CN1162995A - 用于医疗诊断的微凝胶及其制造方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

在一种凝胶盒中制备电泳微凝胶。凝胶盒包括一块盖板，一块底板和一块位于盖板和底板之间的隔离片。隔离片使得盖板和底板间隔25至250微米。将盖板部分密封至底板上，同时留下一个用于引入未聚合凝胶的开口而形成一个凝胶室。然后用未聚合凝胶充填凝胶室，然后令其在凝胶室中聚合。可将电极印刷在板上，或与凝胶的外露边缘接触，或者通过一块板上的窗口接在凝胶上。一种类型的凝胶盒利用了直径25至250微米的分级微珠，该微珠在以丙烯酸酯胶粘剂为例的胶粘剂中形成浆状物，以此用作隔离片。将此浆状物印刷到两块板或其中的一块板的表面上形成要求形状的隔离片，然后利用热或光令其固化。如果需要，可用隔离片在凝胶中形成泳道。

Description

用于医疗诊断的微凝胶及其制造方法和使用方法
发明背景
本发明涉及用于医疗诊断，尤其是用于核酸测序的微凝胶，以及这类凝胶的制造和使用方法。
DNA测序可以利用为实验室使用而设计的自动化系统来进行。在此引用参考的美国专利4,811,218；4,823,007；5,062,942；5,091,652；5,119,316和5,122,345中，描述了用于DNA测序的方法和装置。
这些系统中的一般方法涉及，利用限制性内切核酸酶断裂样品DNA；扩增有关的限制性片段(例如利用PCR)；将扩增后的DNA与测序引物混合，该引物可以与扩增引物相同或不相同；在一般核苷酸(A，C，G和T)和可防止引物被过度延伸的链终止核苷酸例如双脱氧核苷酸存在的条件下，对测序引物进行延伸；分析所得延伸片段产物的长度。该分析可以通过电泳进行，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶上进行核酸测序分析，包括大小和厚度在内的凝胶特性影响着分析所需的时间和花费。由于人们希望能减少测序分析所需的时间和花费使之成为一种诊断手段，所以较好的是有一种凝胶，它能够进行很少量寡聚核苷酸片段的快速分析。本发明的目的之一就是提供这样的凝胶。
本发明目的之二是提供单用途的一次性凝胶盒，可以方便地在其中充以凝胶作快速分析少量样品之用。
本发明目的之三是提供一种制造凝胶的方法，该凝胶能够在短时间内获得对寡聚核苷酸片段很高的分辨力。
本发明目的之四是提供分析含有不同长度寡聚核苷酸片段的样品的方法。
发明概述
本发明的以上目的及其它目的可使用在一凝胶盒中形成的电泳微凝胶来达到。该凝胶盒有一盖板，一底板和位于盖板和底板之间的隔离片。隔离片在盖板和底板之间形成250微米以下的间隔，以25至250微米为佳。将盖板部分密封至底板，留下一个引入未聚合凝胶的开口，由此形成凝胶室。然后在凝胶室中充以未聚合或部分聚合的凝胶，这种凝胶然后在凝胶室中聚合。电极可以印刷在板上，可以令其与凝胶的露出边缘接触，或者可以通过开在一块板上的窗口来插入。
本发明一种较好的实施方式使用了直径250微米以下，以25至250微米为佳的经分级微珠作为隔离片，这些微珠在诸如丙烯酸类胶粘剂或紫外光激活胶粘剂中制成浆状物，或者利用低熔点玻璃与板粘合。将浆状物印刷在两块板或其中的一块板的表面上形成所需形状的隔离片，然后光固化或热固化。如果需要，还可以使用胶粘剂或含有固体颗粒的低熔点玻璃在凝胶内形成泳道。
也可以将大量的微珠置于凝胶室内的两板表面上来形成两板间的间隔。此时，可利用胶粘剂或具有适当厚度的涂有胶粘剂的塑料薄膜来密封边缘。颗粒也可以同时包含在胶粘剂中和凝胶室内。
附图说明
图1显示本发明微凝胶第一种实施方式的分解图；
图2显示本发明微凝胶的第二种实施方式；
图3显示本发明的第三种实施方式；
图4A和4B显示本发明的另外一种实施方式；
图5A和5B显示用于实施本发明的一种凝胶形成插片；
图6显示本发明的一种加样插片；
图7A和7B显示本发明其它加样和凝胶形成插片的实例；
图8显示本发明的一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置；
图9显示本发明的一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置；
图10显示使用本发明对30单体或31单体的混合物的分析结果；
图11A至11F显示M13DNA模板的ddT测序反应的分析结果。
本发明的详细说明
图1显示了本发明微凝胶的第一种实施方式的分解图。如图所示，利用底板1，盖板2和夹在两板之间的隔离片3形成微凝胶。隔离片3和1，2两板的内表面界定了凝胶室4。盖板2上有槽口5用于在凝胶上加样，还有槽口6和7，电极可由此通过而与凝胶接触。
