ES2978396T3

ES2978396T3 - Sistemas y métodos para la preparación en tiempo real de una muestra de polipéptidos para el análisis por espectrometría de masas

Info

Publication number: ES2978396T3
Application number: ES18759204T
Authority: ES
Inventors: Chao-Hsiang Wu
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2024-09-11
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: JP7237022B2; EA202090399A1; JP2020530103A; ZA202001218B; US12104995B2; AU2018309027B2; CL2020000248A1; MA49757A; WO2019028187A1; SG11202000727SA; IL271499B1; US20240402058A1; KR20200035093A; CN110869768A; EP3662287A1; KR102560646B1; BR112020001885A2; US20200355582A1; EP3662287B1; IL271499B2

Abstract

Sistemas y métodos que facilitan la realización de un análisis de una muestra prácticamente en tiempo real. De este modo, el análisis puede realizarse y obtenerse el resultado deseado mucho más rápidamente que lo que permiten los sistemas y métodos convencionales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas y métodos para la preparación en tiempo real de una muestra de polipéptidos para el análisis por espectrometría de masas

CAMPO DE LA DESCRIPCIÓN

La presente descripción se refiere generalmente a ensayos y, más específicamente, a realizar un ensayo en tiempo real de una muestra.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud se presenta con una lista de secuencias en formato electrónico. La lista de secuencias se proporciona como un archivo titulado "51800_Seqlisting.txt", creado el 31 de julio de 2018 y con un tamaño de 263,964 bytes.

ANTECEDENTES

Los ensayos se realizan comúnmente para cuantificar uno o más atributos de un analito, tal como un fármaco, una sustancia bioquímica o una célula. Un ejemplo de tal ensayo es el ensayo del método de atributos múltiples (MAM), que puede detectar y cuantificar los atributos de calidad críticos (CQA), identificados por el perfil de producto diana de calidad (QTPP), de una muestra (Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. Rogers RS, Nightlinger NS, Livingston B, Campbell P, Bailey R, Balland A.MAbs.2015; 7(5): 881-90). El ensayo MAM es un procedimiento operado manualmente que se realiza, por ejemplo, en un laboratorio de pruebas de liberación de moléculas grandes (LMRT). MAM es un método de cartografiado de péptidos basado en cromatografía de líquidos (LC) - espectrometría de masas (MS), que comprende tres etapas: (1) preparación de la muestra (tal como desnaturalización, reducción, alquilación y digestión de polipéptidos; (2) separación de los polipéptidos digeridos por LC y detección por MS; y (3) análisis de los datos para CQA específicos y detección de nueva señal (es decir, picos) en comparación con un estándar de referencia. Hsieh Y L F et Al, Analytical Chemistry, American Chemical Society, vol. 68, no 3, páginas 455-462, describe un sistema analítico automatizado para el examen de la estructura primaria de la proteína.

Los CQA son propiedades químicas, físicas o biológicas que están presentes dentro de un valor específico o valores de rango. Por ejemplo, para las moléculas terapéuticas de polipéptidos grandes, los atributos físicos y las modificaciones de los aminoácidos (los componentes básicos de los polipéptidos) son CQA importantes que se monitorizan durante y después de la fabricación, así como durante el desarrollo de fármacos. A diferencia de los ensayos analíticos convencionales que rastrean los cambios en el tamaño máximo y la forma de los picos de polipéptidos completos o parciales, MAM detecta CQA específicos a nivel de aminoácidos.

Sin embargo, aunque MAM es un avance importante en la evaluación de CQA de moléculas terapéuticas de polipéptidos durante el desarrollo, fabricación y almacenamiento (evaluando, por ejemplo, estabilidad), el análisis puede consumir de siete a diez días, desde la preparación de la muestra hasta el análisis final, tiempo que aumenta los costes y retrasa el desarrollo y la liberación de fármacos. Por ejemplo, los productos terapéuticos polipeptídicos se produce habitualmente por células cultivadas que expresan el polipéptido diana. Dichos sistemas de producción no se "suspenden" fácilmente mientras el análisis MAM de CQA está pendiente, lo que da como resultado que las células produzcan el polipéptido diana con CQA que no cumplen las especificaciones: una pérdida de tiempo, materiales y mano de obra. Además, se acumulan retrasos de siete a diez días durante el desarrollo del fármaco, por ejemplo cuando se optimizan las condiciones de cultivo, impidiendo la administración de nuevos e importantes fármacos polipeptídicos a los pacientes. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos eficientes y más rápidos para facilitar el análisis de CQA utilizando MAM.

SUMARIO

La invención se define en las reivindicaciones. Un aspecto de la presente descripción proporciona un método para realizar un ensayo en tiempo real. El método incluye las etapas de: (a) mover una muestra de un producto que contiene polipéptidos a una columna de unión a polipéptidos a través de una primera bobina de retención; (b) unir los polipéptidos en la muestra a la columna de unión a polipéptidos, separando así los polipéptidos en la muestra del resto de la muestra; (c) mover una disolución de amortiguador de elución de una fuente de amortiguador a la columna de unión a polipéptidos, a través de la primera bobina de retención, y a través de una segunda bobina de retención aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, eluyendo así los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos y moviendo una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la segunda bobina de retención; (d) mover la mezcla de elución/polipéptido de la segunda bobina de retención a una cámara de reacción; (e) incubar los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido en la cámara de reacción, dando como resultado polipéptidos desnaturalizados; (f) mover un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a la cámara de reacción a través de la primera bobina de retención después de (e); (g) incubar los polipéptidos desnaturalizados con el reactivo reductor en la cámara de reacción, dando como resultado polipéptidos desnaturalizados y reducidos; (h) mover un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a la cámara de reacción después de (g); (i) incubar los polipéptidos desnaturalizados y reducidos con el reactivo alquilante en la cámara de reacción, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos; (j) mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a una columna desaladora a través de la primera bobina de retención, estando la columna desaladora equilibrada con un amortiguador de proteólisis; (k) aplicar los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados a la columna desaladora, separando así los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de los reactivos reductores y alquilantes, y dando como resultado polipéptidos desalados; (l) mover los polipéptidos desalados a una columna de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora; (m) digerir los polipéptidos desalados en la tercera columna de polipéptidos, dando como resultado polipéptidos digeridos; y (n) mover los polipéptidos digeridos a un dispositivo analítico para el análisis de los polipéptidos digeridos.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para realizar un ensayo en tiempo real usando un sistema cerrado que incluye una válvula de múltiples puertos, una primera bobina de retención aguas arriba de la válvula de múltiples puertos, una columna de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos, una segunda bobina de retención acoplada de forma fluida a y aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, una cámara de reacción acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un segundo y tercer puertos de la válvula de múltiples puertos, una columna desaladora acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y una columna de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora. El método incluye: (a) mover, a través de un controlador acoplado comunicativamente al sistema cerrado, una muestra de un producto que contiene polipéptidos a la primera bobina de retención; (b) posicionar, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos en una primera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna de unión a polipéptidos a través del primer puerto de la válvula de múltiples puertos, de tal forma que la muestra fluye a la primera columna, por lo que los polipéptidos en la muestra se unen a la columna de unión a polipéptidos; (c) cuando la válvula de múltiples puertos está en la primera posición, mover, a través del controlador, una disolución de amortiguador de elución de una fuente de disolución de amortiguador de elución a la segunda bobina de retención a través de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos; (d) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una segunda posición en la que la segunda bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del segundo puerto de la válvula de múltiples puertos; (e) cuando la válvula de múltiples puertos está en la segunda posición, mover, a través del controlador, una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la cámara de reacción, por lo que los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido se desnaturalizan; (f) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una tercera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos; (g) después de (f), mover, a través del controlador, un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a la primera bobina de retención, y mover, a través del controlador, el reactivo reductor desde la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, reduciendo así los polipéptidos desnaturalizados; (h) después de (g), mover, a través del controlador, un reactivo alquilante que alquila grupos sulfhidrilo a la primera bobina de retención, y mover, a través del controlador, el reactivo alquilante desde la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos; (i) mover, a través del controlador, los polipéptidos alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a la primera bobina de retención a través del tercer puerto; (j) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una cuarta posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna desaladora a través del cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y, cuando la válvula de múltiples puertos está en la cuarta posición, mover los polipéptidos alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante desde la primera bobina de retención a la columna desaladora, por lo que los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se aplican a la columna desaladora, separando así los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de los reactivos reductores y alquilantes, dando como resultado polipéptidos desalados; (k) mover, a través del controlador, los polipéptidos desalados a la columna de enzima proteolítica, por lo que los polipéptidos desalados se digieren; y (l) pasar, a través del controlador, los polipéptidos digeridos a un dispositivo analítico, por lo que los polipéptidos digeridos se analizan.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un sistema cerrado para realizar un ensayo en línea en tiempo real. El sistema incluye: una primera bobina de retención dispuesta de manera fluida para recibir una muestra de un producto que contiene polipéptidos; una válvula de múltiples puertos acoplada de forma fluida a y situada aguas abajo de la primera bobina de retención; una columna de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para recibir la muestra de la primera bobina de retención a través de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos, estando la columna de unión a polipéptidos configurada para unir los polipéptidos de la muestra; una fuente de amortiguador acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para suministrar una disolución de amortiguador de elución a una segunda bobina de retención situada aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución está adaptada para eluir sustancialmente todos los polipéptidos de la columna de unión a polipéptidos; una cámara de reacción acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, la cámara de reacción adaptada para recibir una mezcla de la columna de unión a polipéptidos a través de un segundo puerto de la válvula de múltiples puertos, comprendiendo la mezcla la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos, en el que los polipéptidos de la mezcla se desnaturalizan en la cámara de reacción, en el que la cámara de reacción se dispone para recibir un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a través de la primera bobina de retención y un tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, el reactivo reductor reduce los polipéptidos desnaturalizados, y en el que la cámara de reacción se dispone adicionalmente para recibir un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a través de la primera bobina de retención y el tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, en el que el reactivo alquilante alquila los polipéptidos desnaturalizados y reducidos en la cámara de reacción; una columna desaladora acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para recibir los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción, estando la columna desaladora configurada para separar los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante; y una columna de enzima proteolítica acoplada de forma fluida a y dispuesta aguas abajo de la segunda columna de polipéptidos para obtener los polipéptidos separados de la columna desaladora, estando la columna de enzima proteolítica configurada para digerir los polipéptidos desalados.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un sistema cerrado para realizar un ensayo en tiempo real. El sistema incluye: una válvula de múltiples puertos; una primera bobina de retención aguas arriba de la válvula de múltiples puertos; una columna de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos; una segunda bobina de retención acoplada de forma fluida a y aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos; una cámara de reacción acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un segundo y tercer puertos de la válvula de múltiples puertos; una columna desaladora acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos; una columna de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora; y un controlador acoplado comunicativamente a la válvula de múltiples puertos. El controlador incluye una memoria, un procesador, y una lógica almacenada en la memoria y ejecutable por el procesador para: (a) mover una muestra de un producto que contiene polipéptidos a la primera bobina de retención; (b) posicionar la válvula de múltiples puertos en una primera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna de unión a polipéptidos a través del primer puerto de la válvula de múltiples puertos, de tal forma que la muestra fluye a la primera columna, por lo que los polipéptidos en la muestra se unen a la columna de unión a polipéptidos; (c) cuando la válvula de múltiples puertos está en la primera posición, mover una disolución de amortiguador de elución de una fuente de disolución de amortiguador de elución a la segunda bobina de retención a través de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos; (d) mover la válvula de múltiples puertos a una segunda posición en la que la segunda bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del segundo puerto de la válvula de múltiples puertos; (e) cuando la válvula de múltiples puertos está en la segunda posición, mover una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la cámara de reacción, por lo que los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido se desnaturalizan; (f) mover la válvula de múltiples puertos a una tercera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos; (g) después de (f), mover un reactivo reductor que escinde enlaces de disulfuro a la primera bobina de retención, y mover el reactivo reductor desde la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, reduciendo así los polipéptidos desnaturalizados; (h) después de (g), mover un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a la primera bobina de retención, y mover el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos; (i) mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a la primera bobina de retención a través del tercer puerto; (j) mover la válvula de múltiples puertos a una cuarta posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna desaladora a través del cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y, cuando la válvula de múltiples puertos está en la cuarta posición, mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la columna desaladora, por lo que los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se desalan; (k) mover los polipéptidos desalados a la columna de enzima proteolítica, por lo que los polipéptidos desalados se digieren; y (l) pasar los polipéptidos digeridos a un dispositivo de análisis de glicano, por lo que los polipéptidos digeridos se separan y se cuantifican.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un diagrama esquemático de un sistema para realizar un ensayo en línea en tiempo real ensamblado de acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático de un controlador del sistema ilustrado en la FIG. 1.

