ES2746803T3 - Traducción intracelular de ARN circular - Google Patents

Abstract

Vector para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho vector los siguientes elementos operativamente conectados entre sí y dispuestos en la siguiente secuencia: a) un promotor de ARN polimerasa, b) una unión de empalme del intrón 5' de autocircularización, c) un IRES, d) un 5' UTR opcional, e) un sitio de inserción de clonación múltiple para insertar un ORF en dicho vector, f) un 3' UTR, g) una secuencia de poliA, h) una unión de empalme de intrón 3' de autocircularización, e i) un terminador de ARN polimerasa opcional permitiendo dicho vector la producción de un ARNm circular que puede competir contra los ARNm celulares nativos por la maquinaria de iniciación de la traducción eucariota.

Description

DESCRIPCIÓN

Traducción intracelular de ARN circular

SOLICITUDES ANTERIORES RELACIONADAS SECTOR DE LA DIVULGACIÓN

De manera general, la presente divulgación se refiere a un producto biológico que comprende un ARN circular que es capaz de traducirse dentro de una célula eucariota. La presente invención da a conocer nuevas combinaciones de elementos de ARN que facilitan la traducción y expresión mejoradas de polipéptidos codificados, y da a conocer vectores para preparar ARNm circular, así como diversas aplicaciones que utilizan el ARNm y/o el vector circular. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La “terapia génica” es la utilización de ADN como agente para tratar enfermedades. Su nombre deriva de la idea de que el ADN se puede utilizar para complementar o alterar genes dentro de las células de un paciente como terapia para tratar la enfermedad. La forma más común de terapia génica implica la utilización de ADN que codifica un gen terapéutico funcional para reemplazar un gen mutado no funcional.

Aunque los primeros fracasos clínicos llevaron a muchos a descartar la terapia génica por sobrevalorada, los éxitos clínicos han reforzado ahora el nuevo optimismo en la promesa de la terapia génica. Entre estos se incluyen el tratamiento exitoso de pacientes con enfermedad de la retina amaurosis congénita de Leber, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (SCID (Severe Combined Immunodeficiency, Inmunodeficiencia Combinada Severa)), SCID de adenosina desaminasa (ADA (Adenosine Deaminase, Adenosina Desaminasa)-SCID), adrenoleucodistrofia, leucemia linfocítica crónica (CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia, Leucemia Linfocítica Crónica)), leucemia linfocítica aguda (ALL (Acute Lymphocytic Leukemia, Leucemia Linfocítica Aguda)), mieloma múltiple y enfermedad de Parkinson. Estos éxitos clínicos recientes han llevado a un renovado interés en la terapia génica, con varios artículos en publicaciones científicas y populares que piden una inversión continua en el sector.

El ARN se utiliza en terapias antisentido y basadas en ARNip, pero hasta la fecha el ARNm propiamente no se ha utilizado para terapia génica, aunque la utilización de ARNm frente a ADN en terapia génica ofrece ventajas potenciales. Por ejemplo, la proteína codificada por el ARNm se expresará en todas las células, por lo que la selección de un promotor no es un problema. No puede tener lugar mutagénesis por inserción, lo que aumenta la seguridad del procedimiento, y la naturaleza transitoria de la expresión es ventajosa para muchas aplicaciones. El gen de interés puede expresarse fácilmente en células en división o no división, en oposición a las limitaciones del ADN.

Sin embargo, existen dificultades técnicas considerables que superar antes de que el ARNm pueda utilizarse con éxito en varios procedimientos terapéuticos.

Por ejemplo, la transfección de ARNm utilizando lípidos, electroporación y otros procedimientos da como resultado una respuesta inmune inflamatoria mediada por receptores tipo Toll que reconocen el ARN añadido como extraño. Este reconocimiento conduce a la secreción de interferones, y si se intenta la transfección repetida del ARNm, en última instancia, se produce la muerte celular por apoptosis.

Un avance reciente permite evitar la respuesta inmune innata, proporcionando de este modo una forma de superar este primer obstáculo. La estrategia incorpora nucleótidos modificados que no pueden unirse a receptores de tipo Toll en el ARN, evitando de este modo la respuesta inmune inflamatoria (por ejemplo, las Patentes US8278036, US20100047261, US20120322864). De este modo, se ha superado como mínimo un desafío, en los desafíos para implementar técnicas terapéuticas basadas en ARN.

Otra dificultad ha sido la producción de un ARNm completo y activo mediante transcripción in vitro. Además, el ARNm resultante debe tener todas las características necesarias para el inicio y la traducción, y ser capaz de competir eficazmente contra los ARNm endógenos. De este modo, el ARNm completo en la técnica actual necesita una caperuza 5’ o análogo de caperuza, 5’ UTR (Untranslated Región; Región no Traducida), ORF (Open Reading Frame, Marco de lectura abierto), 3’ UTR y cola de poliadenilación para imitar la molécula de ARNm estándar producida por las células eucariotas. En algunos casos, se omite una caperuza 5’ y se utiliza una secuencia IRES (“Internal Ribosome Entry Site”, Sitio Interno de Entrada al Ribosoma), pero esto es mucho más ineficiente y reduce la vida media de la molécula de ARN lineal sin protección del extremo terminal 5’ del ARN. De manera similar, se puede omitir una cola de poliadenilación, pero con una eficiencia de traducción y una vida media reducidas de la molécula de ARNm lineal.

Sin embargo, el mayor impedimento quizás es la dificultad en la manipulación del ARNm. El ARN tiene dos hidroxilos colgantes adyacentes en el anillo de pentosa del nucleótido terminal, lo que lo hace muy susceptible al ataque nucleófilo por bases o por ARNasas, siempre presentes en el agua y sobre la mayoría de las superficies. Se utilizan reactivos sin ARNasa para la producción de ARNm y su almacenamiento resultante, pero incluso con estas técnicas, la extrema sensibilidad a la degradación genera una dificultad considerable a la implementación de cualquier técnica basada en ARN. Otro impedimento es la corta vida media del ARNm una vez dentro de la célula. El ARN mensajero solo permite la expresión transitoria dentro de las células, de manera general del orden de 6-12 horas.

Se aprecia bien en la bibliografía que las moléculas de ARN circulares tienen vidas medias mucho más largas que sus contrapartes lineales, siendo naturalmente resistentes a cualquier actividad de exonucleasa o ataque nucleofílico. De este modo, la utilización de ARN circular puede resolver ambos problemas de degradación. De hecho, la vida media del ARN circular in vivo se estimó en más de 40 horas en embriones de Xenopus. En el mismo sistema, los ARNm lineales tenían una vida media de 6-8 horas. Incluso en E. coli, un ARN circular que se tradujo activamente fue 4-6 veces más estable que su contraparte lineal debido a la resistencia a la actividad de ARNasa E.

Se sabe también que una secuencia Shine-Dalgarno es necesaria en los procariotas para el reclutamiento de ribosomas y puede mediar en el reclutamiento de ribosomas a cualquier molécula de ARN, ya sea lineal o circular. Sin embargo, originalmente se pensaba que el ARN circular no podía unirse a los ribosomas eucariotas. Afortunadamente, Chen (1995) demostró que el ARNm circular puede unirse a los ribosomas eucariotas con la presencia de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).

Chen utilizó una secuencia IRES de picornavirus para este propósito y demostró la traducción en un sistema in vitro de reticulocitos de conejo. El objetivo principal de su estrategia se centró en la aplicación del desarrollo de proteínas poliméricas a través de la traducción continua alrededor de la molécula de ARN circular. Para que esto tuviera lugar, eliminaron el codón de parada, para que nunca se señale al ribosoma para que se desprenda de la molécula de ARN. En estas construcciones, solo el sitio IRES y la secuencia de codificación estaban presentes en la molécula de ARNm, y faltaban otras señales tales como UTR, tractos poliA, sitios de terminación y similares.