如图1所示的微凝胶可通过如下所述的“挤压充填”来制备。首先，将隔离片3与底板1粘合。然后在凝胶室4区域充以未聚合或部分聚合的凝胶，然后在上面压下盖板2。未聚合的凝胶充满了凝胶室4，过量的凝胶被挤出在板的边缘。然后，凝胶聚合，刮去过量的凝胶。
图2显示了本发明微凝胶的第二种实施方式的分解图，它适合以另一种方法进行充填。在图2中，隔离片23只是位于沿底板1的三边，在第4边上留下缺口。与图1中备有电极槽口6和7不同的是，电极26和27可以以薄膜形式直接沉积于盖板和底板上。合适的电极材料是导体材料例如氧化铟锡(ITO)或铂的薄膜。也可以使用缓冲溶液电极，即其中的常规金属电极(例如铂)与凝胶不直接接触，而由某种浓电解质溶液介导的电极。
可如下制备图2型的微凝胶，首先将底板1，隔离片23和盖板2粘合成凝胶盒。然后将凝胶盒放在一个腔内，开口24垂直向下地位于一未聚合凝胶的容器上方。然后将腔内抽成真空，令凝胶盒下降，其口浸入未聚合的凝胶中，然后重新在腔内充以正压力的气体，将凝胶压入凝胶盒的凝胶室4内。在此实施方式的盖板上不需要槽口，因为凝胶通过开口24而外露，由此可在凝胶进行边缘加样，但是，也可以视需要在盖板上设置一个或多个用于加样和引入电极的槽口。
图3显示本发明的第三种实施方式。此例中，隔离片被用于在凝胶体内产生泳道标记30。这类泳道标记可用于对照每根泳道、每四根泳道或根据使用者的需要按其它间距进行间隔。在一种使用泳道间隔的较好结构中，凝胶被分隔成一系列等宽的泳道。这类泳道的数量由公式(A/4)来确定，其中的A是凝胶中有用的加样位置的数目。
当盖板如图3所示，比底板短时，已发现其优点在于可以令泳道延伸超过盖板的末端而漫过至少部分的底板延伸部分。这样可以使全部泳道都各自从底部向上充填，而且消除了未聚合凝胶从一个泳道溢入相邻泳道和在泳道中部形成气泡的可能性。
图4A和4B显示具有用于加样的窗口5’的盖板2的一种改变形式。窗口的边缘都切割成90°，只有下方边缘31切成30至60°，(以45°为佳)的斜面，正如图4B所清楚显示的。这种设计可改善样品的加入。
具体地说，宜采用图5A所示的凝胶形成插入片和使用图4A和4B所示有切口的盖板来形成凝胶。该插片具有基部1和插入部分52。插入部分52的两端内凹，使其窄于基部。较好的是，各凹槽的大小为2-4mm至5mm。插入部分的自由边做成倾斜，与窗口5’的下方边缘3形成的斜边配合，插片的整体大小经选择可将其插入窗口5’内。例如，合适的尺寸是12.5cm宽，1.5cm高，1mm厚。可在基部31的一侧表面设置一扣环或把手以方便取出。
在凝胶聚合前，最好是在充填凝胶室前，将凝胶形成插片放入窗口，如图5B所示。可用胶带限制凝胶形成插片的移动，将其与底板固定以防在注入的溶液上飘浮。在凝胶盒中注入适量的可聚合溶液后，溶液就充满凝胶室直至凝胶形成插片，部分溶液在此从凝胶形成插片的边缘绕过，从气孔溢出凝胶盒。如果注入凝胶盒的溶液严重过量，溶液甚至可能会从顶部冒出。过量的凝胶对有效的聚合、加样或凝胶的使用没有任何明显影响，可以视需要将其刮去。
UV催化聚合后，要成功地使用本发明的微凝胶，重要的是小心地取出凝胶形成插片而不损坏凝胶。聚合后，如果凝胶盒是向它的表面倾斜的，凝胶形成插片易于向前落出。可能需要轻拍底板来帮助凝胶形成插片的取出。只要凝胶形成插片的一边突出于盖板平面，就可以抓住它而小心地将其抽出，与接触的已固化凝胶脱离。或者，可以利用粘合在凝胶形成插片外表面的胶带将其抽出。使用这两种方法都必须小心，以保持最终沿盖板上的窗口形成的光滑的凝胶边缘。
取出凝胶形成插片形成一个横跨凝胶宽度，由窗口的斜边、凝胶本身和底板包围的槽口，可在其中加入样品。样品正是加入此槽中进行电泳的。
由于此槽口沿凝胶宽度是连续的，因而没有一般用于在凝胶上加样的多个槽孔。所以在如上所述地在成形凝胶上加样时，需要特别采用经特别改进的图6所示的加样插片。该插片具有基本上为矩形的基部61，它具有两条长边和两条短边；从基部的一条长边伸出许多指状体62。每个指状体以0.5至3mm宽为宜。指状体按2至7mm的间隔均匀地分布在沿基部长边的一定区域内，该区域是起始和终止在距离两相邻短边2至4cm的位置，从而使得指状体能配合在槽口内。指状体都在其远端具有30至60°的斜面，以与加样插片的斜面和窗口的下方边缘吻合。将该插片放在利用凝胶形成插片形成的槽口内，然后将样品加在指状体之间。