Las FIGS. 3A y 3B son gráficos que representan los resultados de un estudio que monitoriza la eficacia del sistema de la FIG. 1 en un ciclo de producción de 40 días.

La FIG. 3C es un gráfico que representa una instantánea de los resultados de la FIG. 3B durante un periodo de tiempo de 8 días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La presente descripción proporciona ensayos y métodos en tiempo real que permiten la monitorización y el control de los CQA en tiempo real, de manera que se pueda producir el producto terapéutico de polipéptido final deseado. Los ensayos y métodos descritos pueden facilitar el tiempo de respuesta de los resultados de MAM de tal forma que los resultados estén disponibles en unas pocas horas (por ejemplo, dos a tres horas) en lugar de un resultado de medida fuera de línea típico, operado manualmente, de siete a diez días. Por lo tanto, los ensayos y métodos descritos mejoran el tiempo de respuesta en aproximadamente 54 veces a 120 veces. Dichos resultados "sobre la marcha" (en tiempo real) permiten, por ejemplo, ajustar las variables de producción para fabricar productos (en línea) de manera eficiente que tengan CQA apropiados.

La FIG. 1 ilustra un diagrama esquemático de un sistema 100 ensamblado de acuerdo con las enseñanzas de la presente descripción. El sistema 100, que puede ubicarse en un laboratorio (por ejemplo, un laboratorio de pruebas de liberación de moléculas grandes), es un sistema cerrado para realizar de forma automática o sustancial un ensayo de una muestra de un producto que contiene polipéptidos, como se describe con mayor detalle a continuación. Al automatizar (o automatizar sustancialmente) este procedimeinto utilizando el sistema 100, el ensayo se puede realizar en tiempo real (o sustancialmente en tiempo real, de tal forma que se pueda realizar todo el proceso y se obtenga el resultado deseado, en cuestión de horas (por ejemplo, de 2 a 3 horas), una mejora significativa durante los 7 a 10 días típicamente requeridos por los ensayos MAM operados manualmente, convencionalmente conocidos. Además, la naturaleza cerrada del procedimiento que utiliza el sistema 100 mantiene las condiciones estériles.

En esta versión, los polipéptidos pueden ser polipéptidos terapéuticos, que se analizan adicionalmente más adelante.

El sistema 100 ilustrado en la FIG. 1 generalmente incluye una válvula de múltiples puertos 104, una primera bobina de retención 108, una primera columna 112, una segunda bobina de retención 116, una cámara de reacción 120, una segunda columna 124, una tercera columna 128, y un controlador 132. En la versión ilustrado en la FIG. 1, el sistema 100 también incluye un recipiente 136, una bomba 140, una primera cámara de desechos 144, una segunda cámara de desechos 148, una tercera cámara de desechos 152 y un dispositivo analítico 156 para analizar los polipéptidos. Sin embargo, en otras versiones, el sistema 100 no puede incluir uno o más de estos componentes. Como ejemplo, el sistema 100 no puede incluir el recipiente 136 y/o el dispositivo analítico 156. En cualquier caso, las tuberías generalmente se extienden entre cada uno de los componentes del sistema 100 para facilitar la comunicación de fluido entre los componentes del sistema 100 cuando se desee, como se describe con mayor detalle a continuación. La válvula de múltiples puertos 104 está configurada generalmente para controlar la comunicación de fluido entre los diversos componentes del sistema 100. En esta versión, la válvula de múltiples puertos 104 es una válvula con doce puertos satélite y un puerto central compartido. En otras palabras, la válvula de múltiples puertos 104 tiene un puerto central 160 y doce puertos satélite 164-175 que están acoplados selectivamente de manera fluida al puerto central 160. La válvula de múltiples puertos 104 puede moverse entre doce posiciones diferentes que acoplan de manera fluida el puerto central 160 con los doce puertos satélite diferentes 164-175, respectivamente (algunos de los cuales no se utilizan en la operación del sistema 100 de la FIG. 1). En otras versiones, la válvula de múltiples puertos 104 puede incluir más o menos puertos satélite, puede ser un tipo diferente de válvula o puede reemplazarse por una o más válvulas diferentes (cada una con uno o más puertos). Como ejemplo, la válvula de múltiples puertos 104 puede ser reemplazada por una pluralidad de válvulas de puerto único conectadas y controladas por separado por el controlador 132, reemplazando eficazmente cada una de las válvulas de puerto único uno de los puertos satélite 164 175.

El recipiente 136 generalmente está configurado para contener o almacenar el producto que contiene polipéptidos que se va a analizar. El recipiente 136 en esta versión adopta la forma de un biorreactor que contiene o almacena el producto. Sin embargo, en otras versiones, el recipiente 136 puede adoptar la forma de un recipiente de cultivo celular, tal como un matraz, una placa, etc. El recipiente 136 está acoplado de manera fluida al puerto satélite 164 de la válvula 104 a través de un conducto 180 de las tuberías, de tal forma que la válvula 104 pueda obtener, cuando se desee, una muestra del producto contenido en el recipiente 136 del recipiente 136.

La primera bobina de retención 108 está situada aguas arriba de la válvula 104 y está acoplada de manera fluida al puerto central 160 de la válvula 104 a través de un conducto 184 de las tuberías. Por lo tanto, la primera bobina de retención 108 está dispuesta para recibir la muestra del producto desde el recipiente 136, a través de la válvula 104, cuando la válvula 104 está en una primera posición en la que el puerto central 160 está acoplado de manera fluida al puerto satélite 164.

La primera columna 112 está situada aguas abajo de la válvula 104 y está acoplada de manera fluida al puerto satélite 165 de la válvula 104 a través de un conducto 188 de las tuberías. Por lo tanto, la primera columna 112 está dispuesta para recibir la muestra de la primera bobina de retención 108, a través de la válvula 104, cuando la válvula 104 está en una segunda posición en la que el puerto central 160 está acoplado de manera fluida al puerto satélite 165. Cuando la primera columna 112 recibe la muestra, la primera columna 112 está configurada para unir polipéptidos de la muestra a medida que la muestra fluye a través de ella. De esta manera, la primera columna 112 separa los polipéptidos en la muestra del resto de la muestra, que puede pasar a la primera cámara de desechos 144 a través de la segunda bobina de retención 116.

La primera columna 112, que también puede denominarse aquí como columna de unión a polipéptidos, se selecciona del grupo que consiste en una columna de proteína A, una columna de proteína G, una columna de proteína A/G, una columna de proteína L, una columna de aminoácidos, una columna de avidina, una columna de estreptavidina, una columna de unión a hidratos de carbono, una columna de hidratos de carbono, una columna de glutatión, una columna de heparina, una columna de interacción hidrófoba, una columna de inmunoafinidad, una columna de nucleótidos/coenzimas, una columna de especialidad, y una columna de cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC). Por ejemplo, en el caso de polipéptidos que son IgG humanas de las subclases 1, 2 o 4, IgM, IgA o IgE (y que comprenden una porción Fc humana y/o una región Fab de la familia VH3 humana), son útiles columnas de proteína A. Las columnas de proteína G se pueden usar para purificar las IgG humanas de las subclases 1-4. Las columnas de proteína de fusión recombinante A/G también se pueden usar para purificar todas estas clases de anticuerpos humanos, ya que la proteína de fusión proporciona sitios de unión a proteína A y proteína G. Por lo tanto, las proteínas de fusión a proteína A/G pueden usarse para purificar IgG, IgA, IgE e IgM humanas. Además, pueden usarse columnas de proteína L para purificar IgG, IgM, IgA, IgE e IgD humanas, siempre que los anticuerpos diana tengan una cadena ligera de subtipo kappa (k) apropiada (es decir, subtipos VkI, VkIII y VkIV); las columnas de proteína L también se pueden usar para purificar fragmentos Fab y scFv que también tienen el subtipo de cadena k apropiado, ya que la proteína L se une a la cadena variable (V) de anticuerpos.

La bomba 140 está situada aguas arriba y acoplada de manera fluida a la primera bobina de retención 108 a través de un conducto 192 de las tuberías. La bomba 140 en esta versión adopta la forma de una bomba de jeringa que está acoplada fluidamente tanto a una primera fuente de amortiguador 196 como a una segunda fuente de amortiguador 200. En esta versión, la primera fuente de amortiguador 196 es una fuente de amortiguador de elución que puede suministrar una disolución de amortiguador de elución 204, por ejemplo, en el caso de anticuerpos unidos a proteína A, un amortiguador ácido; o en el caso de anticuerpos unidos a proteína G, amortiguador muy ácido (pH 3 o menos); un experto en la técnica es capaz de optimizar y seleccionar amortiguadores de elución apropiados para anticuerpos unidos, a la bomba 140 (y, en última instancia, la primera bobina de retención 108), y la segunda fuente de amortiguador 200 es una fuente de amortiguador desnaturalizante (que contiene un desnaturalizante que interrumpe la estructura del polipéptido cuaternario, terciario o secundario) que puede suministrar un reactivo desnaturalizante 208 a la bomba 140 (y, en última instancia, la primera bobina de retención 108). En otras versiones, la bomba 140 puede ser un tipo diferente de bomba y/o se pueden usar diferentes bombas 140 para cada una de las fuentes de amortiguador 196, 200.

En algunas versiones, el reactivo desnaturalizante puede ser o incluir un detergente desnaturalizante o un caótropo. En las versiones en las que el reactivo desnaturalizante es o incluye un detergente desnaturalizante, el detergente desnaturalizante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio (SDS), colato de sodio, desoxicolato de sodio, glicocolato de sodio, taurocolato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de litio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) y bromuro de trimetil(tetradecil)amonio (TTAB). Más preferiblemente, el detergente desnaturalizante es SDS. En las versiones en las que el reactivo desnaturalizante es o incluye un caótropo, el caótropo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en urea, n-butanol, etanol, cloruro de guanidinio, perclorato de litio, acetato de litio, cloruro de magnesio, fenol, 2-propanol, y tiourea. Como alternativa, o adicionalmente, el reactivo desnaturalizante puede ser o incluir un fluido calentado que tiene una temperatura adecuada para alcanzar, si no mantener, una temperatura predeterminada (por ejemplo, alrededor de 22°C a alrededor de 120°C) en la cámara de reacción 120 cuando el reactivo desnaturalizante se pasa a la cámara de reacción 120.