En resumen, para eucariotas, un sistema de expresión de ARNm circular solo se ha demostrado in vitro en reticulocitos de conejo, un sistema que de otro modo sesga cualquier nivel de traducción de fondo, incluso en una plantilla lineal sin caperuza ni secuencias IRES. No se presentaron datos sobre la capacidad de un ARNm circular para traducirse in vivo dentro de una célula eucariota, y los resultados en procariotas fueron decepcionantes. Para la aplicación a un sistema de traducción in vivo dentro de la célula, se necesitan más modificaciones al ARNm circular para permitir su competencia exitosa con los ARNm celulares nativos para los factores de iniciación de la traducción.

La patente de Sarnow y Chen (Patente US5766903) reivindica la inserción de un IRES en un ARN circular con un gen de interés. Sin embargo, esta patente no describe la necesidad de otros elementos reguladores en la molécula de ARN circular para la traducción in vivo. De hecho, no hay datos que demuestren una traducción intracelular exitosa de ARNm circular en la bibliografía de patentes o publicaciones. No hay discusión sobre la inserción de una secuencia de poliadenilación, o un 3’ UTR para funcionar en sinergia con el elemento IRES. Además, no se propusieron nuevos elementos IRES con traducción mejorada en ARNm circular.

Además, casi no hubo informes de seguimiento en la bibliografía que demostraran la utilidad del ARNm circular, in vitro o in vivo. En un trabajo reciente, se demostró en un sistema de reticulocitos de conejo in vitro que una plantilla circular de ARNm con el IRES SP-A1 podría dirigir la traducción (Wang 2009). Sin embargo, la eficiencia de traducción del ARN circular in vitro fue del 15% respecto a la de un ARN lineal sin caperuza con IRES. En el mismo experimento, un ARN lineal con caperuza tenía una actividad del 131% respecto a la del ARN lineal sin caperuza, lo que enfatiza cómo el sistema de reticulocitos de conejo tiende a sesgar las transcripciones no limitadas hacia niveles de traducción que son súper fisiológicos.

Se han dado a conocer mecanismos de traducción y los componentes necesarios (Jackson 2010). Sin embargo, el ARN circular todavía se considera inadecuado para impulsar la traducción de proteínas en las células (Wang 2015). En general, el sector se ha centrado en la expresión de ARNm lineal (Yoshioka 2013). Una variedad de patentes adicionales se refiere al ARNm circular. Sin embargo, estas patentes no proporcionan evidencia de la traducción real in vivo de la molécula circular de ARNm. Entre los ejemplos de la técnica anterior se incluyen las Patentes US5766903, US6210931, US5773244, US5580859, US20100137407, US5625047, US5712128, US20110119782.

Por lo tanto, aunque posiblemente reconocieran el potencial de la utilización de ARNm circular para la expresión in vivo en eucariotas, estas solicitudes no estaban de hecho habilitadas.

De este modo, lo que se necesita en la técnica son procedimientos para fabricar y utilizar ARNm circular en los que estas moléculas se hayan habilitado completamente y se haya demostrado que funcionan en sistemas eucarióticos in vivo o ex vivo.

CARACTERÍSTICAS DE LA DIVULGACIÓN

La presente descripción se refiere a una molécula de ARNm circular que puede traducirse eficazmente dentro de las células eucariotas, así como a los procedimientos de fabricación y utilización de la misma, y a los vectores utilizados para producir ARNm circulares.

Una utilización preferente incluye la administración de moléculas de ARNm circulares en células o animales mamíferos, por ejemplo, para la terapia o la bioproducción de proteínas útiles. El procedimiento es ventajoso para proporcionar la producción de un polipéptido deseado dentro de las células eucariotas con una vida media más larga que el ARN lineal, debido a la resistencia a las ribonucleasas y las bases.

El ARNm circular puede transfectarse tal cual, o puede transfectarse en forma de vector de ADN y transcribirse en la célula, según se desee. La transcripción celular puede utilizar polimerasas o ácidos nucleicos añadidos que las codifican, o, preferentemente, puede utilizar polimerasas endógenas. Se ha demostrado en la presente memoria descriptiva una prueba de concepto con polimerasas T7 añadidas, pero esto es solo un ejemplo, y pueden ser preferentes las polimerasas de base celular más convenientes.

La vida media preferente de un ARNm circular en una célula eucariota es de, como mínimo, 20 horas, 30 horas o incluso, como mínimo, 40 horas, tal como se mide mediante una hibridación o experimentos cuantitativos de RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcripción Inversa).

Una realización preferente de la presente invención comprende una molécula de ARNm circular con un IRES, 5’ UTR, la secuencia de codificación de interés, 3’ UTR y una secuencia de poliadenilación, en ese orden. Es bien sabido que se pueden crear muchas combinaciones diferentes de estos elementos de ARN con propiedades que mejoran la traducción y se pueden crear sinergias. Entre dichas combinaciones se incluyen, sin que constituyan limitación, IRES-ORF-3’ UTR-poliA, IRES-ORF-3’ UTR, IRES-5’ UTR-ORF-3’ UTR y similares.

Se da a conocer también una molécula de ARN circular con nucleótidos de ARN modificados. Entre las posibles bases de ribonucleótidos modificados se incluyen 5-metilcitidina y pseudouridina. Estos nucleótidos proporcionan estabilidad adicional y resistencia a la activación inmune.

Se da a conocer también la transcripción in vitro de una plantilla de ADN que codifica la molécula de ARNm circular de interés. Las secuencias de autoempalme del intrón invertido en ambos extremos de la molécula de ARN facilitan la formación de ARN circular sin que se necesiten enzimas adicionales.

Se da a conocer también la producción de ARNm circular dentro de la célula, que se puede transcribir a partir de una plantilla de ADN en el citoplasma mediante una ARN polimerasa de bacteriófago, o en el núcleo mediante la ARN polimerasa II del huésped.

Se da a conocer también la inyección de ARNm circular en un ser humano o animal, de modo que un polipéptido codificado por la molécula de ARNm circular se exprese dentro del organismo. El polipéptido puede encontrarse intracelularmente o secretarse.

El ARNm circular puede transfectarse dentro de las células en cultivo de tejidos para expresar los polipéptidos de interés deseados. En particular, el ARNm circular puede expresar proteínas intracelulares y proteínas de membrana en las células de interés.

La presente invención incluye una o más de las siguientes características:

- Un vector para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho vector los siguientes elementos operativamente conectados entre sí y dispuestos en la siguiente secuencia: a) un promotor de ARN polimerasa, b) una unión de empalme del intrón 5’ de autocircularización, c) un IRES, d) un 5’ UTR opcional, e) un sitio de inserción de clonación múltiple para insertar un ORF en dicho vector, f) un 3’ UTR, g) una secuencia de poliA, h) una unión de empalme de intrón 3’ de autocircularización e i) un terminador de ARN polimerasa opcional, permitiendo dicho vector la producción de un ARNm circular que puede competir contra los ARNm celulares nativos por la maquinaria de iniciación de la traducción eucariota.

- Un vector en el que el promotor y el terminador de la ARN polimerasa son del virus T7, virus T6, virus SP6, virus T3 o virus T4.

- Un vector en el que el 3’ UTR es de beta globina humana, alfa globina humana, beta globina de xenopus, alfa globina de xenopus, prolactina humana, GAP-43 humana, eEF1a1 humana, Tau humana, TNF alfa humana, virus del dengue, ARNm pequeño de hantavirus, ARNm pequeño de bunyanavirus, virus del mosaico de nabo amarillo, virus de la hepatitis C, virus de la rubéola, virus del mosaico del tabaco, IL-8 humana, actina humana, GAPDH humana, tubulina humana, virus de la mancha anular clorótica del hibisco, elemento regulado tras la traducción del virus de la hepatitis de la marmota, virus sindbis, virus de arrugas del nabo, virus de grabado del tabaco o virus de la encefalitis equina venezolana.