制备微凝胶和加样的第二种不同的方法，需要在聚合梳插片的存在条件下形成凝胶，该插片具有一系列可在凝胶上形成加样孔的扁平延伸体。聚合梳插片取代了凝胶形成插片用于微凝胶的充填和聚合步骤。聚合梳插片的大小与凝胶形成插片一样，但是，不同于与盖板上窗口的底边吻合的、平整的45°斜面底边，沿底边每隔一定间隔(例如7mm)，有一个约2mm宽、5mm深的凹槽。结果是形成一列齿状体，每个齿的底边成45°斜面，可与盖板窗口的底边吻合。聚合梳插片放入凝胶盒的窗口后，可利用胶带固定，以致整个窗口完全被覆盖。于是在胶带上加设气孔。然后在凝胶盒中注入溶液。溶液充满凝胶室，并流入聚合梳的齿状体之间的空隙。过量的溶液从气孔中流出。然后可以如本发明所述，利用UV诱导催化令溶液聚合。完全聚合后，小心地去除胶带和聚合梳插片，留下一列凝胶柱竖直地位于底板上。凝胶柱起着界定一些井的作用，这些井可用来分隔利用常规方法加入的样品。已发现，如果在制成微凝胶盒前，用BindSilane(Pharmacia)处理凝胶室的盖板和底板表面，微凝胶会具有更好的加样和使用性能。
图7A和7B显示在底板的延伸部分具有泳道分隔体时(图3)使用的充填塞和加样梳的不同设计。此时，在用于容纳泳道分隔体的插片一侧表面上形成凹槽101。较好的是，凹槽略宽于泳道分隔体，可在充填步骤中允许空气和过量的凝胶溢出。
本发明微凝胶的盖板和底板最好是透明的玻璃板。例如，宜采用1mm厚的低荧光玻璃作为本发明的盖板和底板。1mm厚的硼硅酸盐玻璃具有较大的紫外光透过性，是另一种较好的材料。也可以使用例如塑料之类的其它材料，但是，其荧光强度的范围必须不至于干扰对测序核酸聚合物上发光标记的检测也不得抑制凝胶的聚合。
本发明微凝胶中隔离片3起着在盖板和底板间产生空隙而形成凝胶室的作用。根据本发明，宜选用合适的隔离片，使该空隙在约25至250微米之间，25至100微米更好。因为制造过程必须加倍小心，例如清扫房间来防止可能大于所需空隙的灰尘颗粒污染板的表面，所以更小的空隙是不实用的。而且，空隙越小，两板的平整度就显得越重要。最后，可能需要减少加入凝胶的样品量来避免凝胶分辨能力的下降，这意味着用于检测的由样品发出的信号将较小。大于250mm的空隙可以使用，但这并不好，因为给定组成的凝胶其电阻都会随空隙的增大而增大，这意味着在较厚凝胶中的一定电场强度下，会出现较大的电流及由此产生的较大的电阻热。而且，如果隔离片是通过将胶粘剂涂于两板之一上或两个板上而成的，则须形成一层与空隙基本上等厚的胶粘层。可能很难找到这样一种胶粘剂，其粘度足以使其在隔离片颗粒的开口之间形成跨接，具有尽可能小的溢出量，能够令板沉积到隔离片上，并尽可能减少在涂敷过程中形成的空洞。
用于本发明的一种形式的隔离片是利用胶粘剂固定在盖板或底板上的聚合物薄膜。例如，可将涂有丙烯酸酯胶粘剂的聚乙烯薄膜切割成要求的大小和形状形成隔离片。合适的聚乙烯薄膜包括3M公司出售的商标为SCOTCHCAL的1，2，4密耳薄膜。
还可以在盖板或底板上将颗粒在可固化材料中形成的浆状物通过丝网印刷成要求的形状，由此形成隔离片。例如，在以此方法形成隔离片时，较好的材料是将UV可固化和/或热可固化丙烯酸酯胶粘剂与分级颗粒(具有合适的大小，能界定要求的板间空隙)制成的浆状物。合适的胶粘剂包括LoctiteCHIPBONDERTM#346，347，360和3603，IMPRUVTM349，363，365H 366，以及通用紫外胶粘剂352；和MinicoM07950-R丙烯酸酯胶粘剂。
不同于使用胶粘剂的另一种方法是使用低熔点玻璃粉末和大小合适的固体颗粒的混合物来形成隔离片。该混合物在板上丝网印刷成要求的形式，例如在凝胶室内形成泳道，然后加热熔解低熔点玻璃粉末。冷却后低熔点玻璃即再固化，将固体颗粒粘合在板上。此外，可单独使用低熔点玻璃或与胶粘剂联用来粘合盖板和底板。
玻璃粉即“玻璃料”其熔点以约400至500℃为佳，而固体颗粒珠和板的熔点为600至800℃。尽管存在此熔点差异，仍需注意令玻璃粉末、板和固体颗粒的热膨胀系数相互配合，以避免在冷却时因收缩而形成空洞。各种材料的膨胀系数的差异在10％之内时，可获得认可的结果。
还可以使用自动喷胶枪将颗粒在胶粘剂中形成的悬浮液喷涂在玻璃板上成为要求的形式。该方法与丝网印刷相比的优点在于，实际上除了胶粘剂之外没有其它物质与板接触。
利用这种方法可以仅在一块板上形成隔离片。但较好的是，在盖板和底板上都印刷相互配合的图形，将后将两板对齐并压合，在两板间形成隔离片。虽然此方法需要仔细的对齐，但是已发现其优点在于减少了形成于隔离片内的气泡和空洞，由此产生一致性更好的产品。
两板之间的间距还可以进一步利用固体微珠在凝胶自身中形成的分散系来确定和维持。这可以通过在凝胶盒形成前将适当大小的微珠(例如玻璃珠)在挥发性溶剂中形成的浆状物均匀地涂布在其中一块板的内表面而做到，溶剂挥发后留下固体颗粒分布在板的表面上。