Una válvula 212 está situada entre la bomba 140 y la primera y segunda fuentes de amortiguador 196, 200 para acoplar selectivamente de forma fluida la bomba 140 a solo una de las fuentes de amortiguador 196, 200 a la vez. Más particularmente, la válvula 212 puede moverse entre una primera posición, en la que la bomba 140 está acoplada de forma fluida a la primera fuente de amortiguador 196 y la bomba 140 está aislada de forma fluida de la segunda fuente de amortiguador 200, y una segunda posición, en la que la bomba 140 está acoplada de manera fluida a la segunda fuente de amortiguador 200 y la bomba 140 está aislada de forma fluida de la primera fuente de amortiguador 196. En otras palabras, la bomba 140 está acoplada selectivamente de manera fluida a la primera fuente de amortiguador 196 o la segunda fuente de amortiguador 200 dependiendo de la posición de la válvula 212.

Como se ha indicado anteriormente, la bomba 140 en esta versión es una bomba de jeringa. La bomba de jeringa 140 está configurada generalmente para obtener un amortiguador de una de las fuentes de amortiguador 196, 200 y enviar ese amortiguador a la primera bobina de retención 108. Cuando la válvula 212 está en la primera posición, la bomba 140 puede obtener (por ejemplo, extraer) la disolución de amortiguador de elución 204 de la primera fuente de amortiguador 196, y, cuando se desee, puede enviar (por ejemplo, expulsar) esa disolución de amortiguador de elución 204 a la primera bobina de retención 108. Por el contrario, cuando la válvula 212 está en la segunda posición, la bomba 140 puede obtener (por ejemplo, extraer) el reactivo desnaturalizante 208 de la segunda fuente de amortiguador 200 y, cuando se desee, puede enviar (por ejemplo, expulsar) ese reactivo desnaturalizante 208 a la primera bobina de retención 108.

La segunda bobina de retención 116 está ubicada aguas abajo de la válvula 104, la primera bobina de retención 108 y la primera columna 112. La segunda bobina de retención 116 está acoplada selectivamente de manera fluida al puerto satélite 166 de la válvula 104 a través de los conductos 216, 220 de las tuberías. La segunda bobina de retención 116 también está acoplada selectivamente de forma fluida a la primera columna 112 a través del conducto 220 y un conducto 224. Una válvula de tres vías 228 está dispuesta entre los conductos 216, 220, 224 para facilitar el acoplamiento selectivo para producir el flujo de fluido deseado, como se describe con mayor detalle a continuación.

Por lo tanto, la segunda bobina de retención 116 está dispuesta para recibir la disolución de amortiguador de elución 204 de la primera bobina de retención 108, a través de la válvula 104 y a través de la primera columna 112, cuando la bomba 140 envía la disolución de amortiguador de elución 204 de la manera descrita anteriormente, la válvula 104 está en la segunda posición en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 165. A medida que la disolución de amortiguador de elución 204 pasa a través de la primera columna 112, la disolución de amortiguador de elución 204 eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la primera columna 112. La válvula de tres vías 228 se opera para conectar los conductos 220, 224, acoplando así de manera fluida la primera columna 112 con la segunda bobina de retención 116, de tal forma que una mezcla de elución/polipéptido que incluye la disolución de amortiguador de elución 204 y los polipéptidos eluidos fluye desde la primera columna 112 a la segunda bobina de retención 116 a través de los conductos 220, 224.

La cámara de reacción 120 está situada aguas abajo de la válvula 104 y la primera columna 112, y está acoplada de manera fluida al puerto satélite 167 de la válvula 104 a través del conducto 232 de las tuberías. En esta versión, la cámara de reacción 120 se llena previamente parcialmente, si no completamente, con el reactivo desnaturalizante 208 (es decir, se llena antes de la operación del sistema 100) desde la segunda fuente de amortiguador 200 usando la bomba 140 para enviar el reactivo desnaturalizante 208 a la primera bobina de retención 108 y moviendo la válvula de múltiples puertos 104 a una cuarta posición en la que el puerto central 160 está acoplado de manera fluida al puerto satélite 167 de la válvula 167, facilitando así el movimiento del reactivo desnaturalizante 208 desde la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120. Sin embargo, en otras versiones, la cámara de reacción 120 puede llenarse parcial o completamente con el reactivo desnaturalizante 208 durante la operación del sistema 100 (por ejemplo, después de que la segunda bobina de retención 116 recibe la disolución de amortiguador de elución 204), llenarse parcial o completamente con un reactivo desnaturalizante de otra fuente de amortiguador y/o de una manera diferente, o la cámara de reacción 120 puede no llenarse en absoluto, en cuyo caso el calor puede aplicarse a la cámara de reacción 120 por un elemento de calentamiento 236 conectado a la cámara de reacción 120.

Después de que la mezcla de elución/polipéptido alcance la segunda bobina de retención 116, la mezcla de elución/polipéptido se mueve a la cámara de reacción 120. En esta versión, la cámara de reacción 120 recibe indirectamente la mezcla de elución/polipéptido de la segunda bobina de retención 116. Más particularmente, la válvula de tres vías 228 se opera para conectar los conductos 216, 224, la mezcla de elución/polipéptido se mueve de la segunda bobina de retención 116 al puerto satélite 166 de la válvula de múltiples puertos 104 a través de los conductos 216, 224, la válvula 104 se mueve a una tercera posición en la que la puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 166, de tal forma que la mezcla se mueve a la primera bobina de retención 108, y la válvula 104 se mueve a una cuarta posición en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 167 de la válvula 104, de tal forma que la mezcla se mueve de la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120. En otras versiones, la cámara de reacción 120 puede recibir directamente la mezcla de elución/polipéptido de la segunda bobina de retención 116 o puede recibir indirectamente la mezcla de la segunda bobina de retención 116 utilizando uno o más componentes diferentes y/o en diferente orden.

En cualquier caso, una vez que la mezcla de elución/polipéptido alcanza la cámara de reacción 120, los polipéptidos en la mezcla se incuban en la cámara de reacción 120, desnaturalizando así los polipéptidos en la cámara de reacción 120. Cuando, por ejemplo, la cámara de reacción 120 se llena, al menos parcialmente, con el reactivo desnaturalizante, los polipéptidos en la mezcla se someterán a desnaturalización, tras alcanzar la cámara de reacción 120 y reaccionar con el reactivo desnaturalizante. En algunos casos, la cámara de reacción 120 puede calentarse, al menos tiempo o en todo momento, por el elemento de calentamiento 236 conectado a (por ejemplo, posicionado inmediatamente adyacente, rodeando) la cámara de reacción 120 para ayudar a facilitar el proceso de desnaturalización. En otras palabras, el elemento de calentamiento 236 puede aplicar calor, preferiblemente calor que tiene una temperatura de alrededor de 22°C a alrededor de 120°C y, más preferiblemente, calor que tiene una temperatura de aproximadamente 40°C, a la cámara de reacción 120 para fomentar la desnaturalización. El elemento de calentamiento 236 puede, por ejemplo, adoptar la forma de un bloque de calentamiento, una bobina de calentamiento, un calentador de inducción, una bomba de calor, un calentador de cartucho, un cable de resistencia eléctrica, un fluido calentado, u otro elemento adecuado para calentar una o más porciones de la cámara de reacción 120. En cualquier caso, aplicando calor desde el elemento de calentamiento 236 a la cámara de reacción 120, se puede facilitar el proceso de desnaturalización. Sin embargo, en otros casos, la cámara de reacción 120 no puede llenarse con el reactivo desnaturalizante y el proceso de desnaturalización solo puede facilitarse aplicando calor desde el elemento de calentamiento 236.

Después de la desnaturalización de los polipéptidos en la mezcla, la cámara de reacción 120 está configurada para recibir un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro, reduciendo así los polipéptidos desnaturalizados. El reactivo reductor puede seleccionarse del grupo que consiste en ditiotreitol (DTT), glutatión, pmercaptoetanol (p-ME) y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), y generalmente se suministra por el recipiente de enfriamiento 240, que puede, por ejemplo, adoptar la forma de un refrigerador que tenga una temperatura de 4°C. En esta versión, el recipiente de enfriamiento 240 está ubicado aguas abajo de la válvula 104 y tiene una primera cámara 242 que contiene el reactivo reductor y está acoplado de manera fluida al puerto satélite 168 de la válvula 104 a través del conducto 244 de las tuberías. La primera cámara 242 suministra el reactivo reductor a la primera bobina de retención 108 cuando la válvula 104 está en una quinta posición en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 168 de la válvula 104, y el reactivo reductor se mueve entonces de la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120 cuando la válvula 104 está en (o regresa a) la cuarta posición (en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 167). Por lo tanto, en esta versión, el reactivo reductor se suministra indirectamente a la cámara de reacción 120 a través de la primera bobina de retención 108. Sin embargo, en otras versiones, la primera cámara 242 puede suministrar directamente el reactivo reductor a la cámara de reacción 120 (es decir, sin mover el reactivo reductor a la primera bobina de retención 108).

Después de reducir los polipéptidos desnaturalizados, la cámara de reacción 120 está configurada para recibir un agente alquilante que alquila sulfhidrilos en la cámara de reacción 120, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos en la cámara de reacción 120. El agente alquilante es preferiblemente un alquilante reactivo tal como ácido indol-3-acético (IAA), aunque pueden usarse otros agentes alquilantes. En esta versión, el recipiente de enfriamiento 240 tiene una segunda cámara 248 que contiene el agente alquilante y está acoplado de manera fluida al puerto satélite 169 de la válvula 104 a través del conducto 252 de las tuberías. La segunda cámara 248 suministra el agente alquilante a la primera bobina de retención 108 cuando la válvula 104 está en una sexta posición en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 169 de la válvula 104, y el agente alquilante se mueve entonces de la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120 cuando la válvula 104 está en (o regresa) a la cuarta posición. Por lo tanto, en esta versión el agente alquilante se suministra indirectamente a la cámara de reacción 120 a través de la primera bobina de retención 108. Sin embargo, en otras versiones, la segunda cámara 248 puede suministrar directamente el agente alquilante a la cámara de reacción 120 (es decir, sin mover el agente alquilante a la primera bobina de retención 108), y/o el agente alquilante puede suministrarse desde un recipiente de enfriamiento diferente (por ejemplo, un recipiente de enfriamiento separado del recipiente de enfriamiento 240).

En esta versión, el sistema 100 incluye además una primera válvula normalmente abierta 256 que está acoplada de manera fluida y situada aguas abajo de la cámara de reacción 120. La válvula normalmente abierta 256 tiene un puerto de entrada 260 que está conectado de manera fluida a una salida 264 de la cámara de reacción 120, un primer puerto de salida 268 que está conectado de forma fluida a la segunda cámara de desechos 148, y un segundo puerto de salida 272 que está conectado de forma fluida a la atmósfera. La válvula normalmente abierta 256 normalmente opera en una posición abierta, o primera, cuando el sistema 100 está en funcionamiento y, más particularmente, la cámara de reacción 120 recibe y se llena con la mezcla de elución/polipéptido, el reactivo reductor, el agente alquilante y, en algunos casos, el reactivo desnaturalizante, la válvula 256. En esta posición abierta, el puerto de entrada 260 está acoplado de manera fluida al primer puerto de salida 268 y el puerto de entrada 260 está aislado de manera fluida del segundo puerto de salida 272, de tal forma que cuando la cámara de reacción 120 se llena más allá de su volumen fijo, cualquier contenido en exceso se dirige a la segunda cámara de desechos 148. Sin embargo, la válvula normalmente abierta 256 puede moverse (por ejemplo, aplicando una corriente a la válvula 256) desde la posición abierta a una posición cerrada, o segunda, cuando, por ejemplo, la cámara de reacción 120 ya no recibe el contenido descrito anteriormente y es el momento de limpiar la cámara de reacción 120. En esta posición cerrada, el puerto de entrada 260 está acoplado de forma fluida al segundo puerto de salida 272 y el puerto de entrada 260 está aislado de forma fluida del primer puerto de salida 268, de tal forma que la salida 264 de la cámara de reacción 120 está expuesta a la atmósfera. A su vez, el aire puede fluir hacia la cámara de reacción 120, facilitando así la eliminación del contenido de la cámara de reacción 120.

