11965165B2 (en) Compositions and methods for TTR gene editing and treating ATTR amyloidosis
US20240124897A1 (en) Compositions and Methods Comprising a TTR Guide RNA and a Polynucleotide Encoding an RNA-Guided DNA Binding Agent
US20230012687A1 (en) Polynucleotides, Compositions, and Methods for Polypeptide Expression
TW201924724A (zh) 調配物
TW201802242A (zh) Crispr/cas組分之脂質奈米粒子調配物
HK40125801A (zh) 用於基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
HK40032638B (zh) 用於基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
HK40067192A (zh) 用於多肽表达的多核苷酸、组合物和方法
HK40032638A (zh) 用於基因组编辑的多核苷酸、组合物及方法
HK40110281A (zh) 用於ttr基因编辑及治疗attr淀粉样变性的组合物及方法
EA053115B1 (ru) Полинуклеотиды, композиции и способы редактирования генома
CN118660960A (zh) 用于基因组编辑的多核苷酸、组合物和方法
HK40114401A (zh) 用於基因组编辑的多核苷酸、组合物和方法
HK40065872A (zh) 包括ttr向导rna和对rna引导的dna结合剂进行编码的多核苷酸的组合物和方法
EA048813B1 (ru) Композиции и способы редактирования гена ttr и лечения транстиретинового амилоидоза (attr)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40032638

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TG01 Patent term adjustment
TG01 Patent term adjustment