JPS6332362A - 電気泳動分析用材料の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、電気泳動分析用材料の製造法に関するもので
ある。本発明は、特に電気泳動分析に用いられる分離用
媒体膜を二枚のフィルムの間にはさんだ平板型の電気泳
動分析用材料の製造法に関するものであり、取扱いやす
く、かつオートラジオグラフィーの実施に有用な電気泳
動分析用材料の光重合法による製造法を提供するもので
ある。

［発明の背景］ 平板型電気泳動法は、電気を導くことのできる平板状の
媒体膜中での電場による移動度が、物質によって異なる
ことを利用して分析を行うものであり、特に生化学、医
学の分野において、生体由来物質、例えば蛋白質、核酸
などの分離分析に欠くべからざる手段となっている。と
りわけ、遺伝子工学あるいは遺伝病の研究において、し
ばしば行なわれているＤＮＡの塩基配列の決定操作のた
めには、塩基特異的に分解された四種のＤＮＡ分敲物或
いは塩基特異的に鎖伸長反応に供せられたＤＮＡ混合物
の泳動距離を相互に比較することが必要であるため、平
板型の電気泳動分析法が必須である。

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
ガロース、ポリアクリルアミドなどの高分子ゲルは一枚
の支持体の上または二枚の支持体の間にゲルを形成させ
、膜状物（層状物）または円筒の内部に充填した柱状物
として用いられてきた。しかしながら、支持体上にゲル
を形成して用いる方法では、支持体上にゲルを形成する
時、高分子ゲル膜を有する支持体を電気泳動槽にセット
する時、ゲル膜の保存中、あるいは分析試料を添加する
ときなどにあやまってゲル膜をこわしたり、試料以外の
ものをゲル膜の上に落してゲル膜を損ったりすることな
どがあり、操作上細心の注意と熟練が必要であった。一
方、二枚のガラス板などでモールドをつくり、この中で
ゲルを生成させて、そのモールドを垂直に保ったまま電
気泳動分析を行う垂直式電気泳動法においては、モール
ドの厚さを均一にすることが困難であったり、ゲル形成
液がゲル化しないうちに、狭いモールド中にゲル液を注
入しなければならないことなど操作上高度の熟練を要し
ていた。特に、ＤＮＡの塩基配列決定操作においては、
一枚のゲル膜で出来るだけ多くのＤＮＡの断片を分析で
きるように、長いゲル膜を作ることが望ましいが、その
ようなゲル膜はその製造および取扱いがむずかしがった
。

また、ガラス板を用いるため、そのガラス板が破損しや
すいという欠点もあった。

電気泳動分析においては、ラジオアイソトープで被検試
料中の目的成分を標識し、電気泳動分離した後に、オー
トラジオグラフィーによって被検試料中の目的成分の分
離像を得ることがしばしば行なわれる。この方法におい
ては、ラジオアイソトープを含む電気泳動分離用媒体膜
とそれからの放射線を記録する写真フィルムとを重ねて
暗所に放置する操作（露光操作）を行うが、この際、平
板型のゲル膜の場合、写真フィルムが湿らないように、
ゲル膜の上にプラスチック製ラフピングシートなどの水
不透過性の薄いシートをかぶせなければならない。また
、二枚のガラス板の間に作ったゲル膜の場合には、片方
のガラスを取り外して（これは、ゲル膜中の被検試料の
アイソトープからの放射線が、ガラスを通過する際に吸
収されてその強度を著しく弱められるのを防止するため
である）、薄いシートをかぶせなければならない。

このガラス板を取り除く時に、誤ってゲル膜の一部が上
のガラスに、他の一部が下のガラスに付着するようにし
てゲル膜が破損することもあり、ゲルを破損することな
く片方のガラスのみを取り除くには熟練が必要であった
。

更に、プラスチック製ラフピングシートのような薄いシ
ートをかぶせる時、ゲル膜とシートとの間に泡が残った
り、シートにしわができたりすることが多く、このため
ゲル膜と写真フィルムとの密着性が悪くなり、得られた
オートラジオグラフが、ぼけてしまい、分離能が低下す
るという大きな欠点もあった。

