CN117203233A - 抗tslp抗体组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请总体上涉及包含抗TSLP抗体泰派鲁单抗及其衍生物的组合物，该抗体及其衍生物具有抗体质量属性。

Description

抗TSLP抗体组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月23日提交的美国临时专利申请号63/178,938的优先权权益，将该临时专利申请通过引用以其整体特此并入。
技术领域
本申请总体上涉及包含抗TSLP抗体泰派鲁单抗(tezepelumab)及其衍生物的组合物，该抗体及其衍生物包含抗体质量属性。
背景技术
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是响应于环境和促炎刺激而产生的上皮细胞衍生的细胞因子，引起多种炎性细胞和下游途径的活化(Soumelis等人.Nat Immunol[自然免疫学]2002；3:673-80；Allakhverdi等人.J Exp Med[实验医学杂志]2007；204:253-8)。TSLP在患有哮喘的患者的气道中有所增加，并且与Th2细胞因子和趋化因子表达(Shikotra等人.J Allergy Clin Immunol[过敏临床免疫杂志]2012；129:104-11e1-9)以及疾病严重度(Ying等人.J Immunol[免疫学杂志]2005；174:8183-90；Ying等人.J Immunol[免疫学杂志]2008；181:2790-8)相关。虽然TSLP对Th2免疫力的调节很重要，但其还可能在其他炎症途径中起关键作用，并且因此与多种哮喘表型有关。
泰派鲁单抗为结合TSLP的人免疫球蛋白G2(IgG2)单克隆抗体(mAb)，可防止TSLP与TSLP受体复合物相互作用。应当理解，泰派鲁单抗为包含两个重链和两个轻链并且包含两个与TSLP的结合位点的异源四聚体。在轻度特应性哮喘患者中的概念验证研究证明，泰派鲁单抗抑制早期和晚期哮喘反应，并且在吸入性过敏原激发后抑制Th2炎症的生物标志物(Gauvreau等人.N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2014；370:2102-10)。
发明内容
随着时间的推移，监测配制品中的抗体治疗剂对于确定减少治疗剂的任何分解并保持产品完整性的储存条件非常重要。本披露提供了对在制造和储存期间可随时间改变的抗TSLP抗体的属性的研究，包括可有益于或有害于抗体耐受性和/或功效的属性。
在一方面，本披露提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物，并且其中该组合物中的异构化衍生物的量小于约30％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
在多个实施例中，组合物中的异构化衍生物的量小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在多个实施例中，组合物中的异构化衍生物的量为约0.5％至约13％。在多个实施例中，组合物中的异构化衍生物的量为约1％至12％、2％至10％或约4％至7％。在多个实施例中，异构化衍生物包含在重链或轻链互补决定区(CDR)的修饰。在多个实施例中，异构化衍生物包含位于任一或两个可变区链中的SEQ ID NO:7的重链CDR残基D54，和/或SEQ ID NO:4的轻链CDR残基D49、D50或D52的变化。在多个实施例中，异构化衍生物包含位于D54处以小于约5％的量的异构化。在多个实施例中，异构化衍生物包含位于D54处以小于约4％、3％、2％或1％的量的异构化。在多个实施例中，异构化衍生物包含位于SEQ ID NO:4的残基D49、D50或D52中的一个或多个处以小于约26％的量的异构化。在多个实施例中，异构化衍生物包含位于SEQ ID NO:4的残基D49、D50或D52中的一个或多个处以小于约25％、20％、18％、15％、13％、10％、7％、5％、3％或2％的量的异构化。在多个实施例中，异构化衍生物为异天冬氨酸(isoAsp)、环状天冬氨酸(cAsp)、琥珀酰亚胺或异构化中间体。在多个实施例中，异构化衍生物为异天冬氨酸(isoAsp)或环状天冬氨酸(cAsp)。在多个实施例中，组合物中的异构化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于30％的异构化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于30％的异构化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含脱酰胺化衍生物，并且其中该组合物中的脱酰胺化衍生物的量小于约15％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。在多个实施例中，组合物中的脱酰胺化衍生物的量小于约15％、约10％、约7％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。在多个实施例中，组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约0.5％至约13％。在多个实施例中，组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约0.5％-10％、约1％至8％、约2％至7％或约3％至6％。在多个实施例中，脱酰胺化衍生物包含脱酰胺化的天冬酰胺：SEQ ID NO:3中列出的LCDR1中的残基N25/N26、SEQ ID NO:13中列出的重链中的残基N316、和/或SEQ IDNO:13中列出的重链中的残基N385/390。在多个实施例中，脱酰胺化衍生物包含位于N25/N26处以小于约3％的量的脱酰胺化。在多个实施例中，脱酰胺化衍生物包含N316和/或N385/390中的一个或多个处以小于约13％的量的脱酰胺化。在多个实施例中，脱酰胺化衍生物为脱酰胺化的天冬酰胺或脱酰胺化中间体。在多个实施例中，组合物中的脱酰胺化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的脱酰胺化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的脱酰胺化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
本披露还提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含氧化衍生物，并且其中该组合物中的氧化衍生物的量小于约7％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ IDNO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
在多个实施例中，氧化衍生物的量小于约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。在多个实施例中，组合物中的氧化衍生物的量为约0.4％至约7％、约1％至约6％、约2％至约5％或约0.4％至约4％。在多个实施例中，氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的SEQ ID NO:6中列出的HCDR1的重链甲硫氨酸残基M34、或在SEQ ID NO:13中列出的重链恒定区中的残基M253或M359，或SEQ ID NO:7中列出的HCDR2的重链色氨酸残基W52、SEQ IDNO:5中列出的LCDR3的W90、或SEQ ID NO:8中列出的HCDR3的W102的一个或多个的氧化。在多个实施例中，氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的重链甲硫氨酸残基M34、M253、M359的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约7％。在多个实施例中，氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的色氨酸残基W52、W90或W102的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约3％。在多个实施例中，组合物中的氧化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于7％的氧化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于7％的氧化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
在另一个实施例中，本披露提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含糖基化衍生物，并且其中该组合物中的糖基化衍生物的量小于约40％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
在多个实施例中，组合物中的糖基化衍生物的量小于约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％约7％、约6％或约5％。在多个实施例中，组合物中的糖基化衍生物的量为约1％至约35％、约3％至约30％、约5％至约25％、约10％至约20％。在多个实施例中，糖基化衍生物包含在一个或两个重链上的SEQ ID NO:13的残基N298上的泰派鲁单抗糖基化的改变。在多个实施例中，糖基化衍生物包含泰派鲁单抗对高甘露糖部分或半乳糖基部分的非岩藻糖基化或糖基化的改变。在多个实施例中，糖基化衍生物包含小于约5％的量的非岩藻糖基化衍生物。在多个实施例中，糖基化衍生物包含小于约30％的量的半乳糖基部分。在多个实施例中，糖基化衍生物包含小于约5％的量的高甘露糖部分。在多个实施例中，组合物中的糖基化衍生物的量通过聚糖作图法来确定。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
糖基化衍生物也可以与效应子功能和抗体清除率(应当理解，更低的抗体清除率可以指示更长的半衰期；因此具有比参考抗体或抗体组合物“更少的清除率”的抗体或抗体组合物将被理解为是指在数值上比参考抗体或抗体组合物更长的半衰期)有关。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约15％、约13％、约11％、约8％或约6％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约25％、约23％(例如，约23.1％)、约21％、约18％、约15％、约13％、约11％、约8％、约6％或约5％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约23.1％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。在多个实施例中，高甘露糖种类增加了5％至23.1％，导致泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物的清除率增加了不超过1.7％或10％。
还提供了组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种其二硫化物同种型衍生物，其中该一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-B同种型和/或IgG2-A/B同种型，并且其中组合物中的二硫化物同种型的量小于约75％。在多个实施例中，组合物中的二硫化物同种型的量小于约70％、约65、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。
在多个实施例中，一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-B同种型。在多个实施例中，IgG2-B同种型的量小于约5％。在多个实施例中，一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-A/B同种型。在多个实施例中，组合物中的IgG2-A/B同种型的量小于约75％。在多个实施例中，组合物中的IgG2-A/B同种型的量为约38％至约43％。在多个实施例中，组合物中的二硫化物同种型衍生物的量通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)来确定。
还预期了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物为高分子量(HMW)种类，并且其中组合物中的HMW种类的量小于约20％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
在多个实施例中，组合物中的HMW种类小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在多个实施例中，组合物中的HMW种类的量为约0.5％至约13％、约1％至约11％、约2％至约10％、或约3％至约8％、或约4％至约7％。在多个实施例中，组合物中的HMW种类的量为约1.7％或更少。在多个实施例中，组合物中的HMW种类的量为约1.4％或更少。在多个实施例中，HMW种类包含泰派鲁单抗的二聚体。
在多个实施例中，组合物中的HMW种类的量通过尺寸排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)、沉降速率超速离心(SV-AUC)、或还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)来确定。在多个实施例中，SE-HPLC为SE-ultra HPLC(SE-UHPLC)或具有静态光散射的SE-HPLC(SE-HPLC-SLS)。在多个实施例中，SE-HPLC为SE-UHPLC。在多个实施例中，当SE-HPLC为SE-UHPLC时，使用流动相将蛋白质等度分离，该流动相包含100mM磷酸钠、250mM氯化钠，pH6.8。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的HWM种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的HWM种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
在组合物的多个实施例中，(a)泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合；或(b)泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过15％的高甘露糖，并且与具有大于15％的高甘露糖的组合物相比具有更低的清除率。
在组合物的多个实施例中，(a)泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合；或(b)泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过25％的高甘露糖，并且与具有大于25％的高甘露糖的组合物相比具有更低的清除率。
还提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含泰派鲁单抗片段，并且其中组合物中的泰派鲁单抗片段的量小于约15％，其中泰派鲁单抗包含(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：(i)SEQ IDNO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；和(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列以及(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
在多个实施例中，组合物中的片段的量小于约15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。在多个实施例中，组合物中的片段的量为约0.5％至约13％、约1％至约11％、约2％至约10％、或约3％至约8％、或约4％至约7％。在多个实施例中，泰派鲁单抗片段为低分子量(LMW)或中等分子量(MMW)种类或其组合。在多个实施例中，这些片段为小于约25kD的低分子量种类。在多个实施例中，这些片段为具有约25至50kD的分子量的中等分子量种类。在多个实施例中，组合物中的泰派鲁单抗片段的量通过还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)来确定。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的泰派鲁单抗片段的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的泰派鲁单抗片段的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
本文提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，其中这些泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化衍生物、HMW种类、片段、二硫化物异构体或其组合，其中该组合物具有以下特征的一种或多种：(a)该组合物中的异构化衍生物的量为约30％或更少，如通过还原性肽作图测量的；(b)该组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约15％或更少，如通过肽作图测量的；(c)该组合物中的氧化衍生物的量为约7％或更少，如通过还原性肽作图测量的；(d)该组合物中的糖基化衍生物的量为约75％或更少，如通过聚糖作图测量的；(e)该组合物中的二硫化物异构体的量为约40％或更少，如通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量的；(f)该组合物中的HMW种类的量为约20％或更少，如通过SE-HPLC测量的；和/或(g)该组合物中的片段的量为约20％或更少，如通过rCE-SDS测量的。
在多个实施例中，泰派鲁单抗包含SEQ ID NO:10中列出的重链氨基酸序列和SEQID NO:12中列出的轻链氨基酸序列。
在另一方面，本披露提供了用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法，该方法包括：获得含有泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的一种或多种泰派鲁单抗衍生物的量，其中这些泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化v、二硫化物同种型衍生物、HMW种类、片段或其组合；将一种或多种泰派鲁单抗衍生物的测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。在多个实施例中，测量异构化衍生物的量，并且预先确定的参考标准为约30％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化的量通过还原性肽作图测量。在多个实施例中，测量脱酰胺化衍生物的量，并且预先确定的参考标准为约15％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化的量通过还原性肽作图测量。在多个实施例中，测量氧化衍生物的量，并且预先确定的参考标准为约7％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化的量通过还原性肽作图测量。在多个实施例中，测量糖基化衍生物的量，并且预先确定的参考标准为约40％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化的量通过聚糖作图测量。在多个实施例中，测量二硫化物同种型衍生物的量，并且预先确定的参考标准为约75％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型的量通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量。在多个实施例中，测量HMW种类的量，并且预先确定的参考标准为约20％或更少。在多个实施例中，HMW种类的量通过SE-HPLC测量。在多个实施例中，测量片段的量，并且预先确定的参考标准为约15％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量通过rCE-SDS测量。
在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物获得自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，该细胞系表达编码SEQ ID NO:10的重链的核酸和编码SEQ ID NO:12的轻链的核酸。
在多个实施例中，免疫球蛋白、抗原结合蛋白或抗体为人抗体。在多个实施例中，抗体为IgG2抗体。在多个实施例中，泰派鲁单抗或其衍生物特异性结合SEQ ID NO:2的氨基酸29-159中所示的TSLP多肽。在多个实施例中，泰派鲁单抗或其衍生物的两个结合位点均具有与TSLP相同的结合。
在多个实施例中，泰派鲁单抗或其衍生物以数值上不超过10-8M Kd的亲和力结合TSLP。
进一步预期了组合物，该组合物包含如本文所述的泰派鲁单抗或其衍生物和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
本披露也提供了包含多核苷酸序列的分离的核酸，该多核苷酸序列编码本文所述的泰派鲁单抗或其衍生物的轻链可变结构域、重链可变结构域或两者。
本披露进一步预期了包含核酸的重组表达载体，该核酸编码如本文所述的泰派鲁单抗。还提供了包含表达载体的宿主细胞。
本文进一步预期了生产包含泰派鲁单抗或其衍生物的组合物的方法，该泰派鲁单抗或其衍生物特异性结合包含SEQ ID NO:2的氨基酸29-159的TSLP多肽，该方法包括在允许宿主细胞表达该免疫球蛋白、抗原结合蛋白或抗体的条件下孵育该宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)编码如本文所述的抗原结合蛋白的轻链可变结构域的重组表达载体和编码如本文所述的抗原结合蛋白的重链可变结构域的重组表达载体，或(ii)编码泰派鲁单抗的轻链可变结构域和重链可变结构域两者的重组表达载体。
本文还提供了用于治疗受试者的炎性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含泰派鲁单抗及其衍生物的组合物。在多个实施例中，炎性疾病选自由以下组成的组：哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎和特发性肺纤维化(IPF)。在多个实施例中，哮喘为轻度、中度或重度哮喘。在多个实施例中，哮喘是重度哮喘。在多个实施例中，哮喘为嗜酸细胞性哮喘或非嗜酸细胞性哮喘。
在多个实施例中，该方法包括以每2周或每4周的间隔施用该组合物。在多个实施例中，将该组合物施用至少4个月、6个月、9个月、1年或更长时间的时期。
在多个实施例中，抗体为IgG2抗体。在多个实施例中，泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物包含SEQ ID NO:10中列出的重链可变区和SEQ ID NO:12中列出的轻链可变区，并且包含本文所述的属性的一种或多种。