- Un vector en el que el 5’ UTR es de beta globina humana, beta globina de Xenopus laevis, alfa globina humana, alfa globina de Xenopus laevis, virus de la rubéola, virus del mosaico del tabaco, Gtx de ratón, virus del dengue, proteína de choque térmico de proteína 1A de 70kDa, alcohol deshidrogenasa de tabaco, virus de grabado de tabaco, virus de la arruga del nabo o líder tripartito de adenovirus.

- Un vector en el que la secuencia de poliA tiene, como mínimo, 30 nucleótidos de longitud o, como mínimo, 60 nucleótidos de longitud.

- Un vector en el que el IRES es del virus del síndrome de Taura, virus del triatoma, virus de la encefalomielitis de Theiler, virus 40 de simio, virus 1 de Solenopsis invicta, virus de Rhopalosiphum padi, virus de la reticuloendoteliosis, poliovirus humano 1, virus del intestino de Plautia stali, virus de la abeja de Cachemira, rinovirus humano 2, virus 1 de Homalodisca coagulata, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1, virus 1 de Homalodisca coagulata, virus Himetobi P, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis GB, virus de la fiebre aftosa, enterovirus humano 71, virus de la rinitis equina, virus similar a los picornavirus de Ectropis obliqua, virus de la encefalomiocarditis, virus de Drosophila C, coxsackievirus humano B3, tobamovirus de Crucifer, virus de la parálisis de Cricket, virus de la diarrea viral bovina 1, virus celular de la reina negra, virus de la parálisis letal del áfido, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la parálisis aguda de las abejas, virus de la mancha anular clorótica del hibisco, virus de la peste porcina clásica, FGF2 humana, SFTPA1 humana, AML1/RUNX1 humana, antenapedia de Drosophila, AQP4 humana, AT1R humana, BAG-1 humana, BCL2 humana, BiP humana, c-IAP1 humana, c-myc humana, eIF4G humana, NDST4L de ratón, LEF1 humana, HIF1alpha de ratón, n.myc humana, Gtx de ratón, p27kip1 humana, PDGF2/c-sis humana, p53 humana, Pim-1 humana, Rbm3 de ratón, cosechador de Drosophila, Scamper canina, Ubx de Drosophila, UNR humana, UtrA de ratón, VEGF-A humana, XIAP humana, Drosophila sin pelo, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, virus de grabado de tabaco, virus de arrugas del nabo o un aptámero para eIF4G.

- Un vector que incluye una secuencia de ARN que se une a eIF4E cuando se transcribe en el ARNm circular, que funciona como un elemento IRES.

- Un vector en el que la secuencia de ARN que se une a eIF4E es de la histona H4 de ratón, la ciclina D1 humana, ARN2 de virus del mosaico y las enaciones del guisante, el virus del mosaico de Panicum o un aptámero de ARN a eIF4E.

- Un vector en el que el IRES se combina con un segundo IRES que facilita el reclutamiento adicional del factor de iniciación, la unión de la subunidad ribosómica, la derivación ribosómica, el emparejamiento de bases ribosómico o la translocación ribosómica.

- Un vector en el que en el intrón catalítico de autocircularización es un intrón del Grupo I o intrón del Grupo II. - Un vector que comprende un elemento de transporte nuclear seleccionado del elemento de transporte constitutivo del virus de mono de Mason Pfizer (CTE), elemento 4E-SE, elemento posterior a la regulación del virus de la hepatitis de marmota, elemento posterior a la regulación del virus de la hepatitis B o elemento de respuesta al rev VIH.

- Un vector en el que dicho IRES comprende la SEQ ID No. 3.

- Un procedimiento para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento añadir ribonucleótidos trifosfato, pirofosfatasa inorgánica, inhibidor de ARNasa y una ARN polimerasa a un vector dado a conocer en la presente memoria descriptiva en el tampón de reacción apropiado, transcribiendo el ARN de dicho vector y permitiendo la autocircularización de dicho ARN transcrito para producir ARNm circular.

- Un procedimiento, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en el que dichos ribonucleótidos incluyen ribonucleótidos modificados m5C, m5U, m6A, s2U, ¥ o 2’-O-metil-U.

- Un procedimiento ex vivo para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento transfectar el vector descrito en la presente memoria descriptiva y una polimerasa de fago o ácido nucleico que codifica una polimerasa de fago en una célula eucariota, permitiendo la transcripción de dicho vector dentro de la célula para producir ARN transcrito, y permitiendo la autocircularización de dicho ARN transcrito para producir ARNm circular.

- Un procedimiento ex vivo para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento transfectar un vector descrito en la presente memoria descriptiva en una célula eucariota, en el que dicho vector se transcribe mediante una ARN polimerasa de célula huésped.

- Un ARNm circular en el que dicho ARNm circular tiene en orden un IRES, un 5’ UTR opcional, una secuencia de codificación de interés, un 3’ UTR y una secuencia de poliadenilación.

- Un vector tal como se describe en la presente memoria descriptiva para su utilización en terapia génica.

- Un procedimiento ex vivo para bioproducir una proteína, que comprende introducir un vector descrito en la presente memoria descriptiva en una célula eucariota o un mamífero para la producción de una proteína codificada por dicho ORF.

En la presente memoria descriptiva, se entiende por “gen” una molécula de ADN que incluye, como mínimo, un promotor, un ORF y una secuencia de terminación y cualquier otra secuencia de control de la expresión deseada. Se entiende por “ORF” un marco de lectura abierto, que típicamente codifica una proteína de interés.

Se entiende por “in vivo" la traducción de ARNm dentro de una célula, frente a la traducción “in vitro", en la que una mezcla de componentes purificados que incluye factores de iniciación de la traducción eucariota, ribosomas, ARNt cargados con aminoácidos y ARNm se mezclan entre sí sin células intactas. “Ex vivo" significa dentro de células vivas que se originaron a partir de un organismo multicelular, pero que ahora se cultivan como cultivos celulares. Se entiende por “vector” o “vector de clonación” un fragmento pequeño de ADN, tomado de un virus, plásmido o célula de un organismo superior, que puede mantenerse de forma estable en un organismo y en el que se puede insertar un fragmento de ADN extraño para fines de clonación y/o expresión. Un vector típicamente tiene un origen de replicación, un marcador seleccionable o gen indicador, tal como la resistencia a los antibióticos o GFP, y de manera general contiene un sitio de clonación múltiple. El término incluye vectores plasmídicos, vectores virales, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares.

El vector también puede contener secuencias de integración, que permiten la integración en un genoma del huésped, y esto puede ser particularmente preferente para biorreactores basados en células debido a una mayor estabilidad.

Un “vector de expresión” es un vector que contiene también todas las secuencias necesarias para la transcripción y traducción de un ORF. Entre estas se incluyen un promotor fuerte, la secuencia de iniciación de traducción correcta, tal como un sitio de unión ribosómico y un codón de inicio, un codón de terminación fuerte y una secuencia de terminación de la transcripción. Existen diferencias en la maquinaria para la síntesis de proteínas entre procariotas y eucariotas, por lo tanto, los vectores de expresión deben tener los elementos de expresión apropiados para el huésped elegido. Por ejemplo, los vectores de expresión procariotas tendrían una secuencia Shine-Dalgamo en su sitio de inicio de traducción para la unión de ribosomas, mientras que los vectores de expresión eucariotas contienen la secuencia consenso de Kozak.

Un “sitio de clonación múltiple” o “MCS”, denominado también “polienlazador”, es un segmento corto de ADN que contiene muchos sitios de restricción (hasta ~20) y es una característica estándar de los plásmidos y otros vectores de ingeniería. Los sitios de restricción dentro de un MCS son típicamente únicos, tienen lugar solo una vez dentro de un plásmido dado y, de este modo, pueden utilizarse para insertar un ORF de interés en un vector. Además, los vectores de expresión se diseñan a menudo para que el MCS pueda insertar el ORF en el marco de lectura correcto eligiendo el sitio de inserción correcto, y/o el usuario puede seleccionar el marco de lectura eligiendo vectores, que a menudo están disponibles en los tres marcos.