本发明凝胶的优点还在于，相继制备的凝胶间是高度一致的。这一优点主要是由于在大量生产过程中严格控制了隔离片的厚度。
本发明的微凝胶可用于迅速而准确地分析荧光标记的寡聚核苷酸不同长度片段的混合物。该过程主要是：首先将混合物加样到本发明微凝胶的起始位置，然后给电泳凝胶加上电势，电流由此通过电泳凝胶，令混合物中的寡聚核苷酸片段迁移离开起始位置，并通过凝胶上一个远离起始位置的检测位置。然后测定越过检测位置的寡聚核苷酸发出的荧光。
如前所述，有多种形式的电极可用于给凝胶加上电势。通过这些电极，利用标准的电泳电压电源产生高至350V/cm(以150至350V/cm为佳)的电场。这样高电场强度的优点在于片段可以通过凝胶快速迁移，由此减少分析片段所需的时间。快速迁移还减少了片段在凝胶内的扩散碰撞，由此产生更好的分辨率。这样大小的电场强度是无法用于大型凝胶的，即厚度为0.35mm或更厚的凝胶，因为会出现较大电流和由此产生的加热问题。
图8显示一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置。在图8中，光源41，例如氩离子激光器，发出一束大致平行于凝胶42表面的激发光束40。激发光束透过光束扩展器43和去除非所需波长光线的干扰滤波器44，然后照射到衍射镜45上，衍射镜经选择可反射激发波长的光而发射荧光标记发射波长的光。衍射镜45将激发光束40反射到微凝胶42上。当荧光标记的寡聚核苷酸通过此激发光束时，荧光向各个方向发射，其中包括返回到衍射镜45上的。该光束46透过衍射镜45，经过选择可将发射波长与散射和非特异性荧光分离的干扰滤波器47，再经过将光束46聚焦到光电倍增管49上的透镜48。
图9显示根据本发明的另一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置。如图所示，来自光源81的激发光束80以一定的角度(一般为45至65度)射到微凝胶82的表面。光86朝向光电倍增管89进行发射，然后或再透过聚光透镜和滤光器(未表示)。
还可以使用其它的装置和装置结构。例如，虽然图8和图9所示的装置都用光电倍增管作为检测器，但也可以使用其它类型的检测器。在使用与同一凝胶上的多道样品对齐的成排检测器的装置中，特别适合使用光电二极管。
此外，本领域熟练技术人员懂得，本发明并不限于使用氩离子激光器作为光源。虽然氩离子激光因其发射波长488可有效的激发荧光而较为方便，但使用最大吸收波长不同的其它标记时，会需要使用其它类型的激光或例如汞灯或氙灯等常规光源，与合适的滤光器结合使用。
本发明的凝胶盒原则上可用于利用任何凝胶形成材料来形成微凝胶，包括琼脂糖凝胶。但是，较好的凝胶材料是聚丙烯酰胺凝胶。可以使用化学交联催化剂(例如TEMED和过硫酸铵)或光激活交联系统(例如核黄素和紫外光，或亚甲基蓝和蓝光(450nm))来形成聚丙烯酰胺凝胶。
在将光聚合凝胶与光固化胶粘剂结合使用时，以选择各自的聚合波长不同的凝胶和胶粘剂为宜。这是因为人们观测到有些UV活化胶粘剂中含有的某些材料会使后继的UV固化凝胶固化过程中断(或者通过吸收激发光，或者通过聚合反应引发剂激发状态的终止)。通过将聚合反应改变到一个波长，可降低或者消除这种中断效应。
在使用凝胶分析寡聚核苷酸片段前，可能需要预试一下凝胶，即对试验电泳的缓冲液，施加一定的电势差，但不加样品。这样的预试可以去除来自聚合反应的、可能干扰寡聚核苷酸的迁移或检测的过量反应物。此外，由于试验缓冲液中的某些组份，尤其是尿素，会降解丙烯酰胺凝胶，只在实际进行分析前才引入这些组份能够延长微凝胶的保存时间。
本发明的实施可以通过以下实施例进一步得以说明。
                     实施例1
在1mm厚的压延玻璃制成的凝胶盒中，用6％丙烯酰胺(19∶1的丙烯酰胺∶二丙烯酰胺，7M尿素，0.6×TBE)制备凝胶。围绕底板边缘有50mm的垫片，形成一个15mm宽和75mm长的中心开口。在开口处加入未聚合的凝胶，然后放上盖板将凝胶挤压至由垫片隔离片包围的、要求的50mm厚度。聚合后，从玻璃板的边缘刮去过量的凝胶。
制备一测试混合物，其中含0.1ng/ml30单体，其序列如下：
ATCGGCTAAT CGGCTAATCG GCTAATCGGC                  [Seq ID No.：1]
和0.1ng/ml31单体，其序列如下：
ATCGGCTAAT CGGCTAATCG GCTAATCGGC T                [Seq ID No.：2]这些核苷酸是由一核苷酸的常规供应厂家(Oligos Ect)按照发明者的要求合成的，并在5’端用荧光素进行了标记。