La segunda columna 124, también denominada aquí como la columna desaladora 124, preferiblemente adopta la forma de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño que se encuentra aguas abajo de la válvula 104 y está acoplada de manera fluida al puerto satélite 170 de la válvula 104 a través de un conducto 276 de las tuberías. Por lo tanto, la segunda columna 124 se dispone para recibir los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor y el reactivo desnaturalizante (cuando se usa uno) de la cámara de reacción 120. En esta versión, la segunda columna 124 recibe indirectamente estos materiales desde la cámara de reacción 120. Más particularmente, estos materiales se mueven desde la cámara de reacción 120 a la primera bobina de retención 108, a través de la válvula 104, cuando la válvula 104 está en (o se mueve a) la cuarta posición (en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 167), y la válvula 104 se mueve a una séptima posición en la que el puerto central 160 está acoplado de forma fluida al puerto satélite 170, de tal forma que los materiales se mueven desde la primera bobina de retención 108 a la segunda columna 124. En otras versiones, la segunda columna 124 puede recibir directamente estos materiales desde la cámara de reacción 120 o puede recibir indirectamente estos materiales utilizando uno o más componentes diferentes y/o en un orden diferente.

En cualquier caso, cuando la segunda columna 124 recibe los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante (cuando se usa uno), la segunda columna 124 está configurada para separar los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante (cuando se usan), que finalmente se mueven a la tercera cámara de desechos 152. Por lo tanto, la segunda columna 124 puede denominarse aquí la columna desaladora 124. Al mismo tiempo, la segunda columna 124 está configurada para intercambiar los polipéptidos en una condición de amortiguador deseada que permite que la tercera columna 128 realice la funcionalidad descrita a continuación.

En esta versión, el sistema 100 incluye además una segunda válvula normalmente abierta 280 que está acoplada de forma fluida y situada entre la segunda columna 124 y la tercera columna 128. La válvula normalmente abierta 280 tiene un puerto de entrada 284 que está conectado de forma fluida a una salida 288 de la segunda columna 124, un primer puerto de salida 292 que está conectado de forma fluida a la tercera cámara de desechos 152, y un segundo puerto de salida 296 que está conectado de forma fluida a la tercera columna 128. La válvula normalmente abierta 280 normalmente opera en una posición abierta, o primera, cuando el sistema 100 está en funcionamiento. En esta posición abierta, el puerto de entrada 284 está acoplado de forma fluida al primer puerto de salida 292 y el puerto de entrada 284 está aislado de forma fluida del segundo puerto de salida 296, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor y el reactivo desnaturalizante se dirigen a la tercera cámara de desechos 152. Sin embargo, la válvula normalmente abierta 280 puede moverse (por ejemplo, aplicando una corriente a la válvula 280) desde la posición abierta a una posición cerrada, o segunda, cuando se desea mover los polipéptidos desalados de la segunda columna 124 a la tercera columna 128, que se encuentra aguas abajo de la segunda columna 124. En esta posición cerrada, el puerto de entrada 284 está acoplado de manera fluida al segundo puerto de salida 296 y el puerto de entrada 284 está aislado de forma fluida del primer puerto de salida 292, de tal forma que la segunda columna 124 está acoplada de manera fluida a la tercera columna 128, de tal forma que el desalado pueda pasar de la segunda columna 124 a la tercera columna 128. En esta versión, la tercera columna 128 incluye una enzima proteolítica (por ejemplo, una endopeptidasa seleccionada del grupo que consiste en tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, pepsina, glutamil endopeptidasa, neprilisina, proteasa Lys-C y proteasa V8 deStaphylococcus aureus),de tal forma que la tercera columna 128 puede denominarse aquí columna de enzima proteolítica. En cualquier caso, la tercera columna 128 digiere los polipéptidos desalados obtenidos de la segunda columna 124.

Después de que los polipéptidos se han digerido en la tercera columna 128, los polipéptidos digeridos pueden moverse al dispositivo analítico 156, que puede adoptar la forma de, por ejemplo, un dispositivo de cromatografía de líquidos, un dispositivo de cromatografía de líquidos de alto rendimiento, un dispositivo de cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento, un dispositivo de espectrometría de masas, un dispositivo de análisis de glicano, otro dispositivo de análisis, o una combinación de los mismos. En esta versión, el dispositivo analítico 156 está situado aguas abajo de la tercera columna 128 y está acoplado de forma fluida a la tercera columna 128 a través de un conducto 298 de las tuberías. Por lo tanto, en esta versión, los polipéptidos digeridos se pueden mover automáticamente al dispositivo analítico 156 para su análisis (por ejemplo, para cuantificación y separación). Sin embargo, en otras versiones, el dispositivo analítico 156 no forma parte del sistema 100 (por ejemplo, no está acoplado de manera fluida a la tercera columna 128), en cuyo caso los polipéptidos digeridos pueden moverse al dispositivo analítico 156 de una manera diferente (por ejemplo, manualmente).

Como se apreciado brevemente anteriormente, el sistema 100 también incluye el controlador 132, que en esta versión está acoplado o conectado comunicativamente a diversos componentes del sistema 100 para monitorizar y facilitar o dirigir la operación descrita anteriormente del sistema 100 transmitiendo señales (por ejemplo, señales de control, datos) a, y recibiendo señales (por ejemplo, datos) de los diversos componentes del sistema 100. El controlador 132 puede situarse inmediatamente adyacente a los otros componentes del sistema 100 (por ejemplo, en el mismo entorno que el sistema 100) o puede situarse remotamente de los demás componentes del sistema 100. Como se ilustra, el controlador 132 está acoplado comunicativamente o conectado a la válvula de múltiples puertos 104 a través de una red de comunicación 300, y la bomba 140 a través de una red de comunicación 328, el dispositivo analítico 156 a través de una red de comunicación 332, el elemento de calentamiento 236 a través de una red de comunicación 340, la primera válvula normalmente abierta 256 a través de una red de comunicación 344, y la segunda válvula normalmente abierta 280 a través de una red de comunicación 348. En otras versiones, el controlador 132 se puede acoplar comunicativamente o conectar a más o menos componentes del sistema 100, por ejemplo, la primera bobina de retención 108, la primera columna 112, la segunda bobina de retención 116, la cámara de reacción 120, la segunda columna 124, la tercera columna 128, el recipiente 136, la válvula de tres vías 228 y/o el recipiente de enfriamiento 240.

Como se usa aquí, las frases "acoplado comunicativamente" y "conectado" se definen para referirse a directamente acoplado o conectado o indirectamente acoplado o conectado a través de uno o más componentes intermedios. Dichos componentes intermedios pueden incluir componentes basados en hardware y/o software. Se aprecia que las redes 300-348 pueden ser redes inalámbricas, redes cableadas o combinaciones de una red cableada y una inalámbrica (por ejemplo, una red de telefonía celular y/o red compatible con 802.11x), y pueden incluir una red de acceso público, tal como Internet, una red privada o una combinación de ambas. El tipo y la configuración de las redes 300-348 dependen de la implementación, y se puede usar cualquier tipo de redes de comunicaciones que faciliten las comunicaciones descritas entre el controlador 132 y los componentes del sistema 100, disponibles ahora o desarrollados posteriormente.

Como se muestra en la FIG. 2, el controlador 132 incluye un procesador 352, una memoria 356, una interfaz de comunicaciones 360 y una lógica informática 364. El procesador 352 puede ser un procesador general, un procesador de señal digital, un circuito integrado de aplicación específica (ASIC), una matriz de puertas programable por campo, una unidad de procesamiento de gráficos, un circuito analógico, un circuito digital o cualquier otro procesador conocido o desarrollado más tarde. El procesador 352 funciona de acuerdo con las instrucciones en la memoria 356. La memoria 356 puede ser una memoria volátil o una memoria no volátil. La memoria 356 puede incluir una o más de una memoria de solo lectura (ROM), una memoria de acceso aleatorio (RAM), una memoria flash, una memoria de solo lectura programable y borrable eléctricamente (EEPROM), u otro tipo de memoria. La memoria 356 puede incluir un dispositivo de almacenamiento de datos óptico, magnético (disco duro) o cualquier otro.

La interfaz de comunicaciones 360 se proporciona para permitir o facilitar la comunicación electrónica entre el controlador 132 y los componentes del sistema de refrigeración 100 a través de las redes 300-348. La interfaz de comunicaciones 360 puede ser o incluir, por ejemplo, uno o más puertos de bus serie universal (USB), uno o más puertos Ethernet y/o uno o más puertos o interfaces. La comunicación electrónica puede tener lugar a través de cualquier protocolo de comunicaciones conocido, incluyendo, a modo de ejemplo, USB, RS-232, RS-485, WiFi, Bluetooth y/o cualquier otro protocolo de comunicaciones adecuado.

La lógica 364 generalmente incluye una o más rutinas de control y/o una o más subrutinas incorporadas como instrucciones legibles por ordenador almacenadas en la memoria 356. Las rutinas de control y/o subrutinas pueden realizar un control PID (proporcional-integral-derivativo), de lógica difusa, no lineal o cualquier otro tipo de control adecuado. El procesador 352 generalmente ejecuta la lógica 364 para realizar acciones relacionadas con el funcionamiento del sistema 100.

En términos generales, la lógica 364, cuando se ejecuta, hace que el procesador 352 controle los componentes del sistema 100, particularmente la válvula de múltiples puertos 104, la bomba 140, el elemento de calentamiento 236, la primera y la segunda válvulas normalmente abiertas 256, 280, y el dispositivo analítico 156, de tal forma que el sistema 100 funciona de la manera deseada discutida aquí. Más particularmente, la lógica 364, cuando se ejecuta, puede hacer que el procesador 352 (i) mueva la válvula de múltiples puertos 104 hasta o entre cualquiera de las posiciones descritas aquí, acoplando así de manera fluida diversos componentes del sistema 100 como se ha descrito anteriormente, (ii) controle la bomba 140 (por ejemplo, hacer que la bomba 140 obtenga y produzca la disolución de amortiguador de elución 204 o el reactivo desnaturalizante 208), (iii) controle el elemento de calentamiento 236 (cuando se emplea en el sistema 100) para aplicar calor selectivamente a la cámara de reacción 120 (y el contenido de la misma), (iv) controle la primera válvula normalmente abierta 256, (v) controle la segunda válvula normalmente abierta 280, (vi) controle el dispositivo analítico 156, y realice otra funcionalidad deseada.

Cuando, por ejemplo, se desea realizar un ensayo en tiempo real de una muestra de un producto que contiene polipéptidos, el procesador 352 puede ejecutar la lógica 364 para posicionar la válvula 104 en la primera posición descrita anteriormente, mover el muestra del producto desde el recipiente 136 a la primera bobina de retención 108 a través del conducto 180, el puerto 164, el puerto 160, posicionar la válvula 104 en la segunda posición descrita anteriormente, y mover la muestra desde la primera bobina de retención 108 a y a través de la columna de unión a polipéptidos 112 a través del conducto 184, los puertos 160, 164 y el conducto 188. A su vez, sustancialmente todos los polipéptidos en la muestra se unen a la columna 112, de tal forma que los polipéptidos en la muestra están separados del resto de la muestra, que pasa a la primera cámara de desechos 144 a través de los conductos 220, 224 y la segunda bobina de retención 116.

La lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para hacer que la bomba 140 obtenga la disolución de amortiguador de elución 204 de la primera fuente de amortiguador 196 y envíe la disolución de amortiguador de elución 204 a la primera bobina de retención 108 a través del conducto 192. En algunos casos, la bomba 140 puede necesitar moverse de la segunda posición a la primera posición (para acoplar de forma fluida la bomba 140 con la primera fuente de amortiguador 196), pero en otros casos, la bomba 140 ya puede estar en la primera posición. En cualquier caso, la lógica 364 es ejecutable por el procesador 352 para mover la disolución de amortiguador de elución 204 desde la primera bobina de retención 108 a y a través de la primera columna 112 y a la segunda bobina de retención 116, a través del conducto 184, los puertos 160, 165, y los conductos 188, 220, y 224. De esta manera, la disolución de amortiguador de elución 204 eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la primera columna 112, y una mezcla de elución/polipéptido que incluye la disolución de amortiguador de elución 204 y los polipéptidos eluidos fluye desde la primera columna 112 a la segunda bobina de retención 116.

La lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula 104 a la tercera posición descrita anteriormente, mover la mezcla de elución/polipéptido de la segunda bobina de retención 116 a la primera bobina de retención 108, a través de los conductos 224, 216, los puertos 166, 160, y el conducto 184, mover la válvula 104 a la cuarta posición descrita anteriormente, y mover la mezcla de elución/polipéptido desde la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120, a través del conducto 184, los puertos 160, 167, y el conducto 232. A su vez, los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido se incuban en la cámara de reacción 120 con el reactivo desnaturalizante 208 y/o en presencia de calor aplicado por el elemento de calentamiento 236, que desnaturaliza así los polipéptidos.

La lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula 104 a la quinta posición descrita anteriormente, mover el reactivo reductor desde la primera cámara 242 del recipiente de enfriamiento 240 a la primera bobina de retención 108 a través del conducto 244, los puertos 168, 160, y el conducto 184, mover la válvula 104 de nuevo a la cuarta posición, y mover el reactivo reductor desde la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120, a través del conducto 184, los puertos 160, 167, y el conducto 232. Tras alcanzar la cámara de reacción 120, el reactivo reductor escinde las entrecruzamientos de enlaces de disulfuro, que reduce así los polipéptidos desnaturalizados en la cámara de reacción 120.

La lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula 104 a la sexta posición descrita anteriormente, mover el agente alquilante desde la segunda cámara 248 del recipiente de enfriamiento 240 a la primera bobina de retención 108 a través del conducto 252, los puertos 169, 160, y el conducto 184, mover la válvula 104 de nuevo a la cuarta posición, y mover el agente alquilante desde la primera bobina de retención 108 a la cámara de reacción 120, a través del conducto 184, los puertos 160, 167, y el conducto 232. Tras alcanzar la cámara de reacción 120, el agente alquilante alquila sulfhidrilos en la cámara de reacción 120, que alquila así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos en la cámara de reacción 120.

La lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula 104 a la cuarta posición (si aún no está allí), mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante (cuando se usan) desde la cámara de reacción 120 a la primera bobina de retención 108, a través del conducto 232, los puertos 167, 160, y el conducto 184, mover la válvula 104 a la séptima posición descrita anteriormente, y mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante (cuando se usan) desde la primera bobina de retención 108 a la columna desaladora 124 a través del conducto 184, los puertos 160, 170, y el conducto 276. A su vez, la columna desaladora 124 separa los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante, que se pasan o se mueven a la tercera cámara de desechos 152.

En alguno punto después de mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución 204, el agente alquilante, el reactivo reductor, y el reactivo desnaturalizante (cuando se usan) desde la cámara de reacción 120 a la primera bobina de retención 108, la lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula normalmente abierta 256 desde su primer posición abierta, en el que la salida 264 de la cámara 120 está acoplada de forma fluida a la segunda cámara de desechos 148 para dirigir el contenido que no entra en la cámara de reacción 120 (como resultado de llenarse más allá de su volumen fijo) a la segunda cámara de desechos 148, a su segunda posición cerrada, en el que la salida 264 está acoplada de forma fluida a la atmósfera, de tal forma que el aire pueda fluir a la cámara de reacción 120, facilitando así la eliminación del contenido de la cámara de reacción 120. La válvula normalmente abierta 256 puede regresar a la primera posición abierta inmediatamente después del vaciado de la cámara de reacción 120 o puede regresar a la primera posición abierta en un momento posterior en el tiempo.

Después de que la columna desaladora 124 separe los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de los demás materiales, la lógica 364 es ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover la válvula normalmente abierta 280 desde su primer posición abierta, en el que el puerto de entrada de la válvula 280 está acoplado de forma fluida a la tercera cámara de desechos 152, a su segunda posición cerrada, en el que el puerto de entrada de la válvula 280 está acoplado de forma fluida a la columna de enzima proteolítica 128. A su vez, la lógica 364 es ejecutable por el procesador 352 para mover los polipéptidos desalados (o separados) de la columna desaladora 124 a la columna de enzima proteolítica 128, que digiere los polipéptidos desalados.

Después de que los polipéptidos se hayan digerido, la lógica 364 es, al menos en esta versión, ejecutable adicionalmente por el procesador 352 para mover los polipéptidos digeridos desde la columna de enzima proteolítica 128 al dispositivo analítico 156 para el análisis de los polipéptidos, y hacer que el dispositivo analítico 156 realice el análisis deseado. Como ejemplo, la lógica 364, cuando se ejecuta por el procesador 352, puede hacer que el dispositivo analítico 156 separe y cuantifique los polipéptidos.

En otras versiones, la lógica 364, cuando se ejecuta por el procesador 352, puede hacer que se realice una funcionalidad adicional, menor y/o diferente. Como ejemplo, la lógica 364, cuando se ejecuta por el procesador 352, puede no mover los polipéptidos digeridos desde la columna 128 al dispositivo analítico 156 o hacer que el dispositivo analítico 156 realice el análisis deseado. Además en otras versiones, la lógica 364 puede ejecutarse por el procesador 352 en un orden diferente del descrito aquí. Finalmente, se aprecia que la lógica 364 puede ser ejecutada por el procesador 352 cualquier número de veces diferentes, ya que el sistema 100 puede usarse para realizar un análisis en tiempo real de múltiples muestras (del mismo producto y/o de un producto diferente).

Las FIGS. 3A-3C ilustran los resultados de un estudio de ensayo MAM en línea y en tiempo real diseñado para monitorizar la eficacia del sistema 100 en la preparación de una muestra de un producto que contiene una molécula acopladora de linfocitos T biespecíficas (BiTE®). En particular, el estudio monitorizó la eficacia del sistema 100 durante un ciclo de producción de 40 días. El estudio comenzó a monitorizar y recopilar datos de CQA, tal como el porcentaje de área para 2 sitios de desamidación, DS1 y DS2, y la frecuencia de una fragmentación, FF, ilustrada en la FIG. 3A, y la altura de pico de MS (expresada como un número de recuentos de iones) para cuatro péptidos de referencia RP1, RP2, RP3 y RP4, ilustrados en las FIGS. 3B y 3C, el día 6 del ciclo de producción de 40 días. Como se ilustra en la FIG. 3A, el sistema 100 realizó de manera capaz y eficaz la funcionalidad prevista discutida aquí durante toda la duración del ciclo de producción de 40 días y, como se ilustra en las FIGS. 3B y 3C, los datos de CQA recopilados entre el día 6 y el día 40 fueron sustancialmente consistentes, es decir, no hubo cambios significativos en la calidad del producto con el tiempo, y la calidad del producto aumentó realmente después del día 32, lo que demuestra la robustez del sistema 100 en la preparación automáticamente de la muestra. De hecho, como se ilustra en la FIG. 3C, los datos de CQA recopilados para RP1, RP2, RP3 y RP4 durante ese periodo de tiempo fueron mejores que los datos de CQA obtenidos durante un ensayo MAM manual típico.

Polipéptidos terapéuticos

Las proteínas, incluidas las que se unen a uno o más de los siguientes, pueden ser útiles en los dispositivos y métodos descritos. Estos incluyen proteínas CD, incluyendo CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD30 y CD34; incluhendo las que interfieren con la unión al receptor. Proteínas de la familia de receptores HER, que incluyen HER2, HER3, HER4 y el receptor EGF. Moléculas de adhesión celular, por ejemplo, LFA-I, MoI, pl50, 95, VLA-4, ICAM-I, Vc AM y integrina alfa v/beta 3. Factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF''), hormona del crecimiento, hormona estimuladora de la tiroides, hormona estimuladora del folículo, hormona luteinizante, factor liberador de la hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, sustancia inhibidora de Mulleriano, proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-I-alfa), eritropoyetina (EPO), factor del crecimiento nervioso, tal como NGF-beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo, por ejemplo, aFGF y bFGF, factor del crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), incluyendo, entre otros, TGF-a y TGF-p, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, o TGF-p5, factores de crecimiento insulínico I y II (IGF-I y IGF-II), des(l-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), y factores osteoinductivos. Insulinas y proteínas relacionadas con la insulina, incluyendo insulina, cadena A de la insulina, cadena B de la insulina, proinsulina, y las proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulínico. Coagulación y proteínas relacionadas con la coagulación, tales como, entre otras, factor VIII, factor tisular, factor von Willebrands, proteína C, alfa-1-antitripsina, activadores de plasminógeno, tal como urocinasa y activador de plasminógeno tisular ("t-PA"), bombazina, trombina y trombopoyetina; (vii) otras proteínas sanguíneas y séricas, incluyendo, pero sin limitación, albúmina, IgE y antígenos de grupos sanguíneos. Factores estimuladores de colonias y receptores de los mismos, incluidos los siguientes, entre otros, M-CSF, GM-CSF y G-CSF, y receptores de los mismos, tales como el receptor CSF-1 (c-fms). Receptores y proteínas asociadas al receptor, incluyendo, por ejemplo, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor de LDL, receptores de hormona de crecimiento, receptores de trombopoyetina ("TPO-R", "c-mpl"), receptores de glucagón, receptores de interleucina, receptores de interferón, receptores de linfocitos T, receptores del factor de células madre, tal como c-Kit, y otros receptores. Ligandos de receptor, incluyendo, por ejemplo, OX40L, el ligando para el receptor OX40. Factores neurotróficos, incluyendo factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF) y neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6). Cadena A de relaxina, cadena B de relaxina y prorrelaxina; interferones y receptores de interferón, incluyendo, por ejemplo, interferón-a, -p y -y, y sus receptores. Interleucinas y receptores de interleucina, incluyendo los receptores IL-I a IL-33 e IL-I a IL-33, tal como el receptor IL-8, entre otros. Antígenos virales, incluyendo un antígeno viral de envoltura de SIDA. Lipoproteínas, calcitonina, glucagón, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar, factor de necrosis tumoral alfa y beta, encefalinasa, RANTES (regulado en la activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T), péptido asociado a gonadotropina de ratón, ADNsa, inhibina y activina. Integrina, proteína A o D, factores reumatoides, inmunotoxinas, proteína morfogenética del hueso (BMP), superóxido dismutasa, proteínas de la membrana superficial, factor acelerador de la descomposición (DAF), envoltura del sida, proteínas de transporte, receptores de localización, adresinas, proteínas reguladoras, inmunoadhesinas, anticuerpos. Miostatinas, proteínas TALL, incluyendo TALL-I, proteínas amiloides, incluyendo, pero sin limitación, proteínas beta amiloides, linfopoyetinas del estroma tímico ("TSLP"), ligando RANK ("OPGL"), c-kit, receptores TNF, incluido el receptor TNF Tipo 1, TRAIL-R2, angiopoyetinas y fragmentos o análogos biológicamente activos o variantes de cualquiera de los anteriores.