Los “aptámeros” son moléculas de ácido oligonucleico o peptídicas que se unen a una molécula diana específica. De manera general, los aptámeros se crean seleccionándolos a partir de un gran grupo de secuencias aleatorias, pero también existen aptámeros naturales en los riboswitches. Los aptámeros se pueden utilizar tanto para investigación básica como para fines clínicos como fármacos macromoleculares. Los aptámeros se pueden combinar con ribozimas para autoescindirse en presencia de su molécula objetivo. Estas moléculas compuestas tienen aplicaciones de investigación, industriales y clínicas adicionales.

Más específicamente, los aptámeros de ácido nucleico se pueden clasificar como aptámeros de ADN o ARN o XNA. Comprenden cadenas (de manera general cortas) de oligonucleótidos. Los aptámeros peptídicos comprenden un dominio peptídico variable corto, unido en ambos extremos a proteínas de andamiaje.

La utilización de la palabra “un” o “uno” cuando se utiliza junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones o la memoria descriptiva significa uno o más de uno, a menos que el contexto indique lo contrario. El término “aproximadamente” significa el valor establecido más o menos el margen de error de la medición o más o menos el 10 % si no se indica ningún procedimiento de medición.

La utilización del término “o” en las reivindicaciones se utiliza para significar “y/o” a menos que se indique explícitamente para referirse solo a alternativas o si las alternativas son mutuamente excluyentes.

Los términos “comprenden”, “tienen”, “incluyen” y “contienen” (y sus variantes) son verbos de enlace abiertos y permiten la adición de otros elementos cuando se utilizan en una reivindicación.

La expresión “que consiste en’ está cerrada y excluye todos los elementos adicionales.

La expresión “que consiste esencialmente en’ excluye elementos materiales adicionales, pero permite la inclusión de elementos no materiales que no cambian sustancialmente la naturaleza de la presente invención, tal como instrucciones de utilización, tampones y similares.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un vector diseñado para producir una molécula circular de ARNm. El vector se muestra con un ORF insertado en el mismo, pero antes de la inserción se mostraría un MCS (Multiple Cloning Site, Sitio de Clonación Múltiple).

La figura 2 muestra los resultados de las imágenes de proteínas indicadoras de GFP de la traducción de ARNm circular en células HEK después de la expresión dirigida por la ARN polimerasa T7.

La figura 3 muestra los resultados de las imágenes GFP y DAPI (tinción nuclear) de la traducción de ARNm circular en células HEK después de la expresión dirigida por la ARN polimerasa T7.

La figura 4 muestra las SEQ ID No. 1-9. SEQ ID No. 1: promotor de ARN polimerasa T7 (21 pb); SEQ ID No. 2: secuencia de intrón del grupo I 5’ (167 pb); SEQ ID No. 3: secuencia del aptámero 1 eIF4E (86 pb); SEQ ID No. 4: 5’ UTR de beta globina humana (50 pb); SEQ ID No. 5: 3’ UTR de beta globina humana (133 pb); SEQ ID No. 6: secuencia de intrón del grupo I 3’ (107 pb); SEQ ID No. 7: terminador de ARN polimerasa T7 (47 pb); SEQ ID No. 8: secuencia de poliadenilación (33 pb); SEQ ID No. 9: IRES de EMCV (593 pb).

La figura 5 muestra la SEQ ID No. 10: secuencia pBSK-CR = secuencia de ADN sintetizada basada en el esquema proporcionado en la figura 5. Los genes de interés (GOI; Gene(s) Of Interest, Gen(es) de Interés) pueden clonarse entre NcoI y SalI y expresarse como un ARNm circular con el aptámero eIF4E - 5’ UTR de beta globina-GOI-3’ UTR de beta globina-poliA.

La figura 6 muestra la SEQ ID No. 11: Gene 1LG - Expresa el ARNm lineal sin caperuza que contiene GFP DE IRES.

La figura 7 muestra la SEQ ID No. 12: Gene 2CI - Expresa el ARNm circular que contiene GFP DE IRES.

La figura 8 muestra la SEQ ID No. 13: Gene 3CIA - Expresa el ARNm circular que contiene GFP DE IRES, 3’ UTR de beta globina y la secuencia de poliadenilación.

La figura 9 muestra la SEQ ID No. 14: Gene 4EA - Expresa ARNm circular que contiene el aptámero eIF4E, 5’ UTR de beta globina, GFP, 3’ UTR de beta globina y la secuencia de poliadenilación.

La figura 10 muestra una secuencia de vector de ejemplo, tal como la SEQ ID No. 15: ARN circular IRES-MCS-UTR-poliA - El vector contiene un sitio de clonación múltiple después de un IRC EMCV y antes del 3’ UTR de beta globina y la secuencia de poliA, para permitir la inserción de genes en múltiples marcos de lectura. La expresión produce ARNm circular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente divulgación describe moléculas circulares de ARNm que pueden traducirse con éxito dentro de células de mamífero, así como procedimientos para fabricar las mismas, vectores para fabricar las mismas y procedimientos para utilizar el vector o el ARNm circular.

El ARNm circular presenta regiones adicionales más allá del IRES y el ORF para ayudar a reclutar ribosomas para el ARNm circular. El ARNm circular tiene un sitio IRES, un ORF para una proteína de interés, un 3’ UTR y una secuencia de poliA opcional. En algunas realizaciones de la presente invención, puede existir un IRES y un 5’ UTR, dependiendo de cómo funciona el IRES. Téngase en cuenta que dada la gran diversidad de secuencias IRES en la naturaleza, habrá una amplia gama de eficiencias de traducción cuando estas secuencias IRES se sustituyan en el vector propuesto. En general, sin embargo, la presente invención aumentará la eficiencia del producto de ARNm circular independientemente de la naturaleza del IRES en cuestión, debido a la utilización de la cola de poliA y los elementos 3’ UTR, los cuales ayudan a reclutar ribosomas para la traducción.

Para que los ARNm circulares se traduzcan eficientemente dentro de las células, deben competir in vivo contra los ARNm celulares que también reclutan la maquinaria de traducción. Si bien las secuencias IRES tienen menos requisitos de inicio de traducción, el proceso de reclutamiento canónico a través de eIF4E aún recluta ribosomas de manera mucho más eficiente en una comparación directa. La presente invención da a conocer, además de las secuencias de IRES virales, una secuencia de IRES para ARNm circular que puede reclutar a eIF4E en sí mismo. En una realización de la presente invención, el IRES es un aptámero para eIF4E (SEQ ID No. 3) con especificidad para la cara de la proteína que se une a la caperuza de guanosina. Este aptámero nunca antes se había utilizado como IRES, y representa un aspecto novedoso de la divulgación. El aptámero puede unirse a eIF4E y, de este modo, al resto del complejo de iniciación de la traducción, de manera similar a las moléculas de ARNm celular. Ayuda al inicio de la traducción la presencia de 3’ UTR y la cola de poliA, lo que significa que el ARNm circular en esta realización de la presente invención puede reclutar ribosomas casi de la misma manera que el ARN celular. El ARN celular se circulariza por medio de una conexión física de PABP a las proteínas eIF4G a eIF4E, mientras que el ARN circular en la presente invención se mantiene unido por un enlace físico.

El reclutamiento de eIF4E para la traducción independiente de la caperuza se puede lograr uniendo eIF4E a través de una etiqueta peptídica a una estructura de ARN que se une específicamente a la etiqueta. Esto sugiere que, si una estructura de ARN o un aptámero o un tallo-bucle pudieran unirse a eIF4E directamente, entonces se podría lograr una traducción independiente de la caperuza. De hecho, esto ya se ha observado para un virus vegetal, el virus del mosaico de las enaciones del guisante (PEMV). Su molécula de ARN2 contiene una estructura de ARN de pseudonudo que se une directamente a la proteína eIF4E de la planta.