将100nl测试样品(含每种寡聚核苷酸100毫微微摩尔)用一把毛细管边缘加样到凝胶的顶端。将尺寸为35mm×8mm，厚0.25mm的氧化铟锡长条电极铺放在聚合后凝胶的两端，然后将电极与电泳电源连接，对凝胶施加100V/cm的电场。使用图8所示的氩离子激光系统检测出荧光标记的寡聚核苷酸越过距离起点55至65mm的某一位置的通过。图10中给出由光电倍增管测得的信号。在3分钟的试验时间内，信号分成对应于30单体(峰A)和31单体(峰B)的两个峰。
                       实施例2
用与2％(重量)Sigma玻璃珠(106微米和更小的，经过滤选出大小为45至53微米的珠子)混合的Emerson&Cuming Inc.，Wobum，MA的MinicoM07950-R丙烯酸酯胶粘剂，制备一种UV激活的胶粘剂基质。将这种胶粘剂基质按图3所示的形式丝网印刷到盖板上。然后如图3所示，将盖板放到底板上。然后这两个板经20瓦特UVA光(波长315至385nm)照射，引发胶粘剂的固化将两板粘合在一起。
胶粘剂固化后，将此凝胶盒水平放入一矩形的充填装置(美国专利08/332,892和与其同时申请的CIP，在此引用参考)。简而言之，微凝胶盒被放置在四边形的充填框内，并且是放在一充填室的上一格。在此充填室中，聚丙烯酰胺的凝胶形成溶液被压入凝胶盒中，然后经位于充填室内的20WUVA灯发出的紫外光照射一定时间，该时间应足以令凝胶聚合。
使用的凝胶形成溶液含6％丙烯酰胺(19∶1二丙烯酰胺)，7M尿素的0.6×TBE溶液和10ppm核黄素。通过在25ml丙烯酰胺溶液中加入10.4％的核黄素水溶液10μ来引入核黄素。
                        实施例3
以图2所示的形式将实施例2所述的UV激活的胶粘剂基质丝网印刷到底板上。加入100％乙醇和1％(重量)玻璃珠(45至53微米)形成的浆状物1ml，并在底板上均匀分布。室温下放置5分钟后，如图2所示放上盖板，将两板压合在一起。然后经20瓦特UV光(315至385nm)照射引发胶粘剂的固化将两板粘合成凝胶盒。
将丙烯酰胺溶液注入此微凝胶盒中，如实施例2所述聚合。注入的压力洗出了其中一部分尺寸最小的玻璃微珠。在放入加样插片前从凝胶表面方便地去除这些微珠。
                        实施例4
如实施例2所述制备微凝胶，在微凝胶聚合过程中使用插入板。小心除去插入板代之以加样插片。将微凝胶盒垂直放在电泳装置中。在加样孔中移液加入3μl制备的溶液，其中含有以M13模板DNA进行的全荧光标记ddT DNA测序反应的产物，和作为附加的可见分离标记的亚甲基蓝和二甲苯胺。
将微凝胶窗与含有铂电极的TBE容器利用垫片密封，形成TBE溶液电极。微凝胶的“底”浸在含有铂电极的TBE容器中。为了发散电泳时产生的热量。利用真空抽吸将一铝板贴合在微凝胶盒的背面上。在两电极之间加以电压，在微凝胶中产生300V/cm的电场。
在此电场作用下，DNA片段在微凝胶中迁移通过检测区。使用图8所示的氩离子激光检测系统，检测荧出光标记片段越过距离起点100mm某一位置。图11A至11F图示了，由光电倍增管测得的ddT反应检测信号随时间的变化。由图11A至11F可见，电泳开始后约4.9分钟可观察到比引物多1个核苷酸的ddT延伸产物。电泳开始后13.8分钟内，可清楚地分辨出至少300个核苷酸的片段。
                          实施例5
如实施例2所述制备微凝胶，所不同的是用亚甲基蓝引发系统代替核黄素。该引发系统由100μM亚甲基蓝，1mM亚磺酸甲苯钠和50μM氯化二苯基碘鎓组成。用蓝光源(450nm)例如石英卤素灯来聚合凝胶。
                          实施例6
将10∶3或1∶1的Ferro Corporation(Cleveland，Ohio)的7570号玻璃与一种粘合剂Cerdec Corporation(Frankfurt，Germany)的产品80863以及10％(重量)照实施例2制备的玻璃珠形式的固体颗粒混合，由此制备可丝网印刷的低熔点玻璃组合物。玻璃7570的颗粒大小D50为30.99微米，热膨胀系数(25-260℃)82.6×10-7/℃，密度为5.36g/cm3，软化点为449℃。产品80683是一般用于给陶瓷上釉的水溶性粘合剂。可用于本发明的其它产品还包括Dow Chemical的METHOCEL粘合剂。