Los polipéptidos y anticuerpos ejemplares incluyen Activase® (Alteplase); alirocumab, Aranesp® (Darbepoetin-alfa), Epogen® (Epoetin alfa, o eritropoyetina); Avonex® (Interferon p-Ia); Bexxar® (Tositumomab); Betaseron® (Interferonp); bococizumab (anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 designado como L1L3, véase el documento US8080243); Campath® (Alemtuzumab); Dynepo® (Epoetina delta); Velcade® (bortezomib); MLN0002 (anti-a4p7 mAb); MLN1202 (mAb del receptor de quimiocina anti-CCR2); Enbrel® (etanercept); Eprex® (Epoetina alfa); Erbitux® (Cetuximab); evolocumab; Genotropin® (Somatropina); Herceptin® (Trastuzumab); Humatrope® (somatropina [origen de ADNr] para inyección); Humira® (Adalimumab); Infergen® (Interferón Alfacon-1); Natrecor® (nesiritida); Kineret® (Anakinra), Leukine® (Sargamostim); LymphoCide® (Epratuzumab); BenlystaTM (Belimumab); Metalyse® (Tenecteplasa); Mircera® (metoxi-polietilenglicol-epoetina beta); MyIotarg® (Gemtuzumab ozogamicina); Raptiva® (efalizumab); Cimzia® (certolizumab pegol); SolirisTM (Eculizumab); Pexelizumab (Complemento Anti-C5); MEDI-524 (Numax®); Lucentis® (Ranibizumab); Edrecolomab (Panorex®); Trabio® (lerdelimumab); TheraCim hR3 (Nimotuzumab); Omnitarg (Pertuzumab, 2C4); Osidem® (IDM-I); OvaRex® (B43.13); Nuvion® (visilizumab); Cantuzumab mertansina (huC242-DMl); NeoRecormon® (Epoetin beta); Neumega® (Oprelvekin); Neulasta® (Filgrastim pegilado, G-CSF pegilado, hu-Met-G-CSF pegilado); Neupogen® (Filgrastim); Orthoclone OKT3® (Muromonab-CD3), Procrit® (Epoetina alfa); Remicade® (Infliximab), Reopro® (Abciximab), Actemra® (mAb del receptor anti-IL6), Avastin® (Bevacizumab), HuMax-CD4 (zanolimumab), Rituxan® (Rituximab); Tarceva® (Erlotinib); Roferon-A®-(Interferón alfa-2a); Simulect® (Basiliximab); StelaraTM (Ustekinumab); Prexige® (lumiracoxib); Synagis® (Palivizumab); 146B7-CHO (anticuerpo anti-IL15, véase el documento US7153507), Tysabri® (Natalizumab); Valortim® (MDX-1303, mAb del antígeno protector anti-B. anthracis); ABthraxTM; Vectibix® (Panitumumab); Xolair® (Omalizumab), ETI211 (anti-MRSA mAb), trampa de IL-I (la porción Fc de IgG1 humana y los dominios extracelulares de ambos componentes del receptor de IL-I (el receptor de tipo I y la proteína accesoria del receptor)), trampa de VEGF (dominios Ig de VEGFRl condensado a IgGl Fc), Zenapax® (Daclizumab); Zenapax® (Daclizumab), Zevalin® (Ibritumomab tiuxetan), Zetia (ezetimibe), Atacicept (TACI-Ig), anti-a4p7 mAb (vedolizumab); galiximab (anticuerpo monoclonal anti-CD80), anti-CD23 mAb (lumiliximab); BR2-Fc (Proteína de fusión huBR3/huFc, antagonista soluble BAFF); SimponiTM (Golimumab); Mapatumumab (mAb del receptor humano anti-TRAIL-1); Ocrelizumab (mAb anti-CD20 humano); HuMax-EGFR (zalutumumab); M200 (Volociximab, mAb de integrina anti-a5p1); MDX-010 (Ipilimumab, anti-CTLA-4 mAb y VEGFR-I (IMC-18F1); anti-BR3 mAb; mAb C de toxina A y toxina B anti-C. difficile m Dx -066 (CDA-I) y MDX-1388); conjugados de dsFv-PE38 anti-CD22 (CAT-3888 y CAT-8015); anti-CD25 mAb (HuMax-TAC); anticuerpos antiTSLP; anticuerpo del receptor anti-TSLP (documento US8101182); anticuerpo anti-TSLP designado como A5 (documento US7982016); (anti-CD3 mAb (NI-0401); Adecatumumab (MT201, anti-EpCAM-CD326 mAb); MDX-060, Sg N-30, SGN-35 (anti-CD30 mAbs); MDX-1333 (anti- IFNAR); HuMax CD38 (anti-CD38 mAb); anti-CD40L mAb; anti-Cripto mAb; fibrinógeno de fibrosis pulmonar idiopática anti-CTGF de fase I (FG-3019); anti-CTLA4 mAb; mAb antieotaxina l (CAT-213); anti-FGF8 mAb; mAb anti-gangliósido GD; anticuerpos anti-esclerostina (véanse los documentos US8715663 o US7592429) anticuerpo anti-esclerostina designado como Ab-5 (documentos US8715663 o US7592429); mAb anti-gangliósido GM2; mAb anti-GDF-8 humano (MYO-029); mAb del receptor anti-GM-CSF (CAM-3001); anti-HepC mAb (HuMax HepC); MEDI-545, MDX-1103 (anti-IFNa mAb); anti-IGFIR mAb; anti-IGF-IR mAb (HuMax-Inflam); anti-IL12/IL23p40 mAb (Briakinumab); anti-IL-23p19 mAb (LY2525623); anti-IL13 mAb (CAT-354); anti-IL-17 mAb (AIN457); anti-IL2Ra mAb (HuMax-TAC); mAb del receptor anti-IL5; mAb de los receptores antiintegrina (MDX-Ol8, CNTO 95); mAb anti-IPIO de colitis ulcerosa (MDX- 1100); anticuerpo anti-LLY; BMS-66513; mAb del receptor anti-manosa/hCGp (MDX-1307); conjugado de dsFv-PE38 anti-mesotelina (CAT-5001); anti-PDlmAb (MDX-1 106 (ONO- 4538)); anticuerpo anti-PDGFRa (IMC-3G3); anti-TGFp mAb (GC-1008); mAb del receptor 2 humano anti-TRAIL (HGS-ETR2); anti-TWEAK mAb; anti-VEGFR/Flt-1 mAb; anti- ZP3 mAb (HuMax-ZP3); y un anticuerpo monoclonal beta amiloide que comprende las secuencias, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:6 (documento US7906625).

Los ejemplos de anticuerpos adecuados para los métodos y formulaciones farmacéuticas incluyen los anticuerpos que se muestran en la Tabla 1. Otros ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen infliximab, bevacizumab, cetuximab, ranibizumab, palivizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, altinumab, atlizumab, atorolimiumab, tocilizumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bivatuzumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotin, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, cc49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetan, conatumumab, crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetan, epratuzumab, erenumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotin, golimumab, gomiliximab, gs6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab ravtansina, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonabcd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pintumomab, placulumab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, tefibazumab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tezepelumab, TGN1412, tremelimumab, ticilimumab, tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, zolimomab aritox.

Los anticuerpos también incluyen adalimumab, bevacizumab, blinatumomab, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, erenumab, evolocumab, infliximab, natalizumab, panitumumab, rilotumumab, rituximab, romosozumab, tezepelumab, y trastuzumab, y anticuerpos seleccionados de la Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplos de anticuerpos terapéuticos

Diana (nombre Conc. Viscosidad Tipo HC (incluyendo . LC SEQ ID HC SEQ ID informal) (mg/ml) (cP) alotipos)<Tipo LC>pI NO NO anti-amiloide 142,2 5,0 IgG1 (f) (R;EM) Kappa 9,0 1 2 GMCSF (247) 139,7 5,6 IgG2 Kappa 8,73 4 CGRPR 136,6 6,3 IgG2 Lambda 8,6 5 6 RANKL 152,7 6,6 IgG2 Kappa 8,6 7 8 Esclerostina (27H6) 145,0 6,7 IgG2 Kappa 6,69 10 IL-1R1 153,9 6,7 IgG2 Kappa 7,4 11 12 Miostatina 141,0 6,8 IgG1 (z) (K;EM) Kappa 8,7 13 14 B7RP1 137,5 7,7 IgG2 Kappa 7,7 15 16 Amiloide 140,6 8,2 IgG1 (za) (K;DL) Kappa 8,7 17 18 GMCSF (3.112) 156,0 8,2 IgG2 Kappa 8,8 19 20 CGRP (32H7) 159,5 8,3 IgG2 Kappa 8,721 22 CGRP (3B6.2) 161,1 8,4 IgG2 Lambda 8,6 23 24 PCSK9 (8A3.1) 150,0 9,1 IgG2 Kappa 6,725 26 PCSK9 (492) 150,0 9,2 IgG2 Kappa 6,927 28 CGRP 155,2 9,6 IgG2 Lambda 8,829 30 Hepcidina 147,1 9,9 IgG2 Lambda 7,331 32 TNFR p55 ) 157,0 10,0 IgG2 Kappa 8,2 33 34 OX40L 144,5 10,0 IgG2 Kappa 8,735 36 HGF 155,8 10,6 IgG2 Kappa 8,1 37 38 GMCSF 162,5 11,0 IgG2 Kappa 8,1 39 40 Glucagón R 146,0 12,1 IgG2 Kappa 8,4 41 42 GMCSF (4.381) 144,5 12,1 IgG2 Kappa 8,443 44 Esclerostina (13F3) 155,0 12,1 IgG2 Kappa 7,8 45 46 CD-22 143,7 12,2 IgG1 (f) (R;EM) Kappa 8,847 48 INFgR 154,2 12,2 IgG1 (za) (K;DL) Kappa 8,8 49 50 Ang2 151,5 12,4 IgG2 Kappa 7,451 52 TRAILR2 158,3 12,5 IgG1 (f) (R;EM) Kappa 8,7 53 54 EGFR 141,7 14,0 IgG2 Kappa 6,855 56 IL-4R 145,8 15,2 IgG2 Kappa 8,6 57 58 IL-15 149,0 16,3 IgG1 (f) (R;EM) Kappa 8,859 60 IGF1R 159,2 17,3 IgG1 (za) (K;DL) Kappa 8,661 62 IL-17R 150,9 19,1 IgG2 Kappa 8,6 63 64 Diana (nombre Conc. Viscosidad Tipo HC (incluyendo . LC SEQ ID HC SEQ ID informal) (mg/ml) (cP) alotipos)<Tipo LC>pI NO NO

Dkk1 (6.37.5) 159,4 19,6 Kappa 8,265 66

Esclerostina 134,8 20,9 IgG2 Kappa 7,4 67 68

TSLP 134,2 21,4 IgG2 Lambda 7,269 70

Dkk1 (11H10) 145,3 22,5 IgG2 Kappa 8,2 71 72

PCSK9 145,2 22,8 IgG2 Lambda 8,1 73 74

GIPR (2G10.006) 150,0 23,0 IgG1 (z) (K;EM) Kappa 8,1 75 76

Activina 133,9 29,4 IgG2 Lambda 7,077 78

Esclerostina (2B8) 150,0 30,0 IgG2 Lambda 6,779 80

Esclerostina 141,4 30,4 IgG2 Kappa 6,8 81 82

c-fms 146,9 32,1 IgG2 Kappa 6,683 84

a4p7 154,9 32,7 IgG2 Kappa 6,585 86

* Una concentración ejemplar adecuada para la administración al paciente; AHC - cadena pesada de anticuerpos; LC - cadena ligera de anticuerpos.