Ciertos transcritos eucariotas también pueden reclutar la proteína eIF4E a través de motivos de ARN en sus 3’ UTR o secuencias codificantes, actuando independientemente de los mecanismos de unión de la caperuza. Este motivo se llama elemento sensible 4E o 4E-SE. Se encuentran ejemplos de 4E-SE en ARNm de histona de ratón H4 y ARNm de ciclina D1 humana. Su función en estos ARNm es regular la localización y exportación nuclear, así como modular la traducción. Para los propósitos de un ARNm circular, se puede imaginar fácilmente que el 4E-SE podría utilizarse para reclutar de manera similar eIF4E al ARNm independiente de la caperuza y estimular la traducción. El IRES puede ser un elemento 4E-SE, tomado de secuencias en ARNm celulares, que media la unión directa a eIF4E. En la presente realización, se puede añadir un 5’ UTR o IRES aguas abajo del 4E-SE que promueve la derivación del ribosoma como una forma de estimular la traducción no canónica. Un ejemplo sería el 5’ UTR Gtx de ratón o cualquier secuencia de IRES viral o celular.

Como alternativa a la utilización de una secuencia 4E-SE para unir eIF4E, se propone un aptámero dirigido contra el bolsillo de unión de la caperuza de eIF4E para poder replicar los efectos de la caperuza de guanosina normal en la promoción de la traducción. Un ejemplo de secuencia de aptámero eIF4E se da en la SEQ ID No. 3. Como se sabe en la técnica, se pueden generar aptámeros de muchas secuencias degeneradas contra una proteína dada, y esta es solo una secuencia de ejemplo.

De manera similar, podrían desarrollarse nuevos IRES que se unan directamente a eIF4G, omitiendo el reclutamiento necesario a través de eIF4E. Un ejemplo de esta estrategia sería desarrollar aptámeros contra eIF4G que no inhiban la traducción, pero que medien una fuerte unión a eIF4G.

Además de utilizar secuencias IRES novedosas, añadir otros elementos de ARN a la molécula circular de ARNm permite la traducción dentro de las células. Se reconoce fácilmente, por ejemplo, que mientras que la caperuza es una estructura importante para la traducción de ARNm lineal eucariota, las 5’ UTR, 3’ UTR y colas de poliA también desempeñan funciones importantes en la traducción.

El ARNm circular de la presente invención contiene una secuencia de poliadenilación dentro de la molécula de ARN circular de, aproximadamente, 30 ribonucleótidos de adenosina, que puede unirse a un único complejo de proteína de unión a poli(A) humana. Esta secuencia de poliadenilación se encuentra después del ORF, 3’ UTR y antes del sitio de empalme y la señal de terminación.

Se ha demostrado que la poliadenilación de ARNm aumenta la expresión de la expresión dirigida por IRES viral. La secuencia de poliA añadida en el ARNm circular también podría funcionar como un tipo de sitio IRES adicional, como sugiere un informe de que un líder de ARN poliA 5’ podría permitir eludir los factores de iniciación al mediar en la traducción.

Además de los IRES virales, los ARNm celulares también pueden aumentar la eficacia de traducción de sus secuencias IRES con colas de poliadenilación. La actividad de IRES de ARNm de c-myc y BiP podría mejorarse mediante la adición de una cola de poliA, incluso sin eIF4G o PABP intactos, factores que normalmente mediarían esta interacción.

Se puede utilizar un par de UTR 5’ y 3’ virales que se comunican naturalmente entre sí para mediar la traducción. Los UTR 5’ y 3’ de muchos virus se comunican a través de las interacciones ARN-ARN o ARN-proteína para facilitar una mayor traducción o regulación de la traducción. Esto sugiere que optimizar la utilización de dichas UTR o unir los extremos de forma permanente a través de la circularización podría conducir a una traducción mejorada. Un ejemplo de UTR sinérgicos útiles en la presente invención de ARN circular es el par de UTR 5’ y 3’ del virus del dengue, que juntos poseen actividad IRES.

Se propone también en la presente memoria descriptiva la capacidad de ciertas secuencias 3’ UTR virales para aumentar o reemplazar algunos de los componentes canónicos del ARNm. Como ejemplo, el 3’ UTR del ARNm pequeño del hantavirus de los Andes puede sustituir funcionalmente la cola de poliA y puede actuar en sinergia con la traducción dependiente de la caperuza.

Se puede utilizar un 5’ UTR que facilitará la entrega del ribosoma al primer codón del polipéptido a traducir. El mecanismo de anclaje ribosómico y entrega a los codones AUG aguas abajo también sería útil en las moléculas circulares de ARNm. Este proceso también se conoce como “derivación ribosómica”. Un ejemplo de una secuencia que media la derivación es un elemento de ARNm de la 5’ UTR del ARNm de homodominio Gtx, que se empareja con el ARNr 18S y el líder tripartito de adenovirus.

Aunque los nucleótidos de ARN modificados han recibido mucha atención, entre otras aplicaciones, por su resistencia a las nucleasas en el establecimiento de ARNip, los nucleótidos de ARN modificados producen solo mejoras moderadas en la eficiencia de la traducción y la vida media de la transcripción. De este modo, el ARN circular representa una mejora en la capacidad de conseguir semividas de transcripción más largas en comparación con todos los demás procedimientos actuales, al tiempo que proporciona un procedimiento de producción de ARNm mucho más robusto y económico que requiere solo la enzima ARN polimerasa única. Esto se compara con otros protocolos de productos in vitro de ARNm en la técnica anterior que requieren hasta 3 reacciones enzimáticas en total (por ejemplo, ARN polimerasa, poliadenilasa y enzima de caperuza). Además, los rendimientos de ARN de las reacciones de transcripción mezcladas con el análogo de la caperuza son de manera general 2-6 veces menores que sin el mismo, lo que representa otra ventaja de producción para el ARNm circular.

El ARNm circular descrito en la presente memoria descriptiva también se puede producir in vivo dentro de la célula. Hay dos mecanismos diferentes para la producción in vivo de ARNm circular. En el primer mecanismo, el ADN se entrega o se integra en el núcleo. La transcripción será conducida por un promotor que recluta una ARN polimerasa II que es endógena a esa célula. El autoempalme ocurriría dentro del núcleo. Dado que se ha demostrado que la caperuza 5’ es importante para la exportación de ARNm, puede ser necesario agregar un medio alternativo para aumentar la exportación de ARNm circular. Un ejemplo es el elemento de transporte constitutivo (CTE (Constitutive Transport Element, Elemento de Transporte Constitutivo)) del virus de mono de Mason Pfizer, una secuencia de ARN que ayuda a mediar la exportación no canónica del ARNm.

El otro medio de generación in vivo de ARNm circular consistiría en transfectar ADN lineal o circular que contiene, por ejemplo, un promotor T7 dentro de la célula, y añadir, por ejemplo, T7. La proteína polimerasa T7 podría transfectarse junto con el ADN plasmídico, después de lo cual se uniría en el citoplasma al promotor T7 en el ADN del vector y comenzaría a transcribir ARNm circular. En una versión de este procedimiento, el casete de transcripción puede carecer de un terminador T7 que conduzca a una transcripción continua de ARN en círculo rodante en el que el T7 nunca se disocia de la plantilla de ADN.

El ADN que codifica el ADN de T7 o incluso el ARNm de T7 podría añadirse a la célula, permitiendo la transcripción y la traducción para producir el T7 dentro de la célula. Por supuesto, T7 es solo un ejemplo y podría utilizarse cualquier ARN polimerasa similar, tal como T6, T4, T3, SP6 o ARN polimerasa I y similares.

Las tecnologías necesarias para producir ARN circular se han descrito previamente en la bibliografía. De manera común, se utiliza autoempalme de grupo I mediante una secuencia intrón-exón permutada del bacteriófago T4. Esta reacción puede tener lugar en células procariotas, células eucariotas o in vitro, ya que está catalizada únicamente por ARN. Sin embargo, existe una variedad de procedimientos diferentes en esa técnica anterior con respecto a formas de sintetizar ARN circular. Se entiende que la molécula de ARNm circular mejorada propuesta podría utilizar cualquiera de estos procedimientos en su producción (por ejemplo, Patentes US6210931, US5773244).