将这三种组份混合成糊状物后，按所要求的形式(例如图2和图3所示)将其丝网印刷在玻璃板上。然后将板在125℃加热10分钟，再在320℃加热10分钟制出密封糊。密封时，将板在450℃的炉内放置25分钟令玻璃粉末预熔。然后将另一块板放在该板上，其间夹有预熔的材料。然后将此叠置的组合件再在470℃的炉内放置25分钟，令两块板最后粘合在一起。为了保证板间空隙均匀，在板的外侧施加压力。可以利用夹具，在上面的板上放置重物，或使用自上而下对两块板作用的气动活塞来施加这种压力。
序列表(1)一般信息(i)申请人：Renfrew，John，A.
       Waterhouse，Paul
       Stevens，John K.
       Zaleski，Henryk(ii)发明名称：用于医疗诊断的微凝胶及其制造方法和使用方法(iii)序列数目：2(iv)联系地址：(A)地址：Oppedahl&Larson(B)街道：1992 Commerce Street Suite 309(C)城市：Yorktown Heights(D)州：NY(E)国家：美国(F)邮政编码：10598(v)计算机可读形式：(A)媒体类型：软盘-3.5寸，1.44MB(B)计算机：IBM兼容机(C)操作系统：MS DOS5.0(D)软件：Word Perfect(vi)申请数据：(A)申请号：(B)申请日期：(C)申请类型：(viii)委托人/代理人信息：(A)姓名：Marina T.Larson(B)登记号：32,038(C)参考/记录号：VGEN.P-005-WO(ix)联系信息：(A)电话：(914)245-3252(B)传真：(914)962-4330(2)序列1的信息：(i)序列特征：(A)长度：30(B)类型：核酸(C)链形式：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(iii)假设：无(xi)对序列1的描述：ATCGGCTAAT CGGCTAATCG GCTAATCGGC    30(2)序列2的信息：(i)序列特征：(A)长度：31(B)类型：核酸(C)链形式：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(iii)假设：无(xi)对序列2的描述：ATCGGCTAAT CGGCTAATCG GCTAATCGGC T    31

Claims (66)

1.一种微凝胶盒，它包括
(a)盖板；
(b)底板；
(c)将盖板与底板密封成一个厚250微米以下的凝胶室的密封装置，所述的密封装置上留有开口，通过此开口可用未固化的凝胶充填凝胶室；
(d)大量固体颗粒，所述的固体颗粒位于盖板和底板之间，其平均直径基本上等于凝胶室的厚度。
2.根据权利要求1所述的微凝胶盒，其中将两板密封的装置包含沿盖板和底板至少两条对边涂在盖板和底板之间的胶粘剂。
3.根据权利要求1或2所述的微凝胶盒，其中至少有一部分固体颗粒分散在胶粘剂中。
4.根据权利要求1或2所述的微凝胶盒，其中的固体颗粒利用低熔点玻璃粘合在两块板中的至少一块上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微凝胶盒，其中的凝胶室被分隔成多条泳道。
6.根据权利要求5所述的微凝胶盒，其中的凝胶室利用含有至少部分固体颗粒的多条胶粘剂分隔成多条泳道。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微凝胶盒，其中在将盖板密封到底板上之前，至少有一部分固体颗粒是分布在盖板或底板的一个表面上。
8.根据权利要求7所述的微凝胶盒，其中是将颗粒在挥发性液体中的浆状物进行涂布使固体颗粒分布在盖板和底板上，所述的挥发性液体在将盖板与底板密封前挥发掉。
9.根据权利要求2，3或5至8中任一项所述的微凝胶盒，其中的胶粘剂通过丝网印刷印在盖板或底板上。
10.根据权利要求2，3或5至9中任一项所述的微凝胶盒，其中的胶粘剂是丙烯酸酯胶粘剂。
11.根据权利要求2，3或5至10中任一项所述的微凝胶盒，其中的胶粘剂是光激活胶粘剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的微凝胶盒，其中凝胶室的厚度为25至250微米。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的微凝胶盒，其中凝胶室的厚度为25至100微米。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的微凝胶盒，其中的盖板上切有一个加样孔。
15.根据权利要求14所述的微凝胶盒，其加样孔上覆盖有一条可去除的胶带。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的微凝胶盒，其中的微凝胶盒是一次性的。