Basándose en la descripción anterior, debe apreciarse que los dispositivos, sistemas y métodos descritos aquí facilitan la realización de un ensayo de una muestra sustancialmente en tiempo real. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar, y se puede obtener el resultado deseado, mucho más rápido que lo permitido por los procesos convencionales.

También debe apreciarse que los dispositivos, sistemas y métodos descritos aquí permiten que el proceso de preparación del ensayo en línea en tiempo real usando el sistema 100 pueda monitorizarse fácilmente, lo que a su vez puede mitigar el riesgo y extender un ciclo de producción del producto. En particular, este proceso puede monitorizarse determinando, por ejemplo, el uso de un controlador tal como el controlador 132 y/o manualmente por un operador del sistema 100, si las condiciones en el sistema 100 son óptimas, es decir, si satisfacen un umbral de rendimiento predeterminado. Como se ilustra en las FIGS. 3B y 3C, por ejemplo, la altura de pico de MS, expresada en recuentos de iones, para los cuatro péptidos de referencia RP1, RP2, RP3 y RP4 se puede obtener y comparar con valores históricos para los péptidos de referencia durante la calificación del método para determinar si las condiciones en el sistema 100 son óptimas (y lo son), de tal forma que el ciclo de producción puede comenzar, continuar o extenderse. Sin embargo, cuando se determina que las condiciones en el sistema 100 no son óptimas, se puede ajustar al menos un componente de cultivo celular hasta que las condiciones en el sistema cerrado sean óptimas. Los ejemplos de componentes de cultivo celular que se pueden ajustar incluyen, pero sin limitación: pH, presión, temperatura, flujo de medio (por ejemplo, caudal de medio, velocidad de alimentación de medio), contenido de medio (incluyendo aminoácidos, nutrientes, azúcares, amortiguador), estrategia de gasificación (por ejemplo, mezcla de oxígeno y dióxido de carbono, tasa de gas), agitación (por ejemplo, tasa de agitación), aditivos (por ejemplo, aditivos metálicos, aditivos de azúcar), velocidad de alimentación de aditivos (por ejemplo, antiespuma), e índice de perfusión. En algunos casos, es posible que solo sea necesario ajustar un componente de cultivo celular para que las condiciones en el sistema cerrado sean óptimas, mientras que en otros casos, es posible que sea necesario ajustar múltiples componentes de cultivo celular. Como alternativa, cuando se determina que las condiciones no son óptimas, o cuando las condiciones en el sistema 100 no son óptimas incluso después de ajustar el al menos un componente de cultivo celular, el controlador y/o el operador del sistema 100 pueden apagar el sistema 100.

De esta manera, los dispositivos, sistemas y métodos descritos aquí también mitigan el riesgo involucrado en la operación continua del sistema 100 cuando las condiciones no son óptimas o cuando no es deseable continuar el funcionamiento del sistema 100. En particular, el riesgo puede mitigarse determinando (por ejemplo, calculando u obteniendo) datos de parámetros de proceso y datos de calidad del producto, por ejemplo, pH, temperatura, disolución de oxígeno, viabilidad celular, densidad celular, título, agregación, variante de carga, glucosilación, etc., asociados con la operación actual del sistema 100, determinando si los datos de parámetros de proceso y los datos de calidad del producto satisfacen un umbral de riesgo predeterminado (determinado antes de la operación del sistema 100 por un controlador tal como el controlador 132 y/o en respuesta a la entrada del operador del sistema 100), y después determinando si continuar, detener o ajustar la operación del sistema 100 basándose en si los datos de parámetros de proceso y los datos de calidad del producto satisfacen el umbral de riesgo predeterminado. El umbral de riesgo predeterminado puede determinarse, por ejemplo, observando (1) la aplicación de los datos de parámetros de proceso disponibles y los datos de calidad del producto para calcular los datos promedio históricos de múltiples variables (MV) asociados con la operación anterior del sistema 100 o algunos otro sistema similar, y después (2) estableciendo los datos de MV históricos promedio calculados como el umbral (el umbral puede calcular los propios datos de MV históricos promedio o algún valor o conjunto de valores basados en los datos de MV históricos promedio calculados. En un ejemplo, el umbral de riesgo predeterminado puede representar una desviación aceptable (por ejemplo, tres desviaciones estándar) de los datos de MV históricos promedio calculados. Como alternativa o adicionalmente, el umbral de riesgo predeterminado puede determinarse basándose en la información del operador del sistema 100. En algunos casos, el sistema 100 puede desconectarse cuando los datos de parámetros de proceso y los datos de calidad del producto asociados con la operación actual del sistema 100 no satisfacen (por ejemplo, excede) el umbral de riesgo predeterminado. Sin embargo, en otros casos, el sistema 100 puede ajustarse cuando los datos de parámetros de proceso y los datos de calidad del producto asociados con la operación actual del sistema 100 no satisfacen (por ejemplo, exceden) el umbral de riesgo predeterminado o incluso cuando los datos de parámetros de proceso y los datos de calidad del producto satisfacen pero están cerca del umbral de riesgo predeterminado.

Además, el Solicitante ha descubierto que los dispositivos, sistemas y métodos descritos aquí también permiten extender los ciclos de producción usando el sistema 100. Los procesos convencionales típicamente permiten ciclos de producción de 32 a 40 días, como máximo. Sin embargo, el Solicitante ha encontrado que los dispositivos, sistemas y métodos descritos aquí permiten 50-80, si no 100, duplicaciones de población, es decir, ciclos de producción de aproximadamente 50-80, si no 100 días. Por lo tanto, se puede obtener más producto, todo mientras se monitoriza la operación del sistema 100 para asegurar que el producto satisfaga los objetivos de calidad y se mitigue el riesgo.

Se describen realizaciones preferidas de la presente descripción aquí, incluyendo la mejor o mejores formas conocidas por los inventores para realizar la descripción. Aunque se muestran y se describen numerosos ejemplos aquí, los expertos en la técnica comprenderán fácilmente que los detalles de las diversas realizaciones no han de ser mutuamente excluyentes. En cambio, los expertos en la técnica tras la lectura de las enseñanzas aquí deberían poder combinar una o más características de una realización con una o más características de las realizaciones restantes. Además, también debe entenderse que las realizaciones ilustradas son solo ejemplares, y no deben tomarse como limitantes del alcance de la descripción. Todos los métodos descritos en la presente pueden ser llevados a cabo en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en la presente o que el contexto indique claramente lo contrario. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado aquí, tiene la intención de iluminar mejor los aspectos de la realización o realizaciones ejemplares de la descripción, y no plantea una limitación en el alcance de la descripción. No se debe interpretar ninguna palabra en la memoria descriptiva como una indicación de que algún elemento no reivindicado es esencial para la puesta en práctica de la descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para realizar un ensayo en tiempo real, comprendiendo el método las etapas de:

(a) mover una muestra de un producto que contiene polipéptidos a una columna (112) de unión a polipéptidos a través de una primera bobina (108) de retención;

(b) unir los polipéptidos en la muestra a la columna de unión a polipéptidos, separando así los polipéptidos en la muestra del resto de la muestra;

(c) mover una disolución de amortiguador de elución de una fuente de amortiguador a la columna de unión a polipéptidos, a través de la primera bobina de retención, y a través de una segunda bobina (116) de retención aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, eluyendo así los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos y moviendo una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la segunda bobina de retención;

(d) mover la mezcla de elución/polipéptido de la segunda bobina de retención a una cámara (120) de reacción; (e) incubar los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido en la cámara de reacción, dando como resultado polipéptidos desnaturalizados;

(f) mover un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a la cámara de reacción a través de la primera bobina de retención después de (e);

(g) incubar los polipéptidos desnaturalizados con el reactivo reductor en la cámara de reacción, dando como resultado polipéptidos desnaturalizados y reducidos;

(h) mover un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a la cámara de reacción después de (g);

(i) incubar los polipéptidos desnaturalizados y reducidos con el reactivo alquilante en la cámara de reacción, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos;

(j) mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a una columna (124) desaladora a través de la primera bobina de retención, la columna desaladora equilibrada con un amortiguador de proteólisis;

(k) aplicar los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados a la columna desaladora, separando así los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de los reactivos reductores y alquilantes, y dando como resultado polipéptidos desalados;

(l) mover los polipéptidos desalados a una columna (128) de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora;

(m) digerir los polipéptidos desalados en la columna de enzima proteolítica, dando como resultado polipéptidos digeridos; y

(n) mover los polipéptidos digeridos a un dispositivo analítico (156) para el análisis de los polipéptidos digeridos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que uno o más de (a), (c), (d), (f), (h), (i), (l), y (n) se realizan automáticamente; y/o en el que (a) a (n) se realizan en un sistema cerrado.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que (a) comprende posicionar una válvula (104) de múltiples puertos en una primera posición en la que la primera bobina de retención y la columna de unión a polipéptidos se acoplan de manera fluida a través de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos;

opcionalmente en el que (d) comprende posicionar la válvula de múltiples puertos en una segunda posición en la que la segunda bobina de retención y la cámara de reacción se acoplan de manera fluida a través de un segundo puerto de la válvula de múltiples puertos.

4. El método de la reivindicación 3, en el que (f) y (h) comprenden cada uno posicionar la válvula de múltiples puertos en una tercera posición en la que la primera bobina de retención y la cámara de reacción se acoplan de manera fluida a través de un tercer puerto de la válvula de múltiples puertos;

opcionalmente en el que (j) comprende:

mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a la columna desaladora a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos; y

posicionar la válvula de múltiples puertos en una cuarta posición en la que la primera bobina de retención y la columna desaladora se acoplan de manera fluida a través de un cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además:

antes de o durante (d), mover una primera válvula (256) acoplada de forma fluida a y situada aguas abajo de la cámara de reacción a una primera posición en la que la primera válvula dirige el contenido recibido de la primera bobina de retención en exceso de un volumen de la cámara de reacción a una cámara de desechos, opcionalmente en el que el método comprende además, después de (i), mover la primera válvula desde la primera posición a una segunda posición en la que la primera válvula dirige aire a la cámara de reacción; y/o

después de (k) y antes de (l), (o) mover una segunda válvula (280) acoplada de forma fluida a y situada entre las columnas desaladora y de enzima proteolítica desde una primera posición, en la que la segunda válvula dirige el contenido recibido de la columna desaladora a una cámara de desechos, a una segunda posición, en la que la segunda válvula dirige el contenido recibido de la columna desaladora a la columna de enzima proteolítica; y/o

en el que (a) comprende mover la muestra del producto de un recipiente que contiene los polipéptidos a la columna de unión a polipéptidos a través de la primera bobina de retención; y/o

antes de (d), llenar, al menos parcialmente, la cámara de reacción con un reactivo desnaturalizante, y en el que (e) comprende incubar los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido con el reactivo desnaturalizante en la cámara de reacción, opcionalmente en el que llenar, al menos parcialmente, la cámara de reacción con el reactivo desnaturalizante comprende mover el reactivo desnaturalizante de una fuente de amortiguador desnaturalizante a la cámara de reacción a través de la primera bobina de retención, u opcionalmente en el que (j) comprende además mover el reactivo desnaturalizante de la cámara de reacción a la columna desaladora a través de la primera bobina de retención, y en el que (k) separa además los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados del reactivo desnaturalizante; y/o

aplicar calor a la cámara de reacción.