本披露还提供了组合物，该组合物包含本文所述的泰派鲁单抗及其衍生物，用于在治疗炎性疾病中使用。在某些实施例中，本披露提供了包含本文所述的泰派鲁单抗及其衍生物的组合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。
还考虑了注射器，例如一次性使用或预填充注射器、无菌密封容器(例如小瓶、瓶子、容器、和/或试剂盒或包装)，该注射器包含上述抗体或组合物中的任何一种，任选地带有合适的使用说明。在多个实施例中，施用经由预填充注射器或自动注射器进行。在多个实施例中，自动注射器是Ypsomed 装置。
应当理解，本文所述的每个特征或实施例或组合是本发明任何方面的非限制性、说明性示例，并且因此，意在与本文所述的任何其他特征或实施例或组合相结合。例如，在使用如“一个实施例”、“一些实施例”、“某些实施例”、“另外的实施例”、“特定的示例性实施例”和/或“另一个实施例”的语言描述特征的情况下，这些实施例的类型中的每一种都是旨在与本文所述的任何其他特征或特征的组合相结合而不必列出每一种可能的组合的特征的非限制性示例。此类特征或特征的组合适用于本发明的任何方面。在披露了落入范围内的值的实例的情况下，这些实例中的任何一个都被考虑为范围的可能端点，此类端点之间的任何和所有数值都被考虑，并且考虑了上下端点的任何和所有组合。
本文的标题是为了方便读者，而不旨在进行限制。本发明的其他方面、实施例和变化将自具体实施方式和/或附图和/或权利要求书变得显而易见。
附图说明
图1A-1F是一系列杠杆图，描绘了功效和总CDR IsoAsp(图1A和1D)、HMW种类(图1B和1E)以及总CDR Trp氧化(图1C和1F)之间的关系。
具体实施方式
从各种生物、生化和生物物理技术阐述泰派鲁单抗的结构以提供对其结构和功能性质的理解，以及关键质量属性的评估。
除非另有说明，否则用于本申请(包括说明书和权利要求书)中的以下术语具有以下给出的定义。
除非上下文另外清楚规定，否则如说明书及所附权利要求书中所用，不定冠词“一个/种(a/an)”及定冠词“该(the)”包括复数以及单数指示物。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
术语“约”或“大约”意指如由本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受误差，其部分地取决于如何测量或确定该值。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。每当术语“约”或“大约”在一系列两个或更多个数值中的第一数值前面时，应了解术语“约”或“大约”适用于该系列中的每个数值。
术语“炎性疾病”是指涉及由免疫系统攻击人体自身的细胞或组织引起的异常炎症的医学病症，这可能导致慢性疼痛、发红、肿胀、僵硬、以及对正常组织的损害。炎性疾病包括例如哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、牙周炎、窦炎、活动性肝炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、全身性红斑狼疮、特应性皮炎、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病(例如IgA肾病和狼疮性肾炎)、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎、特发性肺纤维化(IPF)等。在示例性方面，该炎性疾病是哮喘、特应性皮炎、或COPD。在示例性方面，该炎性疾病是哮喘，并且在一些情况下，该哮喘是重度哮喘、嗜酸细胞性哮喘、非嗜酸细胞性哮喘、或低嗜酸细胞哮喘。
如本文所用的术语“哮喘”是指过敏性哮喘、非过敏性哮喘、嗜酸细胞性哮喘和非嗜酸细胞性哮喘。
如本文所用的术语“过敏性哮喘”是指由一种或多种吸入性过敏原引发的哮喘。此类患者对引发哮喘反应的一种或多种过敏原具有阳性的IgE荧光酶免疫测定(FEIA)水平。通常，大部分过敏性哮喘与Th2型炎症有关。
术语“非过敏性哮喘”是指在诊断时具有低嗜酸细胞、低Th2或低IgE的患者。通常，在IgE荧光酶免疫测定(FEIA)中，患有“非过敏性哮喘”的患者对包括地区特异性过敏原的一组过敏原的反应呈阴性。除低IgE之外，那些患者经常在诊断时具有低嗜酸细胞计数或无嗜酸细胞计数和低Th2计数。
如本文所用的术语“重度哮喘”是指需要高强度治疗(例如GINA步骤4和步骤5)来维持良好控制或尽管进行高强度治疗但仍未实现良好控制的哮喘(GINA,Global Strategyfor Asthma Management and Prevention[全球哮喘管理和预防战略].GlobalInitiative for Asthma[全球哮喘防治创议](GINA)2012年12月)。
如本文所用的术语“嗜酸细胞性哮喘”是指具有筛选血液嗜酸细胞计数小于或等于300个细胞/μL，或小于或等于250个细胞/μL的哮喘患者。“低嗜酸细胞性”哮喘是指具有小于250个细胞/μL血液或血清的哮喘患者。可替代地，“低嗜酸细胞性”哮喘是指具有小于300个细胞/μL血液或血清哮喘患者。
“辅助性T细胞(Th)1细胞因子”或“Th1特异性细胞因子”是指由Th1 T细胞表达(细胞内和/或分泌)的细胞因子，并且包括IFN-g、TNF-a和IL-12。“Th2细胞因子”或“Th2特异性细胞因子”是指由Th2 T细胞表达(细胞内和/或分泌)的细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-13和IL-10。“Th17细胞因子”或“Th17特异性细胞因子”是指由Th17 T细胞表达(细胞内和/或分泌)的细胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-22和IL-21。除本文中所列出的Th17细胞因子的外，Th17细胞的某些群体还表达IFN-g和/或IL-2。多功能CTL细胞因子包括IFN-g、TNF-a、IL-2和IL-17。
术语“特异性地结合”为“抗原特异性的”、“对抗原具有特异性”、“选择性结合剂”、“特异性结合剂”、“抗原靶标”或与抗原“免疫反应”是指抗体或多肽以比相似序列的其他抗原更大的亲和力结合靶标抗原。本文预期该药剂特异性地结合可用于鉴别免疫细胞类型的靶标蛋白，例如表面抗原(例如T细胞受体、CD3)、细胞因子(例如TSLP、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IFN-g、TNF-a)及其类似物。在多个实施例中，抗体特异性地结合靶标抗原，但可以与密切相关的物种的同源物交叉反应，例如抗体可结合人类蛋白并且还结合密切相关的灵长类动物蛋白质。在多个实施例中，免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或对TLSP特异性的抗体或其片段以数值小于或等于10-8M的Kd结合。在多个实施例中，本文所述的抗TSLP抗体至少以10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更少的亲和力(Kd)结合。
术语“抗体”是指由各自包含可变区和恒定区的两条重链和两条轻链组成的四聚体糖蛋白。“重链”和“轻链”是指基本上全长的标准免疫球蛋白的轻链和重链(参见例如Immunobiology[免疫学],第5版(Janeway和Travers等人编辑,2001))。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。
抗原结合蛋白包括抗体、抗体片段和抗体样蛋白，可以对标准四聚体抗体的结构进行结构改变。抗体“变体”是指与具有已知序列的亲本抗体相比，在抗体序列或功能中可以具有结构变化的抗原结合蛋白或其片段。抗体变体包括变为恒定区的V区，或可替代地，任选地以非标准方式添加V区至恒定区。实例包括多特异性抗体(例如具有额外V区的双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(例如Fab'、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)，包含前述各项的双互补位肽和重组肽(只要其展现所需生物活性即可)。
抗体片段包括抗体的抗原结合部分，尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、CDR移植抗体结合区、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、线性抗体；螯合重组抗体、三抗体或双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合域免疫球蛋白融合蛋白、单域抗体(包括骆驼化抗体)、含VHH抗体或其变体或衍生物，以及含有足够赋予对多肽的抗原特异性结合的免疫球蛋白的至少一部分(如一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列)的多肽，只要抗体保留所需生物活性即可。
如本文所用，“抗体衍生物”是指包含本文所述的一种或多种属性的抗体、抗原结合蛋白或其片段，该抗体衍生物可根据其化学特性、化学修饰或结构属性类型(例如，HMW种类、片段或同种型)来表征，并表现出所需的生物活性。
“价数(valency)”是指靶向表位的各抗体或抗体片段上的抗原结合位点的数目。典型全长IgG分子或F(ab)2是“二价”的，因为其具有两个相同的靶标结合位点。“单价”抗体片段，如F(ab)’或scFc，具有单个抗原结合位点。三价或四价抗原结合蛋白还可工程改造成多价。
术语“单克隆抗体”是指自基本上均质的抗体群体(即构成该群体的个体抗体除可少量存在的天然存在的可能突变外均一致)获得的抗体。
术语“抑制TSLP活性”包括抑制以下任一个或多个：TSLP结合其受体；在TSLP存在下表达TSLPR的细胞的增殖、活化或分化；在极化分析中在TSLP存在下Th2细胞因子产生的抑制；在TSLP存在下树突状细胞活化或成熟；以及在TSLP存在下肥大细胞细胞因子释放。参见，例如美国专利7982016B2的第6栏和实例8，以及US 2012/0020988A1的实例7-10。
术语“样品”或“生物样品”是指自受试者获得以用于本发明的方法中的样品，并且包括尿、全血、血浆、血清、唾液、痰液、组织切片、脑脊髓液、有活体外刺激的外周血单核细胞、无活体外刺激的外周血单核细胞、有活体外刺激的肠淋巴组织、无活体外刺激的肠淋巴组织、肠灌洗液、支气管肺泡灌洗液、鼻灌洗液和诱导的痰液。
术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指与本文所述的炎性障碍有关的事件、疾病或病症的临床症状、表现或进展暂时或永久、部分或完全地消除、减少、压制或改善。如相关领域中所认识到，用作治疗剂的药物可降低既定疾病状态的严重度，但不必消除疾病的每种表现才被认为是有用治疗剂。相似地，预防性施用的治疗不必完全有效地预防病症发作才可成为可行的预防剂。仅仅降低疾病的影响(例如通过减少其症状的次数或降低其症状的严重度，或通过增加另一治疗的有效性，或通过产生另一有益作用)或降低疾病在受试者中发生或恶化的可能性即为足够。本发明的一个实施例涉及用于确定治疗功效的方法，该方法包括向患者施用治疗剂，该治疗剂施用的量和时间足以引起持续好转，超越反映特定病症的严重度的指示剂的基线。
术语“治疗有效量”是指治疗剂有效改善或减轻与疾病或障碍有关的症状或征象的量。
TSLP
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是上皮细胞衍生的细胞因子，其响应于促炎刺激而产生，并且主要经由其在树突状细胞(Gilliet,J Exp Med.[实验医学杂志]197:1059-1067,2003；Soumelis,Nat Immunol.[自然免疫学]3:673-680,2002；Reche,J Immunol.[免疫学杂志]167:336-343,2001)、肥大细胞(Allakhverdi,J Exp Med.[实验医学杂志]204:253-258,2007)和CD34+祖细胞(Swedin等人.Pharmacol Ther[药理学与治疗学]2017；169:13-34)中的活性来驱动过敏性炎症应答。TSLP通过由白细胞介素(IL)-7受体α(IL-7Rα)链和常见γ链样受体(TSLPR)组成的异二聚体受体发信号(Pandey,Nat Immunol.[自然免疫学]1:59-64,2000；Park,J Exp Med.[实验医学杂志]192:659-669,2000)。
与对照相比，哮喘个体气道中人TSLP mRNA(Brightling等人,J Allergy ClinImmunol[过敏与临床免疫杂志]2008；121:5-10；quiz 1-2；Ortega等人.N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2014；371:1198-207)和蛋白质水平(Ortega等人,同上)有所增加，并且此表达程度与疾病严重度相关(Brightling等人,同上)。最近的研究已证明，人TSLP基因座中的单核苷酸多态性与预防哮喘、特应性哮喘、和气道过度反应有关，这表明TSLP基因表达的差别调节可影响疾病易感性(Ortega等人.N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2014；371:1198-207；To等人.BMC Public Health[BMC公共健康]2012；12:204)。这些数据表明靶向TSLP可抑制与哮喘有关的多个生物途径。
TSLP的早期非临床研究表明在自气道上皮细胞或基质细胞释放TSLP之后，其活化肥大细胞、树突状细胞及T细胞，从而释放Th2细胞因子(例如IL-4/13/5)。最近公开的人类资料证明在重度哮喘中在组织TSLP基因与蛋白质表达、Th2基因特征评分和组织嗜酸细胞之间存在良好相关性。因此，抗TSLP靶标疗法可在具有Th2型炎症的哮喘患者中为有效的(Shikotra等人,J Allergy Clin Immunol.[过敏与临床免疫杂志]129(1):104-11,2012)。
来自其他研究的数据表明，TSLP可经由与Th2无关的途径，如气道平滑肌与肥大细胞之间的串扰，引起气道炎症(Allakhverdi等人,J Allergy Clin Immunol.[过敏与临床免疫杂志]123(4):958-60,2009；Shikotra等人,同上)。TSLP还可促进诱导T细胞分化成产生Th-17-细胞因子的细胞，从而在更重度哮喘中常见到嗜中性细胞炎症增加(Tanaka等人,Clin Exp Allergy.[临床和实验过敏]39(1):89-100,2009)。这些数据和其他出现的证据表明阻断TSLP可用于压制多个生物途径，包括但不限于涉及Th2细胞因子(IL-4/13/5)的途径。
抗体
预期了对TSLP具有特异性的抗体或抗体衍生物或抗原结合蛋白可用于治疗炎性疾病，包括哮喘，如重度哮喘、嗜酸细胞性哮喘、非嗜酸细胞性/低嗜酸细胞性哮喘以及本文所述的其他形式哮喘、特应性皮炎、EoE和COPD。
结合靶标抗原(例如，TSLP)的特异性结合剂(如抗体和抗体衍生物或片段)可用于本披露的方法和组合物中。在一个实施例中，特异性结合剂是抗体。这些抗体可以是单克隆的(MAb)；重组的；嵌合的；人源化的，如互补决定区(CDR)移植的；人的；抗体变体，包括单链；和/或双特异性的；以及其片段；变体；或其衍生物。抗体片段包括抗体的结合目的多肽的表位的那些部分。此类片段的实例包括由全长抗体的酶促裂解产生的Fab和F(ab')片段。其他结合片段包括由重组DNA技术产生的片段，这些技术如表达含有编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒。
单克隆抗体可经修饰用作治疗剂或诊断剂。一个实施例为“嵌合”抗体，其中一部分重链(H)和/或轻链(L)与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源。还包括此类抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可。参见美国专利号4,816,567；Morrison等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]81:6851-55。
在另一个实施例中，单克隆抗体是“人源化”抗体。用于将非人抗体人源化的方法为本领域中所熟知。参见美国专利号5,585,089和5,693,762。通常，人源化抗体具有一个或多个自非人类来源引入其中的氨基酸残基。可例如使用本领域中所述的方法(Jones等人,1986,Nature[自然]321:522-25；Riechmann等人,1998,Nature[自然]332:323-27；Verhoeyen等人,1988,Science[科学]239:1534-36)，通过用啮齿类动物互补决定区的至少一部分代替人抗体的对应区域来进行人源化。
本发明还涵盖结合TSLP的人抗体变体和衍生物(包括抗体片段)。使用在缺少内源性免疫球蛋白产生时能够产生人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)，通过用多肽抗原(即具有至少6个相邻氨基酸)进行免疫接种，任选地结合载剂，来产生此类抗体。参见，例如Jakobovits等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]90:2551-55；Jakobovits等人,1993,Nature[自然]362:255-58；Bruggermann等人,1993,Year inImmuno.[年度免疫学]7:33。还参见PCT申请号PCT/US96/05928和PCT/US93/06926。其他方法描述于美国专利号5,545,807、PCT申请号PCT/US91/245和PCT/GB89/01207、以及欧洲专利号546073B1和546073A1中。人抗体还可通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在如本文所述的杂交瘤细胞中表达来产生。
嵌合、CDR移植以及人源化抗体、抗体片段和/或抗体变体以及衍生物典型地通过重组方法产生。将编码抗体的核酸引入宿主细胞中并且使用本文所述的材料和程序表达。在优选的实施例中，在如CHO细胞的哺乳动物宿主细胞中产生抗体。单克隆(例如人)抗体可通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在如本文所述的杂交瘤细胞中表达来产生。哺乳动物细胞的另外的实例包括获得自美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))的永生化细胞系，除了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞之外，还包括海拉(HeLa)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和人上皮肾293细胞。此外，可以选择细胞系或宿主系统以确保泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的正确修饰和加工。可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这些包括CHO、VERY、BHK、海拉(Hela)、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NS0(不内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7030和HsS78Bst细胞。也可以使用通过永生化人淋巴细胞产生的人细胞系。还可以使用人细胞系(杨森公司(Janssen)；新泽西州泰特斯维尔(Titusville,NJ))以重组产生单克隆抗体。
举例来说，具有如本文所述的分子属性的泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物可以通过选择表达具有该分子属性的泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的细胞克隆来获得。可以使用重组DNA方法，用于产生此类泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物。例如，可以将编码泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的重链和轻链的DNA插入合适的一种表达载体(或多种载体中，例如一种用于重链的载体和一种用于轻链的载体)，该DNA可转染到合适的宿主细胞，例如哺乳动物细胞系的细胞。合适的表达载体是本领域已知的，这些表达载体含有例如编码与启动子连接的泰派鲁单抗多肽的多核苷酸。表达载体可以通过常规技术转移至宿主细胞，并且可以将转移的细胞培养以产生抗体。任选地，宿主细胞可以工程化以调节分子属性。例如，为了调节岩藻糖基化，可对糖基化感受态细胞进行遗传修饰，以改变岩藻糖基转移酶或高尔基体GDP-岩藻糖转运体的活性。举例来说，工程化以调节糖基化的细胞系描述于PCT公开号WO 2015/116315中。
可以选择产生包含相关分子属性的泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的克隆。举例来说，可以进行已建立的基于微量滴定板的克隆产生和生长的方法。可以通过如荧光激活细胞分选(FACS)或有限稀释等过程将数百种混合的异质细胞分选到单细胞培养物中。在被允许恢复至健康和稳定的群体后，可以分析这些克隆衍生的细胞，并且选择群体用于进一步分析。为了进一步分析，克隆细胞可以在小容器中培养，如旋转管、24孔板或96深孔板在“小规模细胞培养”中培养(例如，10天补料分批过程)。在这个小规模的过程中，定期添加大量营养物种，并且获得细胞生长和活力的不同测量值。数百种或甚至数千种这些小规模培养可能是平行的。培养结束时(例如，第十天)，收获细胞用于测定和分析。任选地，基于微量滴定板的克隆产生和生长方法(例如，亚克隆)可以通过使用自动化或部分自动化的高通量和高含量筛选工具，例如，如伯克利照明公司(Berkeley Lights)BeaconTM光电细胞系产生和分析系统。任选地，可以使用高通量筛选方法和机器学习工具以加速选择产生相关分子属性的克隆(参见，例如PCT公开号WO 2020/223422)。
抗TSLP抗体泰派鲁单抗描述于美国专利号7,982,016和美国专利申请号15/951,602。
可用于本发明的方法中的抗TSLP抗原结合蛋白(包括其片段)包含抗TSLP抗体，该抗体包含a.轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：i.包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的轻链CDR1序列；ii.包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的轻链CDR2序列；iii.包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链CDR3序列；以及b.重链可变结构域，该重链可变结构域包含：i.包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的重链CDR1序列；ii.包含SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的重链CDR2序列，以及iii.包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的重链CDR3序列，其中该抗体或抗体衍生物特异性结合如SEQ ID NO:2的氨基酸29-159中所示的TSLP多肽。