17.一种用于分离样品的微凝胶，它包含
(a)盖板；
(b)底板；
(c)将盖板与底板密封成一个厚250微米以下的凝胶室的密封装置，所述的密封装置留有开口，通过此开口可用未固化的凝胶充填凝胶室；
(d)大量固体颗粒，所述的固体颗粒位于盖板和底板之间，其平均直径基本上等于凝胶室的厚度；
(e)装在凝胶室内的电泳凝胶。
18.根据权利要求16所述的微凝胶，其中密封两板的装置是沿盖板和底板至少两条对边，涂于盖板和底板之间的胶粘剂。
19.根据权利要求17所述的微凝胶，其中至少有一部分固体颗粒分散在胶粘剂中。
20.根据权利要求17或18中任一项所述的微凝胶，其中的固体颗粒利用低熔点玻璃粘合在两块板中的至少一块上。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的微凝胶，其中的凝胶室被分隔成多条泳道。
22.根据权利要求21所述的微凝胶，其中的凝胶室利用含有至少部分固体颗粒的多条胶粘剂分隔成多条泳道。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的微凝胶盒，其中在将盖板密封到底板上之前至少有一部分固体颗粒是分布在盖板或底板的一个表面上。
24.根据权利要求23所述的微凝胶，其中是将颗粒在挥发性液体中的浆状物进行涂布使固体颗粒分布在盖板和底板上，所述的挥发性液体在将盖板与底板密封前挥发掉。
25.根据权利要求18，19或21至24中任一项所述的微凝胶，其中的胶粘剂通过丝网印刷印在盖板或底板上。
26.根据权利要求18，19或21至25中任一项所述的微凝胶，其中的胶粘剂是丙烯酸酯胶粘剂。
27.根据权利要求18，19或21至26中任一项所述的微凝胶，其中的胶粘剂是光可固化胶粘剂。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的微凝胶，其中凝胶室的厚度为25至250微米。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的微凝胶，其中的盖板上切有一个加样孔。
30.根据权利要求29所述的微凝胶，其加样孔上覆盖有一条可去除的胶带。
31.根据权利要求17至30中任一项所述的微凝胶，其中的微凝胶是一次性的。
32.根据权利要求17至31中任一项所述的微凝胶，其中的电泳凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。
33.根据权利要求17至32中任一项所述的微凝胶，其中的电泳凝胶是光聚合凝胶。
34.一种制造电泳凝胶的方法，包括以下步骤：
(a)将大量固体颗粒涂于第一板的一个表面上；
(b)形成包含第一板和第二板的凝胶盒，即将第一板部分地密封在第二板上，使固体颗粒位于第一板和第二板之间，并在第一板和第二板之间形成一个厚250微米以下的凝胶室，所述凝胶室有一个用于引入凝胶的开口；
(c)用未聚合凝胶充填凝胶室；
(d)聚合凝胶室内的凝胶，其中的固体颗粒直径基本上等于凝胶室的厚度。
35.根据权利要求34所述的方法，其中的固体颗粒以与低熔点玻璃粉末形成的混合物形式涂在板上，还包括以下步骤：
加热上面有固体颗粒和低熔点玻璃粉末的板，令低熔点玻璃熔化，
然后将板冷却使低熔点玻璃重新固化，由此将固体颗粒藉重新固化后的玻璃与板的表面粘合。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中的第一板利用胶粘剂与第二板密封。
37.根据权利要求36所述的方法，其中的胶粘剂通过丝网印刷进行涂布。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中至少有一部分固体颗粒分散在胶粘剂中。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中的胶粘剂是丙烯酸酯胶粘剂。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中两板之间的间距为25至100微米。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中的凝胶是聚丙烯酰胺。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中的凝胶被分隔成两条或两条以上泳道。
43.根据权利要求42所述的方法，其中的泳道利用含有至少部分固体颗粒的多条胶粘剂分隔而成。