Entre los ejemplos de secuencias de autoempalme de intrones del grupo I se incluyen secuencias de intrón-exón permutadas de autoempalme derivadas del gen del bacteriófago T4 td. El ARNr de la secuencia interviniente (IVS (Intervening Sequence, Secuencia Interviniente)) de Tetrahymena contiene también un ejemplo de secuencias de autoempalme de intrones del Grupo I. Dada la existencia generalizada de intrones catalíticos del grupo I y del grupo II en la naturaleza, se podrían utilizar muchas secuencias posibles para crear el ARN circular.

El autoempalme tiene lugar para intrones raros que forman una ribozima, que realiza las funciones del complejo de empalme únicamente mediante ARN. Hay tres tipos de intrones de autoempalme, Grupo I, Grupo II y Grupo III. Los intrones de los Grupos I y II realizan un empalme similar al del complejo de empalme sin necesitar ninguna proteína. Esta similitud sugiere que los intrones del Grupo I y II pueden estar relacionados evolutivamente con el complejo de empalme. El autoempalme también puede ser muy antiguo y puede haber existido en un mundo de ARN presente antes de las proteínas.

Los sistemas de expresión citoplasmáticos se han utilizado antes como una alternativa a la transcripción nuclear dependiente, o la transfección del propio ARNm. Estos sistemas se basan en la transfección conjunta de una ARN polimerasa de fago (de manera general ADN polimerasa T7) con una plantilla de ADN. A veces, el T7 se expresa como un gen de un promotor nuclear, o el ARNm que codifica la polimerasa T7 se transfecta dentro de la célula. Estas proporcionan alternativas a la transfección de proteínas de la polimerasa T7. Además, en ciertos sistemas, la polimerasa T7 podría dirigir la síntesis de más polimerasa T7, creando un efecto de autogeneración autosostenible. Dichos sistemas de autogeneración alcanzan niveles de expresión incomparables, y solo están limitados por la cantidad de ribonucleótidos trifosfato en el citoplasma, entre otros factores.

Los ARNm circulares podrían generarse continuamente a partir de una plantilla circular, debido a la naturaleza altamente procesadora de la ARN polimerasa T7, que rara vez se cae de una plantilla de ADN durante la fase de alargamiento. La ARN polimerasa T7 puede circular alrededor de los plásmidos muchas veces si no se proporciona una secuencia de terminación adecuada. Esto se ha demostrado en un sistema ARNsh para producir un rendimiento muy aumentado de producto de ARN.

En un esfuerzo por mediar la traducción de tecnologías basadas en ARN para su utilización clínica, se han realizado avances en la purificación de ARNm a gran escala, eliminando las impurezas de ARN bicatenarias que pueden activar el sistema inmune innato (por ejemplo, las Patentes EP2510099, EP2092064).

Una aplicación relacionada distinta de las moléculas circulares de ARNm describe las moléculas efectoras de interferencia de ARN circulares (por ejemplo, Patente WO2010084371). Además, se ha publicado recientemente en la bibliografía que las células humanas poseen moléculas de ARN circulares naturales que parecen funcionar como esponjas de microARN. Sin embargo, estas moléculas de ARN circulares se probaron y no mostraron actividad de traducción, a pesar de poseer secuencias de exón de proteínas. En una aplicación ligeramente diferente, las moléculas de ARN circulares sirven como sustratos para Dicer y procesamiento adicional para producir ARNsi (por ejemplo, la Patente EP2143792).

Los siguientes experimentos son solo de ejemplo y sirven para proporcionar en general experimentos de prueba de concepto para la presente invención.

CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR

Se preparó una serie de vectores para preparar ARNm circular que coincidía con el esquema descrito en la figura 1. Esta plantilla se utilizó a continuación para construir una serie de diferentes genes codificadores de GFP, que producen diferentes tipos de moléculas de ARNm. Los genes 1LG y 2CI producen moléculas de ARNm lineales que existen en la técnica anterior, mientras que los genes 3CIA y 4CE^a producen moléculas de ARNm circulares que son novedosas de la presente invención. Tal como se describe a continuación, se utilizaron procedimientos de clonación estándar para producir las secuencias de ADN del vector final.

Se preparó el plásmido, pBSK-CR con una secuencia de ADN sintetizada que coincide con la figura 5 (SEQ. ID No.

10). También se obtuvo otro plásmido, pIRES-GFP, que contenía el IRES de EMCV seguido de una secuencia de GFP. Se llevaron a cabo las siguientes etapas de clonación para producir los vectores utilizados para generar los ARNm circulares en la presente memoria descriptiva:

Se construyó el vector 1LG, que producía una molécula de ARN lineal, sin caperuza con GFP DE IRES-3’ UTR de beta globina-poliA, mediante digestión con BamHI y SalI en pIRES-GFP y pBSK-CR, seguido de la ligadura del inserto IRES-GFP en la secuencia pBSK-CR.

Se construyó el vector 2CI, que producía una molécula de ARN circular únicamente con IRES-GFP mediante digestión de pIRES-GFP y pBSK-CR con XhoI y XbaI, seguido de la ligadura del inserto IRES-GFP en la secuencia pBSK-CR.

Se construyó el vector 3CIA, que producía una molécula de ARN circular con IRES-GFP-3’ UTR de beta globina-poliA, mediante digestión de pIRES-GFP y pBSK-CR con XhoI y Sail, seguido de la ligadura del inserto de IRES-g Fp en la secuencia pBSK-CR.

Se construyó el vector 4CEA, que producía una molécula de ARN circular con aptámero eIF4E-5’ UTR de beta globina-GFP-3’ UTR de beta globina-poliA, mediante digestión de pBSK-CR y pIRES-GFP con NcoI y Sail, seguido de ligadura del inserto de GFP en la secuencia pBSK-CR.

El plásmido pIRES-GFP de la técnica anterior producía un ARNm con caperuza lineal canónico con cola de poliA que se produce dentro del núcleo de una célula impulsada por un promotor de CMV. Este plásmido nos permite comparar el nuevo ARNm circular de la presente divulgación con la expresión de ARNm lineal con caperuza y proporciona una comparación directa con la técnica anterior. Sin embargo, los niveles relativos de ARNm producidos serán diferentes entre los dos sistemas, dados sus diferentes promotores.

EXPRESIÓN INTRACELULAR DE ARNm IMPULSADA POR T7

El propósito de este experimento fue generar ARNm dentro de la célula con polimerasa T7, eliminando variables de efectos tóxicos de ARN durante la transfección, o la posible degradación del ARNm por las abundantes ARNasas en el ambiente durante la manipulación experimental. El objetivo era transfectar conjuntamente el ADN plasmídico (las combinaciones que se muestran a continuación) en células HEK 293 junto con la proteína de polimerasa de ARN T7 activa en un formato de 24 pocillos, con cuatro pocillos por condición. Todas las cantidades y volúmenes se dan por pocillo.

1. El día antes de la transfección, se tripsinizaron las células HEK y se recontaron. Las células se colocaron en placas a 1,0 x 105 células por pocillo en 0,5 ml de medio de crecimiento completo.

2. Se combinaron 2 pg de ADN y 50 U de ARN polimerasa T7 (NEB®) en 50 pl de medio OPTIMEM sin suero, y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Se añadió lipofectamina pura (5 pl) al complejo de plásmido/ARN polimerasa T7, la mezcla se incubó durante 45 minutos y, a continuación, se diluyó a 200 pl con medio OPTIMEM.

4. Después de una incubación adicional de 30 minutos, se agregaron 200 pl de los complejos de reactivo de ADN-T7 polimerasa-lipofectamina directamente a cada pocillo que contenía células y se mezclaron suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Los complejos de ADN/proteína/lipofectamina no tienen que eliminarse después de la transfección.