还预期了抗体或抗体衍生物，该抗体或抗体衍生物包含a.轻链可变结构域，该轻链可变结构域选自由以下组成的组：i.与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的氨基酸序列；ii.由与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；iii.由在中等严格条件下与由SEQ ID NO:11组成的多核苷酸互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；以及b.重链可变结构域，该重链可变结构域选自由以下组成的组：i.与SEQ IDNO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列；ii.由与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；iii.由在中等严格条件下与由SEQ ID NO:9组成的多核苷酸互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列；或c.(a)的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域，其中该抗体或抗体衍生物特异性结合如SEQ ID NO:2的氨基酸29-159中所示的TSLP多肽。
泰派鲁单抗为一种示例性抗TSLP抗体，其具有：a.i.包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的轻链CDR1序列；ii.包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的轻链CDR2序列；iii.包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链CDR3序列；以及b.重链可变结构域，该重链可变结构域包含：i.包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的重链CDR1序列；ii.包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列的重链CDR2序列，以及iii.包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的重链CDR3序列。
泰派鲁单抗还包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域具有SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列；由SEQ ID NO:11中列出的多核苷酸序列编码；和具有SEQ ID NO:10中所示的由SEQ ID NO:9中所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变结构域。
在多个实施例中，抗TSLP抗体或其抗体衍生物为二价，并且选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、单体抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体以及IgG4抗体。
在多个实施例中，抗TSLP抗体衍生物选自由以下组成的组：双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、单域抗体、scFv，其中该剂量经调整，使得这些结合位点相对于给予二价抗体的结合位点是等摩尔的。
预期抗体或抗体衍生物为IgG2抗体。人IgG2恒定区的示例性序列能以Uniprot编号P01859自Uniprot数据库获得，该Uniprot数据库通过引用并入本文。包括关于其他抗体重链及轻链恒定区的序列信息的信息还可经由Uniprot数据库以及在抗体工程改造及产生领域熟知的其他数据库公开获得。泰派鲁单抗为IgG2抗体。包括IgG2链的泰派鲁单抗的全长重链和轻链的序列分别在SEQ ID NO:13和14中列出。
在某些实施例中，抗体衍生物包括四聚体糖基化抗体，其中与亲本多肽的氨基酸序列相比，糖基化位点的数目和/或类型改变。在某些实施例中，变体包含比天然蛋白质更多或更少数目的N连接的糖基化位点。可替代地，消除此序列的取代将移除已存在的N连接的碳水化合物链。还提供N连接的碳水化合物链的重排，其中消除一个或多个N连接的糖基化位点(典型地天然存在的那些)并且创造一个或多个新的N连接的位点。另外的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中与亲本氨基酸序列相比，一个或多个半胱氨酸残基缺失或取代另一个氨基酸(例如，丝氨酸)。当抗体必须重新折叠成生物学上活性构象时，如在分离不溶性包涵体之后，半胱氨酸变体可能有用。半胱氨酸变体一般具有少于天然蛋白质的半胱氨酸残基，且典型地具有偶数个以使由未配对的半胱氨酸引起的相互作用最小。
所希望的氨基酸取代(无论保守或非保守)可由本领域技术人员在需要此类取代时来确定。在某些实施例中，氨基酸取代可用于鉴别人TSLP的抗体的重要残基，或增加或减少抗体对本文所述的人TSLP的亲和力。
根据某些实施例，优选的氨基酸取代为以下那些：(1)降低对蛋白质水解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变结合亲和力亲和性；(4)抑制形成高分子量(HMW)种类和/或(5)赋予或改变此类多肽上的其他生理化学特性或功能特性。根据某些实施例，可在天然存在的序列中(在某些实施例中，在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施例中为保守氨基酸取代)。在某些实施例中，保守氨基酸取代典型地基本上不会改变亲本序列的结构特性(例如替代氨基酸不应倾向于使亲本序列中存在的螺旋断裂，或破坏亲本序列特征性的其他类型二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles[蛋白质、结构和分子原理](Creighton编辑,W.H.Freeman and Company[W.H.弗里曼公司],纽约(1984))；Introduction to Protein Structure[蛋白质结构简介](C.Branden和J.Tooze编辑,Garland Publishing[加兰出版社],纽约,纽约州(1991))；以及Thornton等人Nature[自然]354:105(1991)，将这些文献各自通过引用并入本文。
制备方法
本披露的泰派鲁单抗组合物可以通过重组表达核酸制备，这些核酸编码宿主细胞中的重链和轻链，从宿主细胞培养物或宿主细胞裂解物中部分纯化或纯化泰派鲁单抗，并根据下文更详细地描述的方法分析所得组合物中的一种或多种的本文详述的泰派鲁单抗衍生物。
为重组产生泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物，将编码重链(例如，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链多肽)和轻链(例如，包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链多肽)的一种或多种核酸插入一种或多种表达载体。可以将编码重链的核酸和编码轻链的核酸插入单个表达载体中或可以将它们插入分开的表达载体中。如本文所用的，术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列和用于在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的适合的核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可包括影响或控制转录、翻译以及如果存在内含子则影响与其可操作连接的编码区的RNA剪接的序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子，任选地操纵序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止子以及多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，如果需要，以便更容易地从细胞中分离目的多肽。载体还可以包括一个或多个选择性标记基因以促进向其中引入载体的宿主细胞的选择。编码泰派鲁单抗的重链和轻链的示例性核酸以及用于重组表达泰派鲁单抗的表达载体的合适的信号肽序列和其他组分描述于美国专利7,982,016中，将其通过引用以其整体特此并入，并且在本文SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:11中列出。
在构建表达载体并且将编码泰派鲁单抗或其衍生物的重链和轻链组分的一种或多种核酸分子插入载体的一个或多个适当位点或载体之后，这一种或多种完整的载体可以插入至用于扩增和/或多肽表达的合适的宿主细胞。可以通过熟知的方法，包括转染、感染、磷酸钙共沈淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术，将泰派鲁单抗或其衍生物的表达载体转染至所选宿主细胞。所选方法将部分随待使用的宿主细胞类型而变化。这些方法和其他合适的方法是本领域技术人员熟知的，并且在例如Sambrook,Fritsch和Maniatis(编辑),Molecular Cloning；A Laboratory Manual[分子克隆；实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室出版社],纽约,(1989)，Ausubel等人.(编辑)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南],Greene Publishing Associates[格林出版协会],(1989)中所示。
当在适当条件下培养时，宿主细胞合成泰派鲁单抗或其衍生物，随后该泰派鲁单抗或其衍生物可以从培养基(如果宿主细胞将其分泌至培养基中)收集或直接由产生其的宿主细胞收集(如果其并非分泌的)收集。适当的宿主细胞的选择将取决于各种因素，例如所希望的表达水平、活性所希望的或所需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和易于折叠成生物活性分子。
示例性宿主细胞包括原核生物细胞、酵母或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏杆菌(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物(如丝状真菌或酵母)为用于重组多肽的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母为低等真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其他属、种和菌株为常用的且可用于本文中，例如毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，耶氏酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、木霉菌属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗体的宿主细胞可以来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染此类细胞的多种病毒株为公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。
脊椎动物宿主细胞也可以为合适的宿主，并且来自这些细胞的抗体的重组产生已成为常规程序。可用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域熟知的，并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216,1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞(Graham等人,J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1、ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68,1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，以及许多其他的细胞系。在一些实施例中，CHO细胞优选地为用于表达泰派鲁单抗或其衍生物的宿主细胞。
将宿主细胞用上述用于产生泰派鲁单抗或其衍生物的表达载体转化或转染，并且在适当修饰的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。用于产生泰派鲁单抗或其衍生物的宿主细胞可以在各种培养基中培养。适用于培养宿主细胞的可商购的培养基，如Ham's F10(西格玛公司(Sigma))、极限必需培养基(MEM，西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛公司)。另外，在Ham等人,Meth.Enz.[酶学方法]58:44,1979；Barnes等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]102:255,1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；或WO 87/00195。必要时，这些培养基中的任一种可以补充有激素和/或其他生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如健他霉素(GentamycinTM)药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。还可包括适当浓度的按本领域技术人员已知任何其他必需的补充剂。培养条件(如温度，pH等)为先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员将为显而易见的。
在培养宿主细胞后，抗体可以在细胞内、周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，裂解宿主细胞(例如，通过机械剪切、渗透压休克、或酶促方法)，并且例如通过离心、微滤或超滤去除例如颗粒碎片(例如，宿主细胞和裂解的片段)。如果抗体分泌到培养基中，可以通过离心或微滤，并任选地随后通过超滤将抗体与宿主细胞分离。可以使用例如，一种或多种色谱步骤，如亲和色谱(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱或混合模式色谱，进一步纯化或部分纯化泰派鲁单抗或其衍生物。
一旦产生或获得泰派鲁单抗组合物，可以评估组合物中的本文所述的一种或多种泰派鲁单抗衍生物的存在和量，这些一种或多种泰派鲁单抗衍生物包括异构化衍生物(包括其异构化中间体)、脱酰胺化衍生物(包括其脱酰胺化中间体)、氧化衍生物、糖基化衍生物、二硫化物同种型衍生物以及尺寸衍生物(例如，HMW种类或片段)。因此，本披露包括用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法，这些方法包括获得含有泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的一种或多种泰派鲁单抗衍生物的量；将一种或多种泰派鲁单抗衍生物的测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。在一些实施例中，这些方法包括以下一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：(1)测量组合物中的异构化衍生物(包括其异构化中间体)的量，(2)测量组合物中的脱酰胺化衍生物(包括其脱酰胺化中间体)的量，(3)测量在组合物中的氧化衍生物的量，(4)测量组合物中的糖基化衍生物的量，(5)测量组合物中的二硫化物同种型衍生物的量，(6)测量组合物中的HMW种类的量，和/或(7)测量组合物中的片段的量。在某些实施例中，所有七种测量都在泰派鲁单抗组合物上进行。
每种泰派鲁单抗衍生物的预先确定的参考标准可以是衍生物的阈值量或这些量的范围，该衍生物未显著影响泰派鲁单抗组合物的功效和/或耐受性，例如用于施用期间的安全性目的或用于抑制配体诱导的TSLP受体激活。例如，每种泰派鲁单抗衍生物的预先确定的参考标准可以是本文披露的每种衍生物的任何限度或范围，因为具有这些衍生物的这些限度/范围的泰派鲁单抗组合物具有与临床试验中评价并且显示具有临床疗效的泰派鲁单抗组合物相比的相当的功效和/或耐受性。应当理解，本文所述的预先确定的参考标准可以在本文所述的方法开始之前指明。
在这些方法的某些实施例中，如果组合物中的泰派鲁单抗衍生物的测量的量满足预先确定的参考标准，则然后可以将泰派鲁单抗组合物归类为可接受的，并且进行到制造或分配过程中的下一步骤，如，例如通过制备组合物的药物配制品(例如，通过与一种或多种赋形剂或稀释剂结合)；通过制备组合物的药物产品(例如，通过填充到小瓶、注射器、自动注射器、或其他容器或递送装置中)；将组合物与使用说明、稀释剂和/或递送装置一起包装；或商业销售组合物或运送组合物给经销商。在这些方法的一些实施例中，如果组合物中的泰派鲁单抗衍生物的测量的量满足预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品。在这些方法的其他实施例中，如果组合物中的泰派鲁单抗衍生物的测量的量满足预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物产品。制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品和药物产品的方法于下文更详细地描述。如果组合物中的泰派鲁单抗衍生物的测量的量未满足预先确定的参考标准，则然后在这些方法的一些实施例中，可以将泰派鲁单抗组合物归类为不可接受的，并且丢弃、销毁或进行另外的制造步骤，如另外的纯化以去除或减少组合物中的泰派鲁单抗衍生物的量，使得满足预先确定的参考标准。
在一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗异构化衍生物(包括其异构化中间体)的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的异构化衍生物的量；将异构化衍生物测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准可以为小于约30％，例如小于约25％、约20％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、或约4％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准为约15％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准为约13％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准为小于约10％、约8％、约5％、约3％或约2％。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约0.5％至约13％的泰派鲁单抗组合物、约1％至约10％的泰派鲁单抗组合物、或约0.5％至约5％的泰派鲁单抗组合物。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准为小于约5％、4％、3％、2％或1％的位于任一或两个可变区链中的SEQ ID NO:7的D54的异构化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量的预先确定的参考标准为小于约13％、约10％、约8％、约5％、约3％或约2％的SEQ ID NO:4的D49、D50或D52的一个或多个的异构化。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的异构化衍生物的量通过还原性肽作图测量。
在一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗脱酰胺化衍生物(包括其脱酰胺化中间体)的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的脱酰胺化衍生物的量；将脱酰胺化衍生物测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准可以为小于约15％，例如约13％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准为约7％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准为约5％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准为约2％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约0.4％至约10％的泰派鲁单抗组合物、约1％至约7％的泰派鲁单抗组合物、或约0.1％至约4％的泰派鲁单抗组合物。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准为小于约3％的位于SEQ ID NO:3中列出的LCDR1中的N25/N26处的脱酰胺化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量的预先确定的参考标准为小于约13％的位于SEQ ID NO:13中列出的重链中的N316和/或SEQ ID NO:13中列出的重链中的N385/390处的脱酰胺化。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化衍生物的量通过还原性肽作图测量。
在一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗氧化衍生物的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的氧化衍生物的量；将氧化衍生物测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准可以为小于约7％或更少、约6％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、或约1％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准为约7％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准为约5％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准为约3％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约0.1％至约7％的泰派鲁单抗组合物、约0.4％至约5％的泰派鲁单抗组合物、或约0.8％至约3％的泰派鲁单抗组合物。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量的预先确定的参考标准为位于SEQ ID NO:8中列出的HCDR3中的W102处的约7％或更少、或约6％或更少、或约5％或更少、或约3％或更少的氧化。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的氧化衍生物的量通过还原性肽作图测量。