6. Un método para realizar un ensayo en tiempo real usando un sistema cerrado que comprende una válvula (104) de múltiples puertos, una primera bobina (108) de retención aguas arriba de la válvula de múltiples puertos, una columna (112) de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos, una segunda bobina (116) de retención acoplada de forma fluida a y aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, una cámara (120) de reacción acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un segundo y tercer puertos de la válvula de múltiples puertos, una columna desaladora acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y una columna (128) de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora, comprendiendo el método:

(a) mover, a través de un controlador acoplado comunicativamente al sistema cerrado, una muestra de un producto que contiene polipéptidos a la primera bobina de retención;

(b) posicionar, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos en una primera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna de unión a polipéptidos a través del primer puerto de la válvula de múltiples puertos, de tal forma que la muestra fluye a la primera columna, por lo que los polipéptidos en la muestra se unen a la columna de unión a polipéptidos;

(c) cuando la válvula de múltiples puertos está en la primera posición, mover, a través del controlador, una disolución de amortiguador de elución de una fuente de disolución de amortiguador de elución a la segunda bobina de retención a través de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos;

(d) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una segunda posición en la que la segunda bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del segundo puerto de la válvula de múltiples puertos;

(e) cuando la válvula de múltiples puertos está en la segunda posición, mover, a través del controlador, una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la cámara de reacción, por lo que los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido se desnaturalizan;

(f) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una tercera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos;

(g) después de (f), mover, a través del controlador, un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a la primera bobina de retención, y mover, a través del controlador, el reactivo reductor desde la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, reduciendo así los polipéptidos desnaturalizados;

(h) después de (g), mover, a través del controlador, un reactivo alquilante que alquila grupos sulfhidrilo a la primera bobina de retención, y mover, a través del controlador, el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos;

(i) mover, a través del controlador, los polipéptidos alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a la primera bobina de retención a través del tercer puerto;

(j) mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a una cuarta posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna desaladora a través del cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y, cuando la válvula de múltiples puertos está en la cuarta posición, mover los polipéptidos alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la columna desaladora, por lo que los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se aplican a la columna desaladora, separando de esta manera los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de los reactivos reductores y alquilantes, dando como resultado polipéptidos desalados;

(k) mover, a través del controlador, los polipéptidos desalados a la columna de enzima proteolítica, por lo que los polipéptidos desalados se digieren; y

(l) hacer pasar, a través del controlador, los polipéptidos digeridos a un dispositivo analítico, por lo que los polipéptidos digeridos se analizan.

7. El método de la reivindicación 6, en el que (a) comprende mover, a través del controlador, la muestra de un recipiente que contiene los polipéptidos a la primera bobina de retención; y/o

en el que (k) comprende pasar los polipéptidos digeridos a un dispositivo analítico seleccionado del grupo que consiste en un dispositivo de cromatografía de líquidos, un dispositivo de cromatografía de líquidos de alto rendimiento, un dispositivo de cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento, un dispositivo de espectrometría de masas, y un dispositivo de análisis de glicanos, o una combinación de los mismos.

8. El método de la reivindicación 6 o 7, que comprende además, antes de (e), mover, a través del controlador, la válvula de múltiples puertos a la tercera posición, y mover, a través del controlador, un reactivo desnaturalizante a la cámara de reacción.

9. El método de la reivindicación 8, en el que mover el reactivo desnaturalizante a la cámara de reacción comprende: mover, a través del controlador, el reactivo desnaturalizante de una fuente de amortiguador desnaturalizante a la primera bobina de retención a través de una bomba, y mover, a través del controlador, el reactivo desnaturalizante de la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos.

10. El método de la reivindicación 8 o 9, en el que (i) comprende además mover el reactivo desnaturalizante de la cámara de reacción a la primera bobina de retención a través del tercer puerto, y en el que (j) comprende además mover el reactivo desnaturalizante de la primera bobina de retención a la columna desaladora, y mediante lo cual, cuando los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se aplican a la columna desaladora, los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se separan adicionalmente del reactivo desnaturalizante.

11. Un sistema cerrado para realizar un ensayo en línea en tiempo real, comprendiendo el sistema:

una primera bobina (108) de retención dispuesta de manera fluida para recibir una muestra de un producto que contiene polipéptidos;

una válvula (104) de múltiples puertos acoplada de manera fluida a y situada aguas abajo de la primera bobina de retención;

una columna (112) de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para recibir la muestra de la primera bobina de retención a través de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos, estando la columna de unión a polipéptidos configurada para unir los polipéptidos de la muestra,

una fuente de amortiguador acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para suministrar una disolución de amortiguador de elución a una segunda bobina de retención situada aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución está adaptada para eluir sustancialmente todos los polipéptidos de la columna de unión a polipéptidos;

una cámara (120) de reacción acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos, la cámara de reacción adaptada para recibir una mezcla de la columna de unión a polipéptidos a través de un segundo puerto de la válvula de múltiples puertos, comprendiendo la mezcla la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos, en el que los polipéptidos de la mezcla se desnaturalizan en la cámara de reacción, en el que la cámara de reacción se dispone para recibir un reactivo reductor que escinde reticulaciones de enlaces de disulfuro a través de la primera bobina de retención y un tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, el reactivo reductor reduce los polipéptidos desnaturalizados, y en el que la cámara de reacción se dispone adicionalmente para recibir un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a través de la primera bobina de retención y el tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, en el que el reactivo alquilante alquila los polipéptidos desnaturalizados y reducidos en la cámara de reacción;

una columna (124) desaladora acoplada de forma fluida a la válvula de múltiples puertos y dispuesta para recibir los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción, la columna desaladora configurada para separar los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados de la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante; y

una columna (128) de enzima proteolítica acoplada de forma fluida a y dispuesta aguas abajo de la segunda columna de polipéptidos para obtener los polipéptidos separados de la columna desaladora, la columna de enzima proteolítica configurada para digerir los polipéptidos desalados.

12. Un sistema cerrado para realizar un ensayo en tiempo real, comprendiendo el sistema:

una válvula (104) de múltiples puertos;

una primera bobina (108) de retención aguas arriba de la válvula de múltiples puertos;

una columna (112) de unión a polipéptidos acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un primer puerto de la válvula de múltiples puertos;

una segunda bobina (116) de retención acoplada de forma fluida a y aguas abajo de la columna de unión a polipéptidos;

una cámara (120) de reacción acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un segundo y tercer puertos de la válvula de múltiples puertos;

una columna (124) desaladora acoplada de forma fluida a y aguas abajo de un cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos;

una columna (128) de enzima proteolítica aguas abajo de la columna desaladora; y

un controlador (132) acoplado comunicativamente a la válvula de múltiples puertos y que comprende una memoria, un procesador, y una lógica almacenada en la memoria y ejecutable por el procesador para:

(a) mover una muestra de un producto que contiene polipéptidos a la primera bobina de retención;

(b) posicionar la válvula de múltiples puertos en una primera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna de unión a polipéptidos a través del primer puerto de la válvula de múltiples puertos, de tal forma que la muestra fluye a la primera columna, por lo que los polipéptidos en la muestra se unen a la columna de unión a polipéptidos;

(c) cuando la válvula de múltiples puertos está en la primera posición, mover una disolución de amortiguador de elución de una fuente de disolución de amortiguador de elución a la segunda bobina de retención a través de la columna de unión a polipéptidos, de tal forma que la disolución de amortiguador de elución eluye sustancialmente todos los polipéptidos unidos a la columna de unión a polipéptidos;

(d) mover la válvula de múltiples puertos a una segunda posición en la que la segunda bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del segundo puerto de la válvula de múltiples puertos;

(e) cuando la válvula de múltiples puertos está en la segunda posición, mover una mezcla de elución/polipéptido que comprende la disolución de amortiguador de elución y los polipéptidos eluidos a la cámara de reacción, por lo que los polipéptidos en la mezcla de elución/polipéptido se desnaturalizan;

(f) mover la válvula de múltiples puertos a una tercera posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos;

(g) después de (f), mover un reactivo reductor que escinde enlaces de disulfuro a la primera bobina de retención, y mover el reactivo reductor desde la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto de la válvula de múltiples puertos, reduciendo así los polipéptidos desnaturalizados;

(h) después de (g), mover un reactivo alquilante que alquila sulfhidrilos a la primera bobina de retención, y mover el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la cámara de reacción a través del tercer puerto, alquilando así los polipéptidos desnaturalizados y reducidos;

(i) mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la cámara de reacción a la primera bobina de retención a través del tercer puerto;

(j) mover la válvula de múltiples puertos a una cuarta posición en la que la primera bobina de retención está conectada a la columna desaladora a través del cuarto puerto de la válvula de múltiples puertos, y, cuando la válvula de múltiples puertos está en la cuarta posición, mover los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados, la disolución de amortiguador de elución, el reactivo reductor, y el reactivo alquilante de la primera bobina de retención a la columna desaladora, por lo que los polipéptidos desnaturalizados, reducidos y alquilados se desalan;

(k) mover los polipéptidos desalados a la columna de enzima proteolítica, por lo que los polipéptidos desalados se digieren; y

(l) hacer pasar los polipéptidos digeridos a un dispositivo de análisis de glicano, por lo que los polipéptidos digeridos se separan y se cuantifican.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o el sistema de las reivindicaciones 11-12, en el que el polipéptido del producto es un polipéptido terapéutico;

opcionalmente en el que el polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un derivado de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y un polipéptido de fusión.

14. El método o sistema de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en infliximab, bevacizumab, ranibizumab, cetuximab, ranibizumab, palivizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, altinumab, atlizumab, atorolimiumab, tocilizumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bivatuzumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotin, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, cc49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetan, conatumumab, crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, enokizumab, enoticumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetan, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, exbivirumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotin, golimumab, gomiliximab, gs6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab ravtansina, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lorvotuzumab mertansina, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonab-cd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pintumomab, placulumab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetida, secukinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tezepelumab, TGN1412, tremelimumab, ticilimumab, tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleucina, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, zolimomab aritox, y los anticuerpos mostrados en la Tabla 1.

15. El método o sistema de la reivindicación 13, en el que el polipéptido terapéutico es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en una glucoproteína, un polipéptido CD, un polipéptido del receptor HER, un polipéptido de la adhesión celular, un polipéptido del factor de crecimiento, un polipéptido de insulina, un polipéptido relacionado con insulina, un polipéptido de coagulación, un polipéptido relacionado con la coagulación, albúmina, IgE, un antígeno del grupo sanguíneo, un factor estimulador de colonias, un receptor, un factor neurotrófico, un interferón, una interleucina, un antígeno viral, una lipoproteína, calcitonina, glucagón, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar, factor de necrosis tumoral alfa y beta, encefalinasa, péptido asociado a gonadotropina de ratón, ADNsa, inhibina, activina, una integrina, proteína A, proteína D, un factor reumatoide, una inmunotoxina, una proteína morfogenética del hueso, una superóxido dismutasa, un polipéptido de membrana superficial, un factor acelerador de la descomposición, una envoltura del SIDA, un polipéptido de transporte, un receptor de localización, una adresina, un polipéptido regulador, una inmunoadhesina, una miostatina, un polipéptido TALL, un polipéptido amiloide, una linfopoyetina del estroma tímico, un ligando RANK, un polipéptido c-kit, un receptor TNF, y una angiopoyetina, y fragmentos, análogos o variantes biológicamente activos de los mismos.