5. Las células se incuban a 37 °C en CO2 al 5 % durante 24 horas.

6. A continuación, se tomaron imágenes de las células HEK utilizando un microscopio fluorescente a las 24 horas para detectar la expresión de GFP. En algunos experimentos, las células se fijaron a las 48 horas con PFA (Paraformaldehyde, Paraformaldehído) al 4 % y, a continuación, se tiñeron con DAPI para detectar el contorno del núcleo de las células y mejorar la visualización de GFP. Entonces se pudo observar la localización de GFP en referencia a la posición del núcleo.

Los resultados del experimento mostraron que el IRES-GFP-3’ UTR-poliA lineal sin caperuza expresó GFP (1LG), tal como se ha observado en varios sistemas. El ARNm circular 2CI, que coincide con la técnica anterior de ARN circular solo por los elementos IRES y ORF, no pudo mostrar la expresión de GFP en experimentos repetidos cuando se tomaron imágenes en células vivas (figura 2) o después de la fijación celular (figura 3). De este modo, la simple circularización de un ARN no es suficiente para la expresión eucariota en células eucariotas, incluso cuando el mismo ARNm se puede transcribir en forma lineal (no se muestra en la presente memoria descriptiva, pero se ha demostrado en la técnica anterior).

Los ARNm circulares 3CIA y 4CEA de la presente invención exhibieron una expresión de GFP distinta, que era similar en intensidad de GFP al ARNm de 1 Lg lineal sin caperuza.

TRANSCRIPCIÓN Y TRANSFECCIÓN de ARNm

Se utilizaron los mismos vectores 1LG, 2CI, 3CIA y 4EA del experimento anterior como plantillas para la transcripción de ARNm in vitro. El proceso de transcripción de ARNm in vitro es bien conocido en el sector y comprende obtener una plantilla de ADN con un promotor de fago de longitud corta seguido por el gen de interés en la cadena del mismo sentido. Esta plantilla de ADN a menudo se linealiza debido a la alta procesividad de las ARN polimerasas, pero puede permanecer circular si sigue una secuencia terminadora de la polimerasa después del gen. Para los experimentos de la presente memoria descriptiva, se creó una reacción de transcripción in vitro de ARNm utilizando el kit MEGAscript de Ambion®. Se añadió una mezcla de ribonucleótidos, polimerasa T7 y plantilla de ADN en una mezcla de reacción de 20 pl. Se dejó que la reacción tuviera lugar durante 2 horas a 37 °C. Las transcripciones de ARNm se purificaron utilizando un protocolo estándar de cloruro de litio para eliminar el exceso de ribonucleótidos, ADN y proteínas.

A continuación, El ARNm purificado se transfectó en células HEK 293 utilizando lipofectamina, tal como sigue:

1. El día antes de la transfección, las células HEK se tripsinizaron y se recontaron. Las células se colocaron en placas a 1,0 x 105 células por pocillo en 0,5 ml de medio de crecimiento completo.

2. Se añadieron 0,5-1 pg de ARN a 2,5 pl de Lipofectamine 2000, la mezcla se incubó durante 45 minutos y, a continuación, se diluyó a 200 pl con medio OPTIMEM.

4. Después de una incubación adicional de 30 minutos, se añadieron 200 pl de los complejos de reactivo de ARNm-lipofectamina directamente a cada pocillo que contenía células y se mezclaron suavemente balanceando la placa hacia adelante y hacia atrás. Los complejos no se eliminaron después de la transfección.

5. Las células se incubaron adicionalmente a 37 °C en CO2 al 5 % durante 24 horas.

6. Se tomaron imágenes de las células HEK utilizando un microscopio fluorescente a las 24 horas para detectar la expresión de GFP. En algunos experimentos, las células se fijaron a las 48 horas utilizando PFA al 4 % y, a continuación, se tiñeron con DAPI para detectar el contorno del núcleo de las células. Entonces se pudo observar la localización de GFP en referencia a la posición del núcleo.

Los resultados del experimento de transfección de ARNm coincidieron con los resultados de la expresión de ARNm llevada a cabo por t7 intracelular, tal como se esperaba. El ARNm de IRES-GFP-3’ UTR-poliA lineal sin caperuza expresó GFP (1LG), tal como se ha observado en varios sistemas de la técnica anterior. El ARNm circular 2C1, que coincide con la técnica anterior de EMCV solo en IRES y ORF (véase la Patente US5766903), no pudo mostrar la expresión de GFP en experimentos repetidos cuando se tomaron imágenes en células vivas o después de la fijación celular. De este modo, de acuerdo con los experimentos anteriores, IRES y ORF solos son insuficientes para la transcripción intracelular de un ARNm circular. Además, se predice que tampoco serán suficientes para la expresión de animales vivos (in vivo).

Los ARNm circulares 3CIA y 4CEA exhibieron expresión de GFP, que era similar en intensidad de GFP al ARNm de 1LG lineal sin caperuza.

CONCLUSIÓN

Utilizando dos procedimientos diferentes de producción de ARNm circular, se observó por primera vez que el ARNm circular puede traducirse intracelularmente en una célula eucariota en competencia directa con los ARNm con caperuza del huésped. Este es un hallazgo significativo que los investigadores anteriores no pudieron conseguir. Además, los ARNm circulares que se traducen dentro de las células eucariotas no se han encontrado hasta ahora en la naturaleza y, de este modo, estos resultados son inesperados. De hecho, aunque ahora se aprecia que los exones e intrones circulares existen dentro de las células eucariotas, la evolución parece no haber seleccionado ninguna traducción capaz de ARNm circular por los ribosomas. Un resumen de los resultados experimentales se enumera en la siguiente tabla.

El gen 2CI se construyó para producir una molécula de ARNm circular que coincide con la técnica anterior que contiene la misma construcción IRES y ORF de EMCV (véase la Patente US5766903). El gen 2CI sirve de este modo como una comparación con la actual presente invención, que contiene múltiples elementos potenciadores de la traducción de ARN. Se observa que únicamente el ARNm circular de 2CI, que codifica IRES-GFP de EMCV, no puede producir ninguna expresión discernible de GFP tanto en imágenes de células vivas como después de la fijación dentro de las células. Esto contrasta con su expresión positiva informada en un sistema de reticulocitos de conejo in vitro (Chen y Sarnow, Science, 1995).

Por otro lado, los ARNm circulares 3CIA y 4CEA producen patrones de expresión similares a la expresión del ARNm lineal sin caperuza 1LG. El ARNm lineal 1LG que contiene IRES-GFP-3’ UTR de beta globina-poliA de EMCV sin caperuza es conocido en la bibliografía por producir GFP después de la transfección, pero los presentes inventores han mostrado la primera demostración confirmada de la expresión de una versión circular del mismo ARNm.

La diferencia en la expresión de GFP entre el ARNm circular en 2CI (sin expresión) y el ARNm circular en 3CIA (expresión) es notable, teniendo en cuenta que las únicas secuencias adicionales eran la secuencia 3’ UTR de beta globina y la de poliadenilación. Esto indica que estas secuencias añadidas fueron capaces de permitir que el IRES de EMCV reclute efectivamente ribosomas dentro de la célula, probablemente al ayudar a reclutar factores de iniciación adicionales al IRES para aumentar su eficacia. Por ejemplo, PABP (Poly(A)-Binding Protein, Proteína de Unión a Poli(A)) se une a la secuencia de poliadenilación y a eIF4G, que es una proteína dirigida por el EMCV de IRES.

La presente invención también da a conocer por primera vez la utilización de una secuencia de ARN de unión a eIF4E como un elemento similar a IRES en el reclutamiento de ribosomas para el ARN circular. Hasta ahora, no se han descrito virus de mamíferos ni genes celulares que utilicen el reclutamiento de eIF4E como mecanismo exclusivo de reclutamiento de ribosomas. La demostración de un aptámero eIF4E que facilita la traducción representa de este modo un nuevo hallazgo para el inicio de la traducción de ARNm eucariota.