在一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗糖基化衍生物的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的糖基化衍生物的量；将糖基化衍生物测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准可以为小于约40％，例如，约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、或约4％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为约30％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为约20％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为约15％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为约10％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约1％至约40％的泰派鲁单抗组合物、约4％至约30％的泰派鲁单抗组合物、约2％至约20％的泰派鲁单抗组合物、或约5％至约15％的泰派鲁单抗组合物。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为组合物中的约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约5％或更少、或约4％或更少的高甘露糖糖基化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为组合物中的约25％或更少、约23％或更少(例如，约23.1％或更少)、约21％或更少、约19％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、约5％或更少、或约4％或更少的高甘露糖糖基化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为组合物中的约23.1％或更少的高甘露糖糖基化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为组合物中的约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约5％或更少、或约4％或更少的半乳糖基化。在多个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量的预先确定的参考标准为约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少的非岩藻糖基化的糖基化。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的糖基化衍生物的量通过聚糖作图测量。
在一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗二硫化物同种型衍生物的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的二硫化物同种型衍生物的量；将二硫化物同种型测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准可以为小于约75％，例如，约70％或更少、约65％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约6％或更少、或约4％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约50％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约35％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约25％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约15％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约10％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约8％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约10％至约70％的泰派鲁单抗组合物、约15％至约50％的泰派鲁单抗组合物、或约20％至约40％的泰派鲁单抗组合物。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约50％或更少的IgG2-A/B同种型。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量的预先确定的参考标准为约5％或更少的IgG2-B同种型。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型衍生物的量通过反相-HPLC测量。
在另一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗的HMW种类的泰派鲁单抗组合物；测量该组合物中HMW种类的量；将HMW种类的测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准可以小于约20％，例如，约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、或约4％或更少。泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准可以为小于约3.0％，例如，约2.5％或更少、约2.4％或更少、约2.3％或更少、约2.2％或更少、约2.1％或更少、约2.0％或更少、约1.8％或更少、约1.6％或更少、约1.4％或更少、约1.2％或更少、约1.0％或更少、约0.8％或更少、约0.6％或更少、或约0.4％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准为约2.5％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准为约1.7％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准为约1.4％或更少。在又另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准为约1.2％或更少。在仍另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准为约0.6％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约0.3％至约2.4％的泰派鲁单抗组合物、约0.6％至约2.1％的泰派鲁单抗组合物、约0.4％至约1.2％的泰派鲁单抗组合物、或约0.6％至约1.4％的泰派鲁单抗组合物。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量通过SE-HPLC测量，例如，通过SE-UHPLC、SE-HPLC-SLS或沉降速率超速离心(SV-AUC)。
在另一个实施例中，这些用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法包括获得含有泰派鲁单抗和泰派鲁单抗的片段(例如，LMW或MMW)的泰派鲁单抗组合物；测量组合物中的片段的量；将片段测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且如果比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。泰派鲁单抗组合物中的HMW种类的量的预先确定的参考标准可以为约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、或约4％或更少。泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准可以为小于约3.0％，例如，约2.5％或更少、约2.4％或更少、约2.3％或更少、约2.2％或更少、约2.1％或更少、约2.0％或更少、约1.8％或更少、约1.6％或更少、约1.4％或更少、约1.2％或更少、约1.0％或更少、约0.8％或更少、约0.6％或更少、或约0.4％或更少。在一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准为约2.5％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准为约1.7％或更少。在另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准为约1.4％或更少。在又另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准为约1.2％或更少。在仍另一个实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准为约0.6％或更少。在一些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量的预先确定的参考标准可以是这些量的范围，例如，约0.3％至约2.4％的泰派鲁单抗组合物、约0.6％至约2.1％的泰派鲁单抗组合物、约0.4％至约1.2％的泰派鲁单抗组合物、或约0.6％至约1.4％的泰派鲁单抗组合物。在某些实施例中，泰派鲁单抗组合物中的片段的量通过rCE-SDS测量。
在本发明的方法的某些实施例中，这些方法包括：
(a)获得含有泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的泰派鲁单抗组合物，其中这些泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化v、二硫化物同种型衍生物、HMW种类、片段或其组合；
(b)通过进行以下的一个或多个评估泰派鲁单抗组合物：
(i)通过还原性肽作图测量组合物中的异构化衍生物的量，并且将测量的量与为约30％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
(ii)通过还原性肽作图测量组合物中的脱酰胺化衍生物的量，并且将测量的量与为约15％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
(iii)通过还原性肽作图测量组合物中的氧化衍生物的量，并且将测量的量与为约7％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
(iv)通过聚糖作图测量组合物中的糖基化衍生物的量，并且将测量的量与为约40％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
(vi)通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量组合物中的二硫化物同种型衍生物的量，并且将测量的量与为约75％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
(vi)通过SE-HPLC中的前峰测量组合物中的HMW种类的量，并且将测量的量与为约20％或更少的预先确定的参考标准进行比较；和/或
(vii)通过rCE-SDS中的前峰测量组合物中的片段的量，并且将测量的量与为约15％或更少的预先确定的参考标准进行比较；
并且
(c)如果步骤(b)中的一种或多种比较表明满足预先确定的参考标准/标准，则制备泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。在一些实施例中，进行所有步骤(b)(i)、(b)(ii)、(b)(iii)、(b)(iv)、b)(v)、(b)(vi)以及b)(vii)。在其他实施例中，仅进行步骤(b)(vi)和(b)(vii)。在某些实施例中，进行步骤(b)(iv)、(b)(vi)和(b)(vii)。
促进蛋白结合的属性的鉴定
为了确定促进蛋白结合和活性的属性，将如本文所述的抗TSLP抗体泰派鲁单抗置于导致其结构改变的条件下，例如治疗性蛋白的氨基酸结构的变化，导致治疗性蛋白的衍生物的形成。在示例性方面，氨基酸的改变的结构被称为“属性”并且可能根据其化学身份或属性类型以及在抗原结合蛋白的氨基酸序列中的位置(例如，其上存在属性的氨基酸位置)来表征。例如，天冬酰胺和谷氨酰胺残基易于脱酰胺化。在蛋白质氨基酸序列的位置10处的脱酰胺化的天冬酰胺是属性的实例。表A中提供了特定氨基酸的示例性属性类型列表。因此，如本文所用的“结构”可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：表A中所列的属性类型，或表A中所列的两种或多种属性类型的组合。应当理解，属性是结构的实例，并且除非另有说明，否则在此提及“结构”的任何地方，属性都被视为结构的实例。例如，高分子量种类(HMW)和片段也是属性的实例。
表A
由于免疫球蛋白或其片段、抗体或抗原结合蛋白(如泰派鲁单抗)包含本文所述的多个氨基酸、抗体或抗原结合蛋白可具有多于一个属性(例如，具有改变的结构的多于一个氨基酸)，并且可根据其属性谱来描述。如本文所用，术语“属性谱”是指抗原结合蛋白的属性列表。在各种情况中，属性谱提供化学身份或属性类型，例如脱酰胺化，任选地，相对于治疗性蛋白的天然结构。在各种情况中，属性谱提供了属性的位置，例如，其上存在属性的氨基酸的位置。在一些方面，属性谱提供了抗原结合蛋白上存在的所有属性的描述。在其他方面，属性谱提供了蛋白质上存在的属性子集的描述。例如，属性谱可以仅提供存在于蛋白质的特定部分，例如恒定区、可变区、CDR(如三个轻链CDR和三个重链CDR)中的那些属性。一种治疗性蛋白(如抗体或抗原结合蛋白)的特征在于在蛋白质上存在的一种或多种属性。一种抗体或抗原结合蛋白可以通过具有不同的属性谱而不同于相同蛋白质的另一种类。当两种治疗性蛋白具有不同的属性谱时，治疗性蛋白代表治疗性蛋白的两个不同种类或衍生物。当两种治疗性蛋白具有相同的属性谱时，治疗性蛋白被认为是治疗性蛋白的同一种类或衍生物。
在各种情况中，将免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白置于导致其结构改变的条件下，例如形成一种或多种属性，并且结构的变化可以改变治疗性蛋白对其靶标的亲和力。在各个方面中，将免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白置于导致其结构改变的条件下，例如形成一种或多种属性，并且结构的变化减少了抗原结合蛋白对其靶标的亲和力。在一些方面，降低的亲和力导致免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白部分或完全丧失与靶标相互作用(例如，结合)的能力。在各种情况中，免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白部分或完全丧失与靶标相互作用(例如结合)的能力最终会降低抗原结合蛋白的效力。在可替代的情况中，将免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白置于导致其结构改变的条件下，例如形成一种或多种属性，并且结构的变化未改变免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白对其靶标的亲和力。在各个方面中，结构的变化未减少蛋白质对其靶标的亲和力。不受任何特定理论的束缚，本披露的方法以精确性和准确性有利地区分影响免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白和靶标之间相互作用的免疫球蛋白、抗体或抗原结合蛋白的那些属性与不影响相互作用的属性。
在各个方面中，本文的组合物包含免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段的种类或衍生物的群体。在各种情况中，群体是免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段的同质群体，任选地，在组合物样品中存在的每种蛋白质是相同的种类或衍生物。在各种情况中，群体是异质群体，该异质群体包含具有本文所述的属性的免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段的至少两个不同种类或衍生物。在各个方面中，异质群体包含免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或更多个不同种类或衍生物。任选地，异质群体包含超过7个、超过8个、超过9个、超过10个、超过20个、超过30个、超过40个、超过50个不同蛋白质的种类或衍生物。在一些方面，群体的每个种类或衍生物具有独特的属性谱。在示例性情况中，免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段的种类是仅在组合物中存在的蛋白质。在一些方面，组合物包含(i)群体免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段，免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段，和(ii)药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂、或其组合。在一些实施例中，至少80％、85％、90％、95％或99％的异质群体的免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段包含如本文所述的属性。在一些实施例中，不超过20％、15％、10％、5％或1％的异质群体的免疫球蛋白、抗原结合蛋白或其片段、或抗体或其片段包含如本文所述的属性。
分离
在示例性实施例中，本披露包括用于将包含不同种类的抗原的混合物分离为至少两个级分的方法。在一些方面，将混合物分离为多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)级分。在一些方面，当前披露的方法的分离步骤保持抗原结合蛋白和其靶标的天然折叠、高序结构以及结合的能力。在各个方面中，将混合物分离为包含未结合的抗体或抗原结合蛋白或靶标的未结合的级分和包含抗体/抗原结合蛋白-靶标复合物的结合的级分。
用于将混合物分离为级分的适合的方法和技术是本领域已知的。参见，例如，Coskun,North Clin Istanb[伊斯坦布尔北部诊所]3(2):156-160(2016)；Snyder等人,Practical HPLC Method Development[实用高效液相色谱法的建立],编辑,第2版,JohnWiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司]1997；Snyder等人,Introduction to ModernLiquid Chromatography[现代液相色谱法导论],John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司],新泽西州霍博肯市(Hoboken,NJ),2010；Heftmann,Chromatography:Fundamentalsand applications of chromatography and related differential migration methods[色谱法：色谱法和相关差异迁移方法的基础和应用],编辑,第6版,第69A卷,爱思唯尔出版公司(Elsevier),荷兰阿姆斯特丹,2004；Mori和Barth,Size Exclusion Chromatography[尺寸排阻色谱法],施普林格公司(Springer-Verlag),柏林,1999。在一些方面，分离基于电荷，如，例如离子交换色谱、毛细管等电聚焦(cIEF)和/或毛细管区带电泳(CZE)，或基于疏水性，如，例如反相分离(RP；例如，RP-HPLC)和疏水性相互作用层析(HIC-HPLC)。在各个方面中，分离基于尺寸，如例如，尺寸排阻色谱(SEC；例如，SE-HPLC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)。本文所述的方法用于检测产物的Met或Trp残基的氧化、片段化/剪裁、Asp的异构化、脱酰胺化、在N末端形成焦谷氨酸。在多个实施例中，使用基于尺寸、电荷、疏水性、对捕获分子的亲和力或其组合来分离混合物的组分的技术，将混合物分离成至少两个级分。在各种情况中，技术为尺寸排阻色谱(SEC)、亲和色谱、使用珠或细胞的沉淀、自由流动分馏(FFF)、离子交换色谱(IEX)、阳离子交换色谱(CEX)、疏水性相互作用色谱(HIC)或超速离心(UC)。任选地，使用基于尺寸来分离混合物的组分的技术，任选地，其中该技术为尺寸排阻色谱(SEC)，将混合物分离成至少两个级分。
在各个方面中，使用基于捕获分子结合固体支持物(任选地，珠或细胞)的亲和力来分离混合物的组分的技术，将混合物分离成至少两个级分。在各种情况中，通过以下将混合物分离：(i)添加混合物至容器(例如管)，该容器包含与捕获分子结合的珠或在其表面表达捕获分子的细胞，(ii)离心该容器(例如，管)以获得上清液和沉淀，(iii)由沉淀收集上清液以获得未结合的级分，(iv)由具有溶液的沉淀释放结合的级分，(v)离心该容器(例如，管)，该容器包含该沉淀和该溶液以获得包含该结合的级分的第二上清液和包含该珠或细胞的第二沉淀，以及(vi)收集该第二上清液以获得该结合的级分。在一些方面，通过以下将混合物分离：(i)添加该混合物至包含与捕获分子结合的珠的柱以获得流通级分和结合的级分，(ii)收集该流通级分以获得该未结合的级分，(iii)由具有溶液的珠中释放结合部分并收集包含该结合部分的溶液。适合的固体支持物包括，例如，珠、树脂、纸，任选地，由纤维素、二氧化硅、氧化铝、玻璃、塑料或其组合制成。在示例性方面，与固体支持物结合的捕获分子是蛋白质。捕获分子可能与靶标相同。有利地，捕获分子不限于任何特定的分子。
在鉴定影响抗原结合蛋白和靶标之间的相互作用的免疫球蛋白、抗原结合蛋白(例如，泰派鲁单抗)或靶标的属性的方法的多个实施例中，对于未结合的级分和结合的级分中的每一种，该方法包括鉴定和定量存在于抗原结合蛋白或靶标的种类或衍生物上的每种属性的丰度，其中，当未结合的级分中的属性的丰度大于结合的级分中的属性的丰度时，该属性负面地影响抗原结合蛋白和靶标之间的相互作用。在各个方面中，该方法包括使用质谱仪以鉴定和定量在未结合的级分和结合的级分的每一种中的抗原结合蛋白或靶标的种类的每种属性的丰度。
在确定存在于抗原结合蛋白或靶标的种类上的已知属性对抗原结合蛋白和靶标之间的相互作用的影响的方法的多个实施例中，该方法包括对于未结合的级分和结合的级分中的每一种，定量已知属性的丰度，其中，当未结合的级分中已知属性的丰度大于结合的级分中已知属性的丰度时，该已知属性对抗原结合蛋白和靶标之间的相互作用具有负面影响。在各个方面中，该方法包括使用质谱仪以定量在未结合的级分和结合的级分的每一种中的已知属性的丰度。
稳定性是指对氨基酸残基的化学修饰和生物物理蛋白修饰的耐受性，如在制造、储存和/或另外的或可替代的应激条件下可能发生的应激条件下的HMW种类的形成。对于本文描述的实施例的方法和免疫球蛋白、抗原结合蛋白及其片段，可以使用尺寸排阻色谱(SEC)确定“稳定性”和/或“HMW”种类。包含免疫球蛋白、抗原结合蛋白或片段或衍生物的组合物可以通过SEC(如SEC-UV)分离。SEC可以使用包含100mM磷酸钠和250mM NaCl(pH 6.8)的流动相，流速可以设置为0.5ml/min，柱温可以设置为37℃，运行时间可以设置为35分钟，并且自动进样器可以设置为4℃。适用于SEC的柱的实例包括含有二氧化硅颗粒的凝胶柱，该二氧化硅颗粒包含二醇官能团并且平均直径为5μm和平均孔径约为25nM的(可商购，例如，作为来自东曹生命科学公司(TOSOH Bioscience)的G3000SWxl柱)。对于SEC-UV，可以在214nm和280nm进行紫外/可见光谱(UV/VIS)检测。应当理解，分离后，代表单体和HMW种类的峰可在SEC洗脱曲线中的不同时间洗脱。