このような問題点を改良したゲル膜シートは、たとえば
特開昭５９−１２６２３７号公報に開示されている。こ
のゲル媒体はＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（
Ｂ　Ｉ　Ｓ）のような二官渣性化合物によるアクリルア
ミドの重合と架橋により得られる０重合の反応開始の最
も広く用いられているのは、カリウムまたはアンモニウ
ムの過硫酸塩および反応促進剤のＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’
　−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を使
用し、リボフラビンあるいはりポフラビンリン酸エステ
ルナトリウム塩のような光増感剤を添加して光重合させ
重合、架橋させる方法である。光増感剤によって開始す
る重合は、紫外線（Ｕ　Ｖ）源の適性波長（吸収）及び
光強度によって重合速度は影！を受けることが知られて
いる。電気泳動用ゲルの製造においては短時間にゲル化
させることが生産性上好ましく、強い強度の光源を用い
るのが望ましい。

しかしながら１本発明者の研究によると、一般に高強度
の光源（例えば高圧水銀灯）を使用すると、高熱が発生
し、このような高強度の光源からの光をゲル形成液に直
接照射すると、高熱がゲル媒体に加えられることになり
、ゲル媒体の温度が上がり、媒体中の水分が蒸発するた
め、性能の安定化がしにくいといった重大な欠点が生ず
ることが判明した。その為、光源の発熱を吸収するため
水を中間に一層設置する冷却方式を利用することも考え
られるが、この方法でも充分に熱を吸収することが出来
ない。なお、強い光を、熱を与えることなく照射したい
場合には、光を鏡により反射させて光を重合系に照射さ
せるコールドミラー法を利用することも知られているが
、このような方法を利用すると光源と重合系の距離が長
くなり、結果的に照射強度が低下することになったり、
装置工大がかりな設備をすることが必要となるため生産
上好ましくない。

［発明の構成］ 本発明は、膜状に形成されたアクリルアミドモノマーと
架橋剤とを含有する水性液にキセノンフラッシュランプ
光源からのフラッシュ光を照射して、該水性液内で架橋
重合を発生させ、水性ゲル膜とすることからなる電気泳
動分析用材料の製造法にある。

本発明によれば、ゲル形成液のゲル化に際してキセノン
フラッシュ光源を用いることにより、ゲル形成液に付与
される８賃を余り大きくすることなく、ゲル形成液に高
い強度の光を与えることができる。従って、本発明の製
造法により得られるゲル媒体中は、その水分の含有量を
容易に調節することができ、信頼性の高い電気泳動用の
媒体を高い生産性にて得ることができる。

［発明の詳細な記述］ 本発明は、上記のように膜状に形成されたアクリルアミ
ドモノマーと架橋剤とを含有する水性液（ゲる形成液）
に光を照射して、該ゲル形成液内で架橋重合を発生させ
て水性ゲル膜とすることからなる電気泳動分析用材料の
製造法の改良を提供するものである。

ゲル形成液を膜状に形成する操作は通常、プラスチック
フィルムあるいはガラスシートなどのシート状物の上に
ゲル形成液を塗布する操作により行なわれる。このシー
ト状物は、そのままゲル膜の支持体（電気泳動用媒体材
料の支持体）としてＩａ　を辷するシート状物であるこ
とが好ましい。

電気泳動用媒体材料の支持体はプラスチック材料もしく
はガラスから形成されるシート状物（フィルム状物も含
む）である、プラスチック製シートとしては、任意のプ
ラスチック材料から形成したものを用いることができる
。好ましいプラスチック材料の例としては、ポリエチレ
ンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネー
ト、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース
アセテート、およびセルロースアセテートプロピオネー
トをあげることができる。

プラスチック材料製支持体は公知の表面活性化処理によ
り表面を親水化したものであることが好ましい。表面親
水化処理のためには紫外線照射、グロー放電処理、コロ
ナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチン
グ、電解エツチング等の公知の方法を適用することがで
きる。

と記支持体としては、一般に厚さが約５０〜５００ルｍ
、好ましくは約７０〜３００湊ｍのものが用いられる。

次にゲル形成液について説明する。

本発明で用いるゲル形成液は、アクリルアミドモノマー
と架橋剤とを、水溶液または水分散液として水中に溶解
または分散させてなるゲル形成液である。

アクリルアミドモノマーの例としては、アクリルアミド
、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミド系化合物
やメタクリルアミド等のメタクリルアミド系化合物が挙
げられ、これらの化合物は単独で、あるいは二種以上を
併用して用いることができる。これらの７クリルアミド
モノマーのうちではアクリルアミドが最も好ましく、ま
たアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物、メタ
クリルアミド系化合物の一種以上の併用も好ましい。