Los experimentos futuros explorarán la optimización de genes de ARNm circulares utilizando diferentes combinaciones de IRES, UTR 5’ y 3’, y la longitud de las secuencias de poliadenilación. El gen de luciferasa de luciérnaga se utilizará como el ORF transfectado para permitir mediciones cuantitativas de las cantidades de proteína producidas después de la traducción de ARNm.

Los presentes inventores también planean un experimento futuro para medir la vida media del ARNm circular de la presente invención en células eucariotas, utilizando RT-PCR cuantitativa y/o experimentos de purificación e hibridación de ARN. Basándose en las enseñanzas de la técnica anterior, esperamos que la vida media sea, como mínimo, 2X, 3X, 4X o 5X más elevada que un ARNm con límite de control que tenga una vida media de 10 horas. De este modo, esperamos una vida media de, como mínimo, 20 horas, 30 horas, 40 horas o más.

MATERIALES

Referencias:

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Vector para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho vector los siguientes elementos operativamente conectados entre sí y dispuestos en la siguiente secuencia:

a) un promotor de ARN polimerasa,

b) una unión de empalme del intrón 5’ de autocircularización,

c) un IRES,

d) un 5’ UTR opcional,

e) un sitio de inserción de clonación múltiple para insertar un ORF en dicho vector,

f) un 3’ UTR,

g) una secuencia de poliA,

h) una unión de empalme de intrón 3’ de autocircularización, e

i) un terminador de ARN polimerasa opcional

permitiendo dicho vector la producción de un ARNm circular que puede competir contra los ARNm celulares nativos por la maquinaria de iniciación de la traducción eucariota.

2. Vector, según la reivindicación 1, en el que el promotor y el terminador de la ARN polimerasa son del virus T7, virus T6, virus SP6, virus T3 o virus T4.

3. Vector, según la reivindicación 1, en el que el 3’ UTR es de beta globina humana, alfa globina humana, beta globina de xenopus, alfa globina de xenopus, prolactina humana, GAP-43 humana, eEF1a1 humana, Tau humana, TNF alfa humana, virus del dengue, ARNm pequeño de hantavirus, ARNm pequeño de bunyanavirus, virus del mosaico de nabo amarillo, virus de la hepatitis C, virus de la rubéola, virus del mosaico del tabaco, IL-8 humana, actina humana, GAPDH humana, tubulina humana, virus de la mancha anular clorótica del hibisco, elemento regulado tras la traducción del virus de la hepatitis de la marmota, virus sindbis, virus de la arruga del nabo, virus de grabado de tabaco o virus de la encefalitis equina venezolana, o en el que el 5’ UTR es de beta globina humana, beta globina de Xenopus laevis, alfa globina humana, alfa globina de Xenopus laevis, virus de la rubéola, virus del mosaico del tabaco, Gtx de ratón, virus del dengue, proteína de choque térmico de proteína 1A de 70kDa, alcohol deshidrogenasa de tabaco, virus de grabado de tabaco, virus de la arruga del nabo o líder tripartito de adenovirus.

4. Vector, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de poliA tiene, como mínimo, 30 nucleótidos de longitud o en el que la secuencia de poliA tiene, como mínimo, 60 nucleótidos de longitud.

5. Vector, según la reivindicación 1, en el que el IRES es del virus del síndrome de Taura, virus del triatoma, virus de la encefalomielitis de Theiler, virus 40 de simio, virus 1 de Solenopsis invicta, virus de Rhopalosiphum padi, virus de la reticuloendoteliosis, poliovirus humano 1, virus del intestino de Plautia stali, virus de la abeja de Cachemira, rinovirus humano 2, virus 1 de Homalodisca coagulata, virus de inmunodeficiencia humana tipo 1, virus Himetobi P, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis GB, virus de la fiebre aftosa, enterovirus humano 71, virus de la rinitis equina, virus de tipo ectropis obliqua picorna, virus de la encefalomiocarditis, virus de Drosophila C, coxsackievirus humano B3, tobamovirus de Crucifer, virus de la parálisis de Cricket, virus de la diarrea viral bovina 1, virus Black Queen Cell, virus de la parálisis letal áfida, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la parálisis aguda de las abejas, virus de manchas anulares cloróticas de hibisco, virus de la peste porcina clásica, FGF2 humana, SFTPA1 humana, AML1/RUNX1 humana, antenapedia de Drosophila, AQP4 humana, AT1R humana, BAG-1 humana, BCL2 humana, BiP humana, c-IAP1 humana, c-myc humana, eIF4G humana, NDST4L de ratón, LEF1 humana, HIF1alpha de ratón, n.myc humana, Gtx de ratón, p27kip1 humana, PDGF2/c-sis humana, p53 humana, Pim-1 humana, Rbm3 de ratón, cosechador de Drosophila, Scamper canina, Ubx de Drosophila, UNR humana, UtrA de ratón, VEGF-A humana, XIAP humana, Drosophila sin pelo, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, c-src humano, FGF-1 humano, picornavirus de simio, virus de la arruga del nabo o un aptámero para eIF4G.

6. Vector, según la reivindicación 1, que incluye además una secuencia de ARN que se une a eIF4E cuando se transcribe en el ARNm circular, en el que preferentemente la secuencia de ARN que se une a eIF4E es de histona H4 de ratón, ciclina D1 humana, ARN2 de virus del mosaico y las enaciones del guisante, el virus del mosaico de Panicum o un aptámero de ARN a eIF4E.

7. Vector, según la reivindicación 1, en el que el IRES se combina con un segundo IRES que facilita el reclutamiento adicional del factor de iniciación, la unión de la subunidad ribosómica, la derivación ribosómica, el emparejamiento de bases ribosómico o la translocación ribosómica, o en el que el intrón catalítico de autocircularización es un intrón del Grupo I o intrón del Grupo II, comprendiendo además un elemento de transporte nuclear seleccionado del elemento de transporte constitutivo del virus de mono de Mason Pfizer (CTE), elemento 4E-SE, elemento posterior a la regulación del virus de la hepatitis de marmota, elemento posterior a la regulación del virus de la hepatitis B o elemento de respuesta al rev VIH.

8. Vector, según la reivindicación 1, comprendiendo dicho IRES la SEQ ID No. 3.

9. Procedimiento para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento añadir ribonucleótidos trifosfato, pirofosfatasa inorgánica, inhibidor de ARNasa y una ARN polimerasa al vector, según la reivindicación 1, en el tampón de reacción apropiado, transcribiendo el ARN de dicho vector y permitiendo la autocircularización de dicho ARN transcrito para producir el ARNm circular.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que dichos ribonucleótidos incluyen ribonucleótidos modificados m5C, m5U, m6A, s2U, ¥ o 2’-O-metil-U.

11. Procedimiento ex vivo para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento transfectar el vector, según la reivindicación 1, y una polimerasa de fago o ácido nucleico que codifica una polimerasa de fago en una célula eucariota, permitiendo la transcripción de dicho vector dentro de la célula para producir el ARN transcrito, y permitiendo la autocircularización de dicho ARN transcrito para producir el ARNm circular.

12. Procedimiento ex vivo para preparar ARNm circular, comprendiendo dicho procedimiento transfectar un vector, según la reivindicación 1, en una célula eucariota, en el que dicho vector se transcribe mediante una ARN polimerasa de la célula huésped.

13. ARNm circular, en el que dicho ARNm circular tiene en orden un IRES, un 5’ UTR opcional, una secuencia de codificación de interés, un 3’ UTR y una secuencia de poliadenilación.

14. Vector, según la reivindicación 1, para su utilización en terapia génica.

15. Procedimiento ex vivo para bioproducir una proteína, que comprende introducir un vector, según la reivindicación 1, en una célula eucariota para la producción de una proteína codificada por dicho ORF.