SEC分析之后，可以任选地进行肽作图，并且可以鉴定与结合的种类和未结合的种类有关的肽修饰，例如如本文和/或在国际公开号WO 2020/247790中描述。对于肽作图，可以使用具有分子量截留(例如，大于10kDa)的过滤器收集洗脱级分，并且用7.5M胍洗脱缓冲液来洗脱。为确定影响与抗原结合的化学修饰，可以将应激的免疫球蛋白(或抗原结合蛋白或其片段)和抗原一起混合，并且分离较早洗脱的结合抗原的复合物和较晚洗脱的未结合的免疫球蛋白(或抗原结合蛋白或其片段)。为确定影响或与HMW相关的化学修饰，可以收集单体和HMW种类。
应当理解，“亲和力”或“结合”可以通过表面等离振子共振(SPR)、生物膜层干涉，或也可以通过如本文所述的SEC结合亲和力实验来确定。除非本文另有说明或科学背景另有要求，否则“亲和力”应理解为是指如通过SPR测量的亲和力。可以使用生物传感器系统(如系统)通过SPR测量Kd值。用系统的分析可以包含分析抗原(例如，TSLP)与具有固定化分子(例如，如本文所述的抗TSLP免疫球蛋白、抗原结合蛋白、或其片段)的芯片的结合和解离。可以使用SPR检测Kd<10-6M的结合复合物。在多个实施例中，可以在20℃、25℃、30℃或37℃下进行SPR。
组合物
应当理解，泰派鲁单抗中的残基的编号是基于分别在SEQ ID NO:10和12中列出的重链和轻链可变序列，以及分别在SEQ ID NO:13和14中列出的全长抗体重链和轻链。
在多个实施例中，提供了包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的组合物，每种泰派鲁单抗衍生物包含：含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的轻链CDR1序列；含有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的轻链CDR2序列；含有SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的轻链CDR3序列；含有SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的重链CDR1序列；含有SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的重链CDR2序列；以及包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的重链CDR3序列，其中这些衍生物包含以下的至少一种：异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化衍生物、HMW种类、片段、二硫化物同种型衍生物或其组合。在多个实施例中，组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，每种泰派鲁单抗衍生物包含SEQ ID NO:10中列出的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12中列出的轻链氨基酸序列。
异构化衍生物包含天冬氨酸残基的改变。天冬氨酸的示例性异构化包括异天冬氨酸(isoAsp)、环状天冬氨酸(cAsp)、琥珀酰亚胺或其他异构化中间体。组合物中的异构化衍生物可以包含重链或轻链互补决定区(CDR)或可变区内其他部分中的衍生物。在多个实施例中，异构化在CDR中。异构化衍生物包含位于任一或两个可变区链中的SEQ ID NO:7的重链CDR D54，和/或SEQ ID NO:4的轻链CDR D49、D50或D52的变化。在多个实施例中，组合物中的异构化衍生物的量为约0.5％至约30％、或约0.5％至13％。在一些实施例中，组合物包含泰派鲁单抗及其衍生物，其中位于D54处的异构化的量小于约5％，和/或其中位于D49、D50或D52的一个或多个处的异构化的量小于约13％。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于30％的异构化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于30％的异构化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
脱酰胺化衍生物包含天冬酰胺残基的改变。示例性脱酰胺化衍生物包括完整脱酰胺化和脱酰胺化中间体。组合物中的脱酰胺化衍生物可以包含脱酰胺化的天冬酰胺：SEQID NO:3中列出的LCDR1中的N25/N26、SEQ ID NO:13中列出的重链可变区中的N316、和/或SEQ ID NO:13中列出的重链可变区中的N385/390。在多个实施例中，组合物包含脱酰胺化衍生物，该脱酰胺化衍生物包含位于N25/N26处以小于约3％的量的脱酰胺化，和/或位于一个或多个的N316和/或N385/390处以小于约13％量的脱酰胺化。在一些实施例中，组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约0.5％-10％。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的脱酰胺化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的脱酰胺化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
氧化衍生物包含在蛋白质中的一种或多种甲硫氨酸或色氨酸残基的改变。示例性氧化衍生物包括完整氧化或氧化中间体。组合物中的氧化衍生物可以包含位于任一或两个重链(或轻链，如果适用)中的重链甲硫氨酸的氧化：SEQ ID NO:6中列出的HCDR1的M34、或SEQ ID NO:13中列出的重链恒定区的M253或M359，或重链色氨酸的氧化：SEQ ID NO:7中列出的HCDR2的W52、SEQ ID NO:5中列出的LCDR3的W90、或SEQ ID NO:8中列出的HCDR3的W102的一个或多个处。例如，组合物中的氧化衍生物可以包含位于任一或两个重链(或轻链，如果适用)中的SEQ ID NO:6中列出的HCDR1的重链甲硫氨酸M34、SEQ ID NO:7中列出的HCDR2的重链色氨酸W52、SEQ ID NO:5中列出的LCDR3的轻链W90、或SEQ ID NO:8中列出的HCDR3的重链W102的一个或多个处的氧化。在多个实施例中，氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的重链甲硫氨酸M34、M253、M359的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约7％。在多个实施例中，氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的色氨酸W52、W90或W102的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约7％，任选地小于约5％或小于约3％。在一些实施例中，组合物中的氧化衍生物的量为约0.4％至约7％。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于7％的氧化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于7％的氧化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
高分子量衍生物包含抗体的聚集，或形成二聚体或更大的蛋白质聚集体。本文考虑的HMW种类包括泰派鲁单抗的二聚体和寡聚体。在多个实施例中，HMW种类为二聚体。在多个实施例中，二聚体是共价或非共价缔合的。在多个实施例中，组合物中的HMW种类的量为约1.7％或更少、约1.6％或更少、约1.5％或更少、约1.4％或更少、约1.3％或更少、约1.2％或更少、约1.1％或更少、约1.0％或更少、约0.9％或更少、约0.8％或更少、约0.7％或更少、约0.6％或更少、约0.5％或更少、或约0.4％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的HWM种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的HWM种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
泰派鲁单抗片段衍生物包括蛋白产物，这些蛋白产物在生产期间可通过内部肽酶切割或通过生产过程中的其他步骤产生。泰派鲁单抗片段包括低分子量(LMW)种类(例如小于约25kD)或中等分子量(MMW)种类(例如25至50kD之间)，或其组合。在多个实施例中，组合物中的片段的量为约1.7％或更少、约1.6％或更少、约1.5％或更少、约1.4％或更少、约1.3％或更少、约1.2％或更少、约1.1％或更少、约1.0％或更少、约0.9％或更少、约0.8％或更少、约0.7％或更少、约0.6％或更少、约0.5％或更少、或约0.4％或更少。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的片段种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的片段种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
泰派鲁单抗的糖基化衍生物包含糖残基特征的改变，这些糖残基可翻译后应用于抗体Fc区的天冬酰胺残基。示例性糖基化衍生物包括非岩藻糖基化、半乳糖基部分(半乳糖基化)的应用和高甘露糖部分对天冬酰胺的应用。本文考虑的糖基化衍生物是位于一个或两个重链上的SEQ ID NO:13中列出的Fc区中的天冬酰胺N298的糖残基的变化。在多个实施例中，组合物中的糖基化衍生物的量为小于约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％。在一些实施例中，糖基化衍生物包含小于约5％、约4％、约3％或约2％的量的非岩藻糖基化衍生物。在多个实施例中，糖基化衍生物包含小于约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％的量的半乳糖基部分。在多个实施例中，糖基化衍生物包含约25％或更少、约23％或更少(例如，约23.1％或更少)、约21％或更少、约19％或更少、约17％或更少、约15％或更少、约12％或更少、约10％或更少、约8％或更少、约5％或更少、或约4％或更少的量的高甘露糖部分。在多个实施例中，糖基化衍生物包含约23.1％或更少的量的高甘露糖部分。在多个实施例中，糖基化衍生物包含小于约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的量的高甘露糖部分。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过15％、13％、11％、8％或5％的高甘露糖，并且具有比具有大于15％的高甘露糖的组合物更少的清除率(和/或更长的半衰期)。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过约25％、约23％、约21％、约19％、约17％、约15％、约13％、约11％、约8％或约5％的高甘露糖，并且具有比具有大于约25％的高甘露糖的组合物更少的清除率(和/或更长的半衰期)。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过约23.1％的高甘露糖，并且具有比具有大于23.1％的高甘露糖的组合物更少的清除率(和/或更长的半衰期)。高甘露糖百分比可以通过HILIC确定。
具有“更少的清除率”的泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物是指当与参考抗体(例如泰派鲁单抗或其他IgG2抗体)的清除率相比时，体内(血液或血清)的清除率的量更少。泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的清除率与参考抗体相比可以为小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多的清除率水平。泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的“更长的半衰期”是指当与参考抗体(例如，泰派鲁单抗或其他IgG2抗体)在体内的半衰期相比，抗体在体内(血液或血清)可检测的时间长度更长。泰派鲁单抗或泰派鲁单抗衍生物的半衰期可以比参考抗体的半衰期长1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多。
在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约40％、35％、30％、25％、23％、21％、20％、19％、184、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或4％的糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性。
糖基化衍生物的功效和/或耐受性也可以与效应子功能和抗体清除率相关。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约15％、约13％、约11％、约8％或约6％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约25％、约23％、约19％、约17％、约15％、约13％、约11％、约8％或约6％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于约23.1％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的抗体清除率和/或更高的耐受性。
二硫化物结构异质性是重组的和天然存在的IgG2分子所固有的，这些分子含有18个二硫键-6个链间和12个链内。铰链：在典型IgG2-A结构中铰链肽含有四种二硫键。与典型IgG2-A结构不同，异构体IgG2-B含有连接Fab肽(CH1-CL-铰链)的两个拷贝和铰链肽的两个拷贝的对称键。IgG2-A/B呈中间体形式，掺入了IgG2-A和IgG2-B的部分特征，通过涉及一个Fab臂由二硫键与铰链肽的两个拷贝共价连接的不对称排列来定义。二硫化物同种型衍生物包含IgG2-B同种型和/或IgG2-A/B同种型。在多个实施例中，组合物中的二硫化物同种型衍生物的量小于约75％。在一些实施例中，当衍生物包含包含IgG2-B同种型时，组合物中的二硫化物同种型衍生物的量小于约20％、约15％、约10％或约5％。在一些实施例中，当衍生物包含IgG2-A/B同种型，组合物中的IgG2-A/B同种型的量小于约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约35％。在多个实施例中，组合物中的IgG2-A/B同种型的量为约38％至约43％。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于75％的二硫化物同种型衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力。在多个实施例中，泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于75％的二硫化物同种型衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
在多个实施例中，组合物具有以下特征的一种或多种：
(a)该组合物中的异构化衍生物的量为约30％或更少，如通过还原性肽作图测量的；
(b)该组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约15％或更少，如通过肽作图测量的；
(c)该组合物中的氧化衍生物的量为约7％或更少，如通过还原性肽作图测量的；
(d)该组合物中的糖基化衍生物的量为约40％或更少，如通过聚糖作图测量的；
(e)该组合物中的二硫化物同种型衍生物的量为约75％或更少，如通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量的；
(f)该组合物中的HMW种类的量为约20％或更少，如通过SE-HPLC测量的；和/或
(g)该组合物中的片段的量为约15％或更少，如通过rCE-SDS测量的。
在一些实施例中，组合物是本文所述的配制品的一部分。在一些实施例中，组合物是用于产生如本文所述的配制品的原料药。
施用方法
在一方面，本披露的方法包括施用本文所述的治疗性抗TSLP抗体或抗体衍生物的步骤，该抗体或抗体衍生物任选地在药学上可接受的载剂或赋形剂中。在某些实施例中，药物组合物为无菌组合物。
本文预期的是用于用如本文所述的抗TSLP抗体或抗原结合蛋白或其片段治疗炎性疾病、病症或障碍的方法，该炎性疾病、病症或障碍如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特应性皮炎、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎和特发性肺纤维化(IPF)。在多个实施例中，疾病、病症或障碍是哮喘，包括重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞性哮喘。
哮喘是气道的一种慢性炎性病症。据估计美国每年哮喘占110万门诊病人就诊、160万急诊、444,000住院治疗，(Defrances等人,2008)，该信息可获自：疾病控制中心网站，www.cdc.gov/nchs/data/nhsr/nhsr005.pdf，且3,500例死亡。在易感个体中，哮喘炎症引起喘息、呼吸急促、胸闷和咳嗽的复发性事件。认为哮喘的病因是多因素的，受遗传环境机制(To等人,BMC Public Health[BMC公共健康]2012；12:204；Chung等人.Eur Respir J[欧洲呼吸杂志]2014；43:343-73)，与环境过敏原(一种重要起因)(Chung等人,同上；PavordID,等人,NPJ Prim Care Respir Med[NPJ呼吸初级保健杂志]2017；27:17)两者的影响。大部分病例在一个人变得对过敏原超敏感时出现(特应性)。特应性的特征在于Th2细胞增加以及Th2细胞因子表达和IgE产生。认为美国大约1000万患者患有过敏症诱发的哮喘。尽管具有可利用的治疗选择，但哮喘仍然为主要健康问题。在世界范围内，当前哮喘影响大约3亿人；至2020年，预计哮喘影响4亿人(Partridge,Eur Resp Rev.[欧洲呼吸综述]16:67-72,2007)。
特应性哮喘患者吸入过敏原诱发一些哮喘表现，包括可逆的气流阻塞、气道高反应性、以及嗜酸细胞性和嗜碱性气道炎症。过敏原吸入激发已成为许多物种中哮喘的主要模型(Bates等人,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.[美国生理学杂志-肺细胞生理学与分子生理学]297(3):L401-10,2009；Diamant等人,J Allergy Clin Immunol.[过敏与临床免疫学杂志]132(5):1045-1055,2013)。
已鉴别出难以用类固醇治疗来治疗的不同哮喘亚型。嗜酸细胞为特有地由Th2型CD4+T细胞介导的过敏性哮喘中的重要炎性细胞。在重度哮喘中嗜中性细胞气道炎症与皮质类固醇治疗有关且可由Th1或Th17型T细胞介导(Mishra等人,Dis.Model.Mech.[疾病模型与机制]6:877-888,2013)。
诊断和评估哮喘的量度包括以下：使用标准化单次呼吸的呼出气一氧化氮分数(FeNO)(美国胸科学会(American Thoracic Society)；ATS,Am J Respir Crit Care Med.[美国呼吸与危重症医学杂志]171(8):912-30,2005)测试而评估的气道炎症。根据ATS/欧洲呼吸协会(European Respiratory Society，ERS)指南进行肺活量测定法(Miller等人,Eur Respir J.[欧洲呼吸杂志]26(1):153-61,2005)。在受试者进行BD前肺活量测定法之后评估支气管扩张剂后(BD后)肺活量测试。使用SABA，如舒喘宁(albuterol)(90μg计量的剂量)或沙丁胺醇(salbutamol)(100μg计量的剂量)或等同物，利用隔离装置，诱发最大支气管扩张，最多进行总共8次吹吸(Sorkness等人,J Appl Physiol.[应用生理学杂志]104(2):394-403,2008)。将在4次、6次或8次吹吸之后获得的最高BD前和BD后FEV1用于测定可逆性及进行分析。哮喘控制问卷(ACQ)6为评估哮喘症状(即夜间醒来、醒来症状、活动限制、呼吸浅短、喘息)和每日使用拯救支气管扩张剂和FEV1的由患者报告的问卷(Juniper等人,1999年10月)。ACQ-6为ACQ的缩短版本，其自初始ACQ评分省略FEV1测量。平均ACQ评分为反应平均值。平均评分≤0.75指示哮喘控制良好，评分在0.75与≤1.5之间指示哮喘得到部分控制，且评分>1.5指示哮喘不受控制(Juniper等人,Respir Med.[呼吸道医学]100(4):616-21,2006)。认为至少0.5的个体变化为临床上有意义的(Juniper等人,Respir Med.[呼吸道医学]99(5):553-8,2005)。标准化哮喘生活质量问卷(AQLQ[S])+12(AQLQ(S)+12)为测量哮喘患者所经历的HRQoL的32项问卷(Juniper等人,Chest.[胸]115(5):1265-70,1999年5月)。哮喘每日日志也用于评估。
相关的美国专利公开US-2018-0296669(通过引用并入本文)披露了用抗TSLP抗体治疗有效地减少非嗜酸细胞/低嗜酸细胞群体中的哮喘症状(如同其在高嗜酸细胞群体中一般)。还预期降低受试者的哮喘恶化频率的方法。
本文还预期治疗具有Th2高哮喘概况或Th2低哮喘概况的受试者的哮喘的方法。预期抑制TSLP蛋白与其受体复合物结合的TSLP拮抗剂将与本文所述的抗体一样有效地治疗低嗜酸细胞性哮喘群体。相似地，预期抑制TSLP与其受体复合物结合的TSLP拮抗剂将有效地治疗Th2低哮喘群体。还预期用于治疗受试者的慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，该方法包括施用本文所述的抗TSLP抗体或抗体衍生物或抗原结合蛋白。预期待治疗的受试者为人类。受试者可为成人、青少年或儿童。
治疗性抗体(或抗体衍生物)组合物可在多个部位递送至患者。多次施用可同时进行或可在一段时间内施用。在某些情况下，提供治疗性组合物的连续流动为有益的。可周期性施用其他疗法，例如每小时、每日、每周、每2周、每3周、每月或以更长时间间隔。
在多个实施例中，既定剂量的治疗剂(如具有两个TSLP结合位点的二价抗体)的量可根据疗法施用的个体的体型以及所治疗的病症的特征而变化。