架橋剤としてはｒ　ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＪ
　１９Ｂ１．２゜２２０−２２８等に記載の公知の化合
物（一種または二種以上の組合せ）を用いることができ
る。架橋剤の具体例としては、Ｎ、Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ、Ｎ’−プロピレンビス
アクリルアミド（ＰＢＡ）、ジ（アクリルアミドジメチ
ル）エーテル（ＤＡＥ）、１．２−ジアクリルアミドエ
チレングリコール（ＤＥＣ）、エチレンウレアビスアク
リルアミド（ＥＵＢ）；エチレンジアクリレート（ＥＤ
Ａ）；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタータルジアミド（Ｎ、Ｎ’
−ｄｉａｌｌｙｌｔａｒｔａｒｄｉａｓｉｄｅ：　ＤＡ
ＴＤ）；およびＮ、Ｎ’−ビスアクリリルシスタミン（
Ｎ、Ｎ’−ｂｉｓａｃｒｙ１７１ｃｙＳｔａ＋＊ｉｎｅ
。

ＢＡＣ）等の二宮俺性化合物が挙げられる。

架橋剤の量は、アクリルアミドモノマーとｆｆＭ剤の総
重量に対して約２〜３０ｗｔ％、好ましくは約３〜１．
　Ｏｗ　ｔ％の範囲である。

ゲルＱ度としては、Ｓ、　Ｈｊｅｒｔｅｎ：　　ｒ　Ａ
ｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉａｐｈｙｓ−Ｊ　　１　　（５ｕ
ｐｐ！、　　）、　　１４７（１９６２）に記載の定義
に９って表示して、単量体、架橋剤および水からなるゲ
ル膜の容積に対して、単量体と架橋剤の量が約３　ｗ　
／　ｖ％から約３０　ｗ　／　ｖ％の範囲で好ましく用
いられる。

ゲル形成液には、所望により尿素、ホルムアミド、陰イ
オン界面活性剤などの変性剤が含まれていてもよい。

ゲル形成液には水溶性ポリマーを含有させることができ
る。

水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮重合型の
水溶性ポリマーを用いることができる。

付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等
の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。縮重合型ポ
リマーの具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアルキレ
ングリコールが挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は
、約１万から約ｌＯＯ万の範囲のものが好ましい。これ
らの水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリルアミドが特に好ま、しい。

水溶性ポリマーは、単量体と架橋剤の合計重量に対して
約２ｗｔ％から約１００ｗｔ％の範囲、好ましくは約５
ｗｔ％から約５０ｗｔ％の範囲の量で用いられる。

ゲル形成液にはアガロースを含有させることができる。

アガロースは公知のアガロースであれば特に制限はなく
、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロー
スのいずれをも用いることができる。用いることのでき
るアカロースの例としては特開昭５５−５７３０号、特
開昭５５−１１０９４６号、特表昭５７−５０２０９８
号等の公報に開示されているアガロース等がある。

アカロースは、単量体と架橋剤とを含むゲル組成液の容
積に対して約０．２ｗ／ｖ％から約２　ｗ　／　ｖ％、
好ましくは約０．３ｗ／ｖ％から約１．２ｗ／ｖ％の割
合にて添加される。

ゲル形成液には泳動対象の物質に合わせて適当なｐＨＨ
衝剤を含有させることができる。緩衝剤としては、日木
化学会編ｒ化学便覧基礎編」　（東京、丸善株、１９６
６年）　＋３１２−１３２０頁；　Ｄａｔａ　ｆｏｒＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（Ｒ，Ｍ、
Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　　ｅｔ　ａ１編第２版、　０ｘｆｏ
ｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ
、１９６９年）　４７６−５０８頁；　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　５，４６７（１９６６）　　；Ａｎａ１
７ｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　１０４
，３００−３１０（１９８０）　　等の刊行物に記載の
緩衝剤があげられる。その具体例としては、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）　　［ＣＡ
ｓ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ　Ｍｏ７？−８６−１］、Ｎ、Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎ
ｅ）　、Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸のＮａ塩ま
たはに塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
′−３−プロパンスルホン酸のＮａＰＡまたはに塩等、
Ｎ−［）リス（ヒドロキシメチル）メチルコー３−アミ
ノプロパンスルホン酸のＮａｋｉ４またはに塩および、
これらのいずれかと必要により組合せられる酸、アルカ
リまたは塩等をあげることができる。特に好ましい緩衝
剤の例としてはＴｒｉｓ、ホウ酸およびＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ塩の組合せ（ｐＨ８，３）がある。