44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中在形成凝胶室之前至少有一部分是分布在盖板或底板的一个表面上。使得许多颗粒位于微凝胶的凝胶室内部。
45.根据权利要求44所述的方法，其中是将颗粒在挥发性液体中形成的浆状物进行涂布使固体颗粒分布在盖板和底板上，所述的挥发性液体在将盖板与底板密封前挥发掉。
46.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中的凝胶是光聚合的。
47.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，还包括这一步骤，即在将盖板装成凝胶盒之前，在其上面切割出加样孔和电极孔。
48.根据权利要求47所述的方法，在充填凝胶室之前用可去除的胶带密封加样孔和电极孔。
49.根据权利要求48所述的方法，其中的可去除胶带允许UV光的透过。
50.根据权利要求34至49中任一项所述的方法，还包括这一步骤，即在将盖板装成凝胶盒之前，在其上面切割出一个基本为矩形的加样孔，所述的加样孔位于盖板的一端，使得由加样孔加入的样品向盖板上的另一端迁移。
51.根据权利要求50所述的方法，其中加样孔有一道最靠近板另一端的长边，所述的长边是斜的，使加样孔在第一表面的尺寸大于相对的第二表面，其中凝胶盒的装配使得第一表面在凝胶盒内部。
52.根据权利要求51所述的方法，还包括这一步骤，即在凝胶聚合之前在加样孔内放置一插片，该插片具有与加样孔的斜面相吻合的斜面，由此在盖板的斜边和凝胶之间形成一个槽口，样品就加在其中。
53.一种分析不同长度的经标记寡聚核苷酸片段混合物的方法，它包括：
(a)在微凝胶上的起点位置加入混合物，所述的微凝胶包含
相互密封后形成一个厚250微米以下的凝胶室的盖板和底板，
大量固体颗粒，其平均直径基本上等于凝胶室的厚度，所述的大量固体颗粒分布在凝胶室内，
装在凝胶室内的电泳凝胶；
(b)给电泳凝胶加以电压，产生一个100V/cm以上的电场强度，由此令电流流过电泳凝胶，结果混合物中的寡聚核苷酸片段由起点位置进行迁移，通过凝胶上一个远离起点的检测位置；
(c)检测越过检测位置的寡聚核苷酸。
54.根据权利要求53所述的方法，其中的电泳凝胶是聚丙烯酰胺。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中至少有一部分固体颗粒分散在胶粘剂中。
56.根据权利要求55所述的方法，其中的胶粘剂是丙烯酸酯胶粘剂。
57.根据权利要求53或54所述的方法，其中至少有一部分固体颗粒利用低熔点玻璃粘合在两块板的至少一块上。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中寡聚核苷酸片段是经荧光标记的，在其越过检测位置时利用荧光检测器对其进行检测。
59.根据权利要求58所述的方法，其中利用氩离子激光检测荧光标记的寡聚核苷酸。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中产生超过150V/cm的电场强度。
61.根据权利要求53至61中任一项所述的方法，其中产生250至400V/cm的电场强度。
62.根据权利要求53至61中任一项所述的方法，其中至少有一部分固体颗粒分散在凝胶室内的凝胶中。
63.一种用于向电泳凝胶上加样的加样插片，它包括
(a)基本上为矩形的平面基部，它具有两条长边和两条短边以及上、下表面；
(b)大量指状体，这些指状体从基部的第一长边延伸出来，与基部的上、下表面共平面，每个指状体均宽0.5至3mm；所述指状体以2至7mm的间隔均匀分布在基部第一长边的一定区域内，该区域的起点和终点距离基部的相邻短边2至4mm；每个所述指状体在远端都有一个指尖部分，所述的指尖切割成相对基部平面成30至60度角的斜面，从而使每个指状体的下表面长于上表面。
64.根据权利要求63所述的加样插片，其中的指状体在其远端都具有一个45°的斜面。
65.根据权利要求63或64所述的加样插片，其中加样插片的下表面具有多条沟槽，所述的这些沟槽与指状体平行而且在整个加样插片的下表面上都有。
66.用于充填电泳凝胶盒的充填插片，它是一个基本上为矩形的平板形元件，该元件具有两条长边和两条短边以及上、下表面，其中
一条所述的长边具有与元件体平面成30至60度的斜面，使得元件的下表面大于上表面，
而且元件的下表面上具有许多条沟槽，所述的这些沟槽与短边平行，从一条长边延伸至另一边。
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