在示例性治疗中，抗TSLP抗体或抗体衍生物以每日剂量约70mg至约280mg的剂量范围施用。例如，剂量能以约70mg、210mg或280mg给予。在多个实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物可以每剂70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、10mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg或280mg的剂量施用。这些浓度能以单个剂型或多个剂量施用。以上剂量每两周或每四周给予。在多个实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物以70mg的单次剂量每两周或每四周施用。在多个实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物以210mg的单次剂量每两周或每四周施用。在多个实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物以280mg的单次剂量每两周或每四周施用。
对于抗体衍生物，抗体衍生物的量应使得剂量中的TSLP结合位点的数量与上述标准二价抗体的TSLP结合位点的数量是等摩尔的。
预期抗TSLP抗体或抗体衍生物每2周或每4周施用至少4个月、6个月、9个月、1年或更长时间的时期。在多个实施例中，该施用为皮下或静脉内。
预期用抗TSLP抗体或抗体衍生物治疗会减少受试者的血液、痰液、支气管肺泡液或肺中的嗜酸细胞。还预期该施用将受试者中的细胞计数自Th2高群体变成Th2低群体。进一步预期施用抗TSLP抗体改善受试者中一个或多个哮喘量度，该哮喘量度选自由以下组成的组的：用力呼气量(FEV)、FEV1可逆性、用力肺活量(FVC)、FeNO、哮喘控制问卷-6评分和AQLQ(S)+12评分。
哮喘改善可被测量为以下中的一个或多个：AER(年恶化率)降低；哮喘的住院治疗/重度恶化减少；首次哮喘恶化(在开始用抗TSLP抗体治疗后)的时间自基线的变化(增加)；在治疗过程(例如52周)中具有一或多次哮喘恶化或重度恶化的受试者的比例相对于安慰剂减少；FEV1和FVC(支气管扩张剂前和支气管扩张剂后)自基线的变化(增加)；血液或痰液的嗜酸细胞(或若获得活检或BAL流体，则为肺嗜酸细胞)自基线的变化(减少)；FeNO自基线的变化(减少)；IgE自基线的变化(减少)；如通过包括ACQ和变体、AQLQ和变体、SGRQ和哮喘症状日志的PRO所测量的哮喘症状和控制有所改善；拯救药物的使用变化(减少)；全身性皮质类固醇的使用减少；血液中Th2/Th1细胞比率下降。大部分/所有这些量度应在总群体和亚群中，包括高和低嗜酸细胞(大于或等于250为高；小于250为低)、过敏性和非过敏性、Th2高和低、骨膜蛋白高和低(与中位数值相比)和FeNO高和低(大于或等于24或小于24)。
本披露中还预期施用多种药剂，如抗体组合物结合如本文所述的第二药剂，包括但不限于消炎剂或哮喘疗法。
然而，预期在多个实施例中，该施用降低受试者中共同施用的疗法的频率或水平。示例性共同施用的疗法包括但不限于吸入型皮质类固醇(ICS)、长效β2激动剂(LABA)、白三烯受体拮抗剂[LTRA]、长效抗毒蕈碱药[LAMA]、色甘酸钠、短效β2激动剂(SABA)、以及茶碱或口服皮质类固醇。在多个实施例中，该施用消除对皮质类固醇疗法的需要。
配制品
在一些实施例中，本披露预期了药物组合物的用途，这些药物组合物包含治疗有效量的抗TSLP抗体或抗体衍生物，以及药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂、和/或辅助剂。另外，本披露提供通过施用此类药物组合物治疗受试者的方法。
在某些实施例中，可接受的配制物质优选地在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施例中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH值、渗透压度、黏性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透的配制物质。在此类实施例中，适合的配制材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；疏松剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨聚糖、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、氚核、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙星(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选地氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药用辅助剂。参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿药物科学],第18”版,(A.R.Genrmo编辑),1990,MackPublishing Company[麦克出版公司]。
适合的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，可能补充有组合物中常见的用于肠胃外施用的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在特定实施例中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，且可进一步包括山梨糖醇或其适合取代物。
配制品组分优选地以对施用部位可接受的浓度存在。在某些实施例中，使用缓冲液以将组合物维持在生理pH值或稍低pH值下，典型地在约4.5至约8的pH值范围内。包括约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9和约8.0。
在多个实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物呈含有乙酸盐以及脯氨酸、蔗糖、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80中的一种或多种的配制品。在多个实施例中，配制品包含5-50mM乙酸盐、小于或等于3％(w/v)脯氨酸、0.015％(w/v)±0.005％(w/v)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，pH在4.9和6.0之间。任选地，抗体或抗体衍生物处于约100和约150mg/ml之间的浓度。配制品可储存在-20℃至-70℃下。包含这些赋形剂的示例性抗TSLP配制品描述于国际申请号PCT/US2021/018561中，通过引用并入本文。
在替代性实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物呈含有表面活性剂以及至少一种碱性氨基酸或其盐的配制品。在示例性情况中，碱性氨基酸是精氨酸或组氨酸。在多个实施例中，盐是精氨酸谷氨酸盐或组氨酸谷氨酸盐，任选地呈10至200mM的浓度。任选地，配制品进一步包含脯氨酸。在替代性实施例中，抗TSLP抗体或抗体衍生物呈含有表面活性剂以及钙或其盐的配制品。在多个实施例中，盐是谷氨酸钙，任选地呈15mM至约150mM的浓度。任选地，配制品进一步包含脯氨酸。在多个实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80、或其混合物。任选地，抗体或抗体衍生物处于大于约110mg/ml，或大于约140mg/ml的浓度。包含这些赋形剂的示例性抗TSLP配制品描述于国际专利申请号PCT/US2021/017880中，通过引用并入本文。
当考虑肠胃外施用时，使用的治疗性组合物可呈无热原的肠胃外可接受的水溶液形式提供，该水溶液包含在药学上可接受的媒介物中的所需抗TSLP抗体或其衍生物中。一种尤其适合肠胃外注射的媒介物为无菌蒸馏水，其中抗体配制成适当防腐的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制备可以涉及用试剂配制所需分子，该试剂如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体，它们可提供可经由积存注射递送的产品的控制释放或持续释放。在某些实施例中，也可以使用透明质酸，其具有促进在循环中的持续时间的作用。在某些实施例中，可植入的药物递送装置可用于引入抗体。在多个实施例中，可以经由预填充注射器或自动注射器施用。在多个实施例中，自动注射器是Ypsomed在多个实施例中，自动注射器披露于WO 2018/226565、WO 2019/094138、WO 2019/178151、WO 20120/072577、WO2020/081479、WO 2020/081480、PCT/US20/70590、PCT/US20/70591、PCT/US20/53180、PCT/US20/53179、PCT/US20/53178、或PCT/US20/53176。
试剂盒
作为另外的一方面，本披露包括含有一种或多种化合物或组合物的试剂盒，该化合物或组合物以有利于其用于实施本披露方法的方式包装。在一个实施例中，这种试剂盒包括本文所述的化合物或组合物，该化合物或组合物包装在容器，如密封的瓶或容器中，标签贴在容器上或包括在包装中，该标签描述了化合物或组合物在实践该方法中的用途。优选地，化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒进一步包括适于根据具体的施用途径施用组合物的装置或适于实践筛选测定。优选地，试剂盒含有描述抗体组合物的用途的标签。
本披露的另外的方面和细节将从以下实例中显而易见，这些实例旨在说明而非限制。
实例
实例1-泰派鲁单抗属性的鉴定
泰派鲁单抗是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的IgG2亚类的全长人单克隆抗体。它由λ亚类的2个重链(HC)和2个轻链(LC)组成。重链和轻链通过二硫键共价连接。进行泰派鲁单抗的生化、生物物理和生物表征，以提供对其结构和功能性质的全面了解，并能够评估可能影响结合和功效的抗体属性。
材料与方法
潜在地影响结合的AMG 157和不稳定残基：作为序列A5(和作为链H5、L5)的AMG157的氨基酸序列以及其他几种TSLP结合抗体先前描述于专利US 7,982,016 B2中。
具有A2G0F/A2G0F糖基化的抗体(C6500 H9998 O2068 N1734S52)的分子量为147189.4Da，该抗体包括去除重链N末端焦谷氨酸和C末端K。TSLP含有74％单体、23％二聚体和3％四聚体种类。
肽作图：使用如在(Ren等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]392:12-21(2009))中所述的样品制备程序，包括用胍重折叠，二硫键的还原和烷基化，缓冲液交换以及用适用于LC-MS分析的肽上的胰蛋白酶消化，进行泰派鲁单抗样品的肽作图。简言之，将包含泰派鲁单抗的样品在0.5ml的pH 7.5变性缓冲液(7.5M盐酸胍(GdnHCl)和0.25M Tris)中稀释至约1mg/ml。通过添加3μl的0.5M二硫苏糖醇(DTT)，随后在室温下孵育30分钟完成还原。通过添加7μl的0.5M碘乙酸(IAA)完成羧甲基化。将反应在黑暗中、在室温下进行15分钟。通过添加4μl的0.5M DTT淬灭过量IAA。使用NAP-5柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州，美国)，将还原的和烷基化泰派鲁单抗样品缓冲液交换至pH7.5消化缓冲液(0.1M Tris或0.1M碳酸氢铵)中。将冻干的胰蛋白酶溶于水中以至终浓度为1mg/ml。通过向还原的、烷基化的以及缓冲液交换的泰派鲁单抗样品添加1-mg/ml胰蛋白酶溶液开始消化，以实现1:25的酶/底物比率。消化在37℃下进行30分钟。通过添加5tl的20％FA将最终消化物淬灭。如在(Ren等人,2009,同上)中所述，在Agilent1290UHPLC系统上进行消化的泰派鲁单抗样品的LC-MS/MS肽作图分析，该系统连接至赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)Q-Exactive Biopharma质谱仪。通过MassAnalyzer软件(Zhang,Anal.Chem.[分析化学]81:8354-8364(2009))，将获取的LC-MS/MS原始数据和泰派鲁单抗和靶标的序列用于鉴定且定量修饰。
SE-UHPLC：将泰派鲁单抗样品加载到分析型SE-UHPLC柱(BEH200柱，1.7μm粒度，4.6mm×150mm，沃特斯公司(Waters Corporation))上，并且使用包含100mM磷酸钠、250mM氯化钠(pH6.8)的流动相将蛋白质等度分离。通过在280nm处的UV吸光度监测洗脱液。在环境温度下操作柱，并以0.4mL/min的流速将流动相施加到柱上。
非还原性RP-HPLC：通过RP-HPLC使用Waters BEH300 C4柱(1.7μm粒度，2.1mm×50mm)分析泰派鲁单抗样品，并且在75℃下使用含有0.1％ TFA的流动相和1-丙醇的梯度洗脱。检测在215nm处的吸光度。
还原性CE-SDS：通过rCE-SDS分析泰派鲁单抗样品。在pH 6.5的十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇存在下，通过加热将样品还原且变性，然后在25℃下将样品电动注射至填充有SDS凝胶缓冲液的裸露熔融石英毛细管中。在220nm处监测吸光度。
CEX-UHPLC：将泰派鲁单抗原料药的样品加载到分析CEX-HPLC柱(BioPro SP-F，5μm粒度，4.6mm×100mm，YMC美洲公司(YMC America,Inc.))上。流动相A包含20mM磷酸钠(pH6.6)，并且流动相B由20mM磷酸钠、500mM氯化钠(pH 6.6)组成。使用从0min至4min的5％至12％流动相B，在18min至23％流动相B，在18.5min至20.5min至100％流动相B，和在21min至25min返回至5％流动相B产生的线性盐梯度来分离蛋白质。通过在280nm处的UV吸光度监测洗脱液。将柱在28℃下处理，并且将流动相在0.6mL/min的流速下施加至该柱。
聚糖作图：N-聚糖作图是分析技术，其中附接天冬酰胺残基的寡糖通过酶裂解来释放。随后用荧光标签衍生的游离寡糖用于检测和定量。通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)与荧光检测对经标记的寡糖进行分离，以生成聚糖谱。在该方法中，泰派鲁单抗用N-糖苷酶F(PNGase F)进行酶消化，该N-糖苷酶F特异性裂解寡糖的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)与天冬酰胺残基之间的键。释放的寡糖通过还原胺化用2-氨基苯甲酸(2-AA)标记。在离心清除步骤后，通过超高效液相色谱(UPLC)系统上的HILIC分离寡糖。计算主要寡糖种类的相对％峰面积。
功效：通过受体-配体结合生物测定和/或基于细胞的报告基因生物测定观察包含本文所述的属性的泰派鲁单抗组合物的功效。
受体-配体结合测定：该测定提供了泰派鲁单抗活性的近端测量，并且直接反映了泰派鲁单抗的分子作用机制，泰派鲁单抗结合TSLP并且防止其与TSLP受体(TSLPR)结合。该方法提供了泰派鲁单抗对抑制TSLP与TSLPR的结合的能力的定量测量。泰派鲁单抗与重组TSLP-His配体(TSLP-His)结合，并且抑制其与生物素化TSLP受体(TSLPR)结合。功效测定是检测生物分子相互作用的基于珠粒的放大化学发光亲和均相检测(α)。该测定含有两种珠粒类型：受体珠粒和供体珠粒。供体珠粒用水凝胶(含有酞菁、光敏剂和链霉亲和素)包被。受体珠粒用含有二甲基噻吩衍生物以及镍螯合物的水凝胶包被。供体珠粒通过链霉亲和素和生物素之间的相互作用结合生物素化的TSLPR，并且由于镍螯合物和组氨酸之间的相互作用，受体珠结合带有组氨酸标签的TSLP。当TSLP-His和生物素化的TSLPR相互结合时，受体珠粒和供体珠粒紧密接近。当将激光应用于该复合物时，环境氧经由供体珠粒转化为单线态氧。如果这些珠粒紧密接近，则会发生向受体珠粒的能量转移，从而产生发光，这是在配备有信号检测能力的板读取器中测量的。泰派鲁单抗结合TSLP-His并且阻止其结合生物素化的TSLPR，因此以剂量依赖性方式降低发光输出。通过比较测试样品应答与获得自参考标准的应答确定测试样品活性。应当理解，本段中的受体-配体结合测定是适用于确定组合物抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His结合的能力的测定。
基于细胞的报告基因生物测定：人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)蛋白与在稳定的鼠BaF细胞表面上表达的人TSLP受体(TSLPR)复合物结合，诱导了Stat 5激活和细胞增殖。该方法利用鼠BaF/hu HTR细胞系，该鼠BaF/hu HTR细胞系用编码Stat荧光素酶报告基因和杀稻瘟菌素抗性基因的质粒共转染。当Stat/BaF/HTR细胞用重组人TSLP孵育，信号转导发生在结合TSLPR后，导致荧光素酶活性增加。AMG 157拮抗诱导TSLPR的活性的TSLP，因此抑制介导荧光素酶应答的TSLP。该方法测量了AMG 157参考标准和在用TSLP刺激的Stat/BaF/HTR细胞上的测试样品的剂量依赖性抑制作用。用TSLP和泰派鲁单抗孵育后，将这些细胞用含有洗涤剂(用于细胞裂解)和荧光素、荧光素酶的底物的试剂处理。荧光素酶与荧光素的反应导致在光度计中测量的发光。在添加荧光素酶底物之后，通过发光读数对报告细胞中响应于TSLP刺激的荧光素酶的产生进行定量。诱导荧光素酶报告活性激活的TSLP的抑制程度与泰派鲁单抗的量成比例。通过比较测试样品对参考标准的应答确定测试样品生物活性。应当理解，本段中所述的基于细胞的报告基因测定是适用于测定组合物抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力的测定，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
结果
泰派鲁单抗的生化表征鉴定了经修饰的泰派鲁单抗抗体，这些抗体可从泰派鲁单抗制剂和储存后的原料药中分离出来，该原料药包括异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、高分子量种类、片段化种类、部分还原性种类、高甘露糖聚糖衍生物或二硫化物同种型衍生物。评估了这些属性对泰派鲁单抗的功效和耐受性的潜在影响。
异构化：通过还原性肽作图与LC-MS/MS评估天冬氨酸异构化。天冬氨酸残基，无论是天然的还是通过Asn脱酰胺化形成的，都可能经由环状酰亚胺中间体发生异构化。基于经修饰的残基与CDR的接近度，异构化可能会影响靶标结合和功效。通过肽作图研究的质谱分析评估泰派鲁单抗中的天然异构化水平。在原料药中未观察到显著水平的位于HC CDR2Asp54和LC CDR3 Asp91/95的异构化。热暴露强制降解研究显示出，LC CDR2 Asp49/50在高温下对异构化敏感。此外，也显示出HC CDR2 Asp54的异构化水平在高温下略微增加(<2％)。因此，在5周的热强制降解(40℃)后，主要异构化位点被鉴定为LC CDR Asp49/50和HC CDRAsp54，分别为10％和2％。
在原料药中，观察到在轻链CDR2中的Asp49/50的异构化为约0.2％。在原料药中未观察到显著水平的位于HC CDR2 Asp54和LC CDR3 Asp91/95的异构化。
在保质期结束时，对临床试验中使用的产品批次监测杂质水平，如HMW种类、碎片、异构化等，并且与同一批次初始释放时的杂质比较。杂质随时间的增加允许用于计算受试者对杂质水平的临床暴露和确定这些属性对产品安全性的影响，并且提供了在原料药中杂质的耐受性的测量。例如，泰派鲁单抗的临床研究利用原料药，该原料药的给药直到其36个月临床保质期的最后一个月。与使用新药物产品批次相比，使用过期药物产品结合更高和更频繁的给药使患者暴露于更高水平的产品相关物质和产品相关杂质。与每月皮下注射给药210mg的剂量相比，增加的暴露量主要是由于每月治疗的累积给药增加(例如，通过420mgQ14D皮下注射给药)。
通过每两周皮下注射420mg的临床剂量比每月210mg的剂量高约4X。根据该给药计划，计算出如通过“曲线下面积”(AUC)或最大血清浓度(Cmax)表示的较高剂量方案的全身暴露量，分别比较低临床剂量高3.2X至3.7X。根据临床研究方案，仅当在暴露量出现出乎意料的变化或出现潜在地与抗药物抗体相关的安全事件时，才会进行抗体测试。未观察到这些结果，并且药物耐受良好。
基于该临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平，并且评估了耐受性。例如，在药物产品(例如，HWM)的属性％可以乘以临床暴露乘数，以确定在210mg Q28D的建议剂量下施用的产品批次中的等效％属性水平。
对于异构化，基于剂量210mg Q28D计算的多达30％的总异构化与任何体内安全性相关问题无关。基于210mg Q28D的剂量计算的26％的D49/D50或D52异构化与任何体内安全性相关问题无关，而基于210mg Q28D的剂量计算的4％的D54异构化与任何体内安全性相关问题无关。
氧化：使用还原性胰蛋白酶肽图LC-MS评估氧化。位于甲硫氨酸(Met)残基处的氧化是翻译后修饰，其可由于暴露于氧气和/或化学氧化剂以及光暴露而潜在地产生。泰派鲁单抗在每个重链中含有8个Met残基(Met2、Met34、Met83、Met117、Met253、Met359、Met398、Met429)。在轻链中没有Met残基。仅一个Met残基(Met34)位于互补决定区(CDR)。在位于重链的残基Met2、Met117、Met253、Met359、Met398处观察到低但可检测的氧化水平(表1)。CDR中的甲硫氨酸氧化可潜在地影响功效，然而未观察到CDR区的Met34的氧化。通过还原性肽图与质谱检测(ESI-MS)估计氧化程度。将来自氧化和未氧化种类的相对强度的推断用于计算相对百分比；然而，由于干扰种类的电离效率和共洗脱的潜在差异，该方法被认为是半定量的。将强氧化下的泰派鲁单抗的分析用于阐明分子上特异性位点对氧化的敏感性。
表1.泰派鲁单抗原料药中的甲硫氨酸氧化水平
强化学氧化显示出重链甲硫氨酸的敏感性顺序为Met117>Met253>Met2>Met429，表明Met117和Met253是具有最大的溶剂暴露的位点。与上述化学氧化研究相似，光降解研究确定了重链Met残基对光诱导氧化的相对敏感性如下所示：Met253>Met117>Met398>Met359。Met34氧化水平低于定量水平，并且给定的序列和分子折叠表明该残基不可用于氧化。此外，光降解研究显示出色氨酸残基的氧化水平增加顺序为Trp102>Trp56>Trp52>Trp90，表明重链可变区Trp102和轻链Trp56是具有最大的溶剂暴露的位点(表2)。
表2.泰派鲁单抗原料药中的色氨酸氧化水平
在保质期结束时观察到的氧化EOS(最大值36个月2-8C加上2个月30C)显示出，HCDR中W52处氧化约0.2％，W102处氧化1.1％。原料药氧化检测0.3％至0.5％氧化的W102。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。基于210mg Q28D的剂量计算的多达6％-7％氧化的W102与任何体内安全性问题无关。色氨酸氧化可能发生在高温和极端的可见光和UV光暴露下。通过极端条件造成的CDR色氨酸氧化与功效的适度降低有关。色氨酸氧化与黄光比色指数之间有很强的相关性。
脱酰胺化：使用胰蛋白酶肽作图与LC-MS评估天冬酰胺脱酰胺化。通过肽作图研究的ESI-MS/MS分析评估泰派鲁单抗中的天然脱酰胺化水平。仅观察到位于重链的残基Asn316和Asn 385处的低水平脱酰胺化(表3)。在原料药中其他位点未观察到脱酰胺化，这些位点包括分别在重链CDR2和轻链CDR1中的Asn57和Asn25/26。
表3.泰派鲁单抗原料药中的天冬酰胺脱酰胺化水平