ゲル形成液にはラジカル架橋重合用触媒が含まれている
ことが好ましい。ラジカル架橋重合用触媒の例としては
、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　１９８１．２
゜２１３−２１９．同１９８１．２．２２０−２２８　
、青水、永井編「最新電気泳動法Ｊ　　（１９７３年発
行）等に記載の公知の低温ラジカル重合開始剤のうちか
ら適宜選択して用いることができる。好ましいラジカル
重合開始剤の具体例としては、β−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）−ペルオクソニ硫酸アンモ
ニウム混合物、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエ
チレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）−ペルオクソニ硫酸アン
モニウム混合物などを挙げることができる。ラジカル重
合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に対し
て約０．３〜ＳｇＬ量％、そして好ましくは約０．５〜
３重量％の範囲である。

また、ゲル形成液には上記のラジカル架橋重合用触媒に
加えて光増感剤を添加しておくことが望ましい、光増感
剤の例としては、リボフラビン、リボフラビンリン酸エ
ステルナトリウム塩などのりポフラビン誘導体を挙げる
ことができる。光増感剤の含有量は、単量体と架橋剤の
合計重量に対して、約０．３〜５重量％、そして好まし
くは約０．５〜３重量％の範囲である。

ゲル形成液には、必要に応じて抗酸化剤などの他の添加
剤を含有させることができる。抗酸化剤としては、ゲル
膜に配合しうることが知られている種々の化合物を用い
ることができる。抗酸化剤の具体例としてはジチオスレ
イトール、２−メルカプトエタノールを挙げることがで
きる。

その他の添加剤としては湿潤剤があり、ポリアクリルア
ミドゲル膜にはグリセリン、エチレンクリコール等のポ
リオール化合物を含有させることもできる。ポリオール
化合物の含有量は、ゲル膜の容積に対して約５〜約４０
　ｗ　／　ｖ％の範囲から選ばれる。ポリオール化合物
のうちではグリセリンが特に好ましい。湿潤剤を配合す
ることにより得られるゲル膜の保存時の極端な水分の蒸
発による乾燥を防ぐことが回旋となり、また極端な乾燥
に起因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル膜の
物性が改善されるとの利点がある。

−ゲル形成液は、支持体上に直接あるいは接着剤層など
の他の中間層を介して公知の方法により膜状に塗布した
のち、このゲル形成液を架橋重合させることによりゲル
膜とされる。

ゲル形成液を支持体の表面で架＠重合させる場合には、
ゲル形成液塗布層の上をさらにカバーフィルム（シート
または板を含む）などの被覆材料でおおうことができる
。この目的に使用されるカバーフィルムとしては前記支
持体と同様な素材からなり、更に支持体同様、酸素透過
渣を低下させているものを用いることができる。この被
覆材料の厚さは３００７ｔｍ以下であり、実用的に好ま
しい厚さの範囲は約４〜２００ｇｍであり、特に好まし
い範囲は約４ｇｍ〜１１００７ｚである。

本発明の製造法においてゲル形成液の架橋重合のために
用いられるのは、キセノンフラッシュランプ光源からの
フラッシュ光である。この照射は窒業雰囲気下で行なう
ことが好ましい。

キセノンフラッシュランプは、キセノンガスが封入（通
常１気圧）されている管球内に設けられたカソードと７
ノードの間に、高電圧を印加するとともにトリガー誘導
によりカソードとアノード間にプラズマ放電させ高輝度
の光を得るようにしたランプである。この場合、発光時
間数マイクロ秒から数十マイクロ秒、発光隔数数ヘルツ
から数百ヘルツに設定して用いるのが一般的である。

キセノンフラッシュランプは。ゲル形成液膜の上、ある
いは下、または上下同時に設置することが出来る。さら
に、他の紫外線ランプを併用することもできる。

キセノンフラッシュランプの設置数には特に制限はない
、キセノンフラッシュランプから発生する熱は、ランプ
の周囲に空気を流すことにより容易にとることが出来る
。このため光源装置が小さくなり生産設備上好ましく、
保守管理もしやすいといったメリットもある。

本発明により得られる電気泳動用媒体材料は、前述の諸
文献等に記載の公知の方法に従って、水乎型および垂直
型平板電気泳動法、ディスク電気泳動泳動法等のいずれ
にも用いることができる。