使用在强脱酰胺化条件下的泰派鲁单抗分析，以评估特异性分子位点对脱酰胺化的敏感性。在生理pH 7.4下，确定最敏感的位点为Asn390和Asn385(原料药3％；EOS 5％)，而次要敏感位点鉴定为Asn316(原料药0.09％-0.1％；EOS 0.4％)，所有这些位于Fc区。LC可变CDR区中位于Asn25处的脱酰胺化仅在低水平下观察到(原料药0.1％至0.2％；EOS0.4％)。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。位于Asn25处的计算的脱酰胺化多达2％(基于210mg Q28D的剂量)与任何体内安全性相关问题无关，并且位于Asn385/390处的计算的脱酰胺化多达13％(基于210mg Q28D的剂量)与任何体内安全性相关问题无关。
糖基化：糖基化与抗体效应子功能和抗体与细胞表面上的Fc受体的结合相关，并且改变的糖基化可干扰这些功能的一种或多种。效应子功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
基于共有序列的存在以及从哺乳动物细胞培养物产生的IgG2单克隆抗体的历史特征，预计泰派鲁单抗在每个重链上的Asn298处含有单个N-糖基化位点。通过比较使用和未使用PNGaseF处理的胰蛋白酶肽图评估糖基化位点。PNGaseF切割聚糖的还原末端N-乙酰葡糖胺残基和肽主链的Asn残基之间的高甘露糖、杂交体和复合聚糖部分。通过将色谱分离的出口偶联至Orbitrap质谱仪了来确定N-连接聚糖图中的种类的组合物。
泰派鲁单抗的聚糖补体的综合表征证明，存在具有不同程度的末端半乳糖基化的双触角N-连接结构作为主要种类和高水平(约95％)岩藻糖基化。如通过HILIC确定的每种CEX原料药的聚糖分布显示于表4中。
表4.泰派鲁单抗原料药(DS)的聚糖峰面积％
泰派鲁单抗聚糖衍生物群体含有半乳糖基化种类(DS 19.9％-28.6％)、非岩藻糖基化种类(DS1.1％-1.2％)以及DS中3.9％-4.8％的高甘露糖种类(主要作为寡甘露糖5)。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。计算的多达约5％的非岩藻糖基化种类、计算的多达75％-90％的半乳糖基化种类、以及计算的多达14％至18％的高甘露糖衍生物与任何体内安全性相关问题无关，所有估计值基于210mg Q28D的剂量。
为研究去除N-连接聚糖的生物学作用，用PNGaseF处理泰派鲁单抗，纯化，并且通过受体-配体结合测定和基于细胞的报告基因生物测定来测试(表5)。这些结果证明，去除N-聚糖在任一功效测定中对泰派鲁单抗均无作用。
表5.去糖基化的泰派鲁单抗的生物活性
*3次重复的平均值
高甘露糖聚糖水平可能潜在地影响产品半衰期，并且生产生物反应器的工艺条件可能影响高甘露糖水平。在工艺表征研究中评估了生产生物反应器工艺参数对高甘露糖的影响，其中鉴定出pH是影响高甘露糖的主要工艺参数。建立了可接受的pH范围以支持一致的高甘露糖水平。在工艺表征研究中的高甘露糖水平为≤7.5％。
实例2-大小衍生物
除了泰派鲁单抗的氨基酸水平的化学变化外，具有聚集体或片段的衍生物也是可能的。
假定存在2个未修饰的轻链、2个N-末端焦谷氨酸化的重链和18个二硫化物，完整泰派鲁单抗的肽主链的总预期质量为144,298Da。此外，天然泰派鲁单抗在两个重链的每一个上的Asn298处含有单一N-连接糖基化位点。具有在Asn298处的2个拷贝的聚糖、2个拷贝的主要重链C-末端Gly衍生物以及2个拷贝的主要重链N-末端焦谷氨酰胺的完整的糖基化泰派鲁单抗的理论质量为147,189Da。用PNGaseF处理的完整泰派鲁单抗去除N-糖基化，同时由于携带聚糖的Asn转化为Asp残基，多肽质量中每个链随之增加1Da，并且降低了去卷积质谱的异质性。去糖基化物质的理论质量为144,300Da。
大小异质性是蛋白质通过化学或酶切割作用以及通过各种机制自缔合的固有性质。潜在的大小衍生物可包括：高分子量(HMW)种类通过自缔合以形成比单体更大的种类(二聚体、更高阶的寡聚种类)。HMW可以通过非共价缔合、可还原共价缔合和/或非可还原共价缔合形成；低分子量(LMW)种类可以通过多肽主链的截短和/或亚基成分(即，轻链和重链)的不完整组装形成。
泰派鲁单抗的大小异质性使用以下分析方法评估：在天然条件下尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)来评估大小和纯度；沉降速率超速离心(SV-AUC)和具有静态光散射(SLS)的SE-HPLC检测来提供摩尔质量的另外的评估；在还原和变性条件下还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)来确定大小和纯度。分离的衍生物包括片段、非可还原共价键、缺少正常糖基化或含有另外的糖基化位点的多肽；在变性条件下非还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)来确定大小和纯度。分离的衍生物包括部分组装的分子、片段、共价键。
这些分析技术的结果表明：基于SE-UHPLC、SE-HPLC-SLS以及沉降速率分析超速离心(SV-AUC)结果，泰派鲁单抗原料药主要由单体组成，二聚体和LMW种类的水平较低。在变性(nrCE-SDS)条件以及还原和变性条件(rCE-SDS)下观察到低水平的LMW种类。基于rCE-SDS结果，泰派鲁单抗主要还原为HC和LC组分，片段化和HMW种类的水平略低。这些包括LMW(比LC小)、中等分子量(MMW，比HC小，但比LC大)以及HMW(比HC大)种类。LMW种类(例如，小于25kD)和MMW种类(约25至50kD)被共同检测为片段，并且在小于2％的泰派鲁单抗制剂中观察到[DS：<0.4％(HC+LC为98.7％-99％)；EOS：1.5％(HC+LC为97.3％-97.5％)]。
通过非变性SE-UHPLC(是过程中控制的方法，并且是原料药和药物产品释放及稳定性测试计划的一部分)监测泰派鲁单抗的大小异质性。在非变性条件下进行方法，以从单体主峰中分离HMW种类。通过SE-UHPLC在Waters BEH200 4.6x150mm 1.7mm粒度柱上，流动相为100mM磷酸钠、250mM氯化钠，pH 6.8，流速为0.4mL/min和在280nm吸光度下检测，分析泰派鲁单抗原料药。曲线由主峰的存在来主导(相对面积百分比为99.6％)，在约为2.8分钟洗脱。在约2.2分钟的保留时间内，在主峰之前洗脱出最好在20X增强色谱中观察到的次要的峰。该峰含有泰派鲁单抗HMW，并且具有0.4％的相对面积百分比，如在表6中所示。
表6.通过SE-UHPLC的泰派鲁单抗原料药的峰面积百分比
总体而言，在原料药(DS)中检测到HMW种类为约0.3％-0.6％，但在EOS中为1.7％，例如≤1.4％ HMW(释放)和≤1.7％ HMW(稳定度)。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。计算的多达20％ HMW的HMW种类(基于210mg Q28D的剂量)与任何体内安全性相关的问题无关。
将rCE-SDS用于评估重链和轻链，以及LMW和MMW种类。泰派鲁单抗的rCE-SDS电泳图呈现在如表7中所示的峰面积％值。这些数据证明，泰派鲁单抗由二硫键连接的重链和轻链组成。在泰派鲁单抗原料药中，在LMW和MMW区域观察到的次要峰位于该方法的基线噪声和可变性内。与SE-UHPLC结果一致，几乎未观察到LMW或MMW种类。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。基于210mg Q28D的剂量计算的多达15％的片段种类与任何体内安全性问题无关。
表7.通过rCE-SDS的泰派鲁单抗原料药的峰面积百分比
*LOQ＝0.3％
还可以在非还原条件下进行CE-SDS以便评估非单体种类的存在。该技术在变性条件下进行，以去折叠蛋白质并且破坏非共价缔合，并且特别适用于检测部分分子种类和部分还原的完整分子，即那些缺少单体抗体预期的2个轻链和2个重链组分或各自链内键联中的一个或多个的分子。已在某些细胞培养条件下报告了由与单个轻链相关的2个重链(HHL)或与单个轻链相关的单个重链(HL，也称为半分子)组成的种类(Trexler-Schmidt M等人,2010)。在SDS和N-乙基马来酰亚胺(pH 6.5)的存在下，通过加热将泰派鲁单抗变性，然后在25℃下将泰派鲁单抗电动注射至填充有SDS凝胶缓冲液的裸露熔融石英毛细管中(50mm IDx 30.2cm)。注射电压为10.0kV，分离电压为15.0kV，并且在220nm下监测吸光度。该数据证明，泰派鲁单抗原料药主要由二硫键连接的重链和轻链单体组成，包含低于4.5％的分布的低水平种类的(表8)。
表8.通过nrCE-SDS的泰派鲁单抗原料药的峰面积百分比
将静态光散射(SLS)检测添加至SE-HPLC方法中，允许确定色谱图中各峰的摩尔质量。通过洗脱种类散射的光强度与种类的浓度和分子量均成比例。UV吸光度(280nm)的强度与蛋白质浓度成比例。通过仪器制造商的软件，利用每个峰的光散射强度和浓度，可以确定每种洗脱物质的摩尔质量。通过与在线多角度光散射检测偶联的SE-HPLC色谱，使用具有TSK-GEL G3000SWxl，5μm粒度，7.8mm ID x 300mm长度柱的Agilent 1100HPLC系统，分析泰派鲁单抗原料药。使用的检测器是Wyatt Heleos II检测器、Wyatt Optilab TrEX RI检测器、以及Agilent UV检测器，其中波长设定在280nm处。SE-HPLC运行在室温下进行，其中将100mM磷酸钠、250mM氯化钠(pH 6.8±0.1)的缓冲液用作流动相，且流速为0.5mL/min。
由泰派鲁单抗原料药生成的SLS数据计算的UV曲线和相应的摩尔质量表明，主峰的摩尔质量为145kDa，与泰派鲁单抗单体的理论质量(147kDa)非常一致。单体前洗脱峰摩尔质量平均为284kDa，与泰派鲁单抗二聚体的理论质量(294kDa)非常一致，表明大多数HMW种类是泰派鲁单抗二聚体(表9)。
表9.通过SE-HPLC-SLS确定泰派鲁单抗原料药的主峰和大多数HMW峰的分子量
通过受体-配体结合测定和基于细胞的报告基因生物测定，评估了富集的HMW级分(富集泰派鲁单抗二聚体)和主峰(主要含有单体)的功效。这些结果显示出，如通过受体-配体结合测定和基于细胞的报告基因生物测定确定的功效降低，泰派鲁单抗活性分别降低了64％和62％(表10)。
表10.SE-UHPLC级分的功效确定
这是预期的结果，因为自缔合施加了空间限制，并且可能导致构象变化，进而可能影响结合。在高温、低pH、生理pH、可视光和UV光暴露下，聚集体形成的速率会增加。生物学表征确定HMW种类显示出功效降低。只有当它们的富集水平显著超过正常加工和储存条件下的可检测到的量时，才能检测到体外功效的降低。
二硫化物同种型：泰派鲁单抗是IgG2亚类的抗体，并且因此预计显示二硫键介导的结构衍生物和同种型(Wypych等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16194-16205,2008；Dillon等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16206-16215,2008)。二硫化物结构异质性是重组的和天然存在的IgG2分子固有的，这些分子含有18个二硫键-6个链间和12个链内(Wang等人,2007；Zhang和Czupryn,2002)。根据非还原肽中存在的键联的数量，使用不同的方法阐述了在泰派鲁单抗中检测到的二硫键的连接性。对于含有单个二硫键的肽，使用还原性和非还原性胰蛋白酶肽图的比较来指定二硫化物的连接性。
与典型IgG2-A结构不同，IgG2-B同种型含有连接两个拷贝的Fab肽(CH1-CL-铰链)与两个拷贝的铰链肽的对称键。IgG2-A/B呈中间体形式表现，掺入了IgG2-A和IgG2-B的部分特征，通过涉及一个Fab臂由二硫键与铰链肽的两个拷贝共价连接的不对称排列来定义(Wypych等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16194-16205,2008；Dillon等人,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第283卷(23):16206-16215,2008；Zhang等人,Anal Chem.[分析化学],第82卷(3):1090-1099,2010)。
在非还原和还原条件下使用内切蛋白酶胰蛋白酶通过肽作图在未分级的原料药中鉴定二硫键连接的肽。除了UV检测外，将RP-HPLC分离的出口与电喷雾电离质谱(ESI-MS)偶联用于质量分析。随后用还原剂[三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)]处理非还原消化物，并使用相同的条件进行重新分析。在还原条件下，通过质谱分析了来自泰派鲁单抗原料药的非还原性胰蛋白酶肽图中的每种二硫键连接的肽的组成肽。综上所述，指定为A至H的二硫键连接的肽的表征阐述了表11中总结的特定Cys残基之间的键联，这些键联证实了典型二硫键结构IgG2-A的存在。
表11.证实肽A至H的IgG2-A连接性
非还原性胰蛋白酶肽图也显示出IgG2-B衍生物的存在。通过非还原性RP-HPLC对IgG2-B二硫化物衍生物进行进一步确认。综上所述，二硫键连接的肽A至D、肽F至G以及肽I的表征阐述了表中总结的特定Cys残基之间的键联，这些键联证实了二硫化物同种型结构IgG2-B的存在。
表12.证实肽A至D、F至G以及I的IgG2-B连接性
还在泰派鲁单抗的非还原性胰蛋白酶肽图中发现了结构同种型IgG2-A/B的存在。通过非还原性RP-HPLC对IgG2-A/B二硫化物同种型衍生物进行进一步确认。综上所述，二硫键连接的肽A至G和肽J的表征阐述了表中总结的特定Cys残基之间的键联，这些键联证实了二硫化物同种型结构IgG2-A/B的存在。
表13.证实肽A至G和J的IgG2-A/B连接性
还原性和非还原性胰蛋白酶肽作图的比较揭示了，预期的主要的IgG2-A结构的二硫键连接的肽的存在，以及具有与另外的IgG2-A/B和IgG2-B二硫键结构同种型相关的连接性的肽。基于RP-HPLC，泰派鲁单抗中的二硫化物同种型的相对水平范围在约3.4％-4.2％的IgG2-B、39.2％-42％的IgG2-A/B，以及54.2％-57.1％的IgG2-A。基于人临床试验中施用时的剂量和估计的属性水平，估计了临床试验患者的属性暴露水平。基于210mg Q28D的剂量计算的多达15％的二硫化物同种型衍生物IgG2-B，以及基于210mg Q28D的剂量计算的多达75％的二硫化物同种型衍生物IgG2-A/B均与任何体内安全性问题无关。通过使用CEX-UHPLC富集原料药、IgG2-A、IgG2-A/B以及IgG2-B中的同种型，评估二硫化物同种型的功效。这些结果证明，在测定能力范围内，所有同种型均显示出全部功效。
实例3-属性和功效的杠杆分析
利用最小二乘方回归模型进行统计分析，以评估HMW种类、位于D49D50处的CDRisoAsp以及总CDR氧化之间的关系。该分析基于如实例1中所述的强降解分析确定的这些属性。
使用本文所述的基于细胞的报告基因生物测定(图1A-C)进行的功效测量，和使用本文所述的受体-配体结合测定(图1D-F)功效测量，进行分析。对于两种功效测定，属性之间鉴定出的关系相当。鉴定出HMW种类和总CDR trp氧化之间的统计上显著的负相关(图1B-C和1E-F)。CDR IsoAsp D49D50和功效之间的关系未达到统计显著性。
实例4-高甘露糖种类和药代动力学(PK)建模
使用建模方法以评估高甘露糖(HM)的增加％对泰派鲁单抗的清除率的潜在的影响。该模型假定半衰期为24.5天(临床研究中泰派鲁单抗IV给药的PK曲线)，并且基于单次IV给药后参考IgG2单克隆抗体的HM％降低率，第1天泰派鲁单抗的HM形式的增加的速率常数为0.035。参考IgG2单克隆抗体HM形式的增加的速率常数具有迄今为止所分析出的最高值，并且被选择作为泰派鲁单抗HM半衰期的保守估计值。PK曲线的建模时间多达122.5天(相当于5个半衰期)，并且没有使用优先配对校正。如下表14中所示，模拟了HM水平与评估的泰派鲁单抗清除率增加之间的关系。
表14：高甘露糖水平和对清除率的估计影响
HM水平 清除率增加的估计量
5％ N/A
8％ 1.7％
11％ 3.3％
13％ 4.4％
15％ 5.5％
18％ 7.2％
21％ 9.4％
23.1％ 10.0％
这些结果表明，具有5％或更少的HM种类的泰派鲁单抗组合物显示出清除率几乎没有增加，并且在泰派鲁单抗组合物中约23％的HM种类导致抗体清除率增加约10％。
本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体特此并入。应理解，所披露的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制所附权利要求的范围。
本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明这些特定实施例的许多等效形式。此类等效物旨在被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> 美国安进公司（Amgen Inc.）
<120> 抗TSLP抗体组合物及其用途
<130> 32053/56674/PC
<150> US 63/178,938
<151> 2021-04-23
<160> 14
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 743
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> TSLP
<220>
<221> CDS
<222> (200)..(676)
<400> 1
gcagccagaa agctctggag catcagggag actccaactt aaggcaacag catgggtgaa 60
taagggcttc ctgtggactg gcaatgagag gcaaaacctg gtgcttgagc actggcccct 120
aaggcaggcc ttacagatct cttacactcg tggtgggaag agtttagtgt gaaactgggg 180
tggaattggg tgtccacgt atg ttc cct ttt gcc tta cta tat gtt ctg tca 232
Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser
1 5 10
gtt tct ttc agg aaa atc ttc atc tta caa ctt gta ggg ctg gtg tta 280
Val Ser Phe Arg Lys Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu
15 20 25
act tac gac ttc act aac tgt gac ttt gag aag att aaa gca gcc tat 328
Thr Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr
30 35 40
ctc agt act att tct aaa gac ctg att aca tat atg agt ggg acc aaa 376
Leu Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys
45 50 55
agt acc gag ttc aac aac acc gtc tct tgt agc aat cgg cca cat tgc 424
Ser Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys
60 65 70 75
ctt act gaa atc cag agc cta acc ttc aat ccc acc gcc ggc tgc gcg 472
Leu Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala
80 85 90
tcg ctc gcc aaa gaa atg ttc gcc atg aaa act aag gct gcc tta gct 520
Ser Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala
95 100 105
atc tgg tgc cca ggc tat tcg gaa act cag ata aat gct act cag gca 568
Ile Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala
110 115 120
atg aag aag agg aga aaa agg aaa gtc aca acc aat aaa tgt ctg gaa 616
Met Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu
125 130 135
caa gtg tca caa tta caa gga ttg tgg cgt cgc ttc aat cga cct tta 664
Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu
140 145 150 155
ctg aaa caa cag taaaccatct ttattatggt catatttcac agcccaaaat 716
Leu Lys Gln Gln
aaatcatctt tattaagtaa aaaaaaa 743
<210> 2
<211> 159
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr
20 25 30
Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser
35 40 45
Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn
50 55 60
Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln
65 70 75 80
Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu
85 90 95
Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly
100 105 110
Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg
115 120 125
Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu
130 135 140
Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln
145 150 155
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> LCDR1
<400> 3
Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> LCDR2
<400> 4
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> LCDR3
<400> 5
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HCDR1
<400> 6
Thr Tyr Gly Met His
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HCDR2
<400> 7
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HCDR3