以下に、本発明を実施例により更に詳しく説明する。

［実施例１−３］ 支持体ウェーブ上に、アクリルアミド、ＢＩＳ、尿素、
ベルオクソニ硫酸カリウム、ＴＥＭＥＤ　（Ｎ、Ｎ、Ｎ
’、Ｎ’　　−テトラメチルエチレンジアミン）、およ
びリボフラビン燐酸エステルナトリウム塩を第１表記載
の量にて含むゲル形成液を流延塗布した。

以下余白 第１表 アクリルアミド　　　　　　　　　　７．８４ｇＢＩＳ
　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１６ｇ尿素　　　
　　　　　　　　　４２．０ｇトリス（ヒドロキシメチ
ル）　　　　　１　、０８ｇアミノメタン 硼＃　　　　　　　　　　　　　　　　０．５５ｇＥＤ
ＴＡ−２Ｎａ　　　　　　　　　　９３ｍｇ（水を加え
てｌｏｏｍ愛にする） ＴＥＭＥＤ　　　　　　　　　　　　３３ル又ベルオク
ソニ硫酸に塩　　　　　　１．５ｍ文（５ｗｔ％水溶液
） リボフラビン燐酸エステルＮａｐ　　２．ＯｍＭ（０，
２５ｗｔ％水溶液） 注：　Ｂ　Ｉ　Ｓ　：　Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリ
ルアミドＴ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　：　Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ
’　−テトラメチルエチレンジアミン 上記のゲル形成液が膜状に塗布された支持体ウェーブを
、窒素で十分置換された硬化ケーシングを通過させると
同時に、上部あるいは下部、又は上部と下部の両方から
２００Ｗのキセノンフラッシュランプから光を照射した
。

上記の光照射とともに、ゲル形成液膜上の温度及び、ゲ
ル化するに必要な時間を測定した。その結果を第２表に
挙げる。

［比較例１−３］ 実施例１と同様にして、ゲル形成液が膜状に塗布された
支持体ウェーブを調製した。

次いで、キセノンフラッシュランプを２００Ｗの高圧水
銀灯に変えた以外は実施例１と同様にしてゲル形成液膜
に光を照射した。

上記の光照射とともに、ゲル形成液膜上の温度及び、ゲ
ル化するに必要な時間を測定した。その結果を第２表に
挙げる。

［比較例４］ 実施例１と同様にして、ゲル形成液が膜状に塗布された
支持体ウェーブをｉＡ製した。

次いで、キセノンフラッシュランプの光照射を省略した
以外は実施例１と同様にしてゲル形成液膜に光を照射し
た。この光照射とともに、ゲル形成液膜上の温度及び、
ゲル化するに必要な時間を測定した。その結果を第２表
に挙げる。

第２表 照射　　　　　ゲル化 光源　　　部位　　温度　時間 実施例１　（キャノン　　　上　　２５℃　３５秒２　
　フラッシュ　　下　　２５℃　３５秒３　　　ランプ
）　上／下　２６℃　３０秒比較例１　（高圧　　　　
　上　　５０℃　２０秒２　　水銀灯）　　　下　　６
０℃　２０秒３　　　　　　　　上／下　８０℃　１５
秒４　　照射なし　　　　　　２０℃　６００秒キセノ
ンフラッシュランプを用いた場合は、いずれもほとんど
、ゲル形成液（ゲル膜）の温度が上昇していないのに対
し、高圧水銀灯を用いた例では温度上昇が著しいのが明
らかである。ゲル化時間はいずれの場合もほとんど同じ
程度の重合速度を示していることがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、膜状または柱状に形成されたアクリルアミドモノマ
   ーと架橋剤とを含有する水性液にキセノンフラッシュラ
   ンプ光源からのフラッシュ光を照射して、該水性液内で
   架橋重合を発生させ、水性ゲル膜とすることからなる電
   気泳動分析用材料の製造法。 ２、該架橋重合を窒素雰囲気下で実施することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の電気泳動分析用材料の
   製造法。 ３、膜状に形成されたアクリルアミドモノマーと架橋剤
   とを含有する水性液を二枚のフィルムに挾んだ状態で架
   橋重合を発生させることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の電気泳動分析用材料の製造法。 ４、水性液が更にラジカル架橋重合用触媒と光増感剤と
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の電
   気泳動分析用材料の製造法。