<400> 8
Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 重链VH
<400> 9
cagatgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaga acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaacactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc accagagaca attccaagaa cactctgaat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcccct 300
cagtgggagc tagttcatga agcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360
tcttca 366
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 重链VH
<400> 10
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 325
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 轻链VL
<400> 11
tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacaacct tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcatggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggg cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcatgt ggtatttcgg 300
cggagggacc aagctgaccg tccta 325
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 轻链VL
<400> 12
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 13
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys
210 215 220
Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210

Claims (89)

1.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物，并且其中该组合物中的该异构化衍生物的量小于约30％，其中泰派鲁单抗包含
A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物中的该异构化衍生物的量为约0.5％至约13％。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中该异构化衍生物包含在重链或轻链互补决定区(CDR)中的修饰。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中该异构化衍生物包含位于任一或两个可变区链中的SEQ ID NO:7的重链CDR D54，和/或SEQ ID NO:4的轻链CDR D49、D50或D52的变化。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中该异构化衍生物包含位于SEQ ID NO:7的D54处的小于约5％的量的异构化。
6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中该异构化衍生物包含位于SEQ ID NO:4的D49、D50或D52的一个或多个处的小于约13％的量的异构化。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中该异构化衍生物为异天冬氨酸(isoAsp)或环状天冬氨酸(cAsp)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中该组合物中的该异构化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于30％的该异构化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
10.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含脱酰胺化衍生物，并且其中该组合物中的该脱酰胺化衍生物的量小于约15％，其中泰派鲁单抗包含
A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的组合物，其中该组合物中的该脱酰胺化衍生物的量为约0.5％-10％。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其中该脱酰胺化衍生物包含脱酰胺化的天冬酰胺：SEQ ID NO:3的N25/N26、SEQ ID NO:13的N316、和/或SEQ ID NO:13的N385/390。
13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中该脱酰胺化衍生物包含位于SEQID NO:3的N25/N26处的小于约3％的量的脱酰胺化。
14.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中该脱酰胺化衍生物包含位于SEQID NO:13的N316、和/或N385/390的一个或多个处的小于约13％的量的脱酰胺化。
15.如权利要求10至14中任一项所述的组合物，其中该组合物中的该脱酰胺化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。
16.如权利要求10至15中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的该脱酰胺化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
17.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含氧化衍生物，并且其中该组合物中的该氧化衍生物的量小于约7％，其中泰派鲁单抗包含
A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的组合物，其中该组合物中的该氧化衍生物的量为约0.4％至约7％。
19.如权利要求17或18所述的组合物，其中该氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的重链甲硫氨酸：SEQ ID NO:6的M34、SEQ ID NO:13的M253、M359，或重链色氨酸：SEQ IDNO:7的W52、SEQ ID NO:5的W90或SEQ ID NO:8的W102的一个或多个处的氧化。
20.如权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中该氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的重链甲硫氨酸：SEQ ID NO:6的M34、SEQ ID NO:13的M253、M359的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约7％。
21.如权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中该氧化衍生物包含位于任一或两个重链中的色氨酸：SEQ ID NO:7的W52、SEQ ID NO:5的W90或SEQ ID NO:8的W102的一个或多个处的氧化，任选地其中该氧化的量小于约3％。
22.如权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中该组合物中的该氧化衍生物的量通过还原性肽作图来确定。
23.如权利要求17至22中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于7％的该氧化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
24.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物为高分子量(HMW)种类，并且其中该组合物中的该HMW种类的量小于约20％，其中泰派鲁单抗包含
A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的组合物，其中该组合物中的该HMW种类的量为约1.7％或更少。
26.如权利要求24或25所述的组合物，其中该组合物中的该HMW种类的量为约1.4％或更少。
27.如权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中该HMW种类包含泰派鲁单抗的二聚体。
28.如权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中该组合物中的该HMW种类的量通过尺寸排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)来确定。
29.如权利要求28所述的组合物，其中该SE-HPLC为SE-Ultra HPLC，其中使用流动相等度分离蛋白质，该流动相包含100mM磷酸钠、250mM氯化钠，pH 6.8。
30.如权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于20％的该HWM种类的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
31.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含泰派鲁单抗片段，并且其中该组合物中的该泰派鲁单抗片段的量小于约15％，其中泰派鲁单抗包含
(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
32.如权利要求31所述的组合物，其中这些泰派鲁单抗片段为低分子量(LMW)或中等分子量(MMW)种类或其组合。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其中这些片段为小于约25kD的低分子量种类。
34.如权利要求31或32所述的组合物，其中这些片段为具有约25至50kD的分子量的中等分子量种类。
35.如权利要求31至34中任一项所述的组合物，其中该组合物中的泰派鲁单抗片段的量通过还原性十二烷基硫酸钠毛细管电泳(rCE-SDS)来确定。
36.如权利要求31至35中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于15％的这些泰派鲁单抗片段的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合。
37.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中该一种或多种泰派鲁单抗衍生物包含糖基化衍生物，并且其中该组合物中的该糖基化衍生物的量小于约40％，其中泰派鲁单抗包含
(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
38.如权利要求37所述的组合物，其中该组合物中的糖基化衍生物的量小于约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％。
39.如权利要求37或38所述的组合物，其中该糖基化衍生物包含在一个或两个重链上的SEQ ID NO:13的残基N298上的泰派鲁单抗糖基化的改变。
40.如权利要求37至39中任一项所述的组合物，其中该糖基化衍生物包含泰派鲁单抗对高甘露糖部分或半乳糖基部分的非岩藻糖基化或糖基化的改变。
41.如权利要求37至40中任一项所述的组合物，其中该糖基化衍生物包含小于约5％的量的非岩藻糖基化衍生物。
42.如权利要求37至40中任一项所述的组合物，其中该糖基化衍生物包含小于约30％的量的半乳糖基部分。
43.如权利要求37至40中任一项所述的组合物，其中该糖基化衍生物包含小于约5％的量的高甘露糖部分。
44.如权利要求37至40或43中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过约25％、约23％、约21％、约19％、约17％、约15％、约13％、约11％、约8％或约5％的高甘露糖糖基化衍生物。
45.如权利要求37至40、43或43A中任一项所述的组合物，其中该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与具有大于25％的高甘露糖糖基化衍生物的组合物相比具有更低的清除率和/或更长的半衰期。
46.如权利要求37至45中任一项所述的组合物，其中该组合物中的该糖基化衍生物的量通过聚糖作图法来确定。
47.如权利要求37至46中任一项所述的组合物，其中
(a)该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的该糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合；或
(b)该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过15％的高甘露糖，并且与具有大于15％的高甘露糖的组合物相比具有更低的清除率。
48.如权利要求37至46中任一项所述的组合物，其中
(a)该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物与包含大于40％的该糖基化衍生物的组合物相比具有更高的功效和/或耐受性，其中所述功效包括抑制固定在供体珠粒上的生物素化的TSLPR与固定在受体珠粒上的TSLP-His的结合的能力，或抑制在编码Stat荧光素酶报告基因的Stat/BaF/HTR细胞表面上表达的TSLPR的结合的能力，该Stat荧光素酶报告基因的表达指示TSLP与TSLPR的结合；或
(b)该泰派鲁单抗和泰派鲁单抗衍生物包含不超过25％的高甘露糖，并且与具有大于25％的高甘露糖的组合物相比具有更低的清除率。
49.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种其二硫化物同种型衍生物，其中该一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-B同种型和或IgG2-A/B同种型，并且其中该组合物中的该二硫化物同种型衍生物的量小于约75％。
50.如权利要求49所述的组合物，其中该一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-B同种型，并且其中该组合物中的该二硫化物衍生物的量小于约20％。
51.如权利要求50所述的组合物，其中该IgG2-B同种型的量小于约5％。
52.如权利要求49所述的组合物，其中该一种或多种二硫化物同种型衍生物包含IgG2-A/B同种型。
53.如权利要求52所述的组合物，其中该组合物中的该IgG2-A/B同种型的量小于约75％。
54.如权利要求52所述的组合物，其中该组合物中的该IgG2-A/B同种型的量为约38％至约43％。
55.如权利要求48至54中任一项所述的组合物，其中该组合物中的二硫化物同种型衍生物的量通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)来确定。
56.一种组合物，该组合物包含泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物，其中这些泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化衍生物、HMW种类、片段、二硫化物同种型衍生物或其组合，其中该组合物具有以下特征的一种或多种：
(a)该组合物中的异构化衍生物的量为约30％或更少，如通过还原性肽作图测量的；
(b)该组合物中的脱酰胺化衍生物的量为约15％或更少，如通过肽作图测量的；
(c)该组合物中的氧化衍生物的量为约7％或更少，如通过还原性肽作图测量的；
(d)该组合物中的糖基化衍生物的量为约40％或更少，如通过聚糖作图测量的；
(e)该组合物中的二硫化物同种型衍生物的量为约75％或更少，如通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量的；
(f)该组合物中的HMW种类的量为约20％或更少，如通过SE-HPLC测量的；和/或
(g)该组合物中的片段的量为约15％或更少，如通过rCE-SDS测量的。
57.如权利要求49至56中任一项所述的组合物，其中泰派鲁单抗包含
(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:3中列出的轻链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:4中列出的轻链CDR2氨基酸序列；以及
(iii)SEQ ID NO:5中列出的轻链CDR3氨基酸序列；以及
(B)重链可变结构域，该重链可变结构域包含：
(i)SEQ ID NO:6中列出的重链CDR1氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:7中列出的重链CDR2氨基酸序列，以及
(iii)SEQ ID NO:8中列出的重链CDR3氨基酸序列。
58.如权利要求1至57中任一项所述的组合物，其中泰派鲁单抗包含SEQ ID NO:10中列出的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:12中列出的轻链氨基酸序列。
59.一种药物配制品，该药物配制品包含如权利要求1至58中任一项所述的组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
60.一种用于治疗受试者的炎性疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1至58中任一项所述的组合物或如权利要求59所述的药物配制品。
61.如权利要求60所述的方法，其中该炎性疾病选自由以下组成的组：哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎和特发性肺纤维化(IPF)。
62.如权利要求60或61所述的方法，该方法包括以每2周或每4周的间隔施用该组合物。
63.如权利要求60至62中任一项所述的方法，其中将该组合物施用至少4个月、6个月、9个月、1年或更长时间的时期。
64.如权利要求60至63中任一项所述的方法，其中该哮喘是重度哮喘。
65.如权利要求60至64中任一项所述的方法，其中该哮喘是嗜酸细胞性哮喘或非嗜酸细胞性哮喘。
66.如权利要求60-65中任一项所述的方法，其中该施用经由预填充注射器或自动注射器进行。
67.如权利要求66所述的方法，其中该自动注射器为Ypsomed装置。
68.如权利要求1至58中任一项所述的泰派鲁单抗组合物或如权利要求59所述的药物组合物，用于在治疗受试者的炎性疾病中使用。
69.如权利要求68所述的组合物，其中该炎性疾病选自由以下组成的组：哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎和特发性肺纤维化(IPF)。
70.如权利要求1至58中任一项所述的泰派鲁单抗组合物或如权利要求59所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的炎性疾病的药物中的用途。
71.如权利要求68至70中任一项所述的组合物或用途，其中该施用经由预填充注射器或自动注射器进行。
72.如权利要求71所述的组合物或用途，其中该自动注射器为Ypsomed装置。
73.如权利要求68至72中任一项所述的组合物或用途，其中该炎性疾病选自由以下组成的组：哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、鼻息肉、慢性自发性荨麻疹、Ig驱动的疾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、嗜酸细胞性胃炎、无鼻息肉的慢性鼻窦炎和特发性肺纤维化(IPF)。
74.一种用于评估泰派鲁单抗组合物的质量的方法，该方法包括：
获得含有泰派鲁单抗和一种或多种泰派鲁单抗衍生物的泰派鲁单抗组合物；
测量该组合物中的一种或多种泰派鲁单抗衍生物的量，其中这些泰派鲁单抗衍生物包含异构化衍生物、脱酰胺化衍生物、氧化衍生物、糖基化衍生物、二硫化物同种型衍生物、HMW种类、片段或其组合；
将该一种或多种泰派鲁单抗衍生物的测量的量与预先确定的参考标准进行比较；并且
如果该比较表明满足该预先确定的参考标准，则制备该泰派鲁单抗组合物的药物配制品或药物产品。
75.如权利要求74所述的方法，其中测量异构化衍生物的量，并且该预先确定的参考标准为约30％或更少。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的异构化的量通过还原性肽作图测量。
77.如权利要求74所述的方法，其中测量脱酰胺化衍生物的量，并且该预先确定的参考标准为约15％或更少。
78.如权利要求74或77所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的脱酰胺化的量通过还原性肽作图测量。
79.如权利要求74所述的方法，其中测量氧化衍生物的量，并且该预先确定的参考标准为约7％或更少。
80.如权利要求74或79所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的氧化的量通过还原性肽作图测量。
81.如权利要求74所述的方法，其中测量糖基化衍生物的量，并且该预先确定的参考标准为约40％或更少。
82.如权利要求74或81所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的糖基化的量通过聚糖作图测量。
83.如权利要求74所述的方法，其中测量二硫化物同种型衍生物的量，并且该预先确定的参考标准为约75％或更少。
84.如权利要求74或83所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的二硫化物同种型的量通过非还原性反相高效液相色谱(RP-HPLC)测量。
85.如权利要求74所述的方法，其中测量HMW种类的量，并且该预先确定的参考标准为约20％或更少。
86.如权利要求74或85所述的方法，其中HMW种类的量通过SE-HPLC测量。
87.如权利要求74所述的方法，其中测量片段的量，并且该预先确定的参考标准为约15％或更少。
88.如权利要求74或87所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物中的片段的量通过rCE-SDS测量。
89.如权利要求74至88中任一项所述的方法，其中该泰派鲁单抗组合物获得自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，该细胞系表达编码SEQ ID NO:10的重链的核酸和编码SEQ ID NO:12的轻链的核酸。
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